Untersuchung der genetischen Abhängigkeiten mit CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays

Cancer Research

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Summary

Dieses Manuskript beschreibt eine gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt (CRISPR) CRISPR-Cas9-basierte Methode für eine einfache und rasche Untersuchung der Rolle der mehrere Kandidaten-Gene in der akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellproliferation in Parallel. Diese Technik ist skalierbar und kann in anderen Krebszelllinien angewendet werden.

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Deshpande, A., Chen, B. R., Zhao, L., Saddoris, K., Kerr, M., Zhu, N., Mali, P., Deshpande, A. J. Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays. J. Vis. Exp. (143), e58710, doi:10.3791/58710 (2019).

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Abstract

Gen Störung Studien sind weitgehend benutzt worden, um die Rolle einzelner Gene in AML-Pathogenese zu untersuchen. Für das komplette gen Störung erreichen, haben viele dieser Studien gemacht komplexe gen Knockout Modelle verwenden. Während dieser Studien mit Knockout-Mäusen eine elegante und bewährte System zur Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehung bieten, eine schnelle und skalierbare Methode zur Bewertung von Kandidatengenen, die spielen eine Rolle bei der AML Zellproliferation oder Überleben in AML Modelle hilft die parallele Abfrage des mehrere Kandidaten-Gene zu beschleunigen. Jüngste Fortschritte in der Genom-Bearbeitung Technologien haben unsere Leistungsfähigkeit genetische Störungen in nie gekanntem Ausmaß dramatisch verbessert. Ein solches System der Genom-Bearbeitung ist die CRISPR-Cas9-basierte Methode, die rasche und wirksame Änderungen im Genom Ziel-Zelle verwendet werden kann. Die Einfachheit und Skalierbarkeit der CRISPR/Cas9-vermittelte gen-Löschung macht es eine der attraktivsten Techniken für die Befragung einer Vielzahl von Genen in phänotypische Tests. Hier stellen wir einen einfache Assay mit CRISPR/Cas9 vermittelte gen-Störung kombiniert mit Hochdurchsatz-Flow-Zytometrie-based Wettbewerb Assays, um die Rolle der Gene, die eine wichtige Rolle bei der Verbreitung spielen kann oder das Überleben der Menschen zu untersuchen und murine AML-Zell-Linien.

Introduction

Die letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forschungsanstrengungen konzentriert sich auf die Ermittlung des Beitrags der wichtigsten molekularen Signalwege in der Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie (AML) gesehen. Traditionell wurde gen-Störung in AML Zellen mit bedingter Knockout-Mäusen oder kurze Haarnadel RNA (ShRNA) durchgeführt. Knockout-Mäusen bieten ein ausgeklügeltes System für die räumlich-zeitliche Steuerung von gen-Löschung, ist Generierung von gen-Knockout-Mäusen arbeitsintensiv, zeitaufwändig und teuer. Darüber hinaus gen-Knockouts mit Rekombination Strategien ist nicht leicht skalierbar; Diese Strategien eignen nicht sich gut für die Befragung mehrerer Gene parallel. Nach der Entdeckung der RNA Interferenz-Methoden, um Knock-down endogenen mRNAs mit kleinen interferierende RNA (SiRNA) oder ShRNA begannen viele Gruppen mit RNA Interferenz Techniken, um die Rolle bestimmter Gene in AML zu untersuchen. Da murine und menschlichen AML-Zellen sind notorisch schwierig zu transfizieren, mit traditionellen Lipid-basierte Transfektion Methoden, die meisten Studien angestellt lentivirally oder retrovirally-codierte ShRNA für Genfunktion in AML Zellen zu studieren. Die jüngste Entdeckung der gruppierten regelmäßig dazwischen kurzer palindromische Wiederholungen (CRISPR) und die zugehörigen Cas Nukleasen (CRISPR-Cas9) hat gen-targeting Technologien1,2,3revolutioniert. CRISPR-Cas9 verwenden, können bestimmte Gene oder genomische Regionen gelöscht, bearbeitet oder mit dem Stichwort Effizienz und Benutzerfreundlichkeit. CRISPR-Cas9-basierte gen-Bearbeitung taucht nun als die Methode der Wahl für die Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in unterschiedlichen Zelltypen aufgrund der Einfachheit, die Wirksamkeit und die breite Anwendbarkeit dieser Technik. CRISPR-Cas9-basierte Methoden sind auch immer die Methode der Wahl in AML, nicht nur für Abfragen einzelner Gene, sondern auch als eine Möglichkeit, mehrere Gene in angeordneten oder zusammengefasste genetische Schirme Ziel angestrebt untersucht mehrere Gene parallel als Potenzial AML-Abhängigkeiten4,5,6.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Konkurrenzfähigkeit Test zur Messung der Auswirkungen von gen-Störung auf das Wachstum der AML Zellen, basierend auf stabile CRISPR-Cas9-vermittelten gen-Bearbeitung gefolgt von Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie. Diese Methode ist einfach, effizient und skalierbar bis Medium-Durchsatz Experimente zur Untersuchung der Rolle von mehreren Genen in AML Zellen parallel.

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Protocol

1. Erzeugung von AML Linie Zellklonen mit hohe Expression von stabilen und aktive Cas9

  1. Produktion von Cas9 lentivirus
    1. Tag 0: Platte 4 x 106 293T Zellen in 10 mL DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Penicillin und L-Glutamin in einer 10 cm Gewebe Kulturschale in einem Biosafety Level 2 (BSL2) zertifiziert Zelle Kultur Haube. Legen Sie die Schale in einem Inkubator 37 ° C.
    2. Tag 1: Die vergoldeten 293T Zellen sollte 70 – 80 % Zusammenfluss am 1. Tag. Führen Sie die Transfektion mit das folgende Protokoll am Nachmittag.
    3. Erwärmen Sie die Transfektion Medium, Kultur, Medien und Transfection Reagens auf Raumtemperatur. Alle erforderlichen Plasmide zur Transfektion Auftauen.
    4. Mix 9 µg psPAX2, 0,9 µg pMD2.G und 9 µg von pLenti-Cas9 Plasmide mit 500 µL Transfektion Medium in eine 5 mL-Tube.
    5. 14 mL Runde Unterrohr 1,7 mL Transfektion Medium hinzufügen. Fügen Sie 57 µL Transfection Reagens direkt in die Transfektion Medium in das Rohr zu vermeiden, berühren die Wand des Rohres.
    6. Sanft Transfektion Reagenzlösung die gesamte Plasmid-Mischung hinzu und mischen Sie durch leichtes Klopfen die Röhre auf der Seite. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20-30 min. Unterdessen verändern Sie das Medium von der kernigen 293T Platte.
    7. Fügen Sie die Transfektion Mischung tropfenweise hinzu, bis auf den Teller und schütteln Sie die Platte seitlich für effizientes Mischen. Legen Sie die Platte in einem Inkubator 37 ° C.
    8. Tag 2: Aspirieren des Überstands von der Transfektion Platte vorsichtig so, dass die Zellen nicht gestört oder von der Platte vertrieben. Verwerfen Sie den überstand. Fügen Sie 10 mL frisches 10 % DMEM Medium durch Abrutschen sanft von den Seiten der Platte zu vermeiden, die Zellen verdrängen.
    9. Tag 3: Sammeln Sie das Virus mit Überstand von der Transfektion Platte langsam in eine sterile Spritze 10 cm zeichnen. Nachdem der Überstand in die Spritze gesammelt, die Spritze beimessen Sie ein Sterilfilter 0,45 µM und halten Sie die Spritze und Filter über eine frische, sterile 15 mL Polypropylen konischem Rohr. Vorsichtig tauchen die Spritze um das Virus mit Überstand durch den 0,45 µM-Filter in der 15 mL Polypropylen konischem Rohr zu filtern.
    10. Speichern Sie die viral bedingte Medium in Aliquote von 2 mL in 2 mL Cryovials bei-80 ° C.
  2. Transduktion von Zelllinien AML
    1. Tag-1: Verdünnen Sie 1 mg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment Lager um 10 µg/mL mit sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Mantel einer Gewebe-Kultur behandelt 6-well-Platte mit 2 mL 10 µg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment funktionierende Lösung in einer BSL2 genehmigt Zelle Kultur Kapuze. Wickeln Sie die Platte in Klarsichtfolie um Verdunstung und bei Raumtemperatur lagern über Nacht zu vermeiden.
    2. Tag 0: Auftauen des viralen Überstands mit Cas9. Aspirieren der rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment Lösung vollständig von der beschichteten Platte kurz vor Spinfection. Fügen Sie 2 mL viral bedingte Medium mit Cas9 auf den Teller und drehen Sie es 1.300 x g für 90 min bei 35 ° C. Dadurch werden die Viruspartikel, die Spinfected gut zu befestigen.
    3. Inzwischen zählen die Zellen ausgestrahlt werden und Spin-down 2 x 106 Zellen in einem 15 mL Polypropylen konische Rohr. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen das Pellet in 2 mL frische Nährmedien.
    4. Nach Spinfection auch die Spinfected den viralen überstand entfernen und entsorgen. Retroviralen Partikel aus der Überstand sind auch am unteren Rand der Spinfected befestigt. Nun, dazu die 2 x 106 Zellen in 2 mL Medium vom Schritt oben Nukleinsäuretablette.
    5. Drehen Sie die Platte wieder auf 1.300 X g sehr kurz (1-2 min) ausreicht, um die Zellen am unteren niederzulassen. Die Platte wieder in den Inkubator und lassen Sie über Nacht für die Transduktion mit der Spinfected Viruspartikel an dem Brunnen befestigt.
    6. 1. Tag: Je nach Zelldichte, fügen Sie mehr Medium zu den transduced Zellen Überwucherung zu vermeiden hinzu.
    7. 2. Tag: Seit das pLenti-Cas9-Plasmid Blasticidin Widerstand Marker, fügen Sie Blasticidin bei einer 10 µg/mL Dosis ausgestrahlt und untransduced (Steuerung) MOLM13 oder Maus MLL-AF9-Leukämie-Zellen für die Auswahl der Cas9 mit dem Ausdruck Zellen hinzu.
      Hinweis: Blasticidin Auswahl an die Cas9 ausgestrahlt MOLM13 oder MLL-AF9 Leukämie-Zellen gilt als abgeschlossen, wenn alle untransduced Kontrollzellen beseitigt worden sind. Für Zell-Linien als MOLM13 und MLL-AF9 Leukämie muss eine Dosis-Antwort-Kurve vor dieses Experiment durchgeführt werden, so dass eine optimale Dosis eingesetzt werden kann. Titration von der viralen überstand kann auch bei niedrig-Transduktion durchgeführt werden.
  3. Auswahl von High-Cas9 mit dem Ausdruck ihrer Zellen zu klonen.
    Hinweis: Uns ist aufgefallen, dass in einigen AML Zelllinien Klon Auswahl möglicherweise nicht notwendig: der größte Cas9-Blasticidin ausgewählt Bevölkerung bereits hat hocheffiziente Genom-Bearbeitung. In diesem Fall ist es möglich, Schritt 1.3 überspringen und fahren Sie mit Schritt 1.4 Cas9 Ausdruck in der Masse Cas9-Blasticidin AML Zellen durch westliche Beflecken zu beurteilen. Es wäre noch wichtig, gen-Bearbeitung Effizienz in diesen Massen Cas9-AML-Zellen (Schritt 1.5) bevor Sie fortfahren, die Wettbewerb-Assays zu bewerten. Wir vermuten, dass die Auswahl der einzelnen High-Cas9 Klone die Genom-Bearbeitung Variabilität, die besonders wichtig ist bei der Prüfung einer Reihe von verschiedenen einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) reduziert.
    1. Führen Sie eine einzelne Zelle Art der Cas9-Blasticidin über einen FACS-Sorter in einer BSL2 genehmigt Haube enthaltenen MOLM13 und MLL-AF9 Leukämiezellen bezeichnet MOLM13-Cas9 und MLL-AF9-Cas9 Zellen, bzw. ausgewählt. Sortieren kann in 5 – 10 Rundboden Gewebe-Kultur behandelte 96 well Platten durchgeführt werden.
    2. Einmal einzelne MOLM13-Cas9 und MLL-AF9-Cas9 Klone kommissioniert wurden und einzeln genannt, erweitern Sie 10 – 20 Klone mit 10 µg/mL Blasticidin in Kulturmedien, Cas9 Ausdruck zu gewährleisten.
  4. Ausdruck von stabilen Cas9 Protein durch Immunoblotting überprüfen.
    1. Nukleare Extrakte der Blasticidin ausgewählt-Klone von MOLM13 und MLL-AF9 Leukämie mit nuklearen Extraction Kit entsprechend des Herstellers Protokoll zu machen. Überprüfen Sie die Cas9-Protein-Expression mit Anti-Flag M2 Antikörper seit der Cas9 in das Plasmid pLenti-Cas9 mit einer N-terminalen Flagge Epitop verknüpft ist.
    2. Laden Sie 50 µg Gesamt-Protein aus jeder nukleare Extrakt auf 10 % Bis-Tris gel und das Gel bei 120 V laufen, bis die oberen Bänder sind gut getrennt.
    3. Blockieren Sie die Membran mit 5 % Milchlösung in TBST Puffer für 1 h.
    4. Inkubieren Sie die Membran mit 1:1,000 Verdünnung von Anti-Flag M2 Antikörper auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL bei 4 ° C über Nacht.
    5. Am nächsten Tag waschen Sie die Membran mit TBST Puffer und inkubieren Sie mit HRP konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper zu einer Verwässerung des 1:5,000 (Endkonzentration von 0,16 µg/mL) bei Raumtemperatur für 1 h.
    6. Die Membran mit TBST gründlich zu waschen und den Fleck mit ECL-Substrat zu entwickeln.
    7. Wählen Sie 3 – 4 Klone mit die höchste Protein-Expression von Cas9, wie gesehen von Western blotting für weitere Funktionsanalyse (Abbildung 1).
  5. Sicherstellung hohen Cas9 Aktivität in ausgewählten Klone
    1. Bereiten Sie Lentivirale Überstand aus einer SgRNA-encoding-Vektor mit Ausrichtung auf das menschliche SgRNAs oder Maus AAVS1 Safe-Harbor Locus wie in Schritt 1.1 beschrieben.
    2. Transduzieren oben Cas9 exprimierenden MOLM13 oder MLL-AF9 Leukämie-Klone mit der Anti-AAVS1 SgRNA Lentivirale überstand die oben beschriebene Spinfection-Methode verwenden. Wählen Sie mit 2,5 µg/mL Puromycin für 4 Tage.
    3. Genomischen DNA aus der MOLM13-Cas9 oder MLL-AF9-Cas9 Leukämie-Klone nach Puromycin Auswahl zusammen mit entsprechenden Wildtyp Steuerelemente mit dem Genomic DNA Extraktion Kit gemäß Herstellervorschrift zu reinigen. Einsatz 50 ng DNA als Vorlage eine PCR mit den AAVS1_test_primers mit 2 x master-Mix von Taq Polymerase und in Tabelle 1aufgeführten PCR-Programm ausführen.
    4. Führen Sie das PCR-Produkt auf einem 2 % Agarosegel und reinigen Sie Gel zu die 268 Basenpaaren Band mit einem Gel Extraction Kit entsprechend des Herstellers Protokoll. Sanger Sequenz das Gel gereinigt PCR-Produkt mit Hilfe des AAVS1_target-Frag_F-Primers.
    5. Bewerten Sie Bearbeitung Effizienz durch den Vergleich der AAVS1 bearbeitet und Wildtyp-Sequenzen mit online-Web-basierte Tools (Abbildung 2).

2. Klonen und Transduktion von SgRNAs in AML-Cas9 Zellen

  1. Medium-Durchsatz Klonen von sgRNAs
    1. 4 – 6 SgRNAs für das gen des Interesses mit einem Web-basierten CRISPR-Design-Software zu entwerfen. Es sind eine Reihe von CRISPR-Design-Tools online verfügbar wie beispielsweise http://crispr.mit.edu/ die SgRNA Sequenzen generieren auf eine Eingabe DNA-Sequenz beruhen.
      1. Geben Sie einen entsprechenden Informationen in Felder mit Sternchen. Klicken Sie auf das Ziel-Genom für SgRNA Design. Fügen Sie die Zielsequenz im Feld Sequenz ein , und klicken Sie auf die Schaltfläche " senden ".
    2. Für das Klonen in der pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W SgRNA Expressionsplasmid, die Nukleotiden "CACC" Sinn Oligo und "AAAC" auf der Rückseite ergänzt antisense Oligo voranstellen, vor der Bestellung. Bestellung vorgemischt und Anti-Sinn Oligos in eine 96-Well-Platte gekennzeichnet Oligo-Mix aus einer Oligonukleotid-Synthese-Unternehmen.
      Hinweis: Wir haben gemacht, Verwendung von pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W Plasmid, das Ortsbild BbsI Einschränkung zum Klonen von SgRNA hat. Für den Fall, dass andere SgRNA Ausdruck Plasmide verwendet werden, müssen die Überhänge für SgRNA Oligonukleotide verwendet entsprechend geändert werden.
    3. Nehmen Sie eine separate U 96-Well Bodenplatte Glühen Plattegekennzeichnet. Machen Sie einen master-Mix von 1 µL T4 PNK, 1 µL 10 x T4 DNA-Ligatur Puffer und 6 µL Wasser pro Reaktion glühen.
    4. Jede Vertiefung der Glühen Platte 8 µL des master-Mix hinzufügen. 1 µL von 100 µM, Sinn und antisense Oligo (oder 2 µL der gemischten Gefühl-Anti-Sense-Oligos) zu den master-Mix hinzufügen. 2 – 3 Mal Pipette vorsichtig gut mischen, drehen Sie die Platte kurz um die Mixe auf den Boden des Brunnen zu erhalten.
    5. Verwenden Sie das folgende Programm Glühen auf einer PCR-Maschine: 30 min bei 37 ° C, 2 min 30 s bei 95 ° C gefolgt von langsame Abkühlung auf 22 ° C in Höhe von 0,1 ° C/s. Nehmen Sie nach Tempern eine frische 96-Well-Platte Verdünnt OligoMixgekennzeichnet. In dieser Platte Verdünnen der phosphorylierten und geglühten Oligos aus der oben genannten Reaktion mit Wasser (1: 200) mit einer Mehrkanal-Pipette.
    6. Digest 5 µg des pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W-Vektor mit 1,5 µL BbsI Restriktionsenzym (10.000 Einheiten/mL) mit einer entsprechenden Puffer bei 37 ° C für 2 h es für später Ligatur linearisieren.
    7. Nehmen Sie frische 96-well-Platte, Ligation Platte etikettiert und fügen 20 ng der BbsI verdaut pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W-Vektor zu einem Brunnen pro gewünschten SgRNA Ligatur. Dazu fügen Sie 2 µL der phosphorylierten, geglühten Oligos aus Verdünnt OligoMix Platte.
    8. Fügen Sie 1 µL 10 x T4 Ligase Puffer und 1 µL T4 DNA-Ligase-Enzym. Vorsichtig mit einer Mehrkanal-Pipette pipette und den Ligatur-Mix auf 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
      Hinweis: Ligatur-Mischungen können bei-20 ° C für die Transformationsschritt später gespeichert werden.
    9. Unterdessen Tauwetter 90 µL chemisch kompetenten E. Coli Zellen auf Eis 10 min vor Ende der Ligatur Schritt.
    10. Mit einer Mehrkanal-Pipette, machen Sie 10 µL-Aliquots der zuständigen Zellen in jede Vertiefung eine separate 96-well-Platte.
    11. Die Ligatur Mischung aus Schritt 2.1.8 in die gut mit den zuständigen Zellen, Pipette rauf und runter sanft hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    12. Pipette 5 µL des Bakterien-DNA-Mix direkt aus den oben genannten Reaktionen in einem 6 gut Platte mit LB-Agar mit 100 µg/mL Ampicillin. Wiederholen Sie für jede der Umwandlung Reaktionen.
    13. Jede Transformation Reaktion in gesondert gekennzeichneten gut von einem 6-Well-Platte-Platte. Fügen Sie ca. 5 – 8 Glasperlen zu jedem gut und schütteln die ganze 6-Well-Platte 8 – 10 Mal in einer kreisförmigen Bewegung.
    14. Wählen Sie 1 – 2 einzelne Kolonien aus jedem Brunnen mit einer sterilen 20 µL Pipettenspitze und Streifen sie in eine sorgfältig gekennzeichneten Stelle auf eine sterile 10 cm Petrischale mit LB-Agar und 100 mg/mL Ampicillin. Nach Schlieren in der LB-Platte, einfach Auswerfen der Spitze verwendet für Klon Streifen in 3 mL LB Ampicillin enthaltenden Medium in einer 14 mL Runde Unterrohr mit der entsprechenden bakteriellen Klon-Nummer gekennzeichnet.
    15. Senden Sie die bakterielle Platte direkt für Sanger Sequenzierung mit menschlichen U6 Promotor forward Primer.
    16. Reinigen Sie nach der Sequenz Bestätigung des geklonten SgRNAs die DNA aus der entsprechenden 14 mL-Tube mit einem Mini-Prep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    17. Messen Sie Konzentration und Qualität der einzelnen Mini-Präparationen mit einem Spektralphotometer. Jeder Mini-Vorbereitung zu einer Konzentration von 15 ng/µL und Pipette in 96-well-Platte, gekennzeichnet SgRNA Klone Plattezu normalisieren.
      Hinweis: Diese Platte kann bei-20 ° C gelagert oder direkt zur Virus Vorbereitung verwendet werden.
  2. Virale Produktion von SgRNA Konstrukte und Transduktion
    1. Für die Herstellung von SgRNA Lentivirale Partikel in das 96-Well-Format folgen die "ShRNA/SgRNA/ORF Hochdurchsatz virale Produktion (96 gut)" Protokoll von der genetischen Störung-Plattform (GPP Web Portal) des Broad Institute (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Resources/Protocols).
    2. 200 µL virale Überstand auf sterilen Röhrchen übertragen und sofort bei-80 ° C eingefroren.
    3. Tag-1: Mantel einen flachen Boden Non-Gewebe Kultur behandelt 96 well-Platte mit 100 µL der rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment in einer Konzentration von 10 µg/mL in einer BSL2 Zelle Kultur Kapuze. Wickeln Sie die Platte mit Klarsichtfolie zu vermeiden Verdampfungsverlust und lasse es über Nacht an Bank.
    4. Tag 0: Entfernen der rekombinanten menschlichen Fibronektin-Fragment aus jedem Brunnen. Die virale Überstand der einzelnen SgRNA bei Raumtemperatur auftauen. Fügen Sie 50 µL virale Überstand aus jeder Tube für jeden gut der Transduktion Platte beschichtet. Drehen Sie die Transduktion Platte bei 1.300 X g für 90 min bei 35 ° C.
    5. Gegen Ende des Spinfection zählen Sie MOLM13-Cas9 (Klon B3) Zellen aus der Kultur-Flasche. Verwenden Sie 10.000 Zellen pro Bohrloch in 100 µL Volumen. Zählen der Zellen für die Transduktion-Brunnen Berücksichtigung Totvolumen.
    6. Nach den 90 min Spinfection entfernen des Überstands aus den Vertiefungen, die mit einer Mehrkanal-Pipette auf 50 µL langsam durch Kippen der Plattenrandes angepasst. 100 µL der Kultur der MOLM13-Cas9 Klon B3 Zellen hinzu kommt jeder gut langsam Abrutschen von der Felge.
    7. Drehen Sie die Platte bei 1.300 X g für 2 min bei 35 ° C, die Zellen auf den Boden absetzen lassen. Übertragen Sie die Platte auf 37 ° C Gewebekultur Grade Inkubator.
    8. 1. Tag: Fügen Sie 100 µL frisches Medium zu jeder gut mit SgRNA ausgestrahlt Cas9-MOLM13 oder Cas9-MLL-AF9 Leukämie Zellen, so dass die mittlere Endvolumen 200 µL hinzu.

(3) Konkurrenzfähigkeit Assay

  1. Tag 3: 72 h (Tag 3) post Transduktion, überprüfen Sie den Prozentsatz des SgRNA mit BFP positive Zellen in jedem Bohrloch durch Durchflusszytometrie (FACS). Verwenden Sie einen Zelle Lebensfähigkeit Farbstoff zu markieren und tote Zellen von der Analyse auszuschließen.
  2. Weiter neu Beschichtung einen Anteil der Zellen in neue Brunnen mit frischem Medium nach jeder FACS Analyse Überwucherung während des Tests zu vermeiden.
  3. Wiederholen Sie die FACS-Analyse alle 2 – 3 Tage um zu überprüfen, den relativen Anteil des BFP positiv (BFP + Ve) Zellen im Vergleich zu den BFP negative (BFP-Ve) (Abbildung 3). Den Anteil der BFP positive Zellen für jeden Zeitpunkt (mit FlowJo oder ähnlichen FACS-Analyse-Software) zu analysieren.
    1. Ziehen Sie Fcs-Dateien für jede Probe zu FlowJo Software. Klicken Sie doppelt auf jede eine Beispieldatei und plot eine Dot-Blot der forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC) mit FSC auf X Achse und SSC auf y-Achse. Tor der Zellen.
    2. Klicken Sie doppelt auf den geschlossenen Zellen und Plotten sie auf Lebensfähigkeit Fleck (auf die y-Achse) vs. FSC Höhe (H) oder Fläche (A)-Dot-Blot. Tor der Lebensfähigkeit Fleck negative (live) Zellen.
    3. Klicken Sie doppelt auf eingezäunten lebenden Zellen und Plotten Sie BFP (auf die y-Achse) vs. FSC (A) auf X-Achse. Tor BFP + Ve Zellen. Gelten Sie diese Tore für alle Proben durch Ziehen der Stichprobe auf Alle Proben unter Registerkarte " Gruppe ".
    4. Klicken Sie auf Tabellen-Editor , eine Analysetabelle aller Proben zu machen. Ziehen Sie BFP + Ve Graf aus eine Probe in der Tabelle und klicken Sie auf die Display -Taste im Tabellen-Editor , erstellen Sie eine Batch-Report aller Proben mit einem Tisch, den Anteil der BFP + Ve Zellen anzeigen. Speichern Sie die Tabelle als eine Xls.
  4. Berechnen die proportionale Zunahme oder Abnahme der % BFP positive Zellen innerhalb der live Zellpopulation im Laufe der Zeit und vergleichen Sie dieses Verhältnis auf das Verhältnis von BFP positive Zellen im Steuerelement SgRNAs (z. B. Luciferase, Rührei oder GLP-SgRNA).
  5. Darstellen Sie das Verhältnis der BFP positive Zellen für die verschiedenen SgRNAs einschließlich-Gens Interesse sowie Steuerelemente mithilfe von Tag 3 als Grundlage.

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Representative Results

In unserer Studie ausgestrahlt wir zuerst die MOLM13 menschlichen AML-Zelllinie, die die MLL-AF9 Translokation mit hoher Titer Virus Codierung der Cas9-Blasticidin Lentivirale Plasmids trägt. In unseren Händen beschriebenen Schüttgut unsortierte MOLM13-Cas9-Zellen wurden hohe Niveau Cas9 Ausdruck durch westliche Beflecken nicht angezeigt und auch nicht ausführen wenn für effiziente gen bearbeiten-mit der Methode untersucht zuvor7. Daher gingen wir zu einzelnen Zellklonen zu etablieren und wählen nur die Klone mit hoher Cas9 wie Western Blot (Abbildung 1). Wir holten 2 verschiedene Klone und sie mit SgRNAs Ausrichtung auf einen Standort in der AAVS1 Safe-Harbor Lokus wie beschrieben früheren7ausgestrahlt. Mit genomischer DNA extrahiert von Puromycin ausgewählt MOLM13-Cas9-AAVS1 SgRNA Klone, führten wir eine PCR mit Primer überspannt die AAVS1 SgRNA Seite schneiden und Sanger sequenziert ein bestimmtes 268 bp PCR Produkt aus 10 isolierte Kolonien für jeden MOLM13 Klon. Nach dem Ausrichten mit der elterlichen Sequenz fanden wir, dass MOLM13 Cas9 Klon B3 und MLL-AF9-Cas9 Klon 8 einen Wirkungsgrad von 100 % (Daten nicht gezeigt hatte). Wir haben diese Klone, die hohe Cas9-vermittelten Erbgut Bearbeitung Fähigkeit für unsere SgRNA-Wettbewerb-Assays anzeigen ausgewählt. Während diese Studien durchgeführt wurden, wurden Web-basierten Tools zur Prüfung schnell Erbgut Bearbeitung Wirksamkeit von Sanger Sequenzen von verschiedenen Gruppen wie Flut8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) oder Eis (https://ice.synthego.com/#/) entwickelt. Diese Tools machen es extrem einfach und kostengünstig zu Erbgut Bearbeitung Effizienz zu beurteilen, ohne einzelne Fragmente zu klonen und Sequenzierung mehrere Klone führen. Masse Cas9 exprimierenden Zellen sollte daher zunächst für Genom Bearbeitung Effizienz mit Hilfe dieser Methoden getestet werden. Für den Fall, dass die Erbgut Bearbeitung Effizienz hoch ist, ist dann Einzeller Klonen nicht erforderlich. Auch für den Fall, dass einzelne Zelle Klonen benötigt wird, wie in unseren Studien gesehen, bieten diese Web-basierte mutagenen Frequenz Einschätzung Werkzeuge eine viel schnellere Methode parallel zu Testzwecken mehrere Klone.

Für SgRNA zu klonen, wir haben nutzen Sie das Klonen Plasmid pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - SgRNA W, die birgt einen blau fluoreszierenden Proteins (BFP) für die Verfolgung von SgRNA ausgestrahlt Zellen und eine RNA-Polymerase III-gesteuerte menschliche U6 Förderer, die den Ausdruck der Laufwerke die geklonten SgRNAs zusammen mit dem Tracer RNA (TracRNA) Gerüst. Wir haben dieses System um 2 SgRNAs auf DOT1L, ein Protein bekannt, eine wichtige Rolle bei der epigenetischen Regulation der Genexpression zu klonen. DOT1L ist ein Histon-Methyltransferase, die Mono, di und Tri-Methylierung mit Ziel Gene9,10Einlagen. Studien haben gezeigt, dass DOT1L eine wichtige in AML MLL-Fusion Onkogene angetrieben Rolle. Daher soll DOT1L Ko mit CRISPR-Cas9 führen zu Maus MLL-AF9 Leukämie Zellproliferation im Einklang mit früheren Studien11,12,13,14erheblich beeinträchtigen. Wir haben zwei SgRNAs auf der AAVS1-safe-Harbor Locus, die in der Intron des PPP1R12C-Gens ist. SgRNAs Herstellung von genomischen Veränderungen auf dieser Website sind nicht voraussichtlich keine Auswirkungen auf die proliferative Kapazität des MLL-Leukämie-Zell-Linien. Als Positivkontrolle geklont wir gezielt die DNA-Replikation-assoziierten Gen RPA3 SgRNAs. RPA3 ist ein Pan-ätherische-gen, das wichtig für die Verbreitung von mehreren AML Zelle Linien4,15,16 nachgewiesen wurde. Anti-RPA3 SgRNAs daher starke Anti-proliferative Effekte in AML Zellen angezeigt und sind in der Regel als Positivkontrolle verwendet. Nach der Transduktion mit Anti-AAVS1 und Anti-RPA3-SgRNA-Plasmide, messen wir den relativen Anteil des BFP + Ve SgRNA ausgestrahlt Zellen im Vergleich zu ihren Gegenstücken BFP-Ve alle 2 – 3 Tage in Kultur (Abbildung 3). Mit dem oben beschriebenen Protokoll führte die Transduktion von MOLM13 oder MLL-AF9 AML Zellen in einem 60 – 70 % Transduktion Effizienz mit unseren viralen Vorbereitungen, so dass die verbleibenden 30 – 40 % Zellen untransduced oder BFP-Ve in jedem gut. Dies ermöglicht die Untersuchung der relativen Vermehrung der Genom-bearbeitete Zellen mit Wildtyp Zellen in der gleichen gut. Die proportionale Zunahme oder Abnahme im Anteil der Zellen SgRNA ausgestrahlt wurde verwendet, als eine Maßnahme, um die funktionelle Wirkung des SgRNA reflektieren gen-Löschung in den MOLM13-Cas9-Zellen vermittelt. Wenn Ihre gen von Interesse für die Verbreitung von AML Testzellen wichtig, führt SgRNA-vermittelte Störung dieses Gens im Laufe des Tests zu der relativen Verminderung des SgRNA exprimierenden BFP + Ve Zellen im Vergleich zu den BFP-Ve-Zellen, während SgRNAs targeting Luciferase, GFP oder unwesentliche Gene die BFP + Ve behalten/Ve-Verhältnis im Laufe der Zeit.

Mit 2 separaten Anti-RPA3 SgRNAs, beobachteten wir eine progressive und signifikante Rückgang des Anteils der BFP + Ve Zellen im Vergleich zu die BFP-Ve untransduced Pendants. Dagegen blieb der Anteil der Anti-AAVS1 SgRNA mit dem Ausdruck BFP Zellen relativ konstant im Laufe der Zeit zeigen, dass AAVS1 targeting keinen Einfluss auf die Verbreitung von MOLM13 Zellen (Abbildung 4a hat). In ähnlicher Weise in den Maus-MLL-AF9-Cas9-Zellen testeten wir die Auswirkungen der SgRNAs targeting Rhodopsin (Rho1), das Auge Pigmentierung gen als Negativkontrolle und Dot1l, einen epigenetischen Regulator bekannt, für die Verbreitung von MLL-AF9-Leukämie-Zellen im Laufe der Zeit erforderlich . In dieser Studie, BFP + Ve Mauszellen MLL-AF9-Cas9 ausgestrahlt mit 2 separaten Anti-DOT1L-SgRNAs zeigte einen dramatische und progressiven Verlust im Laufe der Zeit im Vergleich zu BFP-Ve SgRNA nicht ausgestrahlt Zellen (Abbildung 4 b). Im Gegensatz dazu blieb das Verhältnis der Anti-Rho1 SgRNA im Laufe der Zeit relativ unverändert. Diese Ergebnisse zeigen die Verwundbarkeit der MLL-AF9 Maus Leukämie-Zellen zu einer Erschöpfung der Dot1l zum Ausdruck zu bringen, zuvor veröffentlichten Ergebnisse bestätigt.

Figure 1
Abbildung 1: Vertreter Western Blot führt mit unterschiedlichem Cas9. Einzelne Zelle Klone von der MOLM13 AML-Zell-Linie mit CAS9 ausgestrahlt wurden für Flag-Cas9 Ausdruck Niveaus mit Anti-Flag Antikörper sondiert. Zeigt die höchste Ausdrucksform des Cas9 Klone wurden für weitere Studien ausgewählt. HEK293-T-Zellen transfiziert mit einem Cas9 Expressionsplasmid dienten als Positivkontrolle und Cas9 nicht ausgestrahlt MOLM13 Zellen als Negativkontrollen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: repräsentative Analyse der Genom-Bearbeitung an den Dot1l Locus von ICE-Analyse bewertet. Ein PCR-Amplifikate zentriert um die Dot1l-SgRNA-Ziel-Site wurde Sanger sequenziert und mit ICE-Analyse analysiert. Ein Vergleich der sgDot1l Sequenz (orange Linie), ungezielte DNA-Sequenz (grüne Linie) zeigt die hohe Effizienz bei der sgDot1l gezielt Zellen um die SgRNA-Ziel-Site zu bearbeiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Workflow der vorgeschlagenen Methoden. SgRNAs werden in SgRNA Expressionsvektor Co Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins wie BFP geklont. Zielzellen sind 30 – 60 % Transduktion Preisen ausgestrahlt und gefolgt von Durchflusszytometrie alle 2 – 3 Tage. SgRNAs gezielt Gene erforderlich für AML-Zell-Proliferation wird relative Erschöpfung im Laufe der Zeit zeigen, wie dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Vertreter ergibt sich aus Wettbewerb Assays in der Human- und AML Mauszellen. (ein) Ergebnisse zeigen einer statistisch hochsignifikanten Progressive Rückgang der RPA3 MOLM13-Cas9 Klon B3 Zellen ausgestrahlt. Im Gegensatz dazu sind SgRNAs auf der AAVS1 Website wirkungslos. (b) SgRNAs Dot1l-targeting zeigen eine bemerkenswerte und progressive Rückgang in wettbewerbsfähige Verbreitung im Gegensatz zu SgRNAs targeting Rhodopsin (Rho). p > 0.05. p < 0,05. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung (SD) bedeuten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Grundzüge des Protokolls. (ein) Mal für jeden Schritt bei der Herstellung von Cas9 Virus und SgRNA Klonen beschrieben. Design und Klonen von SgRNAs können durchgeführt werden, während die Erzeugung einzigen Klone von AML Zelllinien mit stabilen Cas9 Ausdruck. (b) allgemeine Protokoll für die Transduktion von AML Zelllinien mit SgRNAs und Konkurrenzfähigkeit Assay mit FACS wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zyklen Dauer des Zyklus Temperatur
1 2 min 95 ° C
35 30 s 95 ° C
30 s 55 º C
30 s 72 º C
1 5 min 72 º C
Halten unendliche 4 º C

Tabelle 1: PCR-Programm für AAVS1 Locus Verstärkung aus genomischer DNA. PCR-Programm für die Verstärkung der AAVS1 Locus aus genomischer DNA für Tests Schneideffizienz der Cas9 in Cas9 mit dem Ausdruck Klonen verwendet.

Ergänzende Datei: Oligo-Sequenzen SgRNA. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

In diesem Manuskript beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines CRISPR-Cas9-basierte Konkurrenzfähigkeit Assays untersucht die Rolle von Kandidatengenen in AML Zelllinien mit Flow-Zytometrie in Human/Murine AML Zellen (Abbildung 5). Das Ziel des Tests ist die Wirkung des Gens Löschung auf Wartung der AML Zellproliferation über zwei bis drei Wochen im Maßstab des Medium-Durchsatz zu identifizieren. Einige wichtige Schritte müssen sorgfältig befolgt werden, um zu erleichtern, die Aufstockung des Protokolls beschrieben. Bei der Herstellung von Cas9 Lentivirus ist es notwendig, das Virus bedingt Medium durch einen 0,45 µM-Filter zur Vermeidung der Verschleppung von 293T Zellen, die das Virus mit Überstand zu filtern. Während Spinfection hilft die Spinfection Platte mit Klarsichtfolie oder Parafilm umwickeln potentiellen Kontamination während der Zentrifugation zu vermeiden. Jedoch sollte die Verpackung entfernt werden, vor dem Einlegen der Spinfected Platte zurück in Gewebekultur Inkubator. Es ist sehr wichtig, mit dem Ausdruck Cas9 Klone für Bearbeitung Effizienz zu bewerten. Klone mit niedrig-Genom Bearbeitung Effizienz zu wenig Cas9 Betätigung zu reflektieren und die Erfolgsrate des Experiments beeinflussen können. In unseren Experimenten wir zuerst menschliche AML Cas9 Klone mit Ausrichtung auf den AAVS1 Locus SgRNAs ausgestrahlt und sequenziert ihre genomische DNA für die Bearbeitung von Effizienz. Vergleich der AAVS1 bearbeitet und Wildtyp-Sequenzen können mit online-Web-basierte Tools wie Flut8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) oder Eis (https://ice.synthego.com/#/) beurteilt werden. Diese Programme vergleichen Sanger Sequenz Spuren von potenziell bearbeitete PCR-fragment, das unbearbeitete Wildtyp oder Referenz-Sequenz und Schätzung die Häufigkeit von Änderungen. Dies ist eine schnelle Möglichkeit mutagenen Veränderungen durch den Test SgRNA, das ist das Maß der Zellaktivität Cas9 zu bewerten. Alternativ das Klonen der PCR Produkt in ein Plasmid PCR-Klonen wie z. B. die TOPO stumpfen Klonen Vektor durchgeführt werden kann, gefolgt von Sanger-Sequenzierung der einzelnen Kolonien Erbgut Bearbeitung Effizienz von Sequenzalignment von jeder Klon zu bewerten die Wildtyp. Wir bevorzugen die erste Methode, aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit und Wirtschaftlichkeit im Vergleich zu den Klonmethode. Die Entdeckung der Basenpaare in der Regel ändert, z. B. Punktmutationen, Indels, etc.., am oder um den SgRNA schneiden Standort in einer überwiegenden Mehrheit der sequenzierte Klonen deuten auf das Vorhandensein einer hochaktiven Cas9. So entschieden wir uns, dass MOLM13 oder MLL-AF9 Leukämie Klone B3 und 8, jeweils mit der höchsten Effizienz der Bearbeitung für weitere Experimente.

Wir entwarfen SgRNAs gezielt verschiedene Gene, die in das Protokoll mit http://crispr.mit.edu/, eine Web-basierte Software, die eine von SgRNAs Liste erwähnt. Es wird empfohlen, die Oberseite-zählende SgRNAs aus der Liste auswählen, um diejenigen mit prognostizierten Ziel Auswirkungen zu beseitigen. Die gestalteten SgRNAs kann mithilfe der veröffentlichten Protokolle wie jene auf (http://www.addgene.org/67974/) Website geklont werden. Sense und Antisense Oligos sind zunächst phosphoryliert und gemäß der Schritt 2.1.5 geglüht. Der erste Schritt bei 37 ° C ist wichtig für die Phosphorylierung Oligos mit der T4-Kinase und anschließende PCR-Zyklen sind wichtig für Glühen von Sinn und Anti-Sense-Oligonukleotide in DsDNA. Es ist wichtig, ein fluoreszierendes Protein im SgRNA Klonen Vektor, der entscheidend für die Verfolgung von SgRNA ausgestrahlt Zellen später in die Wettbewerbs-Assays sind. SgRNA Klonen wird mit dem Einsatz von 96-well-Platte an der Treppe, die einschließlich Glühen und Ligatur skaliert. Für Ligation können saubere PCR Reaktionscup Streifen auch verwendet werden, da sie mit Mehrkanal-Pipetten vereinbar sind. Im Fall, dass die Umwandlung von einer größeren Gruppe von SgRNA Klone ist notwendig, eine 96-Well-Platte in die 10 μl kompetenten Zellen sind Pre-regelmÄÑig in jede Vertiefung und bei-80 ° C eingefroren kann verwendet werden, um den gesamten Prozess zu beschleunigen. Die Beschichtung der Ligatur Reaktionen soll wählen Sie einzelne Kolonien, das ist schwierig, in der 96-Well-Format durchzuführen. Daher für bakterielle Umwandlung gibt es ein leichter Verlust bei der Skalierbarkeit. Doch auch für die Beschichtung von Umwandlung Reaktionen von eine gesamte 96-Well-Platte erfordert nur insgesamt sechzehn 6-Well-Platten für das gesamte Projekt. Man muss im nächsten Schritt der Kommissionierung Kolonien von den Wandel Platten vorsichtig sein. Während Schlieren eine Kolonie auf einem gekennzeichneten Stelle sicherstellen, dass der Spot deutlich von den anderen Spots isoliert ist. Kennzeichnung von einem quadratischen Raster auf dem Boden der Petrischale mit einem dunklen Permanentmarker verhindert Kreuzkontamination von bakteriellen Klone.

Sobald die Minipreps SgRNA Konstrukte bereit sind, kann das Virus in das 96-Well-Format erfolgen. Auf dieser Ebene der Durchsatz ist es unpraktisch, 200 µL des Virus mit Überstand zu filtern. Daher sollte der virale überstand mindestens über Nacht zur Vermeidung von Kreuzkontamination von 293T Zellen erfolgt über in der Überstand eingefroren werden. Es kann auch gespeichert werden in 50 µL-Aliquots in steriles Röhrchen PCR-Streifen zu vermeiden Einfrieren Auftauen des Überstands. Darüber hinaus dienen diese Virus bedingt Überstände transducing AML Zellen. Für den Fall, dass das niedrige Titer von kann virale Transduktion werden beobachtet, wie geringe Häufigkeit der BFP + Ve Zellen bewertet, dann es wichtig zu bestimmen, die virale Titer und testen Transductions auf unterschiedliche Vielzahl von Infektionen (MOI), 40-60 Prozent zu gewährleisten Transduktion Preise. Virale Titer-Bestimmung und MOI Berechnung bezeichnet man im detail hier17. In der Konkurrenz-Assay wie in Schritt 3 des Protokolls beschrieben ist es sehr wichtig, nicht lebensfähige Zellen, um zu verhindern, dass Unechte Artefakte aus Auto-Fluoreszenz bei der Analyse der BFP nicht BFP-Verhältnis. Zum Zeitpunkt der FACS, vor der Analyse von Proben empfiehlt die Verwendung von BFP negative und BFP Positivkontrollen Spannungen genau eingestellt. Jeder neu Galvanik Zeitpunkt hängt das Volumen der Zellen neu verchromt werden die Konzentration der Zellen zum gegebenen Zeitpunkt. Wir plattiert neu in der Regel 20 μL von insgesamt 200 μL zu jedem Zeitpunkt in einen frischen Brunnen mit 180 μL frisches Medium. Gute Durchmischung der Zellen durch Pipettieren sanft nach oben und unten kurz vor Re Beschichtung ist sehr empfehlenswert. In der Regel haben wir beobachtet, dass der Test muss mehr als 15 – 20 Tage durchgeführt werden Bekanntmachung starke Veränderungen in der BFP + Ve/Ve-Verhältnis, obwohl dies von gen zu gen variiert.

Diese Versuchsanordnung eignet sich gut zum Testen mehrere Gene parallel in mehreren AML-Zelllinien, die Rolle von Kandidatengenen für das Überleben oder Verbreitung von AML Zellen rasch zu identifizieren. Ein Nachteil des hier beschriebenen wettbewerbsfähige Verbreitung-Assays ist, daß es nicht mögliche Zelle extrinsischen Faktoren wie parakrine Signalisierung Ereignisse aus gen gezielt Zellen, die die ungezielte Zellpopulation innerhalb derselben beeinflussen können gut. Obwohl dies selten der Fall sein könnte, sollte dieser Faktor berücksichtigt werden bei der Durchführung von Assays. Obwohl wir AML als Beispiel verwendet haben für die CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays in diesem Manuskript beschrieben, kann diese Methode für alle Krebs-Zell-Linie verwendet werden, um die Rolle von mehreren Genen parallel zu identifizieren. Es gibt verschiedene Vorteile der gen-Löschung mit CRISPR-Cas9 über gen-Knockdown mit RNA-Interferenz. Erstens, im Gegensatz zu ShRNAs, die in der Regel ein breites Spektrum der Ziel-mRNA-Hemmung zeigen, bewirken SgRNAs gepaart mit der Cas9-Nuklease komplette KO von Zielgenen. Dramatischer und konsequente Phänotypen kann mit CRISPR-Cas9-basierte Methoden, dadurch obwohl es muss gewarnt werden, dass die targeting Effizienz der einzelnen SgRNAs sowie ShRNAs stark variieren kann.

Die Flow-Zytometrie-based Wettbewerb Assay bietet mehrere Vorteile gegenüber traditionellen Verbreitung Assays, in denen eine feste Anzahl von Zellen überzogen sind, um die relative proliferative Aktivität der Gene gestört Zellen zu messen. Ein Vorteil ist, dass die relative proliferative Aktivität der Zellen schnell und einfach durch Durchflusszytometrie für mehrere Tage gemessen werden kann unter Umgehung der Notwendigkeit einer Zelle zählen bei jedem Schritt der Beschichtung. Dies ist nützlich, wenn die Prüfung einer großen Anzahl von Kandidaten SgRNAs gezielt mehrere Gene, wie zählen alle der Brunnen ist umständlich und zu Ungenauigkeiten führen kann. Anders als ATP-basierte Messung assays für das Zellwachstum, Durchflusszytometrie auf einer Stichprobe von lebenden Zellen, wodurch diese Methode hilfreich für langfristige Analyse durchgeführt werden kann. Dies ist besonders vorteilhaft bei der Untersuchung von Faktoren wie epigenetische Modulatoren, die späten wirkende Auswirkungen auf die Proliferation von AML Zellen zeigen können und erfordern langfristige Assays. Zweitens ermöglicht das Vorhandensein von nicht ausgestrahlt Zellen innerhalb derselben auch eine gut kontrollierte Zellpopulation, die verwendet werden, um die Basislinie zum Test gesetzt. Drittens Wenn Setup in einem 96-Well-Format, der Test fast vollständig durchgeführt werden kann, mit Mehrkanal-Pipetten beschleunigt wesentlich den gesamten Prozess aus Klonen von SgRNAs Virus Vorbereitung und schließlich fließen durchflusszytometrischen Bewertung von Fluoreszenz.

Die hier beschriebene Methode kann effizient skaliert-Up für die Untersuchung von bis zu 96 SgRNAs parallel in einer angeordneten Bildschirm sein. 4 – 6 SgRNAs pro gen vorausgesetzt, kann diese Methode daher für die schnelle Abfrage des mindestens 16 – 24 Gene parallel verwendet werden. Im Falle einer größeren Anzahl von Genen, wie eine ganze molekulare Weg, die in AML Zellen abgefragt werden muss werden gebündeltes CRISPR-Cas9-basierte Bildschirme mehr nützlich sein.

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Disclosures

A.J.D ist ein Berater, A2A Pharma (New Jersey) und Salgomed Therapeutics (San Diego). Andere Autoren haben keine Konflikte zu erklären.

Acknowledgments

Das pCW-Cas9-Plasmid war ein Geschenk von Eric Lander & David Sabatini (Addgene Plasmid # 50661) und die pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W-Plasmid aus dem Labor Yusa (Addgene Plasmid #67974. Wir möchten die Durchflusszytometrie Kern bei SBP Medical Discovery Institute für rechtzeitige Hilfe mit Flow-Analyse und Sortierung zu danken. Wir würden gerne die Unterstützung der Lady Tata Memorial Foundation n. anerkennen Wir möchten auch die Unterstützung der folgenden Finanzierungsquellen anerkennen: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center gesponsert Grant, der V-Stiftung und der San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FLAG-M2 Antibody sigma-aldrich F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody Invitrogen 31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo Fisher 34095
ChemiDoc Imaging System BIO RAD 17001401
Sorvall Legend RT centrifuge Thermo Scientific
Blasticidin Thermo Fisher R21001
SYTOX Red Thermo Fisher S34859
Opti-MEM Thermo Fisher 31985062
DMEM Thermo Fisher 11965-092
RPMI Thermo Fisher 11875-093
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher 25030081
Fetal Bovine Serum (FBS) SAFC 12303C
single gRNA vector Addgene #67974 pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit sigma-alorich NXTRACT
XtremeGENE 9 sigma-alorich 6365787001
Retronectin Takara T100B
Flow cytometer BD Biosciences
T4 PNK NEBioLabs M0201S
T4 DNA ligation buffer NEBioLabs B0202S
T4 DNA Ligase enzyme NEBioLabs M0202S
Ampicillin Fisher scientific BP1760-25
LB agar Fisher scientific BP9724-500
LB Broth Fisher scientific BP9731-500
Qiagen mini-prep kit Qiagen 27104
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3 Peprotech 213-13
Recombinant Murine IL-6 Peprotech 216-16
Recombinant Murine M-CSF Peprotech 315-02
Stable competent cells NEBiolabs C3040I
10 cm Tissue Culture dishes Fisher Scientific 353003
Cell lysis solution Qiagen 158906
Protein precipitation solution Qiagen 158910
DNA hydration solution Qiagen 158914
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
BbSI New England BioLabs R0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit Genessee Scientific 42-138
Puromycin Fisher scientific BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495949A
15 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495970C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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