Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Измерения поражения цели наркотиков являются центральным элементом разработки эффективных лекарств и химических зонд проверки. Здесь мы подробно протокол для измерения наркотиков целевых участия, используя высокое содержание изображений в Гонав совместимых адаптация сотовых тепловой сдвиг анализа (CETSA).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Quantitating взаимодействие малых молекул с их предполагаемой белка цели имеет решающее значение для разработки лекарств, целевые проверки и проверки химических зонд. Методы, позволяющие оценить это явление без изменения целевого белка или малые молекулы особенно ценный, хотя технически сложным. Assay сотовой тепловой сдвига (CETSA) является одним из способов для отслеживания целевых участия в живых клетках. Здесь мы описываем адаптация оригинальной CETSA протокол, который позволяет для высокой пропускной способностью измерений при сохранении субцеллюлярные локализации на уровне отдельной ячейки. Мы считаем, что этот протокол предлагает важные успехи в приложение CETSA для углубленного характеристику соединения целевого взаимодействия, особенно в гетерогенной популяции клеток.

Introduction

При разработке новых лекарств или химические датчики, важно пару наблюдаемых Фармакологический эффект или функциональной индикации измерений целевой размещение или участия в живых клеток в1,2,3. Эти данные необходимы для обеспечения что малые молекулы фактически достигает желаемой цели и проверки биологических гипотеза позади белка целевого отбора4,5. Кроме того во время разработки лекарств, модель системы возрастающей сложности используются для выбора и подтвердить свинца соединения до клинических испытаний. Чтобы подтвердить перевод биологии через эти доклинические систем, методы для отслеживания наркотиков целевых участия и сопровождающие биологии на протяжении всего этого процесса развития являются критическими.

Наркотики целевых участия традиционно сложной для мониторинга в живых клеток с unfunctionalized малых молекул и белков, особенно на уровне одной ячейки с пространственным разрешением6,7. Один из последних методов наблюдать взаимодействие между неизмененной наркотиков и белков в живых клеток является пробирного сотовой тепловой сдвиг (CETSA), в котором лиганд индуцированной стабилизации родной белка в ответ на вызов тепла является количественных8, 9,10. Это достигается путем количественной оценки оставшихся растворимого белка после воздействия тепла вызов. В первоначальное раскрытие CETSA Западная помарка была использована для обнаружения. Чтобы включить скрининг кампаний и ударил сортировка больших составных коллекций, усилия увеличить пропускную способность CETSA экспериментов привели к разработке нескольких однородных, основанный на Гонав анализов10,11. Однако одно ограничение с помощью этих методов является, что они в настоящее время лучше всего подходят для соединения лечения в клеточных суспензий и обнаружения требует лизис клеток, приводя к потере пространственной информации. CETSA может быть применена экспериментально, либо как лиганд индуцированного сдвига в тепловой агрегат температуры (общT) на одну концентрацию малые молекулы или лигандом концентрации, необходимой для стабилизации белка в одной температуры. Последняя называется изотермический дозы ответ отпечатки пальцев (ITDRF) для обозначения зависимость этих измерений на конкретных экспериментальных условиях.

Цель настоящего Протокола заключается в измерения поражения цели с помощью CETSA в адэрентных клеток immunofluorescent обнаружения антител (если) с высоким содержанием микроскопии12. Эта процедура расширяет оригинальный CETSA платформа для одноклеточных количественного определения целевых участия с сохранением субцеллюлярные локализации. В частности в отличие от многих предыдущих докладах, в этой процедуре составные лечение проводится в живых адэрентных клеток без поверхности отряд или стирки перед проблемой тепла, таким образом, сохраняя равновесие созданной привязки, мы стремимся, чтобы измерить13. В настоящее время метод проверяется на один целевой белок p38α (MAPK14) в несколько ячеек, строк, и мы надеемся, что путем обмена этой процедуры метод может быть применен широко по всей плавильной протеома. Мы ожидаем, что этот протокол может быть адаптирована в конвейере развития наркотиков от скрининга, хит классифицирование посредством мониторинга целевых участия в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Заполнение ячеек

Примечание: Общий обзор рабочего процесса см. Подробный перечень материалов и реагентов доступны в Таблице материалов.

  1. До заполнения ячеек, сверлить отверстия сверлом стандартной в рамках черного 384-ну изображений пробирного плит чтобы избежать воздушных пузырей, защемления под пластину позже во время шага Отопление. Чтобы избежать пластиковые частицы, попадающие скважин во время этого шага и поддерживать стерильные условия, печать пластины с клей фольги или крышка до бурения в культуре ткани капюшоном. Как правило достаточно 3 отверстия с диаметром 3,5 мм на каждой стороне пластины (короткая сторона).
  2. Подготовьте скамейке ламинарного потока очистки с 70% этиловом спирте. Следующие методы стандартных асептических культуры ткани извлеките из клеток колбу или блюдо. Вымыть клетки с 5-10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS), а затем добавить трипсина 2 мл флакон. Инкубируйте настой при 37 ° C, пока клетки A-431. Подсчет ячеек, либо с помощью haemocytometer или мобильный счетчика. Готовят суспензию клеток 50 000 клеток/мл в культурной среде.
  3. Лунки 40 мкл суспензии клеток (давая окончательный клеток плотность 2000 ячеек на хорошо) в каждой скважине пробирного пластины с помощью реагента Дозатор сыпучих или многоканальные пипетки, в зависимости от масштаба эксперимента. Кратко двигаться пластину из стороны в сторону, чтобы разогнать ячейки равномерно в нижней части пластины.
  4. Чтобы свести к минимуму эффекты краев плиты, позволяют клеткам поселиться в нижней части пластины пробирного 20 минут при комнатной температуре в задней части Ламинарный шкаф. Затем место пластину в пластиковый контейнер с влажной салфетки для обеспечения влажной атмосфере. Перед использованием протрите пластмассовый контейнер с 70% этиловом спирте.
  5. Инкубируйте поле с Пробирной плита на 2-3 дней при 37 ° C и 5% CO2 в обычных увлажненные инкубатора. Монитор confluency клеток до 50-75%, по оценке визуального осмотра с световой микроскоп.

2. составные лечение

  1. В день эксперимента аспирационная среднего от каждой хорошо с помощью пластины шайбу. Поместите пластины на пластину шайбу и выберите программу, аспирации. Если плита шайбу не доступен, затем жидкость можно удалить, инвертирование пластину с закруткой быстрого руку над лотка для отработанных чернил или раковину. Полное удаление жидкости имеет важное значение для хорошей производительности. Затем любой избыток жидкости удаляется путем тыча с бумажными полотенцами.
  2. 30 мкл соединений, разбавленный присвоил концентрации в ячейку культуры среднего с использованием автоматизированного дозирования или многоканальные пипетки в зависимости от масштаба эксперимента. Обеспечить добавление нескольких скважин на каждой табличке пробирного отрицательной (ДМСО) и положительный (известный лигандом) элемента управления. Поскольку это термальный переход пробирного, это необходимо, что составные концентрация превышает Константа диссоциации соблюдать белка стабилизации. Таким образом грубый ориентир для составных концентрации 50 - 100 раз IC50, но более подробно описания составных концентрации находятся в разделе обсуждения.
    Примечание: Переносимость ДМСО клеточных линий должны быть проверены до эксперимента.
  3. Уплотнение соединения лечение пробирного пластины с дышащей пластины уплотнения и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.

3. тепло вызов

  1. Во-первых Установите ванну водой до нужной температуры. Обратите внимание, что конечная температура, которая достигается внутри скважины пробирного пластины может отличаться от окончательной температуры в водяной бане. Исследовать смещение заранее с Макетные пластины и термопары термометр. Это обычно занимает 30 минут для ванн для стабилизации на требуемую температуру.
  2. Чтобы убедиться, что на этапе Отопление в скважинах пробирного пластины будет достигнута желаемая температура, подготовьте незапечатанных Макетные пластины, содержащие такой же объем среднего как пробирного пластины.
  3. Удаление пробирного пластины из инкубатора. Возьмите дышащей печать и вновь запечатать пробирного пластины, содержащий соединение лечение клетки с жесткой клей фольги обеспечить, что вода не будет течь в скважины во время последующего нагрева в водяной бане. Убедитесь, что отверстия в раме пластины доступны.
  4. Место пробирного и Макетные крышку на водяной бане с нижней части плиты, под углом к поверхности воды, чтобы заставить оставшийся воздух из-под плиты.
  5. Контролировать температуру внутри скважины новой Макетные пластины с помощью термопары термометра.
  6. Тепла пробирного пластины в водяной бане в течение 3 минут. Сразу передача пробирного и Макетные пластины другой водой ванну с водой, комната закаленное, чтобы остыть в течение 5 минут. Пластину пробирного теперь готова для дальнейшей обработки.

4. Фиксация

  1. Отказаться от 16% (w/v) параформальдегида 10 мкл (PFA) непосредственно на пластину пробирного с помощью реагента Дозатор сыпучих или многоканальные пипетки. Инкубируйте 20 минут при комнатной температуре.
    Примечание: Некоторые фиксативов классифицируются как канцерогенные и институциональной безопасности правила должны соблюдаться.
  2. Аспирационная PFA решения и вымыть клетки с 300 мкл PBS с помощью пластины шайбу. Поместите пластины на пластину шайбу и выберите программу, аспирации.
    Примечание: Эта процедура была оптимизирована с помощью протокола переполнения на пластине шайбу в котором жидкость одновременно обойтись и удалены. Если плита шайбу или аналогичная процедура недоступна, Стиральная шаг альтернативно может быть сделано вручную.
  3. Ручной стирки процедуры: Удалите жидкость из скважин, инвертирование пластину с закруткой быстрого руку над лотка для отработанных чернил или раковину. Полное удаление жидкости имеет важное значение для хорошей производительности. 80 мкл PBS с многоканальные пипетки и инвертировать пластину снова, как описано выше, повторите процедуру Стиральная два раза. После последнего мыть пятно пластину против чистого бумажные полотенца для удаления любой избыток жидкости.

5. permeabilization

  1. 20 мкл 0,1% (v/v) NP-40 скважин с многоканальные пипетки и инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Вымойте клетки, используя ту же процедуру, как описано выше (шаг 4.2).
  2. Кроме того когда это уместно, примените протокол извлечения антигена, например:
    1. 20 мкл 1% SDS, для скважин с многоканальные пипетки. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут и промыть в том же порядке, описанные выше (шаг 4.2).
    2. Добавьте 80 мкл 10 мм глицин при рН 7,2 и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирационная глицин решения с помощью пластины шайбу, поместив на пластине шайбу и выбор протокола аспирации. Примечания в 2.1 и 4.2 Если плита шайбу не доступен.

6. Блокирование

  1. Мкл 15 1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS для скважин с помощью реагента Дозатор сыпучих или многоканальные пипетки. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 1 часа, или на ночь при 4 ° C с алюминиевой фольги пластина печатью.

7. первичные антитела

  1. Аспирационная блокирования решения с помощью пластины шайбу, поместив на пластине шайбу и выбор протокола аспирации. Примечания в 2.1 и 4.2 Если плита шайбу не доступен.
  2. 10 мкл основное антитело, разбавленный соответственно в 1% (w/v) BSA в PBS для скважин с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 1 часа, или на ночь при 4 ° C с алюминиевой фольги пластина печатью.

8. вторичные антитела

  1. Аспирационная основное антитело раствора и промыть скважин в том же порядке, как описано выше (шаг 4.2).
  2. 10 мкл Alexa 488 вторичные антитела, разбавленный соответственно в 1% (w/v) BSA в PBS. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре. Уплотнение пластину с клей Алюминий фольга уплотнением для защиты от света.
    Примечание: Защите плиты от света в течение этого и последующих шагов.

9. Ядерная окрашивание и клеток маска

  1. 10 мкл ядерных краску разбавляют до 0,05 мг/мл в PBS для скважин с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте дополнительные 10 минут при комнатной температуре.
  2. Аспирационная вторичные антитела и Hoechst решения и промыть скважин, используя ту же процедуру, как описано выше (шаг 4.2).
  3. 10 мкл клеток маски, разбавляют до 200 нг/мл в PBS для скважин с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре.
  4. Аспирационная решение маска клеток и промыть скважин, используя ту же процедуру, как описано выше (шаг 4.2).
  5. Лунки 60 мкл PBS для всех скважин с помощью пластины шайбу, Дозатор сыпучих реагента или многоканальные пипетки и печать пластины с клей фольги.

