Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Målinger av narkotika mål engasjement er sentrale effektiv narkotika utvikling og kjemiske sonde validering. Her, detalj vi måle narkotika mål engasjement med høy innhold imaging i en microplate-kompatibelt tilpasning av mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) er en protokoll.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Quantitating samspillet av små molekyler med sine tiltenkte protein målet er avgjørende for narkotika utvikling, målet validering og kjemiske sonde validering. Metoder som måler dette fenomenet uten endring av protein målet eller små molekyl er spesielt verdifull om teknisk utfordrende. Mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) er en teknikk for å overvåke målet engasjement i levende celler. Her beskriver vi en tilpasning av den opprinnelige CETSA-protokollen, som tillater for høy gjennomstrømning mål samtidig beholde subcellular lokalisering på enkeltcelle nivå. Vi tror denne protokollen gir viktige fremskritt til anvendelsen av CETSA for detaljert karakterisering av sammensatte mål interaksjon, spesielt i heterogene populasjoner av celler.

Introduction

Ved utvikling av nye medisiner eller kjemiske sonder er det viktig å par observert farmakologisk effekt eller funksjonelle avlesning mål mål personer eller engasjement i lever celler1,2,3. Disse dataene er både å sikre at de små molekylet faktisk når ønsket målet og validere biologiske hypotesen bak protein mål utvalg4,5. Videre under narkotika utvikling brukes modellsystemer økende kompleksitet til å velge og bekrefte et kundeemne sammensatte før kliniske studier. For å bekrefte oversettelse av biologi over disse prekliniske systemer, er metoder for sporing narkotika-mål engasjement og tilhørende biologi utvikling prosessen avgjørende.

Narkotika-mål engasjement har tradisjonelt vært utfordrende overvåke lever celler med unfunctionalized små molekyler og proteiner, særlig på encellede nivå med romlig oppløsning6,7. En nyere metode å observere samspillet mellom uendret narkotika og proteiner i levende celler er mobilnettet termisk Skift analysen (CETSA) der ligand-indusert stabilisering av en innfødt protein som svar på en varme utfordring er kvantifisert8, 9,10. Dette oppnås ved å kvantifisere gjenværende løselig protein etter eksponering for en varme utfordring. I første fremlegging av CETSA, ble western blot brukt for påvisning. For å aktivere screening kampanjer og traff triaging større sammensatte samlinger, har arbeidet med å øke gjennomstrømmingen CETSA eksperimenter ført til utviklingen av flere homogen, microplate-baserte analyser10,11. Imidlertid er en begrensning med disse at de er for tiden best egnet til sammensatte behandling i cellen suspensjoner og gjenkjenning krever celle lysis, fører til tap av romlig informasjon. CETSA kan være brukt eksperimentelt enten som en ligand-indusert endring i termisk aggregering temperatur (Tagg) på en enkelt konsentrasjon av små molekyl eller ligand konsentrasjon nødvendig å stabilisere protein på en enkelt temperatur. Sistnevnte kalles isotermiske dose svar fingeravtrykk (ITDRF) for å markere avhengighet av disse målene på bestemte eksperimentelle forhold.

Målet med denne protokollen er å måle mål engasjement ved hjelp av CETSA i tilhenger celler ved immunofluorescent (hvis) antistoff oppdagelsen med høyt innhold mikroskopi12. Denne prosedyren utvider den opprinnelige CETSA plattformen å tillate encellede kvantifisering av mål engasjement med bevaring av subcellular lokalisering. Spesielt, i motsetning til mange tidligere rapporter, i denne prosedyren sammensatte behandling utføres i live tilhenger celler uten overflaten avdeling eller vask før varme utfordringen, dermed bevare etablerte bindende likevekt mål å måle13. Foreløpig metoden er godkjent for ett mål protein p38α (MAPK14) i flere cellelinjer, og vi håper at ved å dele denne prosedyren teknikken kan brukes bredt på den smeltende proteom. Vi forventer at denne protokollen kan tilpasses gjennom rørledningen narkotika utvikling fra screening, traff triaging gjennom overvåking av målet engasjement i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. såing av celler

Merk: Se figur 1for en generell oversikt over arbeidsflyten. En detaljert liste over materialer og reagenser finnes i Tabellen for materiale.

  1. Før Såing av cellene, bore hull med en standard drill i rammen av svart 384-og bildebehandling analysen plater å unngå luftbobler blir fanget under platen senere under oppvarming trinnet. Unngå plast partikler inn brønnene i dette trinnet og opprettholde sterile forhold, forsegle platene med en selvklebende aluminiumsfolie eller dekke platen før boring i vev kultur hette. Vanligvis nok 3 hull med en diameter på 3,5 på hver side av platen (Kortside).
  2. Forbered en laminær strømning benk ved rengjøring med 70% etanol. Standard steril vev kultur metoder, Fjern medier fra cellen kolbe eller rett. Vask celler med 5-10 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS), og deretter legge til 2 mL trypsin kolbe. Inkuber kolbe på 37 ° C inntil A-431 cellene løsner. Telle celler enten ved hjelp av en haemocytometer eller cellen teller. Forberede en celle suspensjon av 50 000 celler/mL i kultur medium.
  3. Dispensere 40 µL av cellen suspensjon (gir en siste celle tetthet av 2000 celler per brønn) i hver brønn av en analysen plate ved hjelp av en bulk reagens dispenser eller en flerkanals Pipetter, avhengig av omfanget av eksperimentet. Kort flytte platen fra side til side å spre celler jevnt på bunnen av platen.
  4. For å minimere plate-kanteffekter, at cellene å bosette seg på bunnen av analysen platen i 20 minutter ved romtemperatur bak laminær strømning panseret. Deretter plass platen i en plastboks med fuktig papirhåndklær å sikre en fuktig atmosfære. Før bruk, tørk plast beholderen med 70% etanol.
  5. Inkuber boksen med analysen plate for 2-3 dager på 37 ° C og 5% CO2 i en konvensjonell fuktet inkubator. Overvåke confluency cellene til 50-75%, som vurdert av visuell inspeksjon med lys mikroskop.

2. sammensatte behandling

  1. Sug opp mediet hver godt med en plate vaskemaskin på dagen for eksperimentet. Plasser platen på plate vaskemaskinen og Velg programmet aspirasjon. Hvis en plate vaskemaskin ikke er tilgjengelig, kan væske fjernes ved å snu platen med en rask hånd vri vevsavfall eller vask. Fullstendig fjerning av væske er avgjørende for god ytelse. Overflødig væske blir deretter fjernet av dabbing med papirhåndklær.
  2. Legge til 30 µL av forbindelser utvannet til appropriated konsentrasjonen i celle kultur medium med automatisert dispensing eller en flerkanals pipette avhengig av omfanget av eksperimentet. Sørg for å legge til en negativ (DMSO) og positiv (kjent ligand) kontroll flere brønner på hver analysen plate. Siden dette er en termisk Skift analysen, er det nødvendig at sammensatte konsentrasjonen overskrider dissosiasjon konstant å observere protein stabilisering. Dermed en grov retningslinje for sammensatte konsentrasjon er 50 - 100 ganger IC50, men mer detaljerte beskrivelser for sammensatte konsentrasjoner finnes under diskusjon.
    Merk: DMSO toleranse cellen linjer bør testes før eksperimentet.
  3. Seal sammensatte behandlet analysen platen med en pustende plate sel og ruge på 37 ° C og 5% CO2 i en fuktet inkubator i 30 minutter.

3. varme utfordring

  1. Først sett vannbad til ønsket temperatur. Merk at den endelige temperaturen som nås innenfor brønnene av analysen plate kan være forskjellig fra den endelige temperaturen i vannbad. Undersøke forskyvningen på forhånd med en dummy plate og thermocouple termometer. Vanligvis tar det 30 minutter for bad å stabilisere i ønsket temperatur.
  2. For å bekrefte at ønsket temperatur nås i brønnene av analysen plate under oppvarming trinnet, forberede en utette dummy plate som inneholder samme volum av medium som analysen platen.
  3. Fjern analysen platene fra inkubator. Ta av pustende segl og tette igjen analysen platen inneholder sammensatte behandlet cellene med en stram selvklebende aluminiumsfolie slik at vann vil lekke i brønnene under påfølgende oppvarming i vannbad. Kontroller at de boret hullene i plate ramme er tilgjengelig.
  4. Plass analysen platen og dummy plate i vannbad med bunnen av platen vinklet mot vannflaten å tvinge eventuelle gjenværende luft ut fra platene.
  5. Temperaturen inne i brønnene av en ny dummy plate med en thermocouple termometer.
  6. Varm analysen platen i vannbad i 3 minutter. Øyeblikkelig overføre analysen og dummy plate til en annen vannbad med rom-varmebehandlet vann avkjølt i 5 minutter. Analysen platen er nå klar for videre behandling.

4. fiksering

  1. Dispensere 10 µL 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA) direkte til analysen platen ved hjelp av en bulk reagens dispenser eller en flerkanals pipetter. Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter.
    Merk: Noen fiksativene klassifiseres som kreftfremkallende og institusjonelle sikkerhetsforskrifter bør følges.
  2. Sug opp PFA løsningen og vaskes cellene med 300 µL PBS med en plate vaskemaskin. Plasser platen på plate vaskemaskinen og Velg programmet aspirasjon.
    Merk: Denne fremgangsmåten er optimalisert ved hjelp av en overflyt protokoll på plate vaskemaskinen som flytende samtidig utlevert og fjernet. Hvis en plate skive eller lignende prosedyre ikke tilgjengelig, kan vask trinnet også gjøres manuelt.
  3. Manuell vaske prosedyre: Fjern væsken fra brønnene ved å snu platen med en rask hånd vri vevsavfall eller vask. Fullstendig fjerning av væske er avgjørende for god ytelse. Legg 80 µL av PBS med en flerkanals pipette og snu platen opp ned igjen som beskrevet ovenfor, gjenta vaskemaskin to ganger. Etter siste vask, blot platen mot ren papirhåndklær for å fjerne overflødig væske.

5. permeabilization

  1. Legg til 20 µL på 0,1% (v/v) NP-40 fordelt med en flerkanals Pipetter og ruge ved romtemperatur i 10 minutter. Vask cellene med samme prosedyre som beskrevet ovenfor (trinn 4.2).
  2. Alternativt, om nødvendig, bruke en antigen henting protokoll, f.eks:
    1. Legge til 20 µL av 1% SDS brønner med en flerkanals pipetter. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter og vask etter samme prosedyre beskrevet ovenfor (trinn 4.2).
    2. Legger til 80 μL 10 mM glysin pH 7.2 og ruge minutter ved romtemperatur. Sug opp glysin løsningen med en plate skive ved å plassere på plate vaskemaskinen og velge aspirasjon protokollen. Se notater i 2.1 og 4.2 Hvis en plate skive ikke er tilgjengelig.

6. blokkerer

  1. Legge til 15 µL av 1% (w/v) bovin serum albumin (BSA) i PBS brønnene bruker en bulk reagens dispenser eller en flerkanals pipetter. Inkuber platen ved romtemperatur i 1 time eller over natten på 4 ° C med en aluminiumsfolie plate segl.

7. primære antistoff

  1. Sug opp den blokkerer løsningen ved hjelp av en plate skive ved å plassere på plate vaskemaskinen og velge aspirasjon protokollen. Se notater i 2.1 og 4.2 Hvis en plate skive ikke er tilgjengelig.
  2. Legge til 10 µL primære antistoff utvannet tilsvarende 1% (w/v) BSA i PBS fordelt ved hjelp av en flerkanals pipetter. Inkuber platen ved romtemperatur i 1 time eller over natten på 4 ° C med en aluminiumsfolie plate segl.

8. sekundære antistoff

  1. Sug opp den primære antistoff løsningen og vask brønnene etter samme prosedyre som beskrevet ovenfor (trinn 4.2).
  2. Legge til 10 µL Alexa 488 sekundære antistoff utvannet tilsvarende 1% (w/v) BSA i PBS. Inkuber ved romtemperatur i 1 time. Forsegle platen med en selvklebende aluminiumsfolie segl å beskytte mot lyset.
    Merk: Beskytte plate fra lys i løpet av denne og påfølgende trinnene.

9. kjernefysiske flekker og celle maske

  1. Legge til 10 µL kjernefysiske fargestoff utvannet til 0,05 mg/mL i PBS fordelt ved hjelp av en flerkanals pipetter. Inkuber ved romtemperatur i ytterligere 10 minutter.
  2. Sug opp den sekundære antistoff og Hoechst løsning og vask brønnene bruker samme prosedyre som beskrevet ovenfor (trinn 4.2).
  3. Legge til 10 µL av cellen maske utvannet til 200 ng/mL i PBS fordelt ved hjelp av en flerkanals pipetter. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
  4. Sug opp cellen maske løsningen og vask brønnene bruker samme prosedyre som beskrevet ovenfor (trinn 4.2).
  5. Dispensere 60 µL av PBS alle brønner med plate vaskemaskinen, en bulk reagens dispenser eller en flerkanals Pipetter, og forsegle platene med en selvklebende aluminiumsfolie.

10. bilde oppkjøpet og analyse

  1. Ta bilder på en høy innhold imager bruker 3 fluorescerende kanaler: DAPI (387/447), GFP (472/520) og TexasRed (562/624). Erverve 4 bilder per brønn med 10 X-målet. Bruke automatisert laser autofokus og bruke binning 2 under oppkjøpet. Lagre bilder som 16 bit, grå skala tiff-filer sammen med metadata.
  2. Analysere bilder ved hjelp av tilgjengelig programvare. Identifisere cellekantlinjene benytter en celle Scoring algoritmen med DAPI (kjernen) og TexasRed (cytoplasma).
  3. Pakk ut gjennomsnittlig intensitet for alle ervervet bølgelengder for ytterligere dataanalyse.
  4. Beregne Z-faktoren for å sikre robustheten av analysen.
  5. Beregne % stabilisering bruker følgende formel: 100 * (1-(godt intensitet-gjennomsnittlig godt intensitet negativ kontroll) / (gjennomsnittlig intensitetsskruen positiv kontroll-gjennomsnittlig intensitet negativ)). Negativ kontroll er her DMSO og positiv er referanse stoffet. Siden maksimal stabilisering mellom forbindelser kan variere og faktisk være større enn kontrollen positiv for ITDRF kurver, brukes maksimum og minimum stabilisering intensiteter for hver sammensatte i stedet for intensitetsverdiene av kontroll .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen i figur 1 beskriver den grunnleggende arbeidsflyten for å kjøre CETSA analyser på tilhenger celler med oppdagelsen av gjenværende løselig protein av høy innhold tenkelig. Denne arbeidsflyten kan lett tilpasses alle stadier av analysen utvikling ved å endre oppsettet plate forbindelser eller reagenser14. Vi detalj forventede resultater for flere forventet brukstilfeller nedenfor.

Antistoff identifikasjon og analysen utvikling. En forutsetning for vellykkede resultatene er identifikasjonen av et primære antistoff eller andre passende affinitet reagens som selektivt gjenkjenner den opprinnelige formen av proteinet i nærvær av samlet og utfelt protein dannet under varmen utfordringen i trinn 3. For å etablere CETSA tenkelig analysen beskrevet her, skjermet vi et panel av 9 antistoffer målretting p38α ved 52° C for signal-vinduet mellom positive og negative kontroller. Vi deretter titreres beste antistoffer og avgjort på forholdene vist i figur 2 A, B med representant immunofluorescence bilder for p38α stabiliseres av en kjent ligand (positiv kontroll) og DMSO (negativ kontroll). Antistoff anerkjennelse, bør også ikke bli forstyrret av conformational endringene av målet protein som kan bli indusert av ligand binding (figur 2C). Som et eksempel, BIRB796 har en lang av hastighet og kvantifisering av mål engasjement var bare mulig ved å bruke en antigen henting trinn (5,2; Figur 2D). Det er viktig å validere resultatene av primære antistoffer med kjente ligander dekker ulike bindende områder av målet protein hvis tilgjengelig. Antistoff valideringen gjøres helst både med og uten antigen henting trinn.

Tagg og ITDRF kurver. Som nevnt ovenfor, kan CETSA eksperimenter kjøres i to forskjellige moduser, Tagg kurver og ITDRF eksperimenter. Begge variantene benytte samme grunnleggende protokoll beskrevet i figur 1 og delen protokollen. I første stilling er hensikten å utfordre cellene med en temperaturgradient og sammenligne Tagg kurvene i tilstedeværelse og fravær av en enkelt konsentrasjon av ligand. For å utføre en Tagg kurve, er separate plater oppvarmet i 3 minutter over et spekter av temperaturer. I å utføre dette eksperimentet, er det viktig å tid hvor sammensatte behandling for hver plate med tiden det tar for vannbad å stabilisere til nye temperatur. I denne forbindelse, er peforming varme utfordringen trinn i vannbad mer tidkrevende enn varme rør i en PCR-maskin. Eksperimentell banen er til neste kjøre konsentrasjon svar kurver til en ligand ved fast temperatur å generere ITDRF kurver. Vanligvis når du tester flere forbindelser, tilberedes analysen klar plater for sammensatte tillegg med automatisert flytende håndtering for å oppnå mest reproduserbar dataene. Forbindelser er serielt fortynnet i DMSO og da oppløst i celle kultur medier til de ønskede konsentrasjonene. Vi har vanligvis testet 11 punkt konsentrasjon serien starter på 50-100 µM i 3 eller 4 ganger fortynning, men dette avhenger av styrken på ligander brukes. Det anbefales å først etablere Tagg kurven både i fravær og tilstedeværelsen av en ligand og velg temperaturen for påfølgende isotermiske eksperimenter der et skifte mellom kurvene kan observeres. Valgte temperaturen skal være rundt eller like over Tagg. Begge formatene tillater for bekreftelse av mål engasjement men for rangering av sammensatte slektskap ITDRF eksperimenter er ofte mer egnet. Figur 3A viser en illustrasjon av forventet kvantifisert resultater for en Tagg kurve og figur 3B kvantifiserer resultatene av et typisk ITDRF-forsøk.

Screening kampanje. Protokollen kan også tilpasses til screening kampanjer for å identifisere romanen bindemidler av målet protein. I dette tilfellet brukes isotermiske varme utfordringer for mange forbindelser i en enkelt konsentrasjon etterfulgt av ITDRF eksperimenter for identifiserte stabiliserende forbindelser. Vi forbereder analysen klar screening plater og overføre forbindelsene fortynnet i kultur medier til analysen platene bruker automatiserte flytende håndtering. Som med alle temperaturstabilitet analyser, er det nødvendig å overskride dissosiasjon konstant å observere protein stabilisering, og dermed vi har søkt små molekyl biblioteker på 50 µM å lette hit identifikasjon. Triaging treff med ITDRF kan senere rangering og prioritering av disse forbindelsene. Figur 4 viser et representativt resultat fra en screening plate.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk oversikt over protokollen beskrevet i denne artikkelen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Antistoff identifikasjon og analysen utvikling. A) eksempeldata for påvisning av menneskelig p38α i A-431 celler. Representant bilder av positive (1 µM AMG548) og negative (DMSO) kontroller. Rød - kjernefysiske Hoechst flekker, grønn-p38α flekker. Bilder tatt med 10 X forstørrelse; den hvite skala linjen representerer 73 µm. B) eksempel på kvantifisert uttrykt som gjennomsnittlig intensitet/mobiltelefon. Feilfelt representerer standardfeil betyr av 16 replikat for 6 separate plater. Hver plate ble oppvarmet til 52 ° C i et vannbad etterfulgt av fiksering av celler, permeabilization og etterfølgende immunostai. C) Immunofluorescence signal intensitet målt etter behandling av A-431 celler med 1 µM BIRB796 eller DMSO som beskrevet ovenfor direkte etterfulgt fiksering. I fravær av en oppvarming trinn er BIRB796 signalet lavere enn DMSO signalet, antyder at BIRB796 forstyrrer gjenkjenning av p38α med denne antistoff. D) ITDRFCETSA kurver for cellene behandlet med BIRB796 med (blå trekant) eller uten (grå trekant) antigen henting protokollen. Dette tallet er endret fra Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Termisk aggregering og ITDRF eksperimenter. A) termisk aggregering kurve eksperimenter for cellene behandlet med positive (1 µM AMG548, i oransje) og negative (DMSO grå) kontroller. Feilfelt representerer standardfeil betyr av 32 eller 464 replikat. B) ITDRFCETSA eksperimentet utføres på 52 ° C for cellene behandlet med føljetong fortynninger av SB203580 i blått, Skepinone-L i grønt og RWJ67657 i rødt. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt av 6 replikat. Kvantifisert data er uttrykt som gjennomsnittlig intensitet/mobiltelefon og normalisert mot den høyeste konsentrasjonen av respektive sammensatte. Dette tallet er endret fra Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Representant oversikt over en screening plate på 10 X forstørrelse. Positiv kontroller (1 µM AMG548) er i kolonner 2 og 24 og negative kontroller (DMSO) er i kolonne 1 og 23. Alle andre brønner inneholder 50 µM av biblioteket forbindelser brukes for screening med flere hits merket. I senket tallene representerer den hvite linjen i nedre høyre hjørne 200 µm. Dette tallet er endret fra Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som beskrevet under resultater, finnes det flere viktige trinn i prosedyren. Først er det viktig å identifisere en høykvalitets affinitet reagens. Vi anbefaler screening et lite bibliotek av antistoffer for hvert ønsket mål. Etter en primær antistoff er valgt, er det også viktig å validere systemet for en rekke forskjellige bindende områder av protein målet eventuelt. Mot screening for forbindelser som forstyrrer analysen signalet som vist i figur 2C ved å utelate varme utfordringen er svært oppmuntret. Når en redusert signal i nærvær av en ligand er observert, kan en antigen henting protokoll som beskrevet i trinn 5.2 testes. Ujevn oppvarming av platene kan føre svingninger og plate-til-plate variasjoner i de observerte dataene. Siden platene er delvis senkes i et vannbad under forbigående varme utfordringen (trinn 3.4) er ytre brønnene av platene utsatt for varmtvann ikke bare på bunnen av, men også gjennom ytterveggen. Dette medfører høyere temperatur under neddykking samtidig i de ytre brønnene plate og påfølgende plate kanteffekter. Derfor er det anbefalt å unngå ytterste brønnene av platen. Liknende effekter kan også sees hvis luftbobler under platen under oppvarming trinnet forhindrer tilstrekkelig kontakt mellom varmtvann og bunnen av brønnene. Gitt utfordringene med oppvarming tenkelig plater, kan enheter og plater spesielt laget for eksponering for varme hjelpe forhånd denne metoden. Vi har utforsket bruk av flere linjer, og har funnet variasjon i overflaten vedlegg etter varme utfordringen for tilhenger celletyper. Foreløpig eksperimenter i vår lab foreslår at bruk av en malematerialer eller ekstracellulær matrix som Synthemax II-SC eller cellen-Tak kan minimere celle avdeling, men dette kan utgjøre en teknisk utfordring ved semi-tilknyttet celletyper. Siden sammensatte behandling utføres i levende celler, må de små molekylene celle permeabel. Hvis sammensatt ikke er membran gjennomtrengelig, anbefales alternativ høy gjennomstrømning CETSA metoder. Noen forbindelser må aktiveres metabolically for å binde til deres mål proteiner11. I slike tilfeller anbefales lenger behandling celler med sammensatte før varme utfordringen.

Denne protokollen krever en enkelt plate fra celle seeding i imaging gjør det mottakelig for høy gjennomstrømning screening kampanjer. Antall celler for hvert eksperiment er mye lavere enn kan oppnås med vestlige blots eller forrige AlphaScreen søk15. Videre fjernes vask celle avdeling skritt, som kan endre sammensatte tilgjengelighet og bindende, bevare etablerte bindende likevekt gjennom varme utfordring trinn. I motsetning til tidligere prosedyrer rapporteres manglende tapsfrie cytotoksisitet samtidig på av kjernefysiske flekker. Til slutt, bildebehandling beholder romlig oppløsning av individuelle celler, slik at målet engasjement mål i blandede grupper av celler eller cellen stater.

Å virkelig vurdere anvendelse av tilnærming, er felles innsats bruke teknikken over den smeltende proteom nødvendig. Slike eksperimenter vil avklare enkel identifisering egnet affinitet reagenser, hvilken rapport selektivt på innfødt protein i nærvær av de resterende denaturert og samlet proteiner. Vi vet for tiden ikke hvordan protein uttrykk nivå vil påvirke muligheten til å måle pålitelig et signal-vindu. Vi forventer at dette vil reflektere tilhørighet og selektivitet av tilgjengelige antistoffer, og forventer at for lav rikelig proteiner teknologiene som brukes til å forbedre signal i immunofluorescent analyser vil være aktuelt. Også kan merket proteiner eller functionalized forbindelser brukes for gjenkjenning i modifiserte versjoner av beskrevet protokollen. Denne protokollen er begrenset til mål som smelter og samhandling hvor en kvantifiserbare stabilisering kan observeres. For eksempel kan endogene ligander stabilisere et protein i levende celle analyser, som kan forhindre ytterligere stabilisering av en ytre ligand. Selv om ikke utforsket her, tror vi at det vil være mulig å multiplex readouts tillate for studier av flere mål samtidig, eller et mål med nedstrøms effektor. Videre studier er nødvendig å undersøke disse aspektene i situ CETSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer rapporten.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter infrastrukturstøtte fra vitenskap for livet laboratorium og Karolinska Institutet. Forfatterne bekrefter også inngang og diskusjoner med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka og Thomas Lundbäck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17, (3), 167-181 (2018).
  2. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13, (6), e1002165 (2015).
  3. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14, (7), 475-486 (2015).
  4. Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17, (9), 419-424 (2012).
  5. Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9, (4), 195-199 (2013).
  6. Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. Small-Molecule Target Engagement in Cells. Cell Chemical Biology. 23, (4), 435-441 (2016).
  7. Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
  8. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341, (6141), 84-87 (2013).
  9. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  10. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9, (9), 2100-2122 (2014).
  11. Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
  12. Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13, (4), 942-950 (2018).
  13. Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21, (10), 1019-1033 (2016).
  14. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
  15. Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, (30), E6231-E6239 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics