Skille bakterier av kapselen beløpet med usammenhengende tetthet gradering

Genetics
 

Summary

Vi viser bruk av usammenhengende tetthet forløpninger skille bakteriell populasjonene basert på kapselen produksjon. Denne metoden brukes sammenligne kapsel avstanden mellom kulturer, isolere mutanter med en bestemt kapsel fenotype eller identifisere kapsel regulatorer. Beskrevet her er optimalisering og kjøre til analysen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feltwell, T., Dorman, M. J., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient. J. Vis. Exp. (143), e58679, doi:10.3791/58679 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Capsule er en nøkkel virulens faktor i mange bakteriell arter, formidling immun evasion og motstand mot ulike fysiske påkjenninger. Mens mange metoder er tilgjengelig å kvantifisere og sammenligne kapsel produksjon mellom ulike stammer eller mutanter, det finnes ingen brukte metode for sortering bakterier basert på hvor mye capsule de produserer. Vi har utviklet en metode for å skille bakterier av kapselen, bruker en usammenhengende tetthet gradering. Denne metoden brukes til å sammenligne kapsel beløp semi kvantitativt mellom kulturer, isolere mutanter med endrede kapsel produksjon og rense capsulated bakterier fra komplekse eksempler. Denne metoden kan også kombineres med transposon-innsetting sekvensering å identifisere tilblivelse involvert i kapselen regulering. Her er metoden demonstrert i detalj, inkludert hvordan å optimalisere gradient betingelsene for en ny bakterie-art eller stamme, og hvordan å konstruere og kjøre tetthet graderingen.

Introduction

Mange bakteriell arter produsere en polysakkarid kapsel som beskytter bakteriell cellen fra forskjellige fysisk stresset og anerkjennelse og drap av immunsystemet. Klebsiella pneumoniaeer kapsel produksjonen en absolutt forutsetning for infeksjon1,2. K. pneumoniae kapsel formidler motstand mot antimikrobielle peptider, motstand mot komplement-mediert drapet, forebygging av fagocytose og undertrykkelse av medfødte immunforsvaret3. Overskytende kapselen produksjon er assosiert med økt virulens og markedsstøtte ervervet (i stedet for nosocomial) infeksjoner4.

En rekke kvantitative og kvalitative tester er tilgjengelig å undersøke kapsel produksjon. For Klebsiella arter inkluderer disse streng test5, der en tannpirker rørt til en koloni trekkes oppover og lengden på strengen produsert målt, og mucoviscosity analysen6, som innebærer langsomme sentrifugering av en kultur etterfulgt av måle den optiske densitet for nedbryting. Disse metodene er enkel og rask, men mangler følsomhet når den brukes på klassisk Klebsiella stammer kapsel overproducing stammer. En annen metode for kapsel kvantifisering er uronic syre analysen, som er teknisk utfordrende og krever bruk av konsentrert svovelsyre1. Til slutt, kapsel vises direkte av mikroskopi (figur 1A). Disse metodene bare mikroskopi tillater brukeren å observere forskjellige capsulation delstater enkelt innbyggere og ingen av disse metodene kan fysisk separasjon av capsulated og ikke-capsulated.

Tetthet-baserte separasjoner av gradient sentrifugering brukes rutinemessig i cell biology for å rense forskjellige eukaryote celle typer7, men brukes sjelden i mikrobiologisk forskning. Mucoviscosity analysen for Klebsiella er basert på observasjon at svært capsulated bakterier tar mer tid å pellets med sentrifugering, og vi tenkte at dette kan skyldes redusert samlede tetthet av capsulated celler. Metoden vist her ble utviklet for å skille K. pneumoniae bestander fysisk av kapselen beløpet ved hjelp tetthet gradert sentrifugering (figur 1). Denne metoden ble brukt til Streptococcus pneumoniae, som indikerer at det gjelder for andre bakterie-art. Tetthet-gradient separasjon av en mettet transposon mutant bibliotek sammen med transposon-innsetting sekvensering (tetthet-TraDISort) er brukt til å identifisere tilblivelse involvert i kapselen produksjon og regulering8. Tilsvarende denne metoden ble brukt i forbindelse med tilfeldig-prime polymerasekjedereaksjons (PCR) personlige kolonier isolere ikke-capsulated K. pneumoniae mutanter. Denne metoden kan også brukes for rask sammenligninger av kapselen mellom ulike befolkningsgrupper og forhold, eller å rense capsulated bakterier fra komplekse eksempler (figur 1B). Endelig er det kan analysen andre fenotyper som påvirker tetthet, for eksempel cellestørrelsen eller samling.

Dette manuskriptet viser hvordan å optimalisere fremgangsmåten for en ny bakterie-art eller belastning og demonstrerer bygging og drift av en usammenhengende tetthet gradert skille hyper-capsulated, capsulated og ikke-capsulated.

Protocol

Merk: Kontroller at alle risikovurderinger gjelder for bakteriell stammer følges når dyrking og håndtering prøver. Vær oppmerksom som definerer mange graderinger samtidig kan føre til muskel lidelser på grunn av press på leddene fra den langsomme pipettering involvert. Planlegge arbeidet og ta forholdsregler for å unngå skader.

1. utarbeidelse av bakteriell stammer eller Mutant biblioteker

  1. Strek ut stammene skal testes på riktig agar plater. Dette er lager plater for eksperimentet.
    1. Inkuber platene overnatting på ønsket temperatur å oppnå enkelt kolonier. For dette eksperimentet, kultur K. pneumoniae (NTUH-K2044 og ATCC43816 stammer) på Luria kjøttkraft (LB) agar 37 ° C og S. pneumoniae (23F wild type og 23F Δcps) på blod agar i en fuktet stearinlys krukke på 37 ° C.
  2. Velg en enkelt koloni fra et lager plate (trinn 1.1) å vaksinere 10 mL av aktuelle kjøttkraft bruker et sterilt loop eller cocktail pinne. For screening av tilfeldige mutant biblioteker, vaksinere suppen med 10 µL av tilfeldige mutant biblioteket aksjer (TraDIS biblioteket).
    1. Inkuber K. pneumoniae stammer i lav salt LB medier på 37 ° C med skjelvende og S. pneumoniae stammer i hjernen hjertet infusjon (BHI) medier, statisk på 37 ° C.
    2. Overføre overnatter kulturen til en 15 mL rør og sentrifuger i en benk toppen centrifuge for 10 min 3200 x g i sving ut bøtter med 15 mL tube innlegg og aerosol tett lokk.
    3. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 2 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
      Merk: Kast supernatant via den aktuelle flytende biologiske avfall ruten i laboratoriet. Formålet med sentrifugering og rørets trinnene (1.2.2 og 1.2.3) er å konsentrere bakterier for enkel visualisering på graderingen. Bakteriekulturer kan lastes direkte på graderingen foretrekkes. Tungt capsulated stammer kan ikke danne tett pellets. Hvis dette skjer, fjerne nedbryting så mye som mulig uten å fjerne alle bakterielle celler, Legg 1 x PBS til et siste volum 5 ml og resuspend pellet. Fortsette protokollen trinn 1.2.5.
    4. For ikke-mucoid stammer, gå til trinn 2.
    5. Sentrifuge rør som beskrevet i trinn 1.2.2.
    6. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 2 mL 1 x PBS. Cellene er nå klar til bruk.
      Merk: Tettheten av bakteriell celle suspensjon er ikke kritisk, men må være tilstrekkelig for visualisering i forløpningen. En minimum OD600 (optisk tetthet på 600 nm) 4 foreslås.

2. forberedelse av Gradient fortynninger og mini gradering Test

  1. Forberede gradient fortynninger.
    Merk: Nøyaktig konsentrasjoner av tetthet gradert medium (f.eksPercoll) behov i tetthet forløpninger å oppnå god separasjon vil variere avhengig av bakteriell belastning og vekst betingelsene brukes. Mini gradering testene utføres først for å identifisere konsentrasjonene som vil gi best separasjon. Dette omfatter 500 µL av en enkelt fortynning i en 2 mL tube. Hvis bakterier blir Hentet fra gradient og subcultured for nedstrøms programmer, bør disse trinnene utføres under aseptiske forhold.
    1. Kombiner tetthet gradert medium med 1 x PBS gjøre tetthet gradert fortynninger. Gjøre fortynninger av 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% og 80% (f.eks, 2 mL tetthet gradert medium pluss 8 mL 1 x PBS = 10 mL av 20% tetthet gradert medium).
    2. Aliquot 500 µL av 20% gradient fortynning i en 2 mL tube for hver stamme skal testes (f.eks, 4 stammer = 4 rør som inneholder 500 µL av 20% gradient fortynning).
    3. Gjenta trinn 2.1.2 for resten av de graderte fortynninger.
  2. Bruke bakterier på graderingen.
    1. Bruke 100 µL av bakterieceller i trinn 1.2.3 og 1.2.6 til toppen av hver forløpning fortynning følge trinnene nedenfor.
      1. Tar opp 100 µL av celler med en 200 µL pipette og plassere pipette på siden av røret bare under meniscus på mini graderingen.
      2. Sug opp bakterieceller på graderingen ekstremt sakte slik at de danner et lag på toppen av gradient, uten blanding av grensesnittet.
      3. Gjenta trinn 2.2.1.1–2.2.1.2 for alle stammer skal testes.
    2. Bruker en fast vinkel rotor med en aerosol tett lokk, sentrifuge forberedt rør i en microcentrifuge for 10 min 8000 x g.
    3. Etter sentrifugering, overføre rør til stativet for å visualisere minimum gradient fortynning må beholde celler like over gradient laget etter sentrifugering.
    4. Hvis resultatene ikke er klare, gjenta mini gradering testen med intervaller på 5% tetthet gradert middels fortynninger over og under konsentrasjonene som er definert i trinn 2.1.1 (f.eks, 25% og 35% fortynninger bør testes hvis resultatet på 30% er tvetydig).
      Merk: Se figur 2A for typiske resultater på en enkelt tetthet gradert middels fortynning.
    5. Bruk resultatene fra trinn 2.2.3–2.2.4 for å finne de ideelle gradient fortynninger bruke skille celler i større skala usammenhengende graderinger.

3. forberedelse av celler for viktigste eksperimentet

  1. Klargjør friske over natten kulturer ved vaksinere 10 mL av aktuelle kjøttkraft som beskrevet i trinn 1.2.
    1. Inkuber kulturer over natten i riktig forhold som beskrevet i trinn 1.2.1.
    2. Pellets natten kultur som beskrevet i trinn 1.2.2.
  2. Vask cellene som beskrevet i trinn 1.2.3.
  3. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 1 mL 1 x PBS. Hvis belastningen er mucoid og ikke pellets lett, resuspend av pellets i opptil 2 mL PBS eller gjenværende media. Cellene er nå klar til bruk.

4. forberedelse av usammenhengende tetthet forløpninger

Merk: En alternativ metode for gradient forberedelse nedenfra (mest konsentrerte) til toppen (minst konsentrert) bruker en pipette er beskrevet i trinn 7.

  1. Pipetter 1 mL av mest fortynne tetthet gradert fortynning i en 5 mL polypropylen rundt bunnen rør til det beste, mest fortynnet, laget av graderingen.
    Merk:
    etterfølgende lag av mer konsentrert gradient fortynninger legges under dette laget som bruker en nål, for ikke for å forstyrre lagene. Minimum to og maksimum tre gradient lag 1 ml anbefales for robust separasjon og lett visualisering av bakterier.
    1. Bruke en 1 mL disponibel sprøyte med en 1,5 tommers nål knyttet, ta 1 mL av den neste mest konsentrerte tetthet gradert middels fortynning i sprøyten. Unngå å ta opp noen luft, som bobler kan forstyrre gradient lag.
    2. Plassere p enden på bunnen av røret som inneholder det første laget. Sug opp innholdet sprøyte veldig sakte for å unngå å blande grensesnittet.
      Merk: Grensesnittet av de to fortynninger vil stige mer konsentrert gradient fortynning legges. Observere grensesnittet ved å holde det til lys eller en utenfor vinduet. Hvis ingen tydelig grensesnitt er observert, forkaste graderingen og starte på nytt.
      1. Fjern nålen fra gradient svært forsiktig for ikke for å forstyrre grensesnittet mellom de ulike gradient fortynninger. Sett røret i et egnet stativ å holde den oppreist.
    3. Hvis bruker tre ulike fortynninger, Gjenta trinn 4.1.1–4.1.2.1 slik at den tetteste fortynning er nederst. Hvis graderingen er konstruert lykkes, vil det være tre forskjellige sjiktene med ingen blande i grensesnittene.

5. legge forberedt celler graderinger og separasjon av sentrifugering

  1. Legge til 600 µL forberedt celler fra trinn 3.3 øverst på graderingen i røret veldig langsomt og uten blande grensesnittet, som beskrevet i trinn 2.2.
  2. Plassere rør i rør adaptere og veie kombinert adaptere og rør for å sikre de er balansert.
    1. Sett røret kortene i en fast vinkel rotor innenfor en benk toppen sentrifuge. Sentrifuger i 30 min 3000 x g.
    2. Etter sentrifugering, nøye fjerne rør, plassere dem i et egnet stativ og fotografere resultatene som en post.
  3. Gjenopprette bakteriell fraksjoner for uronic syre kvantifisering eller DNA utvinning ved å følge trinn 6.
    1. Hvis nedstrømsapplikasjoner ikke er nødvendig, kast den prøver/graderinger via den aktuelle flytende biologiske avfall ruten i laboratoriet.
      Merk: Det er viktig å validere separasjon for nye arter/stammer av bakterier. Individuelle fraksjoner graderingen bør undersøkes av mikroskopi, uronic syre analysen (trinn 8) eller et annet passende kvantitative analysen å bekrefte kapsel fenotypen av hver fraksjon. Hvis målet er å skille basert på aggregasjon eller cellestørrelsen, benyttes uavhengig riktige analyser.

6. gjenopprette eksempel brøker og valgfrie utvekst trinn

  1. Gjenopprette fraksjoner fra en forløpning ved å fjerne og fjerne væske fra den øverste fortynning hvis ingen bakteriell brøkdel finnes i laget.
    1. For å fjerne topp brøkdel, bruke en P200 pipette forsiktig passere pipette spissen gjennom gradient til brøk og ta opp brøken. Plasser brøken i en 1,5 mL tube og Merk korrekt.
    2. Å komme seg videre fraksjoner, fortsatt bruker P200 pipette, sett på spissen forsiktig gjennom gradient til brøk og gjenopprette brøken til en frisk 1,5 mL tube. Fjern overflødig gradering som fraksjoner lavere ned gradient åpnes.
    3. Hvis DNA utvinning fra en brøkdel som inneholder svært lav cellen tallene er nødvendig (f.eks for tetthet-TraDISort), subkultur brøkdel av følger protokollen fra trinn 6.2 for valgfrie utvekst å få flere celler.
      Merk: Det vil være et lavt nivå av carryover fra celler øverst på forløpningen i lavere fraksjoner, som brøker fjernes fra topp til bunn. Minimere denne ved forsiktig for ikke å blande gradient, ved hjelp av en nål fjerne lavere fraksjoner, og utføre re-rensing av svært lav overflod prøver der carryover kan påvirke resultatene.
  2. Overføre celler fra lav-overflod brøkdel utvinnes i trinn 6.1.1–6.1.2 i 5 mL av flytende mediefil. Plasser i en inkubator og vokse for 2t på 37 ° C.
    1. Etter 2 timer med vekst eller når prøven har nådd et OD600 1, overføre kulturen til en 15 mL tube. Sentrifuge røret i 10 min 3200 x g i en sentrifuge med swing bøtter og aerosol tett lokk. Forkaste nedbryting
    2. Resuspend celle pellet i 1 mL 1 x PBS.
  3. Forberede en fersk singel-konsentrasjon tetthet gradert i et 5 mL polypropylen rør. Bruke gradient konsentrasjonen fra like over plasseringen av fraksjon i den originale forløpningen (f.eks for rensing av ΔslyA mutant vist i figur 2D, 15% tetthet gradert medium brukes).
    Merk:
    denne re-rensing er valgfritt.
    1. Bruke cellene til toppen av gradering og sentrifuger som beskrevet i trinnene 2.2 og 5.1.
    2. Fjern rørene fra sentrifuge og plasser i en passende stativ. Fotografere graderingen og gjenopprette brøken for DNA utvinning som beskrevet i 6.1-6.1.2.
      Merk: Prøven er nå klar for DNA utvinning og andre nedstrøms programmer.

7. alternativ metode for Gradient forberedelse nedenfra (mest konsentrerte) til toppen (minst konsentrert) bruker en Pipette

  1. Bruk graderte fortynninger i trinn 2.2.3. Bruker en 1000 µL pipette, Legg 1 mL av den tetteste gradient fortynning slik 5 mL.
    1. Bruker en 200 µL pipette, legge 200 µL av neste tett gradient fortynning veldig sakte til toppen av laget i røret, for ikke å blande grensesnittet. Legge til en annen 200 µL og deretter den endelige 600 µL. legge til flere mindre volumer gir mer kontroll over pipettering hastighet og hindrer blanding av grensesnittet. Hvis grensesnittet mikser, forkaste og starte på nytt.
    2. Gjenta trinn 7.1.1 med tredje, minst tett gradient konsentrasjonen hvis tre fortynninger brukes. Røret skal nå ha graderinger 2 mL eller 3 mL avhengig av resultatene fra trinn 2.2.3.
    3. Gå til trinn 5 av protokollen for å legge til celler og fortsette eksperimentet.

8. måling av kapselen beløpet av Uronic Acid analysen

  1. Justere OD600 hver gjenopprettede brøkdel 4.0 ved fortynning med PBS. Fortsett med kvantifisering av uronic syrer som er publisert tidligere1.

Representative Results

Representant resultater er vist i figur 2. Nøyaktige resultatet du kan forvente vil avhenge av bakteriell arter, av tetthet forløpninger, og om brukeren undersøker en enkelt belastning eller en pool av mutanter. De fleste stammer vil migrere til ett sted i en gradering, som vist i figur 2A og 2D. Bruke metoden til en bakteriell mutant biblioteket vil gi opphav til bandet over gradient, en mindre tett band distribueres gjennom det øverste laget av gradient, og en mindre acapsular brøkdel nederst (figur 2B). Disse fraksjoner forskjellige kapsel beløpet som vist av en analysen for uronic syrer (figur 2B). Transposon innsetting sekvensering av personlige fraksjoner gir klart lokalisering av bestemte mutanter innen forskjellige gradient fraksjoner, som vist for kapsel biosyntesen locus K. pneumoniae ATCC43816 (figur 2C). Representant resultatene for ren kulturer av K. pneumoniae NTUH-K2044 og S. pneumoniae, og ulike kapsel biosyntesen eller regulatoriske mutanter, er vist i figur 2D.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk av tetthet sentrifugering metoden å skille bakterier basert på kapselen, og dens anvendelser. (A) et elektronmikroskop bilde av en capsulated Klebsiella pneumoniae celle. Kapselen er synlig som et tett lag på utsiden av cellen. (B) anvendelser av tetthet sentrifugering til studiet av capsulated bakterier. (Bi) Tetthet separasjon kan brukes til å generere høy - lav- og nei-kapsel brøkdeler av et transposon mutant bibliotek og etterfulgt av transposon innsetting sekvensering å definere gener som påvirke kapsel produksjon. (Bii) Rensing av capsulated bakterier fra et omfattende utvalg. (Biii) Bruk tetthet-baserte separasjon for rask sammenligninger av kapselen avstanden mellom eksempler. Denne metoden tillater også visualisering av heterogene kapsel produksjon bakteriell bestander, som vist i (Biii). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant resultater. (A) eksempel på utdata fra mini gradering tester. To forskjellige K. pneumoniae stammer var sentrifugeres på 1 mL av 15% tetthet gradert medium. Hypermucoviscous NTUH-K2044 belastning beholdes over tetthet gradert middels laget, mens ATCC43816 (som gjør mindre kapsel) overfører nederst på laget. (Bi) Bruk av tetthet gradering å dele et transposon mutant bibliotek i tre fraksjoner. Merk at nederst delen inneholder en lav andel av mutanter og er ikke synlig på dette bildet. (Bii) Validering av forskjellige kapsel beløp i toppen, midten og bunnen brøker med analysen for uronic syrer. Celler fra øverste, midterste og Forvokst bunnen brøker ble isolert og resuspended i PBS et OD600 4, så kapsel polysakkarider trukket ut og uronic syren målt1. (C) eksempel tetthet-TraDISort resultater. Mutasjon steder identifisert vises som blå linjer over kromosom diagrammet. Mutanter mangler capsule kan identifiseres som de som finnes i inndatabiblioteket men er oppbrukt i topp fraksjonen mens å være beriket i bunnen fraksjonen, som vist her kapsel biosyntesen locus8. (D) et eksempel på bruk av tetthet gradert sentrifugering sammenligne kapsel avstanden mellom wild type og mutant stammer av K. pneumoniae NTUH-K2044 og S. pneumoniae 23F. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Capsule er en viktig virulens faktor i mange bakteriell arter inkludert K. pneumoniae3, Streptococcus pneumoniae9, Acinetobacter10og Neisseria11 arter. Selv om det finnes ulike metoder for kvantifisering og visualisering av bakteriell kapsler, i dag er det ingen brukte metoden å fysisk separate capsulated og ikke-capsulated celler. I denne artikkelen har vi vist en robust metode for capsule-baserte separasjon av bakteriell befolkninger, med flere bruksmuligheter i forbindelse med forskjellige oppstrømshastighet eller nedstrøms protokoller.

Tilstedeværelsen av en overflate kapsel kan redusere bakteriell celle tetthet, som gir utskillelse av tetthet gradert sentrifugering (figur 2D). Vi har validert denne metoden i K. pneumoniae NTUH-K204412 og ATCC4381613 og Streptococcus pneumoniae 23F14 og dens Δcps mutant15. Denne metoden bruker Percoll16 som den viktigste bestanddel av tetthet gradient, som er en suspensjon av belagt kolloidal silika partikler som har lav viskositet og ingen toksisitet mot bakterier - i prinsippet andre stoffer møte disse kriteriene kunne brukes til å opprette tetthet graderingen.

Det kan være utfordrende å lag av forskjellig tetthet bland ikke når du konstruere tetthet forløpninger og hvis blande forekommer, metoden separasjon vil ikke gi ren resultater. Vi har tatt to alternative metoder for å helle forløpninger, med en nål eller en pipette-begge er effektiv, og hvilken metode du bruker er bare et spørsmål om preferanser. For alle trinnene som involverer pipettering et stoff (en bakteriell suspensjon, eller en mer fortynne gradient laget) over en gradient laget, kan pipettering Quidel mindre volumer gjøre det lettere å oppnå en skarp grensesnitt uten blanding av lag.

En begrensning av denne protokollen er at ytelsen med andre bakterie-art ikke kan garanteres. Derfor er det avgjørende når undersøke en ny bakterie-art eller å validere tetthet-baserte separasjon med en ekstra, uavhengige kapsel kvantifisering metode. Visualisere bakterier i hver fraksjon av mikroskopi med passende kapsel flekker er en pålitelig metode som detaljert protokoller er tilgjengelige17. Kapsler som inneholder uronic syrer (slik som Escherichia coli og K. pneumoniae) Alternativt kan kvantifiseres av en bestemt analysen, som vist i figur 2B1. Sentrifugering-baserte mucoviscosity testen er ikke egnet som en uavhengig Valideringsmetode, som denne analysen er også avhengig av tettheten av bakterieceller.

En annen begrensning av denne metoden er at kapselen er svært følsomme for oppdrettsforholdene, og selv små endringer i vekst medium, temperatur, eller lufting kan påvirke resultatene av denne analysen. For å minimere problemet, kan forskere bruke et definert vekst medium eller en batch-konsekvent komplekse medium, holde alle andre vekst parametre like mellom eksperimenter og inkluderer aktuelle kontrollen stammer for å aktivere tolkningen av uventede resultater . Noen bakteriell kapsler er skjøre og kan skråstille fra cellen når kulturer er pipetted. For å unngå klippe av kapsler, bør kulturer centrifuged og resuspended mer enn to ganger under forberedelse for opplasting på graderingen. Om tap av kapselen under konsentrasjon av kulturer fortsatt problematisk, bakteriekulturer kan brukes på en tetthet gradert direkte, med et større volum av bakteriell suspensjon lagt om nødvendig for visualisering.

Fremtidige anvendelser av denne metoden er å bruke det på andre bakterie-art og bruke dette skillet i forbindelse med ulike oppstrøms og nedstrøms teknologier. I tillegg til tetthet-TraDISort8foreslår vi at tetthet gradert separasjon av capsulated bakterier kan brukes for isolering av mutanter med endrede capsule, for rensing av capsulated celler fra blandet kulturer eller komplekse eksempler, og for rask profilering av kapselen produksjon i flere stammer. Til slutt, kan denne teknologien brukes undersøke andre bakterielle fenotyper som aggregering.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske interesser å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Jin-Town Wang og Susannah Salter for stammer, og medlemmer av gruppen Parkhill for nyttig diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av Wellcome Sanger Institute (Wellcome grant 206194), og Sir Henry Wellcome doc. til F.L.S. (grant 106063/A/14/Z). M.J.D. støttes av en Wellcome Sanger Institute PhD Studentship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets Eppendorf 5810 718.007
Adapters for 15 mL tubes Eppendorf 5810 722.004
Fixed andgle rotor F-34-6-38 Eppendorf 5804 727.002
2.6 to 7 mL tube adapter Eppendorf 5804 739.000
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 Eppendorf 5424 000.460
2 mL tubes Eppendorf 0030 120.094
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086
5 mL polypropylene round bottom tube Falcon 352063
1 mL disposable syringe Luer slip Becton Dickinson 300013
AGANI Needle 21G Green x 1.5" Terumo AN 2138R1
P1000 pipette and tips
P200 pipette and tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Favre-Bonté, S., Licht, T. R., Forestier, C., Krogfelt, K. A. Klebsiella pneumoniae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infection and Immunity. 67, (11), 6152-6156 (1999).
  2. Bachman, M. A., et al. Genome-wide identification of Klebsiella pneumoniae fitness genes during lung infection. mBio. 6, (3), 1-9 (2015).
  3. Paczosa, M. K., Mecsas, J. Klebsiella pneumoniae: Going on the offense with a strong defense. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. 80, (3), 629-661 (2016).
  4. Shon, A. S., Bajwa, R. P. S., Russo, T. A. Hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae. Virulence. 4, (2), 107-118 (2014).
  5. Fang, C. -T., Chuang, Y. -P., Shun, C. -T., Chang, S. -C., Wang, J. -T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae. strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. The Journal of Experimental Medicine. 199, (5), 697-705 (2004).
  6. Lai, Y. -C., Peng, H. -L., Chang, H. -Y. RmpA2, an activator of capsule biosynthesis in Klebsiella pneumoniae CG43, regulates K2 cps gene expression at the transcriptional level. Journal of Bacteriology. 185, (3), 788-800 (2003).
  7. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), 1-10 (2014).
  8. Dorman, M. J., Feltwell, T., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. The capsule regulatory network of Klebsiella pneumoniae defined by density-TraDISort. (2018).
  9. Geno, K. A., et al. Pneumococcal capsules and their types: Past, present, and future. Clinical Microbiology Reviews. 28, (3), 871-899 (2015).
  10. Weber, B. S., Harding, C. M., Feldman, M. F. Pathogenic Acinetobacter: From the cell surface to infinity and beyond. Journal of Bacteriology. 1986, (6), 880-887 (2016).
  11. Mubaiwa, T. D., Semchenko, E. A., Hartley-Tassell, L. E., Day, C. J., Jennings, M. P., Seib, K. L. The sweet side of the pathogenic Neisseria.: The role of glycan interactions in colonisation and disease. Pathogens and Disease. 75, (5), 1-9 (2017).
  12. Wu, K. -M. M., et al. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiellapneumoniae. NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. Journal of Bacteriology. 191, (14), 4492-4501 (2009).
  13. Broberg, C. A., Wu, W., Cavalcoli, J. D., Miller, V. L., Bachman, M. A. Complete genome sequence of Klebsiellapneumoniae. Strain ATCC 43816 KPPR1, a rifampin-resistant mutant commonly used in animal, genetic, and molecular biology studies. Genome Announcements. 2, (5), (2014).
  14. Croucher, N. J., et al. Role of conjugative elements in the evolution of the multidrug-resistant pandemic clone Streptococcuspneumoniae Spain23F ST81. Journal of Bacteriology. 191, (5), 1480-1489 (2009).
  15. Croucher, N. J., et al. Selective and genetic constraints on Pneumococcal serotype switching. PLoS Genetics. 11, (3), 1-21 (2015).
  16. Pertoft, H., et al. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  17. Breakwell, D. P., Moyes, R. B., Reynolds, J. Differential staining of bacteria: Capsule stain. Current Protocols in Microbiology. 15, (1), 1-4 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics