Verwendung von hohen Gehalt Imaging zu Target Engagement in adhärenten Zellen zu quantifizieren

Biochemistry

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Summary

Messungen der Droge Ziel Engagement sind von zentraler Bedeutung für effektive Medikamentenentwicklung und chemische Sonde Validierung. Hier zeigen wir ein Protokoll zur Messung der Droge-Ziel Engagement mit hohen Inhalt Bildgebung in einer Mikrotestplatte-kompatiblen Adaption des zellulären thermische Verschiebung Assays (CETSA).

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Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (141), e58670, doi:10.3791/58670 (2018).

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Abstract

Quantifizierung der Interaktion von kleinen Molekülen mit ihrer beabsichtigten Protein-Ziel ist entscheidend für die Arzneimittelentwicklung, Target-Validierung und chemische Sonde Validierung. Besonders wertvoll sind die Methoden, die dieses Phänomen ohne Änderung der Protein-Ziel oder kleines Molekül zu messen, aber technisch anspruchsvolle. Die zelluläre thermische Verschiebung Assay (CETSA) ist eine Technik, Ziel Engagement in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Anpassung der ursprünglichen CETSA-Protokoll, das für hohen Durchsatz-Messungen unter Beibehaltung der subzellulären Lokalisierung auf der Ebene der einzelnen Zelle kann. Wir glauben, dass dieses Protokoll bietet wichtige Fortschritte für die Anwendung der CETSA für detaillierte Charakterisierung der Verbindung zu den Zielgruppen Interaktion, vor allem in heterogenen Bevölkerung der Zellen.

Introduction

Bei der Entwicklung neuer Medikamente oder chemische Sonden es unerlässlich ist, die beobachteten pharmakologischen Wirkung oder funktionelle auslesen, Messungen der Ziel-Belegung oder Engagement in lebenden Zellen1,2,3paar. Diese Daten sind notwendig, um sicherzustellen, dass das kleine Molekül in der Tat das gewünschte Ziel erreicht und die biologischen Hypothese hinter Protein Ziel Auswahl4,5zu überprüfen. Darüber hinaus werden während der Medikamentenentwicklung, Modellsysteme der zunehmenden Komplexität zur auswählen und einen Vorsprung vor klinischen Studien Verbindung bestätigen. Um die Übersetzung der Biologie dieser präklinischen systemübergreifend zu bestätigen, sind Methoden für Droge-Ziel Engagement verfolgen und begleitende Biologie während dieses Entwicklungsprozesses entscheidend.

Droge-Ziel Engagement ist traditionell schwierig, in lebenden Zellen mit unfunctionalized kleine Moleküle und Proteine, insbesondere auf der Ebene der Einzeller mit räumlicher Auflösung6,7zu überwachen. Eine neue Methode zu beobachten, die Interaktion zwischen unveränderten Drogen und Proteine in lebenden Zellen ist die zelluläre thermische Verschiebung Assay (CETSA) in dem Liganden-induzierte Stabilisierung eines nativen Proteins als Reaktion auf eine Hitze-Herausforderung quantifizierte8ist, 9,10. Dies geschieht durch Quantifizierung der verbleibenden lösliche Protein nach Exposition gegenüber einem Hitze-Herausforderung. In der ersten Offenlegung von CETSA wurde western-Blot zum Nachweis verwendet. Screening-Kampagnen aktivieren und Selektierung von größeren zusammengesetzten Sammlungen getroffen, haben Anstrengungen zur Erhöhung des Durchsatzes CETSA Experimente führten zur Entwicklung von mehreren homogenen, Mikrotestplatte basierende Assays10,11. Eine Einschränkung mit diesen Methoden ist jedoch, dass derzeit zusammengesetzten Behandlung in Zellsuspensionen optimal und die Erkennung Zelle Lysis erfordert, führt zum Verlust der räumlichen Informationen. CETSA kann sein angewandt experimentell entweder als Liganden-induzierte Verschiebung in der thermischen Aggregation Temperatur (TAgg) an einem einzigen Zusammenschluss kleiner Moleküle oder die Liganden-Konzentration notwendig, das Protein in einer einzelnen Temperatur zu stabilisieren. Letzteres wird als isothermen Dosis Antwort Fingerabdrücke (ITDRF), um die Abhängigkeit von diesen Messungen an bestimmten experimentellen Bedingungen bedeuten bezeichnet.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Ziel Engagement mit CETSA in adhärenten Zellen durch immunofluorescent (IF)-Antikörpernachweis mit High-Content Mikroskopie12messen. Dieses Verfahren reicht die ursprüngliche CETSA-Plattform, um einzellige Quantifizierung der Ziel-Engagement mit der Erhaltung der subzellulären Lokalisierung zu ermöglichen. Bemerkenswert ist, im Gegensatz zu vielen früheren Berichten in diesem Verfahren zusammengesetzte Behandlung erfolgt in lebenden adhärente Zellen ohne Oberflächen Ablösung oder waschen vor der Hitze-Challenge, so bewahrt das Gleichgewicht der etablierten Bindung wollen wir13messen. Derzeit ist die Methode für ein Ziel Protein p38α validiert (MAPK14) in mehrere Zellinien, und wir hoffen, dass durch den Austausch dieses Verfahren die Technik im großen und ganzen über das schmelzende Proteom angewendet werden kann. Wir erwarten, dass dieses Protokoll kann angepasst werden, während die Droge-Entwicklungs-Pipeline vom Screening, hit Selektierung durch Überwachung der Ziel Engagement in Vivo.

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Protocol

(1) Aussaat von Zellen

Hinweis: Für einen allgemeinen Überblick über den Workflow siehe Abbildung 1. Eine detaillierte Liste der Materialien und Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung.

  1. Vor der Aussaat der Zellen, die Bohrungen Sie mit einem standard Bohrer im Rahmen des schwarzen 384-Well Assay Bildplatten, wird unter der Platte später während der Heizung Schritt eingeschlossenen Luftbläschen zu vermeiden. Kunststoffpartikel Eingabe der Brunnen während dieses Schrittes zu vermeiden und sterile Bedingungen zu halten, die Platten mit einer selbstklebenden Aluminiumfolie zu versiegeln oder die Platte vor dem Bohren in einer Gewebekultur Haube abdecken. Es genügt in der Regel 3 Löcher mit einem Durchmesser von 3,5 mm auf jeder Seite der Platte (kurze Seite).
  2. Vorbereiten einer Laminar-Flow Bank durch Reinigung mit 70 % Ethanol. Entfernen Sie nach standard aseptischen Gewebekultur Techniken Medien aus Zelle Kolben oder Schale. Waschen Sie Zellen mit 5-10 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie dann 2 mL Trypsin in den Kolben. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 ° C, bis die A-431 Zellen lösen. Zählen Sie den Zellen entweder mit einem Zählkammern oder Zelle Zähler. Bereiten Sie eine Zellsuspension von 50.000 Zellen/mL in Kulturmedium.
  3. 40 µL Zellsuspension (was eine endgültige Zelldichte von 2.000 Zellen pro Well) in jede Vertiefung eines Test-Platte mit einem Großteil Reagenz Dispenser oder eine Multi-Channel-pipettieren, je nach Umfang des Experiments zu verzichten. Kurz bewegen die Platte von einer Seite zur anderen Zellen gleichmäßig auf der Unterseite der Platte verteilen.
  4. Zur Minimierung von Plattenrand Effekte ermöglichen Sie die Zellen am unteren Rand der Assay-Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf der Rückseite der Laminar-Flow-Haube zu begleichen. Legen Sie die Platte in einen Kunststoffbehälter mit feuchten Papiertüchern in feuchter Atmosphäre zu gewährleisten. Wischen Sie vor dem Einsatz den Kunststoffbehälter mit 70 % Ethanol.
  5. Inkubieren Sie Feld mit der Assay-Platte für 2-3 Tage bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem konventionellen befeuchteten Inkubator. Konfluenz der Zellen bis zu 50-75 %, zu überwachen, wie durch Sichtkontrolle mit einem Lichtmikroskop beurteilt.

(2) zusammengesetzte Behandlung

  1. Am Tag des Experiments Aspirieren des Mediums aus jeder gut mit einer Platte Scheibe. Legen Sie die Platte auf die Platte Scheibe und wählen Sie das Ziel-Programm. Wenn eine Platte Scheibe nicht verfügbar ist, kann die Flüssigkeit entfernt werden, durch Umdrehen der Platte mit einem schnellen Hand Twist über eine Abfallfach oder Waschbecken. Vollständige Entfernung der Flüssigkeit ist wichtig für eine gute Leistung. Überschüssige Flüssigkeit wird dann durch Abtupfen mit einem Papiertuch entfernt.
  2. Fügen Sie 30 µL verdünnt, um die angeeigneten Konzentration im Zellkulturmedium mit automatisierten Dosierung oder einer Mehrkanal-Pipette je nach Umfang des Experiments Verbindungen hinzu. Stellen Sie sicher um eine Negative (DMSO) und positiv (bekannte Liganden) Kontrolle mehrere Bohrungen auf jeder Assay-Platte hinzuzufügen. Da dies eine thermische Verschiebung-Assay ist, ist es notwendig, dass die Compoundkonzentration übersteigt die Dissoziationskonstante Eiweißstabilisierung zu beobachten. So eine grobe Richtlinie für Compoundkonzentration ist 50 - 100 Mal den IC50, aber mehr Detail-Beschreibungen für zusammengesetzte Konzentrationen finden sich in Abschnitt Diskussion.
    Hinweis: DMSO Verträglichkeit der Zelllinien sollte vor dem Experiment getestet werden.
  3. Abdichtung die Verbindung behandelt Assay-Platte mit einer atmungsaktiven Platte verschließen und 30 Minuten bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator inkubieren.

3. Wärme Herausforderung

  1. Stellen Sie zuerst das Wasserbad in die gewünschte Temperatur. Beachten Sie, dass die endgültige Temperatur, die in die Vertiefungen der Assay-Platte erreicht ist die Endtemperatur im Wasserbad abweichen kann. Untersuchen Sie den Versatz im Voraus mit einem Dummy-Platte und Thermoelement-Thermometer. Es dauert in der Regel 30 Minuten für das Bad auf der gewünschten Temperatur zu stabilisieren.
  2. Um sicherzustellen, dass die gewünschte Temperatur, in den Vertiefungen der Assay-Platte während der Heizung Schritt erreicht ist, bereiten Sie eine unverschlossene Dummy-Platte mit dem gleichen Volumen des Mediums als der Assay-Platte.
  3. Entfernen Sie der Assay-Platten aus dem Inkubator. Die atmungsaktive Dichtung abnehmen und neu versiegeln der Assay-Platte mit der Verbindung-behandelten Zellen mit einer engen Klebstoff Alufolie um sicherzustellen, dass kein Wasser in den Brunnen beim anschließenden Erhitzen im Wasserbad eindringen wird. Stellen Sie sicher, dass die Bohrlöcher in Kennzeichenrahmen zugänglich sind.
  4. Platzieren der Assay-Platte und die Dummy-Platte im Wasserbad mit der Unterseite der Platte schräg in Richtung der Wasseroberfläche jede verbleibende Luft heraus unter den Platten zu erzwingen.
  5. Überwachen Sie die Temperatur im Inneren der Brunnen einer neuen Dummy-Platte mit einem Thermoelement-Thermometer.
  6. 3 Minuten erhitzen Sie die Assay-Platte im Wasserbad. Sofortüberweisung-Assay und Dummy-Platte zu einem anderen Wasserbad mit Raum-temperierten Wasser für 5 Minuten abkühlen lassen. Der Assay-Platte ist nun bereit zur Weiterverarbeitung.

4. Fixierung

  1. 10 µL 16 % (w/V) Paraformaldehyd (PFA) direkt an der Assay-Platte mit einem Großteil Reagenz Dispenser oder ein Mehrkanal-Pipettieren zu verzichten. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: Einige Fixiermittel werden als krebserregend eingestuft und institutionellen Sicherheitsvorschriften beachtet werden.
  2. Aspirieren Sie die PFA-Lösung und waschen Sie die Zellen mit 300 µL PBS mit einer Platte Waschmaschine. Legen Sie die Platte auf die Platte Scheibe und wählen Sie das Ziel-Programm.
    Hinweis: Dieses Verfahren ist mit einem Überlauf-Protokoll auf der Platte Unterlegscheibe in der Flüssigkeit gleichzeitig verzichtet und entfernt optimiert worden. Wenn eine Platte Scheibe oder ähnliches Verfahren nicht verfügbar ist, kann die Waschschritt alternativ manuell durchgeführt werden.
  3. Manuellen Waschverfahren: Entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen durch Umdrehen der Platte mit einem schnellen Hand Twist über eine Abfallfach oder Waschbecken. Vollständige Entfernung der Flüssigkeit ist wichtig für eine gute Leistung. Fügen Sie 80 µL PBS mit einer Mehrkanal-Pipette und invertieren Sie die Platte wieder wie oben beschrieben, wiederholen Sie den Waschvorgang zwei Mal. Tupfen Sie nach dem letzten Waschen die Platte gegen saubere Papiertücher, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

5. Permeabilisierung

  1. Fügen Sie 20 µL von 0,1 % (V/V) NP-40 in die Vertiefungen mit einem Mehrkanal-pipettieren und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit dem gleichen Verfahren wie beschrieben (Schritt 4.2).
  2. Alternativ erfassen Sie gegebenenfalls gelten Sie ein Antigen Abruf Protokoll, z. B.:
    1. Der Brunnen mit einem Mehrkanal-Pipettieren 20 µL 1 % SDS hinzufügen. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren Sie und waschen Sie nach dem gleichen Verfahren beschrieben (Schritt 4.2).
    2. 80 μl 10 mM Glycin bei pH 7,2 hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie die Glycin-Lösung unter Verwendung einer Platte Unterlegscheibe durch Platzierung auf der Platte Scheibe und zum Auswählen des Protokolls streben. Siehe Hinweise im 2.1 und 4.2, wenn eine Platte Scheibe nicht verfügbar ist.

6. Sperrung

  1. Der Brunnen mit einem Großteil Reagenz Dispenser oder ein Mehrkanal-Pipettieren fügen Sie 15 µL 1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA hinzu) in PBS. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur 1 Stunde oder über Nacht bei 4 ° C mit einer Aluminium-Platte Folienversiegelung.

(7) Primärantikörper

  1. Aspirieren Sie die blockierende Lösung unter Verwendung einer Platte Scheibe durch Platzierung auf der Platte Scheibe und zum Auswählen des Protokolls streben. Siehe Hinweise im 2.1 und 4.2, wenn eine Platte Scheibe nicht verfügbar ist.
  2. Fügen Sie 10 µL Primärantikörper entsprechend verdünnt in 1 % (w/V) BSA mit PBS-Puffer in die Vertiefungen mit einem Mehrkanal-pipettieren. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur 1 Stunde oder über Nacht bei 4 ° C mit einer Aluminium-Platte Folienversiegelung.

(8) sekundäre Antikörper

  1. Aspirieren Sie die primären Antikörper-Lösung und waschen Sie die Brunnen nach demselben Verfahren wie beschrieben (Schritt 4.2).
  2. Fügen Sie 10 µL Alexa 488 Sekundärantikörper entsprechend verdünnt in 1 % (w/V) BSA mit PBS-Puffer. 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Dichtplatte mit einem selbstklebenden Aluminium-Folie-Siegel um vor Licht zu schützen.
    Hinweis: Schützen Sie Platte aus Licht während dieser und weiteren Schritten.

(9) nukleare Färbung und Zelle Maske

  1. Fügen Sie 10 µL des nuklearen Farbstoff verdünnt, um 0,05 mg/mL mit PBS-Puffer in die Vertiefungen mit einem Mehrkanal-pipettieren. Weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. Aspirieren Sie Sekundärantikörper und Hoechst Lösung und waschen Sie die Brunnen, die mit dem gleichen Verfahren wie beschrieben (Schritt 4.2).
  3. Fügen Sie 10 µL der Zelle Maske verdünnt auf 200 ng/mL mit PBS-Puffer in die Vertiefungen mit einem Mehrkanal-pipettieren. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Aspirieren Sie die Zelle-Maske-Lösung und waschen Sie der Brunnen mit dem gleichen Verfahren wie beschrieben (Schritt 4.2) zu.
  5. 60 µL PBS in alle Vertiefungen mit der Platte Scheibe, ein Großteil Reagenz Dispenser oder ein Mehrkanal-Pipettieren zu verzichten, und die Platten mit einer selbstklebenden Aluminiumfolie verschließen.

10. Bild Erfassung und Analyse

  1. Die Aufnahmen auf einen hohen Inhalt Imager mit 3 Leuchtstoffröhren Kanäle: DAPI (387/447), GLP (472/520) und TexasRed (562/624). 4 Bilder pro Bohrloch mit 10 X-Objektiv zu erwerben. Verwenden Sie automatisierte Laser-Autofokus und wenden Sie binning 2 während der Akquisition an. Speichern von Bildern als 16-Bit, graue Skala TIFF-Dateien mit Metadaten.
  2. Bilder mit verfügbare Software zu analysieren. Zellgrenzen mit einer Zelle Scoring-Algorithmus mit DAPI (Kern) und TexasRed (Zytoplasma) zu identifizieren.
  3. Mittlere Intensität für alle erworbenen Wellenlängen für weitere Datenanalyse zu extrahieren.
  4. Berechnen Sie den Z-Faktor um die Robustheit des Tests zu gewährleisten.
  5. % Stabilisierung anhand der folgenden Formel berechnen: 100 * (1-(gut Intensität – mittlere gut Intensità ¤ t Negativkontrolle) / (mittlere Intensität positive Kontrolle-Durchschnitt Intensität Negativkontrolle)). Hier negative Kontrolle ist DMSO und Positivkontrolle Referenzstoff. Da die maximale Stabilisierung zwischen Verbindungen kann variieren und in der Tat größer sein als die positive Kontrolle für ITDRF Kurven, sind die maximalen und minimalen Stabilisierung Intensitäten für jede Verbindung manchmal anstelle der Intensitätswerte des Kontroll-Vertiefungen verwendet. .

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Representative Results

Das Protokoll gemäß Abbildung 1 beschreibt die grundlegenden Workflow für die Ausführung CETSA Assays auf adhärente Zellen mit Erkennung der verbleibenden lösliche Protein von hoher Content Imaging. Dieser Workflow kann durch Bearbeiten des Layouts der Platte der Verbindungen oder Reagenzien14leicht an allen Phasen der Assay-Entwicklung angepasst. Wir ausführlich die erwarteten Ergebnisse für mehrere erwartet folgenden Fällen verwenden.

Antikörper-Identifikation und Assay-Entwicklung. Voraussetzung für erfolgreiche Ergebnisse ist die Kennung der primären Antikörper oder andere geeignete Affinität-Reagenz, die selektiv die native Form des Proteins im Beisein der aggregierten und ausgefällte Eiweiß gebildet während der Hitze erkennt fordern Sie in Schritt 3. Um der CETSA Bildgebung Test hier beschriebenen zu etablieren, haben wir eine Gruppe von 9 Antikörper gezielt p38α bei 52° C für Signalfenster zwischen den positiven und negativen Kontrollen überprüft. Wir dann die besten Antikörper titriert und ließ sich über die Bedingungen, dargestellt in Abbildung 2 A, B mit Vertreter Immunfluoreszenz Bilder für p38α durch einen bekannten Liganden (Positivkontrolle) und DMSO (Negativkontrolle) stabilisiert. Antikörper Anerkennung darf nicht durch Konformationsänderungen des Zielproteins unterbrochen werden, die durch Liganden binden (Abbildung 2) induziert werden kann. Als Beispiel BIRB796 hat eine lange Rabatt Preis und Quantifizierung der Ziel-Engagement war nur möglich durch die Anwendung eines Antigen-Retrieval-Schritt (5,2; Abb. 2D). Es ist wichtig, überprüfen Sie die Leistung des primären Antikörpers mit bekannten Liganden für verschiedene Bindungsstellen des Zielproteins, falls vorhanden. Die Antikörper-Validierung erfolgt vorzugsweise sowohl mit als auch ohne die Antigen-Retrieval-Schritt.

T-Agg und Kurven ITDRF. Wie bereits erwähnt, können CETSA Experimente in zwei verschiedenen Modi, TAgg Kurven und ITDRF Experimente ausgeführt werden. Beide Varianten nutzen das gleiche grundlegende Protokoll, dargestellt in Abbildung 1 und im Abschnitt Protokoll. Bei der ersten Einrichtung ist der Zweck fordern Sie die Zellen mit einem Temperaturgradienten und vergleichen die T-Agg -Kurven in an- und Abwesenheit von einer einzigen Konzentration des Liganden. Um eine T-Agg -Kurve durchzuführen, werden separate Platten für 3 Minuten in einem Temperaturbereich erhitzt. In diesem Experiment durchführen, ist es wichtig, die zusammengesetzte Behandlung Länge für jede Platte mit der Zeit Zeit braucht es für das Wasserbad, um die neue Temperatur zu stabilisieren. In dieser Hinsicht ist die Hitze Herausforderung Schritt im Wasserbad Peforming mehr Zeit in Anspruch als Heizung Rohre in einer PCR-Maschine. Der experimentellen Weg ist zum nächsten Lauf Konzentration-Wirkungs-Kurven eines Liganden an eine feste Temperatur ITDRF Kurven erzeugen. Im Allgemeinen sind wenn Sie mehrere Verbindungen zu testen, Test bereit Platten für den zusammengesetzten Zusatz zubereitet automatisierte Handhabung von Flüssigkeiten, um die meisten reproduzierbaren Daten zu erreichen. Verbindungen sind seriell in DMSO verdünnt und dann in Zellkulturmedien, die gewünschten Konzentrationen aufgelöst. Wir haben in der Regel 11-Punkte-Konzentrationsreihe ab 50-100 µM in 3 oder 4 fache Verdünnung getestet, aber das hängt von der Potenz der Liganden eingesetzt. Es wird empfohlen, zunächst die T-Agg -Kurve sowohl in Abwesenheit und Anwesenheit eines Liganden zu etablieren und wählen die Temperatur für nachfolgende isothermen Experimente, wo eine Verschiebung zwischen den Kurven beobachtet werden kann. Die gewählte Temperatur sollte um oder knapp über den T-Agg. Beide Formate erlauben für die Bestätigung der Ziel-Engagement aber Ranking der zusammengesetzten Affinitäten ITDRF Experimente sind oft geeignet. Abbildung 3A zeigt eine Darstellung der erwarteten quantifizierten Ergebnisse für eine T-Agg -Kurve und Abbildung 3 b quantifiziert Ergebnisse eines typischen ITDRF-Experiments.

Screening-Kampagne. Das Protokoll kann auch zum screening-Kampagnen, um neuartige Bindemittel des Zielproteins identifizieren angepasst werden. In diesem Fall werden isothermen Hitze Herausforderungen für eine große Anzahl von Verbindungen in einer einzigen Konzentration, gefolgt von ITDRF Experimente für identifizierte stabilisierende Substanzen angewendet. Wir bereiten Sie bereit Siebungplatten Assay und übertragen die Verbindungen in Kulturmedien der Assay-Platten mit automatisierten Handhabung von Flüssigkeiten verdünnt. Wie bei allen thermischen Stabilität Assays, es ist notwendig, die Dissoziationskonstante Eiweißstabilisierung beobachten zu übertreffen, und somit haben wir kleines Molekül Bibliotheken bei 50 µM zur Erleichterung der erfolgreichen Identifizierung angewendet. Selektierung der Hits mit ITDRF ermöglicht später Ranking und Priorisierung dieser Verbindungen. Abbildung 4 zeigt ein repräsentatives Ergebnis aus einer Screening-Platte.

Figure 1
Abbildung 1 . Schematische Übersicht über das Protokoll in diesem Artikel beschriebene. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Antikörper-Identifikation und Assay-Entwicklung. A) Beispieldaten zur Erkennung von menschlichen p38α in den A-431 Zellen. Repräsentative Bilder der positiven (1 µM AMG548) und negative (DMSO) Kontrollen. Rot - nuklearen Hoechst Färbung, grün-p38α Färbung. Aufnahmen mit 10-facher Vergrößerung; die weiße Skala Bar steht für 73 µm. B) Beispiel der quantifizierten Daten ausgedrückt als durchschnittliche Intensität/Zelle. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler von Mittelwert von 16 Wiederholungen für 6 separate Platten. Jede Platte wurde auf 52 ° C im Wasserbad, gefolgt von Fixierung der Zellen, Permeabilisierung und anschließende Immunostaining erhitzt. (C) Immunfluoreszenz Signalintensität gemessen nach der Behandlung A-431 Zellen mit 1 µM BIRB796 oder DMSO wie oben beschrieben folgen direkt durch Fixierung. In Ermangelung einer Heizung Schritt ist das BIRB796 Signal niedriger als das DMSO-Signal, was darauf hindeutet, dass BIRB796 die Erkennung von p38α mit diesem Antikörper stört. (D) ITDRFCETSA Kurven für Zellen mit BIRB796 behandelt entweder mit (blaues Dreieck) oder ohne (graues Dreieck) Antigen-Retrieval-Protokoll. Diese Zahl wurde von Axelsson Et Al. 201812geändert. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Thermische Aggregation und ITDRF Experimente. (A) thermische Aggregation Kurve Experimente für Zellen behandelt mit positiven (1 µM AMG548 in Orange) und negative (DMSO in grau) Kontrollen. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler von Mittelwert von 32 oder 464 Wiederholungen. (B) ITDRFCETSA Experiment durchgeführt bei 52 ° C für Zellen behandelt mit Verdünnungsreihen von SB203580 in blau, Skepinone-L in grün und RWJ67657 in rot. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts 6 Wiederholungen. Quantifizierte Daten sind als durchschnittliche Intensität/Zelle ausgedrückt und gegen die höchste Konzentration der jeweiligen Verbindung normalisiert. Diese Zahl wurde von Axelsson Et Al. 201812geändert. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Repräsentativen Überblick über eine Screening-Platte bei 10-facher Vergrößerung. Positivkontrollen (1 µM AMG548) sind in den Spalten 2 und 24 und Negativkontrollen (DMSO) sind in den Spalten 1 und 23. Alle anderen Brunnen enthalten 50 µM der Bibliothek Verbindungen verwendet für das Screening bei mehreren Treffern bezeichnet. In den Einschub-Figuren stellt die weiße Linie in der unteren rechten Ecke 200 µm. Diese Zahl wurde von Axelsson Et Al. 201812geändert. Copyright 2018 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Wie im Abschnitt "Ergebnisse", gibt es mehrere wichtige Schritte des Verfahrens. Erstens ist es wichtig, eine qualitativ hochwertige Affinität Reagenz zu identifizieren. Es wird empfohlen, eine kleine Bibliothek von Antikörpern für jedes gewünschte Ziel screening. Nachdem Sie ein primärer Antikörper ausgewählt hat, ist es auch wichtig zur Validierung des Systems für eine Reihe von verschiedenen Bindungsstellen des Protein-Ziel gegebenenfalls. Counter-Screening für Verbindungen, die mit dem Assay-Signal stören, wie in Abbildung 2 dargestellt, durch den Verzicht auf der Hitze-Herausforderung ist ausdrücklich erwünscht. Wenn eine reduzierte Signal in Gegenwart eines Liganden beobachtet wird, kann eine Antigen-Retrieval-Protokoll wie im Schritt 5.2 beschrieben getestet werden. Ungleichmäßige Erwärmung der Platten kann Schwankungen und Platte-Platte-Variationen in den beobachteten Daten verursachen. Da die Platten teilweise während der vorübergehenden Hitze Challenge (Schritt 3.4) in einem Wasserbad eingetaucht bist sind die äußeren Vertiefungen der Platten in das heiße Wasser nicht nur an der Unterseite der Brunnen, sondern auch durch die Außenwand ausgesetzt. Dies kann höheren Temperatur während der gleichen Zeit eintauchen in den äußeren Vertiefungen der Platte und anschließende Platte Randeffekte führen. Daher empfiehlt es sich, die äußere Vertiefungen der Platte zu vermeiden. Ähnliche Effekte können auch gesehen werden, wenn Luftblasen unter der Platte während der Heizung Schritt verhindert ausreichend Kontakt zwischen dem heißen Wasser und dem Boden der Brunnen gefangen sind. Angesichts der Herausforderungen mit Heizung Bildplatten, könnten Geräte und Platten speziell für Hitze diese Methode voraus. Wir haben die Verwendung von mehreren Zelllinien untersucht und Variabilität in Oberfläche Anlage nach der Hitze-Herausforderung für adhärente Zelltypen gefunden haben. Vorläufige Experimente in unserem Labor deuten darauf hin, dass die Verwendung einer Beschichtung oder extrazelluläre Matrix wie Synthemax II-SC oder Zelle-Tak Zelle Ablösung minimieren kann, aber dies eine technische Herausforderung darstellen könnte, Verwendung von semi-angeschlossenen Zelltypen. Da zusammengesetzte Behandlung in lebenden Zellen durchgeführt wird, müssen die kleinen Moleküle Zelle durchlässig sein. Wenn die Verbindung nicht Membran durchlässig ist, werden alternative Hochdurchsatzmethoden CETSA empfohlen. Einige Verbindungen metabolisch aktiviert werden, um an ihr Ziel-Proteine-11binden müssen. In solchen Fällen empfiehlt sich längere Behandlung Zellen mit der Verbindung vor der Hitze-Herausforderung.

Dieses Protokoll erfordert eine einzelne Platte aus Zelle Aussaat Imaging Hochdurchsatz-screening-Kampagnen zugänglich zu machen. Die Anzahl der Zellen für jedes Experiment ist wesentlich niedriger als mit western Blots erreicht werden kann oder vorherigen AlphaScreen assays15. Darüber hinaus werden waschen oder Zelle Ablösung Schritte, die zusammengesetzten Verfügbarkeit und verbindliche verändern können, entfernt, Erhaltung der etablierten verbindliche Gleichgewicht durch die Hitze Herausforderung Schritt. Im Gegensatz zu bisherigen Verfahren mangelnder Signal aufgrund der Zytotoxizität gleichzeitig auf nukleare Färbung berichtet. Zu guter Letzt bewahrt Bildgebung die räumliche Auflösung der Einzelzellen, zulassend Ziel Engagement Messungen in gemischten Populationen von Zellen oder Zellen Staaten.

Um die Anwendbarkeit des Konzepts wirklich beurteilen zu können, sind gemeinsame Anstrengungen der Technik über das schmelzende Proteom anwenden erforderlich. Solche Experimente klären die einfache Identifizierung von geeigneten Affinität Reagenzien, welcher Bericht selektiv auf das native Protein im Beisein der verbleibenden denaturiert und aggregierte Proteine. Wir wissen derzeit nicht, wie Proteingehalte Ausdruck beeinflussen die Fähigkeit, ein Signalfenster zuverlässig messen. Wir erwarten, dass dies zu reflektieren, Affinität und Selektivität der verfügbaren Antikörper, und erwarten, dass für niedrige reichlich Proteine Technologien verwendet, um Signal in immunofluorescent Tests anwendbar ist. Alternativ könnte tagged Proteine oder funktionalisierten Verbindungen zur Erkennung in modifizierten Versionen des Protokolls beschrieben verwendet werden. Dieses Protokoll ist beschränkt sich auf Ziele, die schmelzen und für Interaktionen, wo eine quantifizierbare Stabilisierung beobachtet werden kann. Endogene Liganden können z. B. ein Protein in live Zelle Assays, stabilisieren die weitere Stabilisierung durch einen exogenen Liganden verhindern kann. Obwohl hier nicht erforscht, glauben wir, dass es Multiplex-anzeigen, die für das Studium der mehrere Ziele gleichzeitig zu ermöglichen, oder ein Ziel mit nachgeschalteten Effektoren möglich ist. Weitere Studien sind notwendig, um diese Aspekte von in Situ CETSA zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Angaben zu berichten.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen Infrastrukturunterstützung aus der Wissenschaft Leben Labor-und Karolinska Institutet. Die Autoren erkennen auch ein- und Gespräche mit Michaela Vallin, Magdalena Otrocka und Thomas Lundbäck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS) Medicago 09-9400-100
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013 for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908 fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody ThermoFisher Scientific A11008 secondary antibody
HCS CellMask Red stain ThermoFisher Scientific H32712 Cytoplasm stain
NP-40 Sigma-Aldrich 56741 for permeabilization
Hoechst stain 33342 Sigma-Aldrich B2261 nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose Sigma-Aldrich 6429 cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 cell culture media component
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 cell culture media component
Corning, breathable plate seal Sigma-Aldrich CLS3345 for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229] Abcam ab170099 primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates VWR 736-2044 imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates VWR 784201
Adhesive aluminum foil VWR 30127790
Peelable aluminium seal Agilent 24210-001 for PlateLoc
LY2228820 Selleckchem S1494 p38α inhibitor
PH797804 Selleckchem PH797804 p38α inhibitor
BIRB796 Selleckchem S1574 p38α inhibitor
SB203580 Tocris 1202 p38α inhibitor
AMG 548 Tocris 3920 p38α inhibitor
RWJ 67657 Tocris 2999 p38α inhibitor
L-Skepinone CBCS compound collection p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate) BDH 44244 used in antigen retrieval
Glycine Sigma-Aldrich G8898 used in antigen retrieval
A-431 cells ATCC ATC-CRL-1555
Echo 550 Labcyte For preparation of compound plates
Plate sealer Agilent PlateLoc
Bulk reagent dispenser Thermo Scientific 5840300 Multidrop Combi
Automated liquid handling Agilent Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer Tecan Hydrospeed
Water bath Julabo TW12
Thermocouple VWR Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager Molecular Devices ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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