10. приобретение и анализа изображений

  1. Захват изображения на высокой контента Тепловизор с использованием 3 Флюоресцентная каналов: DAPI (387/447), GFP (472/520) и TexasRed (562/624). Приобрести 4 изображений в колодец, используя 10 X цель. Использование автоматизированных лазерной автофокусом и применять биннинга 2 во время приобретения. Хранить изображения как файлы tiff 16 бит, серая шкала вместе с метаданными.
  2. Анализ изображений с помощью программного обеспечения. Определение границ ячейки с помощью алгоритма, забив ячейки с DAPI (ядра) и TexasRed (цитоплазма).
  3. Экстракт средней интенсивности для всех приобретенных длин волн для дальнейшего анализа данных.
  4. Вычислить коэффициент Z для обеспечения надежности assay.
  5. Рассчитать % стабилизации, с помощью следующей формулы: 100 * (1-(хорошо интенсивности – средняя интенсивность хорошо отрицательный контроль) / (средняя интенсивность позитивного управления средняя интенсивность отрицательный контроль)). Здесь отрицательный контроль ДМСО и положительный контроль является веществом, ссылки. Так как максимальная стабилизации между соединениями может варьироваться и фактически быть больше, чем положительный контроль для ITDRF кривых, максимальной и минимальной стабилизации интенсивности для каждого соединения иногда используются вместо значений интенсивности управления скважин .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол, изложенные на рисунке 1 описывает основной рабочий процесс для запуска CETSA анализов на адэрентных клеток с выявления оставшихся растворимого белка с высоким содержание изображений. Этот рабочий процесс может быть легко адаптирована для всех этапов анализа развития, изменяя макет пластины соединений или реагенты14. Мы подробно ожидаемые результаты для нескольких ожидаемых случаев ниже.

Антитело идентификации и анализа развития. Предпосылкой для успешных результатов является выявление основного антитела или другие подходящие сродство реагент, который выборочно признает родной форму белка в присутствии агрегированные и осажденный белки, сформирован во время жары вызов в шаге 3. Для создания изображений Пробирная CETSA, описанные здесь, мы экранированный Группа 9 антител против p38α на 52° C для окна сигнала между положительной и отрицательной контроля. Мы затем титруют лучшие антитела и поселились на условиях, указанных в рисунке 2 A, B с представителем иммунофлюоресценции изображения для p38α, стабилизированный известных лиганда (положительный контроль) и ДМСО (отрицательный контроль). Также признание антитела не быть нарушена конформационные изменения целевого белка, которая может быть вызвана лигандом привязки (рис. 2 c). Например BIRB796 имеет долгую от ставки и количественное определение целевых участия был возможен только путем применения шаг извлечения антигена (5.2; 2D фигуры). Важно проверить производительность основного антитела с известными лигандами, охватывающих различные привязки сайтов целевого белка, если таковые имеются. Антитело проверка выполняется предпочтительно с и без извлечения шаг антигена.

Tобщ и кривые ITDRF. Как упоминалось выше, CETSA эксперименты могут выполняться в двух различных режимах, Tобщ кривых и ITDRF экспериментов. Оба варианта используют тот же основной протокол, перечисленных на рисунке 1 и в разделе протокол. В первой установки целью является вызов клетки с градиентом температуры и сравнить Tобщ кривых на присутствие и отсутствие единого концентрации лиганда. Чтобы выполнить кривойобщ T, отдельные пластины нагреваются на 3 минуты в диапазоне температур. При выполнении этого эксперимента, важно время длина соединения лечения для каждой пластины с время, необходимое для водяной бани для стабилизации новой температуре. В этой связи peforming, вызов тепла шаг в водяной бане больше времени, чем Отопление трубы в машину ПЦР. Экспериментальный путь — до следующего запуска концентрации ответ кривые лиганда при фиксированной температуре для создания ITDRF кривых. В общем при тестировании нескольких соединений, пробирного готовые плиты для того соединения готовятся с использованием автоматизированной обработки жидких для достижения наиболее воспроизводимого данных. Соединения являются серийно разводили в ДМСО и затем растворяют в СМИ культуры клеток к желаемой концентрации. Обычно мы проверили 11 точку концентрации серии, начиная с 50-100 мкм в 3 или 4 раза разрежения, но это зависит потенции лигандов используется. Рекомендуется сначала установить Tобщ кривой в отсутствие и наличие лиганда и выберите температуру для последующей изотермической экспериментов, где можно наблюдать переход между кривыми. Заданная температура должна быть около или чуть выше Tобщ. Обоих форматов позволяют для подтверждения поражения цели, но для ранжирования составных сродства ITDRF эксперименты часто являются более подходящим. На рисунке 3A показывает иллюстрации ожидаемые количественные результаты для кривойобщ T и рисунок 3B количественные результаты типичная ITDRF эксперимента.

Скрининг в кампании. Протокол также может быть адаптирована к скрининг в кампании для выявления роман Биндеры целевого белка. В этом случае изотермические тепла проблемы применяются для большого числа соединений в одном концентрации следуют ITDRF экспериментов для выявленных стабилизирующим соединений. Мы готовим пробирного готовы скрининг пластины и передачи разводят в культуре СМИ пробирного пластины с помощью автоматизированной обработки жидких соединений. Как с все анализы термическая стабильность, это нужно превысить Константа диссоциации соблюдать белка стабилизации, и таким образом мы применили малые молекулы библиотек в 50 мкм для облегчения идентификации хит. Сортировка с помощью ITDRF хитов позднее позволит ранжирования и определения приоритетности этих соединений. Рисунок 4 показывает представитель результат от скрининга пластины.

Figure 1
Рисунок 1 . Схематический обзор Протокола, описанные в этой статье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Идентификации и анализа развития антитела. A) пример данных для обнаружения человека p38α в A-431 клетках. Представитель изображения положительной (1 мкм AMG548) и отрицательные (ДМСО) элементов управления. Красный - ядерной Hoechst окрашивание, зеленый p38α окраски. Снимки, сделанные с 10 крат; в баре белые шкалы представляет собой 73 мкм. B) пример количественных данных, выраженных как средняя интенсивность/клеток. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего 16 реплицирует для 6 отдельных пластин. Каждая пластина был нагрет до 52 ° C на водяной бане следуют фиксации клеток, permeabilization и последующего иммуноокрашивания. Интенсивность сигнала C) иммунофлюоресценции, измеренная после лечения A-431 клетки с 1 мкм BIRB796 или ДМСО как описано выше следуют непосредственно фиксации. В отсутствие шага Отопление сигнал BIRB796 меньше чем ДМСО сигнал, предполагая, что BIRB796 разрушает выявления p38α с этой антитела. D) ITDRFCETSA кривых для клеток лечение с BIRB796 или с (синий треугольник) или без протокола получения антигена (серый треугольник). Эта цифра была изменена Аксельссон et al. 201812. Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Тепловой агрегат и ITDRF экспериментов. A) тепловой агрегат кривой эксперименты для клеток лечение с положительным (1 мкм AMG548, оранжевый) и отрицательные (ДМСО в серый) элементов управления. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего 32 или 464 реплицирует. B) ITDRFCETSA эксперимент на 52 ° C для клетки лечат серийных разведений SB203580 синим, Skepinone-Л в зеленых и RWJ67657 в красный цвет. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения 6 реплицирует. Количественных данных выражается средней интенсивности/клеток и нормализуется против самая высокая концентрация соответствующих соединений. Эта цифра была изменена Аксельссон et al. 201812. Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Представитель обзор скрининг пластины при 10-кратном. Положительный контроль (1 мкм AMG548) в колонках 2 и 24 и негативный контроль (ДМСО) находятся в колонках 1 и 23. Все другие скважины содержат 50 мкм библиотека соединений, используемых для скрининга с несколькими хитами обозначено. В цифрах врезные белая линия в правом нижнем углу представляет 200 мкм. Эта цифра была изменена Аксельссон et al. 201812. Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как обсуждалось в разделе результаты, существует несколько ключевых шагов к процедуре. Во-первых важно определить реагент сродство высокого качества. Мы рекомендуем, скрининг небольшую библиотеку антител для каждой требуемой цели. После того, как был выбран основное антитело, также важно для проверки системы для ряда различных привязки сайтов целевого белка при необходимости. Борьбе с скрининга для соединений, которые мешают пробирного сигнала, как показано на рис. 2 c , исключив вызов тепла настоятельно рекомендуется. Когда наблюдается снижение сигнала в присутствии лиганд, антиген протокол поиска, как описано в шаге 5.2 могут быть проверены. Неравномерный нагрев пластин могут вызвать колебания и плита to-plate вариации в наблюдаемых данных. Поскольку пластины частично погруженным в ванне с водой во время переходных тепла (шаг 3.4) внешние скважин пластины подвергаются воздействию горячей воды не только в нижней части скважины, но также через наружную стену. Это может вызвать высокую температуру в то же время погружения в внешних скважин пластины и последующих пластины краевых эффектов. Поэтому рекомендуется чтобы избежать внешних скважин пластины. Аналогичные эффекты можно увидеть также если пузырьки воздуха оказались в ловушке под пластину на этапе Отопление, предотвращения достаточно контакта между горячей воды и в нижней части скважины. Учитывая проблемы с изображений пластины, приборы и тарелки, специально сделанные для воздействия тепла может помочь продвигать этот метод. Мы изучили использование нескольких клеточных линий и нашли изменчивости в поверхности насадку после тепла вызов для типов адэрентных клеток. Предварительные эксперименты в нашей лаборатории показывают, что использование покрытие или внеклеточная матрица Synthemax II-SC или ячейки-так можно свести к минимуму мобильный отряд, но это может представлять собой техническую проблему при использовании типов полу прилагаемый клеток. Поскольку составные лечение проводится в живых клеток, малые молекулы должны быть проницаемость клеток. Если соединение не является проницаемой мембраны, рекомендуются альтернативные высокой пропускной способности CETSA методы. Некоторые соединения нужно быть метаболически активируется для привязки к их целевых белков11. В таких случаях рекомендуется больше лечения клетки с соединения до тепла вызов.

Этот протокол требует одной пластине из ячейки посева для визуализации, делая поддаются высокой пропускной способности, скрининг в кампании. Количество ячеек для каждого эксперимента намного ниже, чем может быть достигнуто с западной помарки или предыдущих AlphaScreen assays15. Кроме того Стиральная или ячейки отряд шаги, которые могут изменить соединение доступность и привязки, удаляются, сохранения равновесия созданной привязки через вызов шаг тепла. В отличие от предыдущих процедур отсутствие сигнала из-за цитотоксичность является одновременно сообщил о ядерной пятнать. Наконец изображений сохраняет пространственного разрешения отдельных ячеек, позволяя для целевого взаимодействия измерений в смешанных популяциях клеток или ячейке государства.

Чтобы действительно оценить применимость подхода, необходимы согласованные усилия, чтобы применить технику через плавления протеома. Такие эксперименты будет уточнить легкость выявления подходящих сродство реактивы, какой отчет выборочно на родном протеине присутствии оставшихся денатурированного и агрегированы белков. В настоящее время мы не знаем, как повлияет на способность надежно измерить окно сигнала уровнях выражения протеина. Мы ожидаем, что это отражает близость и избирательности доступных антител и ожидаем, что для низких обильные протеины будут применяться технологии, используемые для повышения сигнал в immunofluorescent анализов. Кроме того тегами белки или функционализированных соединения могут использоваться для обнаружения в модификации описанные протокола. Этот протокол является только для целей, которые расплава и для взаимодействия где можно наблюдать количественно стабилизации. К примеру эндогенные лиганды может стабилизировать белков в живой клетки анализов, которые могут препятствовать дальнейшей стабилизации к экзогенным лигандом. Хотя не изучены здесь, мы считаем, что это будет возможно мультиплекс отсчетов разрешить для изучения нескольких задач одновременно, или цель с течению эффекторов. Дальнейшие исследования необходимы для изучения этих аспектов в месте CETSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют не раскрытия информации для доклада.

Acknowledgments

Авторы признают, поддержку инфраструктуры от науки для жизни лабораторных и Каролинского института. Авторы также признают ввода и обсуждений с Michaela Vallin, Магдалена Otrocka и Томас Lundbäck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17, (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13, (6), e1002165 (2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14, (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17, (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9, (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23, (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341, (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9, (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13, (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21, (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, (30), E6231-E6239 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics