Исследование генетических зависимостей с помощью анализов на основе ТРИФОСФАТЫ Cas9 конкурс

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Эта рукопись описывает основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 метод кластерного регулярно Interspaced короткие палиндром повторяет (ТРИФОСФАТЫ) для простого и оперативного расследования роли нескольких генов кандидат в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) пролиферации в параллельно. Эта техника является масштабируемым и может быть применен в других рак клеточных линий, а также.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Deshpande, A., Chen, B. R., Zhao, L., Saddoris, K., Kerr, M., Zhu, N., Mali, P., Deshpande, A. J. Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays. J. Vis. Exp. (143), e58710, doi:10.3791/58710 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Джин возмущений исследования широко используются для изучения роли отдельных генов в патогенезе бод. Для достижения полной гена срыв, многие из этих исследований сделали использовать сложные гена нокаут моделей. Хотя эти исследования с нокаут мышей предлагают элегантный и проверенные временем системы для расследования взаимоотношений генотип фенотип, быстрый и масштабируемый метод для оценки кандидата генов, которые играют роль в AML пролиферации или выживания в моделях ПФТ поможет ускорить параллельных допроса нескольких генов кандидата. Последние достижения в технологии изменения генома резко повысили нашу способность выполнить генетических возмущений в беспрецедентных масштабах. Одна такая система генома редактирования является основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 метод, который может использоваться для сделать быстрые и эффективные изменения в геноме целевой ячейки. Простоту и масштабируемость ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной ген-удаления делает его одним из самых привлекательных методов допроса большого числа генов в фенотипических анализов. Здесь мы представляем простой анализа с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9 при посредничестве ген нарушения в сочетании с высокой пропускной способностью на основе потока цитометрии конкуренции анализов расследовать роль генов, которые могут играть важную роль в распространении или выживания человека и мышиных ПФТ клеточных линий.

Introduction

В последние несколько десятилетий стали свидетелями многочисленных исследований было сосредоточено на выявлении вклад основные молекулярные пути в патогенезе острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Традиционно ген нарушения в клетках AML была выполнена с использованием условной нокаут мышей или шпильки короткие РНК (индуцируемый). В то время как нокаут мышей предлагают сложную систему для пространственно временной контроль ген-удаления, генерации мышей Нокаут гена трудоемкий, длительным и дорогостоящим. Кроме того ген просвечивание с помощью рекомбинации стратегии не легко масштабируемой; Эти стратегии не хорошо подходят для допроса нескольких генов параллельно. После открытия РНК интерференции методы для нокдауна эндогенного мРНК, используя малые интерферирующие РНК (siRNA) или индуцируемый многие группы началась с использованием методов РНК интерференции для расследования роли конкретных генов в борьбе с отмыванием денег. Поскольку мышиных и человеческие клетки AML сложно transfect методами традиционной липидных трансфекции, большинство исследований работает lentivirally или retrovirally кодировке индуцируемый для изучения функции генов в клетках бод. Недавнее открытие кластеризованной регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) и связанные Cas nucleases (ТРИФОСФАТЫ-Cas9) революционизировало ген ориентация технологии1,2,3. С помощью ТРИФОСФАТЫ-Cas9, конкретные гены или геномных регионов может быть удален, редактировать или с меткой эффективность и простота. ТРИФОСФАТЫ-Cas9-редактирование на основе гена теперь становится методом выбора для расследования взаимоотношений генотип фенотип в типах различных клеток, благодаря простоте, эффективности и широкого применения этой техники. Методы, основанные на ТРИФОСФАТЫ-Cas9 также становится методом выбора в борьбе с отмыванием денег, не только для допроса отдельных генов, но также, как способ для нескольких генов в выстроились или пула генетической экраны, направленных на расследование нескольких генов параллельно как потенциал AML-зависимости4,5,6.

В этой рукописи мы опишем простой конкурентных роста assay для измерения воздействия ген беспорядки на рост клеток ПФТ, основанный на стабильной ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной ген редактирования следуют высок объём проточной цитометрии. Этот метод является простой, эффективной и масштабируемой пропускной способности среднего экспериментов для изучения роли нескольких генов параллельно в клетках бод.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. создания AML клеток линии клоны с высоким выражением стабильных и активного Cas9

  1. Производство Cas9 Лентивирусы
    1. День 0:6 293T клетки Клемная 4 x 10 в 10 мл DMEM с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин и L-глютамина в 10 см блюдо культуры ткани в области биобезопасности уровня 2 (BSL2) сертифицированные капот культуры клеток. Поместите блюдо в инкубаторе 37 ° C.
    2. День 1: Покрытием 293T клетки должен быть 70-80% притока на 1 день. Выполните трансфекции, используя следующий протокол в послеобеденное время.
    3. Теплый трансфекции среднего, культуры средств массовой информации и трансфекции реагента до комнатной температуры. Размораживание всех требуемых плазмид для transfection.
    4. Mix 9 мкг psPAX2, 0,9 мкг pMD2.G и 9 мкг с 500 мкл трансфекции среды в 5 мл pLenti-Cas9 плазмид.
    5. Добавьте 1,7 мл среды трансфекции 14 мл круглая труба внизу. Добавьте 57 мкл Реагента трансфекции непосредственно в трансфекции среднего в трубе не прикасайтесь к стенке трубки.
    6. Аккуратно добавить смесь всего плазмида трансфекции реагент решение и смешайте нежно касания трубку на стороне. Инкубируйте смесь при комнатной температуре 20 – 30 мин. Тем временем измените носитель с семенами 293T пластины.
    7. Добавить смесь трансфекции каплям к пластине и осторожно покачайте пластину боком для эффективного смешивания. Место пластину в инкубаторе 37 ° C.
    8. День 2: Аспирационная супернатант от пластины трансфекции нежно что клетки не нарушается или смещены от пластины. Выбросите супернатант. Добавьте 10 мл свежего среде DMEM 10% путем сползать вниз осторожно от стороны пластины во избежание выбивании клетки.
    9. День 3: Собирайте вирус, содержащий супернатант от пластины трансфекции медленно, опираясь в стерильный шприц 10 см. После супернатант собирается в шприц, придают стерильные 0,45 мкм фильтром шприц и удерживайте шприц и фильтр более свежий, стерильные 15 мл полипропиленовые Конические трубки. Аккуратно окунуться шприц для фильтрации вирусов, содержащих супернатант через 0.45 мкм фильтром в 15 мл полипропиленовые Конические трубки.
    10. Хранить вирусный кондиционером среднего аликвоты по 2 мл в криопробирки 2 мл-80 ° c.
  2. Трансдукция ПФТ клеточных линий
    1. День -1: Развести 1 мг/мл рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмент складе до 10 мкг/мл с стерильных фосфат амортизированное saline (PBS). В Гуд культуры клеток BSL2 одобрил пальто культуры ткани лечение 6 хорошо плита с 2 мл раствора рабочей фрагмент содержит рекомбинантного человеческого фибронектин 10 мкг/мл. Оберните пластину в цепляются обертка, чтобы избежать потери на испарение и хранить при комнатной температуре на ночь.
    2. День 0: Оттепель вирусный супернатанта, содержащие Cas9. Аспирационная рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмент решение полностью с покрытием плиты непосредственно перед spinfection. Добавить 2 мл вирусных кондиционером среды с Cas9 к пластине и спина его на g 1300 x 90 мин при 35 ° C. Это помогает вирусные частицы, которые придают spinfected хорошо.
    3. Тем временем, граф клетки, чтобы быть преобразованы и спином вниз 2 х 106 клеток в 15 мл полипропиленовые Конические трубки. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 2 мл свежего культуры средств массовой информации.
    4. После spinfection удалить все вирусные супернатант из spinfected хорошо и отбросить. Ретровирусные частицы от супернатант хорошо прикреплены к нижней части spinfected. Это хорошо, добавьте 2 x 106 клеток высокомобильна в 2 мл среды из шага выше.
    5. Спиновые пластину снова на 1300 x g очень кратко (1 – 2 мин) достаточно, чтобы позволить клетки поселиться в нижней части. Установите пластины обратно в инкубаторе и оставить на ночь для трансдукции с spinfected вирусных частиц, прилагается к колодцу.
    6. День 1: В зависимости от плотности клеток, добавьте больше среднего transduced клеток, чтобы избежать разрастания.
    7. День 2: Поскольку плазмида pLenti-Cas9 маркер сопротивления Blasticidin, добавьте Blasticidin в дозе 10 мкг/мл transduced и untransduced (управления) MOLM13 или мыши MLL-AF9 лейкозных клеток для отбора Cas9 выражая клетки.
      Примечание: Blasticidin выбор Cas9-преобразованы MOLM13 или MLL-AF9 лейкозных клеток считается завершенным, когда были ликвидированы все клетки untransduced управления. Для клеточных линий, за исключением MOLM13 и MLL-AF9 лейкоз кривой отклика дозы должны быть выполнены перед этот эксперимент, так что оптимальная доза может применяться. Титрование вирусный супернатант могут также выполняться при низкой трансдукция ставки.
  3. Клон выбор высоких Cas9 выражая клеток.
    Примечание: Мы заметили, что в некоторых ПФТ клеточных линий, клон выбор не может быть необходимым: основная Cas9-Blasticidin выбран населения уже имеет высокую эффективность изменения генома. В этом случае можно пропустить шаг 1.3 и перейти к шагу 1.4 для оценки выражения Cas9 в клетках ПФТ массовых Cas9-blasticidin, Западный blotting. По-прежнему было бы важное значение для оценки эффективности редактирования гена в этих массовых Cas9-AML клеток (шаг 1.5) прежде чем приступить к конкуренции анализов. Мы предположить, что выбор одного высокого Cas9 клонов уменьшает изменчивости генома редактирования, который является особенно важным при тестировании ряда различных единого руководства РНК (sgRNAs).
    1. Выполните одноклеточных, своего рода Cas9-Blasticidin выбран MOLM13 и MLL-AF9 клеток лейкемии, отныне называется MOLM13-Cas9 и MLL-AF9-Cas9 клеток, соответственно, с помощью СУИМ сортировщик, содержащихся в капюшоне BSL2 одобрил. Сортировка может быть выполнена в 5 – 10 круглым дном культуры ткани 96 хорошо обработанные пластины.
    2. Однажды один MOLM13-Cas9 и клоны MLL-AF9-Cas9 были собраны и индивидуально именем, разверните 10 – 20 клоны с 10 мкг/мл Blasticidin в культуре средств массовой информации для обеспечения поддержания Cas9 выражения.
  4. Выражение проверить стабильного белка Cas9, immunoblotting.
    1. Сделайте ядерные экстракты всех клонов Blasticidin выбран MOLM13 и MLL-AF9 лейкоза, с использованием ядерных добыча комплект согласно протоколу производителя. Проверьте Cas9 выражение протеина с использованием анти флага м2 антитела с Cas9 в pLenti-Cas9 плазмиды связан с N-терминальный флаг epitope.
    2. Загрузите 50 мкг общего белка из каждой ядерной экстракт на 10%, бис-трис гель и Побегите гель на 120 V до верхней полосы хорошо отделены.
    3. Блокировать мембраны с 5% раствором молока в TBST буфер для 1 h.
    4. Проинкубируйте мембрану с 1:1,000 разбавления антитела анти флаг м2 в конечной концентрации 1 мкг/мл при температуре 4 ° C на ночь.
    5. Следующий день, Промойте мембрану с TBST буфер и проинкубируйте с ПХ конъюгированных анти мыши вторичное антитело на ослабление 1:5,000 (конечной концентрации 0,16 мкг/мл) при комнатной температуре в течение 1 ч.
    6. Промойте мембрану тщательно с TBST и развивать пятно с помощью ECL субстрата.
    7. Выберите 3 – 4 клоны с высшим выражением белка Cas9, как видно, Западный blotting для дальнейшего функционального анализа (рис. 1).
  5. Обеспечение высокой Cas9 активностью в отдельных клонов
    1. Подготовка лентивирусные супернатант от вектор кодирования sgRNA с sgRNAs, ориентация человека или мыши AAVS1-избежании локус, как описано в шаге 1.1.
    2. Передают Топ Cas9-выражая MOLM13 или MLL-AF9 лейкоз клоны с лентивирусные супернатант анти AAVS1 sgRNA, с помощью метода spinfection, описанного выше. Выберите с 2,5 мкг/мл Puromycin для 4 дней.
    3. Очищайте геномной ДНК от лейкемии клоны MOLM13-Cas9 или MLL-AF9-Cas9 после Puromycin выделение с соответствующих одичал тип элементов управления с использованием геномной ДНК добыча комплект в соответствии с инструкциями производителя. Использование 50 нг ДНК как шаблон для выполнения ПЦР с AAVS1_test_primers с помощью 2 x мастер смеси Taq-полимеразы и ПЦР программы, перечисленные в таблице 1.
    4. Запуск продукта ПЦР на 2% агарозном геле и гель Очистить полосе пары 268, используя набор извлечения геля согласно протоколу производителя. Сэнгер последовательности гель очищенный продукт PCR, используя праймер AAVS1_target-frag_F.
    5. Оцените эффективность редактирования путем сравнения AAVS1 отредактированы и wildtype последовательностей с использованием онлайн веб-инструменты (рис. 2).

2. клонирование и трансдукция sgRNAs в клетках AML-Cas9

  1. Средне-пропускная способность клонирование sgRNAs
    1. Дизайн 4-6 sgRNAs для гена интереса, используя веб-ТРИФОСФАТЫ дизайн программного обеспечения. Существует ряд ТРИФОСФАТЫ дизайн инструментов доступны онлайн такие, как http://crispr.mit.edu/ которые генерируют sgRNA последовательности на основе входной последовательности ДНК.
      1. Введите соответствующие сведения в поля со звездочками. Нажмите на целевой генома sgRNA дизайн. Вставьте в поле последовательность последовательности целевых объектов и нажмите на кнопку " Отправить ".
    2. Для клонирования в pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA выражение плазмида, вставьте нуклеотидов «CACC» в смысле oligo и «AAAC» для обратного дополняет антисмысловых oligo перед заказом. Порядок смешиванием и анти чувство oligos в плиту 96-луночных помечены Oligo-микс от компании синтеза олигонуклеотида.
      Примечание: Мы сделали использование pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W плазмида, который имеет BbsI ограничение сайт для sgRNA клонирования. В случае, если используются другие sgRNA выражение плазмид, свесы, используемые для sgRNA олигонуклеотидов должны быть изменены соответственно.
    3. Возьмите отдельный U 96-луночных днище помечены Отжига пластины. Сделать мастер смесь 1 мкл T4 ПНК, 1 мкл 10 x буфер лигирование T4 ДНК и 6 мкл воды на отжиг реакции.
    4. Мкл 8 мастер смеси для каждой скважины отжига пластины. Добавьте 1 мкл, 100 мкм, смысл и антисмысловых oligo (или 2 мкл смешанные чувства анти смысл oligos), главный микс. Пипетка 2-3 раза осторожно смешать хорошо, спина пластину кратко для получения смеси в нижней части скважины.
    5. Используйте следующие отжига программу на машине ПЦР: 30 минут при 37 ° C, 2 мин 30 сек при 95 ° C следуют медленного охлаждения до 22 ° C со скоростью 0,1 ° C/сек. После отжига, возьмите свежий 96-луночных тарелку помечены Разбавленным OligoMix. В этой плиты разбавляют фосфорилированных и отожженной oligos от выше реакции с водой (1: 200) с помощью многоканальных дозаторов.
    6. Digest 5 мкг pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W вектор с 1,5 мкл BbsI энзима ограничения (10 000 единиц/мл) с помощью соответствующего буфера при 37 ° C 2 h для линеаризации для перевязки позже.
    7. Возьмите свежие 96 хорошо тарелку помечены Лигирование пластины и добавить 20 нг BbsI переваривается pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W вектор одной скважины за желаемого sgRNA лигирование. К этому добавьте 2 мкл фосфорилированных, отожженная oligos от пластине Разведен OligoMix .
    8. Добавьте 1 мкл 10 x T4 лигаза буфера и 1 мкл фермента ДНК лигаза T4. Аккуратно Пипетка с многоканальные пипетки и инкубировать лигирование смеси при комнатной температуре в течение 2 ч.
      Примечание: Перешнуровка смеси могут храниться при-20 ° C для преобразования шаг позднее.
    9. Тем временем оттепели 90 мкл химически сведущее Escherichia coli клеток на льду 10 мин до конца шага перевязки.
    10. С помощью многоканальных дозаторов, сделайте 10 мкл аликвоты компетентных клеток в каждой скважине отдельной 96 хорошо пластины.
    11. Добавить смесь перевязка из шага 2.1.8 в хорошо содержащие сведущие клетки, Пипетка вверх и вниз осторожно и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
    12. Пипетка 5 мкл бактерии ДНК смесь непосредственно из выше реакции в 6 хорошо пластины, содержащий LB-агар с 100 мкг/мл ампициллина. Повторите для каждого преобразования реакций.
    13. Тарелка каждого преобразования реакции в отдельно помечены хорошо 6-ну пластины. Добавьте примерно 5 – 8 стеклянные бусины каждому хорошо и встряхнуть весь 6-ну пластины 8 – 10 раз в круговом движении.
    14. Выбрать один колоний 1 – 2 от каждой скважины с кончиком пипетки стерильные 20 мкл и полоска в тщательно помечены пятно на стерильные 10 см Петри с LB агар и 100 мг/мл ампициллина. После мелирование в пластину фунтов, просто выкинуть кончик для клон мелирование в 3 мл LB-ампициллина содержащих среды в 14 мл круглая труба внизу отмечена с соответствующим номером бактериальных клон.
    15. Отправить пластину бактериальных непосредственно для Сэнгер виртуализации вперед грунтом человека U6 промоутер.
    16. После подтверждения последовательности клонированной sgRNAs очищают ДНК из соответствующего 14 мл трубки с помощью мини-подготовка комплекта согласно инструкциям производителя.
    17. Измерьте концентрацию и качество каждого из мини парфюмерные спектрофотометром. Нормализация каждой мини-подготовка к концентрации 15 нг/мкл и пипетки в 96 хорошо плиту помечены sgRNA клоны пластины.
      Примечание: Эта пластинка может хранить при-20 ° C или используется непосредственно для приготовления вирус.
  2. Вирусная производство sgRNA конструкций и трансдукция
    1. Для производства sgRNA лентивирусные частиц в 96-луночных формате, выполните «индуцируемый/sgRNA/ORF высокой пропускной способности вирусный производства (96 хорошо) «протокол от платформы генетических возмущений (web портал GPP) широкой института (URL-адрес: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Resources/Protocols).
    2. Передача 200 мкл вирусных супернатант в стерильные пробирки и немедленно заморозить при температуре-80 ° С.
    3. День -1: Пальто плоское дно Non ткани Культура лечение 96 также пластины с 100 мкл рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмента в концентрации 10 мкг/мл в капюшоне культуры клеток BSL2. Оберните пластину с помощью цепляются обертка, чтобы избежать потери на испарение и оставить его на скамейке на ночь.
    4. День 0: Удалите фрагмент содержит рекомбинантного человеческого фибронектин из каждой скважины. Оттепель вирусный супернатант каждого sgRNA при комнатной температуре. 50 мкл вирусных супернатант от каждой трубы к каждому покрытием и трансдукция пластины. Спиновые трансдукции пластины на 1300 g x 90 мин при 35 ° C.
    5. В конце spinfection граф MOLM13-Cas9 (клон B3) клетки от культуры колбу. Используйте 10 000 ячеек на хорошо объема 100 мкл. Подсчет ячеек для всех скважин трансдукции, учитывая мертвого объема.
    6. После spinfection 90 мин удалите супернатант из всех скважин, используя многоканальные пипетки скорректирована по 50 мкл медленно наклоняя тарелку. 100 мкл культуры клеток MOLM13-Cas9 клон B3, чтобы каждый хорошо медленно скольжения вниз от обода.
    7. Спиновые пластину на 1300 x g на 2 мин при 35 ° C до пусть оседают на дно клетки. Передать плита класса инкубатора 37 ° C тканевой культуры.
    8. День 1: Добавьте 100 мкл свежих средних каждый хорошо содержащие sgRNA преобразованы Cas9-MOLM13 или Cas9-MLL-AF9 лейкемии клеток, таким образом, что окончательное средний объем составляет 200 мкл.

3. конкурентоспособные роста Assay

  1. День 3: 72 h (день 3) пост трансдукции, проверьте процент sgRNA, содержащие BFP клеток в каждой скважине подачей cytometry (СУИМ). Использование красителя жизнеспособность клеток Марк и исключить мертвые клетки из анализа.
  2. Далее, повторно покрытие доли клеток в новой скважины с свежие среднего после каждого СУИМ анализа во избежание разрастание в assay.
  3. Повторяйте каждые 2-3 дня анализ СУИМ проверить относительную долю BFP положительных (BFP + ve) клеток, по сравнению с BFP отрицательные (БПС ve) (рис. 3). Анализируйте процент положительных клеток BFP для каждой точки времени (с использованием FlowJo или аналогичного программного обеспечения для анализа FACS).
    1. Перетащите файлы Fcs для каждого образца FlowJo программного обеспечения. Дважды щелкните на любой один образец файла и сюжет дот-блот вперед разброса (FSC) против стороны точечной (SSC) с FSC по оси X и SSC на оси Y. Ворота всех клеток.
    2. Дважды щелкните на закрытом клетки и печати их на жизнеспособность пятно (на оси Y) vs. FSC высота (H) или области (A) дот-блот. Ворота жизнеспособность пятно отрицательные клетки (live).
    3. Дважды щелкните на закрытом живых клеток и сюжет BFP (на оси Y) vs. FSC (A) на оси X. Ворота BFP + ve клеток. Применить все эти ворота для всех образцов, перетащив выбранный образец для Всех образцов на вкладке группы .
    4. Щелкните Редактор таблиц , чтобы сделать таблицу анализа всех образцов. Перетащите BFP + ve рассчитывать от одного образца в таблице и нажмите на кнопку дисплей в Редактор таблиц для создания пакета отчета всех образцов с таблицей отображения процент BFP + ve клеток. Сохраните таблицу как xls.
  4. Рассчитать пропорциональное увеличение или уменьшение % BFP позитивных клеток в живых клеток населения с течением времени и сравнить этот показатель соотношения BFP позитивных клеток в sgRNAs управления (например Люцифераза, яичница или GFP sgRNA).
  5. Участок соотношение позитивных клеток BFP для различных sgRNAs, включая gene(s) интерес, а также элементы управления, используя день 3 в качестве базового.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В нашем исследовании мы сначала преобразованы MOLM13 человека ПФТ клеток линии, которая несет транслокации MLL-AF9 с высоким титр вируса кодирования лентивирусные плазмида Cas9-blasticidin. В наших руках массовых несортированные MOLM13-Cas9 клетки не отображать выражение высокого уровня Cas9, Западный blotting и также не выполняют хорошо, когда assayed для эффективного редактирования-с помощью метода гена описано выше7. Таким образом мы приступили к созданию клонов одну ячейку и выбрать только клоны с высоким уровнем Cas9, как видно, западные blotting (рис. 1). Мы выбрали 2 различных клонов и преобразованы их с sgRNAs, ориентация на сайте в избежании Локус AAVS1 как описано ранее7. С использованием геномной ДНК, извлеченные из выбранных Puromycin MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA клоны, мы провели ПЦР с праймерами, охватывающих AAVS1 sgRNA, вырезать сайта и Сэнгер виртуализации конкретного продукта PCR 268 bp из 10 изолированной колонии для каждого клона MOLM13. После выравнивания с родительской последовательности мы обнаружили, что эффективность 100% (данные не показаны) MOLM13-Cas9 клон B3 и клон MLL-AF9-Cas9 8. Затем мы выбрали эти клоны, отображение высокая Cas9-опосредованной изменения генома возможности для наших sgRNA конкуренции анализов. Хотя эти исследования проводились, веб-инструменты для быстрого тестирования изменения генома эффективности от Сэнгер последовательности были разработаны различные группы, например ПРИЛИВА8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) или льда (https://ice.synthego.com/#/). Эти инструменты позволяют легко и экономически эффективно оценить изменения генома эффективность без необходимости для клонирования отдельных фрагментов и выполнить последовательность нескольких клонов. Таким образом массовая Cas9-выражая клетки сначала должны испытываться для редактирования с помощью этих методов эффективность генома. В случае, если изменения генома эффективность высока, затем одноклеточных клонирования не требуется. Кроме того в таком случае что одну ячейку клонирование как видно из нашего исследования, эти инструменты оценки веб-мутационного частоты предлагают гораздо быстрее метод для тестирования несколько клонов параллельно.

Для sgRNA клонирования, мы сделали использование клонирования плазмиды pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - sgRNA W, которая затаивает синий флуоресцентный белок (БПС) для отслеживания sgRNA преобразованы клетки и РНК полимеразой III-driven человека U6 промоутер, диски выражение Клонированная sgRNAs вместе с трассирующими эшафот РНК (tracRNA). Мы использовали эту систему для клонирования 2 sgRNAs против DOT1L, белок, известно, играют важную роль в эпигенетическую регуляцию экспрессии генов. DOT1L является гистона метилтрансфераза, что депозиты моно-, ди и tri метилирования в целевых генов9,10. Исследования показали, что DOT1L играет важную роль в AML, движимый MLL-фьюжн онкогенов. Таким образом DOT1L нокаут с помощью ТРИФОСФАТЫ-Cas9, как ожидается, привести к значительно ухудшить пролиферации клеток лейкемии MLL-AF9 мышь с учетом предыдущих исследований11,12,,1314. Мы использовали два sgRNAs ориентации Локус безопасной гавани AAVS1, который находится в Интрон гена PPP1R12C. sgRNAs производство геномных изменений в этот сайт не может иметь каких-либо эффектов на пролиферативную способность MLL-лейкоз клеточных линий. Как положительный контроль мы клонированные ориентации связанной репликации ген ДНК RPA3 sgRNAs. RPA3 является Пан эфирные ген, который показал важное значение для распространения нескольких ПФТ клеток линии4,15,16 . Анти-RPA3 sgRNAs поэтому отображения сильным анти пролиферативных эффектов в клетках AML и обычно используется в качестве позитивного элемента управления. После трансдукция с анти AAVS1 и анти RPA3 sgRNA плазмид, мы измерили относительная доля BFP + ve sgRNA преобразованы клетки по сравнению с их коллегами BFP-ve каждые 2-3 дня в культуре (рис. 3). С протоколом, описанных выше трансдукции MOLM13 или бод MLL-AF9 клеток приводит к 60 – 70% электромеханической эффективности с нашей вирусной подготовки, оставив остальные ячейки 30 – 40% untransduced или BFP-ve в каждый хорошо. Это позволяет для изучения распространения относительного изменения генома клеток с одичал тип клетки в том же хорошо. Пропорциональное увеличение или уменьшение в процент sgRNA преобразованы клеток был использован как мера отразить функциональный эффект sgRNA при посредничестве ген удаление в клетках MOLM13-Cas9. Если ваш гена интереса имеет важное значение для пролиферацию клеток ПФТ теста, затем sgRNA опосредованной срыв этого гена приведет к относительное уменьшение sgRNA выражая BFP + ve клетки по сравнению с БПС ve клетки в ходе анализа, в то время как sgRNAs ориентации Люцифераза, GFP или несущественных гены сохранит BFP + ve-ve соотношение с течением времени.

С помощью 2 отдельных анти RPA3 sgRNAs, мы наблюдали прогрессивного и значительное снижение в процентном содержании BFP + ve клетки по сравнению с БПС ve untransduced коллегами. Напротив доля sgRNA анти AAVS1, выражая BFP клеток остается относительно постоянным с течением времени, демонстрируя, что AAVS1 ориентации не влияет на пролиферацию клеток MOLM13 (рисунок 4a). Аналогичным образом в мыши MLL-AF9-Cas9 клеток, мы протестировали эффекты sgRNAs ориентации родопсина (Rho1), Джин пигментация глаз как отрицательный контроль и Dot1l, эпигенетических регулятор, известный для распространения MLL-AF9 лейкозных клеток со временем необходимо . В этом исследовании, BFP + ve MLL-AF9-Cas9 клетки мыши преобразованы с 2 отдельных анти DOT1L sgRNAs показали драматические и прогрессивные потери с течением времени, по сравнению с БПС ve sgRNA преобразованы клеток (рис. 4В). В противоположность этому отношение анти Rho1 sgRNA оставался относительно неизменным со временем. Эти результаты демонстрируют уязвимость MLL-AF9, выражая мыши лейкозных клеток к Dot1l истощение, подтверждающие ранее опубликованные результаты.

Figure 1
Рисунок 1: представитель западной помарке результаты показаны различные уровни Cas9. Для флага Cas9 выражение уровней с использованием антител против флага были зондируемой одной ячейки клонов MOLM13 бод клеточной линии преобразованы с CAS9. Клоны, показаны высшим выражением Cas9 были отобраны для дальнейшего изучения. Transfected клеток HEK293-T с Cas9 выражение плазмида были использованы в качестве позитивного управления и Cas9-преобразованы MOLM13 клетки как негативный контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель анализ изменения генома в локусе Dot1l, оценены ледовый анализа. Ампликон ПЦР, вокруг Dot1l sgRNA целевой сайт был Сэнгер виртуализации и анализируются с помощью анализа льда. Сравнение sgDot1l последовательности (оранжевая линия)-целевой последовательности ДНК (зеленая линия) демонстрирует высокий уровень редактирования эффективность в sgDot1l целевые клетки вокруг sgRNA целевого сайта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: схема рабочего процесса из предложенных методов. в sgRNA выражение вектор совместно выражая флуоресцентных белков, таких как BFP клонируются sgRNAs. Клетки-мишени преобразованы на 30 – 60% трансдукции ставки и следуют проточной цитометрии каждые 2-3 дня. sgRNAs ориентация генов, необходимых для пролиферации клеток ПФТ покажет относительного истощения со временем, как показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: представитель результаты анализов конкуренции в человека и клетки мыши AML. () результаты показывают статистически весьма значительное прогрессивное снижение RPA3 преобразованы MOLM13-Cas9 клон B3 клетки. В отличие от sgRNAs ориентации на AAVS1 сайте имеют никакого эффекта. (b) sgRNAs ориентации Dot1l показывают замечательные и прогрессивного снижение конкурентные распространения, в отличие от sgRNAs ориентации родопсина (Rho). p > 0,05. p < 0,05. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: общий обзор Протокола. () время для каждого этапа производства Cas9 вирус и sgRNA клонирования описал. Дизайн и клонирование sgRNAs может выполняться во время создания единого клоны ПФТ клеточных линий с стабильной Cas9 выражением. (b) общий протокол для трансдукции ПФТ клеточных линий с sgRNAs и пробирного конкурентных роста с помощью СУИМ показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Циклы Продолжительность цикла Температура
1 2 мин 95 ºC
35 30 s 95 ºC
30 s 55 ° C
30 s 72 ° C
1 5 мин 72 ° C
Удерживайте бесконечные 4 ° C

Таблица 1: ПЦР программа для AAVS1 Локус амплификацию геномных ДНК. ПЦР программа используется для усиления AAVS1 Локус от геномной ДНК для тестирования эффективности резки Cas9 в Cas9 выразить клонов.

Дополнительный файл: последовательности oligo sgRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой рукописи мы описываем подробный протокол для проведения пробирного ТРИФОСФАТЫ-Cas9 основе конкурентоспособных роста расследовать роль генов кандидата в AML клеточных линий с помощью проточной цитометрии в клетках человека/мышиных AML (рис. 5). Цель анализа требуется определить эффект удаления гена на поддержание пролиферации клеток ПФТ более двух-трех недель на пропускной способности среднего масштаба. Некоторые важнейшие шаги необходимо тщательно следовать для облегчения наращивания описанных протокола. В производстве Cas9 человека необходимо фильтровать вирус кондиционером среднего через 0.45 мкм фильтр, чтобы избежать уноса 293T клеток на вирус, содержащий супернатант. Во время spinfection упаковка spinfection табличка с цепляются обертка или парафина помогает избежать возможного загрязнения во время центрифугирования. Однако оберните следует удалить перед размещение плита spinfected обратно в инкубатор культуры ткани. Это очень важно для оценки выражения Cas9 клонов для редактирования эффективности. Клоны с низким геном редактирования эффективности отражают недостаточная активность Cas9 и может повлиять на успешность эксперимента. В наших экспериментах мы сначала преобразованы человеческих клонов Cas9 бод с sgRNAs против AAVS1 Локус и последовательность их геномной ДНК для редактирования эффективности. Сравнение AAVS1 отредактированы и wildtype последовательностей может быть оценена с помощью онлайн веб-инструменты, как ПРИЛИВА8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) или льда (https://ice.synthego.com/#/). Эти программы сравнения Сэнгер последовательности следы потенциально отредактированный ПЦР фрагментов в неотредактированных wildtype или ссылка последовательности и оценить частоту изменений. Это быстрый способ оценки мутационного изменения, вызванные sgRNA тест, который является мерой клеточной активности Cas9. Кроме того, клонирование PCR продукт в ПЦР клонирование плазмиды такие как TOPO тупым клонирования вектор может быть выполнена, следуют Сэнгер последовательности отдельных колоний оценить эффективность изменения генома, выравнивание последовательностей каждого клона для одичал тип. Мы предпочитаем первый метод, с учетом его простоты и эффективности затрат по сравнению с метод клонирования. Как правило, открытие базы пары изменяет такие точечные мутации, indels и т.д., или около sgRNA резки сайт в подавляющем большинстве виртуализированного клоны указывают на наличие весьма активных Cas9. Таким образом мы решили, что MOLM13 или MLL-AF9 лейкоз клоны B3 и 8, соответственно, с наивысшей эффективности редактирования для дальнейших экспериментов.

Мы разработали sgRNAs ориентации различных генов, упоминаемых в протоколе, с помощью http://crispr.mit.edu/, веб-программное обеспечение, которое дает список sgRNAs. Мы рекомендуем вам выбрать из списка Топ скоринг sgRNAs для того, чтобы устранить те с прогнозируемым пробить эффектов. Разработан sgRNAs можно клонировать с помощью любого из опубликованных протоколов, например на веб-сайте (http://www.addgene.org/67974/). Смысл и antisense oligos сначала фосфорилированных и термически обработанная согласно шаг 2.1.5. Первым шагом при 37 ° C имеет важное значение для phosphorylating oligos с T4 киназы и последующих циклов PCR важны для отжига в dsDNA смысл и анти чувство олигонуклеотидов. Важно иметь флуоресцентный белок в векторе sgRNA клонирования, которая имеет решающее значение для отслеживания sgRNA преобразованы клетки позднее в конкурсе анализов. sgRNA клонирования масштабируется с использованием 96 хорошо пластины на всех этапах, включая отжига и перевязки. Для перевязки чистый полоски Микропробирка ПЦР может использоваться также поскольку они совместимы с многоканальные пипетки. В случае, что требуется преобразование большего набора sgRNA клонов, 96-луночных пластины в котором 10 мкл сведущие клетки пре aliquoted в каждой скважине и замороженные при температуре-80 ° C может использоваться для ускорения всего процесса. Покрытие реакции перешнуровки предназначен для выбора отдельных колоний, который трудно выполнить в формате 96-луночных. Таким образом для бактериальных трансформации, есть небольшие потери в масштабируемости. Тем не менее даже для плакировки преобразования реакций от всего 96-луночных пластины, он потребует только в общей сложности шестнадцать 6-ну пластин для всего проекта. Надо быть осторожным в следующий шаг выбора колоний от преобразования пластины. Во время мелирование колонии в маркированных месте, убедитесь, что пятно явно изолирован от других мест. Маркировка квадратную сетку в нижней части Петри с темной перманентный маркер помогает предотвратить перекрестного заражения бактериальной клонов.

Как только готовы minipreps sgRNA конструкций, вирус может производиться в 96-луночных формате. На этом уровне пропускную способность это непрактично для фильтрации 200 мкл вирус, содержащий супернатант. Следовательно вирусный супернатант должны быть заморожены по крайней мере на ночь, чтобы избежать перекрестного загрязнения от любой 293T клеток, перенесены в надосадке. Он также может храниться в 50 мкл аликвоты в стерильную ПЦР-пробирку полосы, чтобы избежать замораживания оттаивания супернатант. Кроме того эти вирус кондиционером supernatants используются для преобразователя ПФТ клетки. В случае, если что низкие титры о вирусных трансдукции наблюдаются, как оценивается низкой частоты BFP + ve клетки, то это может быть важно определить титр вирусных и тестирования transductions на различных многочисленных инфекций (МВД) для обеспечения 40-60% трансдукция ставки. Титр вирусных решимость и мои вычисления описан подробно здесь17. В конкурсе assay как описано в шаге 3 протокола, это очень важно исключить нежизнеспособных клеток, чтобы предотвратить ложные артефакты от авто флуоресценции при анализе BFP не BFP соотношение. В то время СУИМ, прежде чем анализировать пробы настоятельно рекомендуется использовать BFP негативные и позитивные элементы BFP точно установить напряжения. В каждой точке повторно plating время объем клетки, чтобы быть повторно покрытием зависит от концентрации клеток в данный момент времени. Мы обычно повторно покрытием 20 мкл из в общей сложности 200 мкл в каждый момент времени в свежий колодец с 180 мкл свежей среды. Тщательного смешивания клеток, нежно закупорить вверх и вниз перед повторной покрытие настоятельно рекомендуется. Как правило, мы наблюдали, что assay должен осуществляться более 15-20 дней до уведомления сильные изменения в BFP + ve-ve коэффициенты, хотя это зависит от гена в геном.

Эта экспериментальная установка хорошо подходит для тестирования нескольких генов параллельно в нескольких ПФТ клеточных линий оперативно определить роль генов кандидата в выживания или пролиферацию клеток бод. Одно предостережение пробирного конкурентные распространения, описанные здесь является, что она не считает потенциал клеток внешние факторы, как паракринными сигнализации событий от целевых генов клеток, которые могут повлиять на популяции непромысловых клеток в течение того же хорошо. Хотя это может быть редким явлением, этот фактор следует учитывать при проведении этого анализа. Хотя мы использовали ПФТ в качестве примера для анализов на основе ТРИФОСФАТЫ-Cas9 конкуренции, описанные в этой рукописи, этот метод может использоваться для любой линии клеток рака для определения роли нескольких генов параллельно. Существуют различные преимущества ген удаление с помощью ТРИФОСФАТЫ-Cas9 за нокдаун гена с помощью РНК-интерференции. Во-первых в отличие от процессируются, который обычно демонстрируют широкий спектр целевых мРНК ингибирование, sgRNAs, в сочетании с Cas9 Нуклеаза осуществляют полный нокаут генов-мишеней. Это может привести к более драматический и последовательным фенотипы с основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 методами, даже несмотря на то, что необходимо предупредил, что определение эффективности отдельных sgRNAs, а также процессируются могут значительно отличаться.

Проба на основе потока цитометрии конкуренции предлагает несколько преимуществ перед традиционными распространения анализы, в которых покрыты фиксированное количество клеток для измерения относительной Пролиферативная активность клеток, возмущенных гена. Одним из преимуществ является, что относительная Пролиферативная активность клеток легко и быстро измерять подачей cytometry на несколько дней, минуя потребность клеток подсчета на каждом шагу покрытие. Это полезно при тестировании большое количество sgRNAs кандидата, против нескольких генов, как подсчет всех скважин является громоздкой и может привести к неточности. В отличие от СПС на основе измерения assays для роста клеток, проточной цитометрии может быть выполнена на выборке живых клеток, что делает этот метод полезен для долгосрочного анализа. Это особенно полезно в изучении факторов, таких как эпигеномные модуляторы, которые могут показать конца действия влияние на пролиферацию клеток ПФТ и может требовать долгосрочного анализов. Во-вторых наличие клеток не преобразованы в течение того же хорошо позволяет хорошо контролируемых клеток населения, которое может использоваться для задания базового плана для assay. В-третьих когда соединение в формате 96-луночных, assay почти полностью может проводиться с помощью многоканальных пипеток, существенно ускорить весь процесс от клонирования sgRNAs вирус подготовки, и в конечном итоге поток гранулярных оценки флуоресцирование.

Метод, описанный здесь может быть эффективно масштабировать вверх для расследования до 96 sgRNAs параллельно выстроились экране. Предполагая, 4 – 6 sgRNAs за гена, этот метод может использоваться таким образом для быстрого допроса по крайней мере 16 – 24 генов параллельно. В случае большего числа генов, например весь молекулярной путь, который должен быть допрошен в клетках AML пула на основе ТРИФОСФАТЫ-Cas9 экраны будет более полезным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

A.J.D является консультантом A2A Фармацевтика (Нью-Джерси) и Salgomed терапии (Сан-Диего). Другие авторы имеют конфликты не объявить.

Acknowledgments

Плазмиды pCW-Cas9 был подарок от Eric Lander и Дэвид Сабатини (плазмида # 50661 Addgene) и pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W плазмиды от Юса лаборатории (плазмида #67974 Addgene. Мы хотели бы поблагодарить проточной цитометрии ядро SBP медицинского открытия Института за своевременную помощь с анализа потока и сортировки. Мы хотели бы отметить поддержку леди Тата Мемориальный фонд до н.э. Мы хотели бы также отметить поддержку следующие источники финансирования: NIH/NCI Р30 CA030199 рака центр при поддержке гранта, Сан-Диего NCI рака центров (C3) и V-фонд #PTC2017to A.J.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FLAG-M2 Antibody sigma-aldrich F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody Invitrogen 31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo Fisher 34095
ChemiDoc Imaging System BIO RAD 17001401
Sorvall Legend RT centrifuge Thermo Scientific
Blasticidin Thermo Fisher R21001
SYTOX Red Thermo Fisher S34859
Opti-MEM Thermo Fisher 31985062
DMEM Thermo Fisher 11965-092
RPMI Thermo Fisher 11875-093
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher 25030081
Fetal Bovine Serum (FBS) SAFC 12303C
single gRNA vector Addgene #67974 pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit sigma-alorich NXTRACT
XtremeGENE 9 sigma-alorich 6365787001
Retronectin Takara T100B
Flow cytometer BD Biosciences
T4 PNK NEBioLabs M0201S
T4 DNA ligation buffer NEBioLabs B0202S
T4 DNA Ligase enzyme NEBioLabs M0202S
Ampicillin Fisher scientific BP1760-25
LB agar Fisher scientific BP9724-500
LB Broth Fisher scientific BP9731-500
Qiagen mini-prep kit Qiagen 27104
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3 Peprotech 213-13
Recombinant Murine IL-6 Peprotech 216-16
Recombinant Murine M-CSF Peprotech 315-02
Stable competent cells NEBiolabs C3040I
10 cm Tissue Culture dishes Fisher Scientific 353003
Cell lysis solution Qiagen 158906
Protein precipitation solution Qiagen 158910
DNA hydration solution Qiagen 158914
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
BbSI New England BioLabs R0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit Genessee Scientific 42-138
Puromycin Fisher scientific BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495949A
15 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495970C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10, (10), 957-963 (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, (6213), 1258096 (2014).
  3. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  4. Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33, (6), 661-667 (2015).
  5. Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6, (10), 1166-1181 (2016).
  6. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543, (7644), 270-274 (2017).
  7. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, (6121), 823-826 (2013).
  8. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46, (10), 58 (2018).
  9. Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25, (13), 1345-1358 (2011).
  10. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125, (4), 593-605 (2016).
  11. Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20, (1), 66-78 (2011).
  12. Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20, (1), 53-65 (2011).
  13. Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117, (18), 4759-4768 (2011).
  14. Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117, (25), 6912-6922 (2011).
  15. Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29, (1), 79-83 (2011).
  16. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, (6264), 1096-1101 (2015).
  17. Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics