Stabil DNA motiv, 1D och 2D nanostrukturer tillverkad av små cirkulära DNA-molekyler

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna artikel presenterar en detaljerad protokoll för T4 ligering och denatureringen sida rening av små cirkulära DNA-molekyler, glödgning och infödda sida analys av cirkulära plattor, montering och AFM avbildning av 1D och 2D DNA nanostrukturer samt agaros gel elektrofores och centrifugering rening av ändliga DNA nanostrukturer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denna artikel presenterar en detaljerad protokoll för syntes av små cirkulära DNA-molekyler, glödgning av cirkulära DNA motiv och byggandet av 1D och 2D DNA nanostrukturer. Under årtiondena, är den snabba utvecklingen av DNA nanoteknik tillskrivs användning av linjära DNAs som råvara. Till exempel är panelen DAO (dubbla crossover, antiparallel, udda halv-vänder) välkänd som en byggsten för byggandet av 2D DNA galler; core struktur DAO är tillverkad av två linjära enkelsträngat (ss) oligonukleotider, som två linor att göra en höger hand mormor knut. Häri, en ny typ av DNA plattor kallas cDAO (kopplat DAO) byggs med hjälp en liten cirkulär ss-DNA i c64nt eller c84nt (cirkulär 64 eller 84 nukleotider) som byggnadsställning strand och flera linjära ss-DNAs som krampa trådar. Perfekt 1D och 2D nanostrukturer monteras från cDAO plattor: oändlig nanotrådar, nanospirals, nanorör, nanobanden; och ändlig nano-rektanglar. Detaljerade protokoll beskrivs: 1) förberedelse av T4 ligase och rening av denaturering sida (polyakrylamid gelelektrofores) av små cirkulära oligonukleotider, 2) glödgning av stabil cirkulära plattor, följt av infödda sidanalys, 3) montering av oändlig 1D nanotrådar, nanorings, följt nanospirals, oändlig 2D galler av nanorör och nanobanden och ändliga 2D nano-rektanglar, av AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. Metoden är enkel, robust och prisvärd för de flesta laboratorier.

Introduction

DNA-molekyler har använts för att bygga många typer av nanostrukturer över årtionden. Typiska motiv innehåller DAE (double crossover, antiparallel, även halv-varv) och DAO plattor1,2,3, star plattor4,5,6,7, enda strandsatta (ss) plattor8,9,10, och DNA origami11,12,13. Dessa DNA motiv och galler monteras från linjär ss-DNAs. Nyligen har andra och vi rapporterade användning av cirkulär ss-oligonukleotider som ställningar att bygga motiv, 1D nanorör och 2D galler14,15,16,17. Genom att sätta en Holliday junction (HJ)18,19,20,21 i mitten av c64nt, kan ett par av två kopplade DAO plattor vara bildade17. Detta nya cDAO motiv och dess derivat är stabil och tillräckligt styv för att montera 2D DNA galler upp till 3 × 5 µm2. I detta papper använder vi en benämna av ”cirkulära plattor”, som definieras som en stabil komplexa DNA-molekyl som konstruerat med en cirkulär byggnadsställning och andra linjära märlor av ss-oligonukleotider, och en annan term för ”linjära kakel”, som är byggd från en full uppsättning av linjära SS-oligonukleotider.

Detta protokoll visar hur att bygga fem sorters DNA nanostrukturer med små cirkulära DNA-molekyler som ställningar: 1) oändlig 1 D c64nt och c84nt nanotrådar, 2) oändlig 2D cDAO-c64nt-O och cDAO-c64nt-E (-O representerar ett udda antal 5 halv-svängar och -E representerar ett jämnt antal av 4 halv-varv) galler, 3) oändlig 2D cDAO-c84nt-O och cDAO-c84nt-E galler, 4) ändlig 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O och 5 × 6 cDAO-c 74 & 84nt-O rektanglar, 5) oändlig 1 D acDAO-c64nt-E nanorings och nanospirals (se Figur 3-5 för schematiska ritningar och bilder av de ovanstående fem typer av DNA nanostrukturer). De 1D c64nt och c84nt nanotrådar monteras från varje c64nt och c84nt byggnadsställning är associerad med två linjära klammer respektive. Varje cirkulär platta av cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt eller cDAO-c84nt är glödgas från dess motsvarande byggnadsställning av c64nt, c74nt eller c84nt med fyra linjär klammer respektive. De oändliga 2D galler monteras från samma typ av två cirkulära plattor med olika sekvenser. De två ändliga 2D rektangel galler monteras från två uppsättningar av 32 cirkulär sub plattor respektive. För att spara pengar, används endast en-sekvenserade c64nt, c74nt och c84nt som respektive schavotten medan olika överhäng används att glödga den 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt och 20 cDAO-c84nt cirkulär sub plattor respektive i första sub kakel glödgning steg, sedan Blanda motsvarande 32 cirkulär sub brickor och tillämpa andra gallret glödgning steg för att montera den ändliga 5 × 6 cDAO-c64nt-O och 5 × 6 cDAO-c 74 & 84nt-O galler, respektive. Definitivt, annorlunda sekvenserade cirkulär ställningar kan antas för att montera en mängd ändlig storlek nanostrukturer, men det kommer att kosta mer pengar och mödor. Den oändliga 1D acDAO-c64nt-E nanorings och nanospirals är glödgas från en-sekvenserade asymmetriska acDAO-c64nt plattor med linjära anslutningar av ett jämnt antal 4 halv-varv. Det finns två metoder att montera oändlig 2D galler från cirkulära plattor cDAO-c64nt och cDAO-c84nt, som kännetecknas av intertile distanserar av ett jämnt antal 4 och ett udda antal 5 halv-vänder respektive. Den förstnämnda kräver alla brickor anpassas identiskt; det senare kräver alternationen av ansiktena på två intilliggande brickor längs de spiralformade axlarna. Om panelen är styv och plana, såsom cDAO-c64nt, kommer att båda metoderna generera planar nanobanden; Om panelen är böjd mot en riktning, såsom cDAO-c84nt, intertile anslutningen av ett jämnt antal 4 halv varv kommer att generera nanorör, medan intertile anslutningen av ett udda antal 5 halv varv kommer att producera planar nanobanden på grund av avskaffandet av krökning-partisk tillväxt vid alternativa justering av böjda plattor. Framgångsrika montering av 1D och 2D DNA nanostrukturer från cirkulära plattor anger flera fördelar med denna nya strategi: verkställas stabilitet och styvhet av cirkulära plattor över linjära plattor, kirala plattor för montering av asymmetriska nanostrukturer som nanorings och nanobanden, nya visioner på förståelse av DNA mekanik och molekylära strukturer, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av cirkulär DNAs

  1. Använd alla linjära DNAs som tillhandahålls av kommersiella bolag direkt utan ytterligare rening.
  2. Centrifugera DNA proverna vid 5.000 × g i 5 min att samla alla DNA pellets längst ned i rören. Tillsätt en lämplig mängd TE buffert (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) att upplösa DNA.
  3. Mätning av koncentrationen av ”a” ng/µL för varje ss-DNA-lösning med en mikro UV-spektrometer på 260 nm. Konvertera ”a” ng/µL till ”b” µM efter b = en × 10-3 / (molekylvikt av DNA (del). Justera mängden TE lösning att göra 10 µM DNA stamlösning.
  4. Använda T4 DNA-ligase för att ansluta 3' och 5' ändarna av 5'-fosforyleras linjära DNA mallar ( figur 1) c64nt, c74nt och c84nt som tillhandahålls från kommersiella företag direkt.
  5. Blanda av 5'-fosforyleras linjära DNA-strängen (3,5 µM) och dess motsvarande splint DNA-strängen (4,5 µM) i 80 µL TE buffert i en 200 µL PCR test tube15. Inkubera röret i en öppen thermo flaska fylld med 95 ° C vatten. Kyla ner det varma vattnet till rumstemperatur (25 ° C) i ca 2-3 timmar under lab atmosfären.
  6. Tillsätt 10 µL 10 x T4 buffert (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, 1 mM ATP) och 10 µL av T4 ligase (300 U/µL) till blandningen till en slutlig volym av 100 µL. Inkubera blandningen i en termocykler för 16 timmar vid 16 ° C.
    Obs: Ovanstående DNA koncentrationer och reaktionsvolym på ~ 100 µL är optimerade för hög ligatur effektivitet och hög avkastningen av rätt oligo-monomer ringbildning. Köra två eller flera rör med ligering reaktioner på samma tid enligt experimentell design. En alternativ inkubation förfarandet för ligering ersätter steg 1,6 är 4 timmar vid 25 ° C.
  7. Efter inkubering, inaktivera den T4 ligase i 95 ° C vatten för 5 minminutes. Sedan överföra röret till en is vattenbad och inkubera i 5 minuter för att svalna.
  8. Tillsätt 10 µL 10 x Exonuclease jag buffert och 10 µL Exonuclease I (5 U/µL) till den kylda blandningen och Inkubera röret vid 37 ° C i ett vattenbad för 30 min till selektivt smälta de återstående linjär DNAs och lämna de circularized DNAs intakt.
  9. Förbereda en 10% denatureringen sida gel.
    1. Använd gummihandskar och skyddsglasögon när du förbereder sida gelen i dragskåp. Lägg till 6,67 mL 30% (w/v) akrylamid/bisacrylamide lösning (19:1), 2 mL 10 x TAE· Mg buffert (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8,0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g urea (7 M) och avjoniserat vatten till en slutlig volym av 20 mL i en 40 mL centrifugrör.
      Försiktighet: 30% (w/v) akrylamid/bisacrylamide lösning (19:1) lösningen är giftiga.
    2. Tillsätt 20 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) och 100 µL av ammonium persulfatoxidation (APS, 10% w/v) till 40 mL tube innan överföringen gellösningen till elektrofores systemet omedelbart. Infoga en 1,5 mm tjock och 10-bra kam. Vänta minst 20 min tills gellösningen är stelnat.
    3. Ställa in en konstant spänning på 80 V för en gel av 85 × 80 × 1,5 mm3 (bredd × höjd × tjocklek). Lägg till 1 x TAE· Mg buffert i elektrofores system och rapportens gelen i 20 min vid 10 V/cm.
  10. Placera PCR provröret från steg 1,8 i 95 ° C vatten för 5 min att inaktivera Exonuclease jag. Sedan överföra röret till en is vattenbad och inkubera i en annan 5 min.
  11. Tillsätt 20 µL av formamid i röret till en slutlig volym av 140 µL och blanda lösningen. Distribuera lösningen till 7-9 denatureringen sida gel brunnar lika med 16-20 µL för varje gel väl. Blanda 2 µL lastning färgämne (0,05% bromofenolblått, 0,05% xylen cyanol FF, 60% glycerol, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7,6) med 8 µL av motsvarande föregångare linjära DNA (10 µM) och injicera blandningen till en separat brunn för referens.
    Obs: Tillägg av formamid är att öka tätheten av lastning lösningen för att sjunka till botten av sidan gelen väl och också att ta avstånd några dubbel strandsatta DNA rester.
  12. Kör gelen för ca 2 h vid 10 V/cm och sluta köra när xylen cyanol FF är högst 2/3 av glasplattan med blotta ögat.
  13. Använd gummihandskar och skyddsglasögon för att skydda hud och ögon. Ta gelen ur glasplattan. Placera gelen på en fluorescerande TLC (tunnskiktskromatografi)-tallrik. Klippte av banden target gel vid ett rakblad så exakt som skuggade av UV-bestrålning (figur 2).
    Försiktighet: UV-ljus är skadligt för ögon och skinn.
    Obs: Under UV-bestrålning vid 254 nm, DNA kommer att absorbera ljuset och kastar en skugga på TLC plattan. Cirkulära DNA sprang något långsammare än sin motsvarande föregångare linjära DNA. Vissa osmält linjär DNAs och oönskade cirkulär DNAs i små mängder som omger skuggad mål bandet kommer att förorena cirkulär DNA om de samlas.
  14. Över gel banden till ett 2,0 mL mikrocentrifug rör. Lufttorka eller föna torrt banden gel och sedan mosa gelerna till en pasta av en spatel eller tillplattad glasstav. Kontrollera att gelen har krossats fullständigt till en pasta, som är kritiska till den höga avkastningen av cirkulära DNA. Tillsätt två gånger gel volym avjoniserat vatten i röret och skaka röret i rumstemperatur över natten.
  15. Filtrera blandningen för att samla supernatanterna i en 2,0 mL mikrocentrifug rör. Återställa alla kvarvarande DNA genom att skölja med liten volym avjoniserat vatten och filter igen för att kombinera supernatanterna.
  16. Extrahera eluenten med lika stor volym av n-butanol. Upprepa proceduren tills aqueous volymen reducerats till ca 200 µL.
  17. Tillsätt 500 µL av absolut etanol (−20 ° C) och 20 µL av 3 M NaOAc (pH 5.1) till blandningen för DNA nederbörd. Förvara tuben vid −20 ° C i 30 min.
  18. Centrifugera röret vid 12.000 × g i 10 minuter vid 4 ° C, Kassera supernatanten. Återstående DNA fällningen är cirka 100 µL i röret.
  19. Lägga till 600 µL av 75% etanol (−20 ° C) i röret och lagra den på −20 ° C i 30 min. Sedan Centrifugera vid 12.000 × g under 10 minuter vid 4 ° C, Kassera supernatanten. Återstående DNA fällningen är cirka 100 µL lösning i röret igen. Upprepa proceduren två gånger.
  20. Efter den sista centrifugeringen, Kassera supernatanten så mycket som möjligt. Torra resterna med en vakuum koncentrator.
  21. Store renat cirkulär DNA i röret vid −20 ° C.
  22. Återsuspendera cirkulär DNA i TE buffert att göra 10 µM cirkulär DNA stamlösning enligt steg 1.3 när det behövs.

2. glödgning av församlingen lösningar

  1. Bered varje kakel eller nanostrukturella montering av c64bp, c84bp, HJ-c64nt, åhj-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt och acDAO-c64nt-E med en designad uppsättning linjära och cirkulära DNAs för one-pot glödgning.
    1. För varje församling lösning, blanda 2 µL 10 x TAE· Mg buffert, 1 µL av varje DNA stamlösning av en uppsättning linjära och cirkulära slingor i lika molar nyckeltal och ytterligare TE buffert i en 200 µL PCR test tube till en slutlig koncentration på varje hårstrå på 0,5 µM och en slutlig volym av 20 µL. glödga församlingen lösningen i ett Thermo flaska från 95 ° C till 25 ° C över 48 h.
  2. Bered varje montering av 2D oändlig galler av cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E och cDAO-c84nt-O med en designad uppsättning linjära och cirkulära DNAs för tvåstegsverifiering glödgning.
    1. Förbered varje föregångare sub kakel montering lösning genom att blanda 2 µL 10 x TAE· Mg buffert, 1 µL av varje DNA stamlösning av en uppsättning linjära och cirkulära slingor i lika molar nyckeltal, och ytterligare TE buffert i en 200 µL PCR test tube till en slutlig koncentration på 0,5 µM för varje hårstrå och en slutlig volym av 20 µL. I det första sub kakel glödgning steget, glödga varje föregångare sub kakel lösning i en PCR termocykler med en snabb-linjära kyla metod från 95 ° C till 25 ° C över 2,5 h.
    2. Bered varje montering av ovanstående fyra oändlig galler genom att blanda 10 µL av varje av de två motsvarande sub kakel lösningarna tillsammans till en slutlig koncentration av 0,25 µM för varje hårstrå. I det andra gallret glödgning steg, glödga 20 µL blandningen i en PCR termocykler med en långsam kylning metod som bor vid 50 ° C i 2 h och kyla med en hastighet av 0.1 ° C per 5 minuter till 20 ° C, ca 24 h totalt.
      Obs: Två parallella experiment kan köras samtidigt eller därefter i glödgning steg för varje 2D oändligt gitter.
  3. Förbered montering lösningar för två ändliga rektangel församlingar 5 × 6 cDAO-c64nt-O och 5 × 6 cDAO-c 74 & c84nt-O för tvåstegsverifiering glödgning.
    1. Förbered varje föregångare sub kakel montering lösning genom att blanda 1 µL 10 x TAE· Mg buffert, 0,5 µL av varje DNA stamlösning av en uppsättning linjära och cirkulära slingor i lika molar nyckeltal, och ytterligare TE buffert i en 200 µL PCR test tube till en slutlig koncentration på 0,5 µM för varje hårstrå och en slutlig volym av 10 µL. I det första glödgning steget, glödga varje föregångare sub kakel lösning i en PCR termocykler med en snabb-linjära kyla metod från 95 ° C till 25 ° C över 2,5 h.
    2. Förbered varje ändlig rektangel galler församlingen lösning genom att blanda 32 x (2 µL av varje sub kakel lösning) tillsammans i en 200 µL PCR test tube till en slutlig koncentration på ~ 15 nM för varje sub kakel och en slutlig volym av 64 µL. I glödgning steg, glödga 64 µL blandningen i en PCR termocykler med en långsam kylning metod som bor vid 50 ° C i 2 h och kyla ner med en hastighet av 0.1 ° C per 5 min till 20 ° C, ca 24 timmar totalt.
      Obs: Fem parallella experiment kan köras samtidigt eller därefter i glödgning steg för varje ändlig rektangel sammansättning.

3. infödda Sidanalys

  1. Förbereda en 10% infödd sida följande steg 1,9 utom komponenten urea.
  2. För kontrollprover av c64bp och c84bp, lägga till 2 µL av varje församling lösning och 1 µL lastning dye till 3 µL av TE buffert som kontroller separat. För varje andra församlingar som anges i figur 3, tillsätt 1 µL av varje församling lösning och 1 µL lastning dye till 4 µL av TE buffert.
  3. Injicera varje av ovanstående lösningar till en gel väl. Tillsätt 5 µL av DNA-markör (25-500 bp) i en separat brunn för referens.
  4. Kör gelen i ca 4 timmar vid 10 V/cm i ett is vattenbad. Den xylen cyanol FF kommer slut på glasskivan.
  5. Använd gummihandskar och skyddsglasögon för att skydda hud och ögon. Ta gelen ur glasplattan och fördjupa det i 100 mL avjoniserat vatten med 10 µL av en nukleinsyra gel fläck i 30 min.
    Varning: Nukleinsyra gellösningen fläcken är giftiga.
  6. Observera gelen i en UV-imaging system och ta en bild av den färgade gel (figur 3).

4. rening av ändliga galler

  1. Förbereda en native 2% agarosgel för elektrofores rening av ändliga galler.
    1. Blanda 1 g agaros pulver, 5 mL 10 x TBE· Mg buffert (89 mM Tris, 89 mM borsyra, 2 mM EDTA, pH 8,0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 2 µL av nukleinsyra gel fläcken och 47,5 mL avjoniserat vatten i en flaska med 250 mL i triangeln. Koka blandningen tills bubblorna blir liten och tät. Lägga till varmt vatten i flaskan till en total volym om 50 mL och en koncentration av 2% agaros.
    2. Använd tjocka handskar. Häll gellösningen i en plast gel låda med 7 x 10 x 1 cm3 (bredd × längd × tjocklek). Infoga en 1,5 mm tjock och 12, väl gel kam. Vänta tills gelen svalna till rumstemperatur. Vid behov, placera gelen i kylskåp 4 ° C.
      Varning: Tänk på skållning eftersom lösningen är mycket varmt.
    3. Lägg till 0,5 x TBE· Mg buffert i elektrofores systemet. Prerun gelen på 5 V/cm för 20 min i en ice vattenbad vid en konstant spänning på 50 V.
    4. Injicera 20 µL av den ändliga galler lösningen bereddes i steg 2,3 i varje agarosgel väl och tillsätt 5 µL av en DNA-markör (100-3000 bp) till en separat väl. Kör gelen för 2 h vid 5 V/cm i ett is vattenbad.
    5. Använd gummihandskar och skyddsglasögon för att skydda hud och ögon. Klipp ut målet gel band med en position liknande 1000 bp markören under UV-ljus och skiva dem i fina bitar och placera de krossade gelerna in ett filter kolumn8.
    6. Centrifugera kolumnen vid 2000 x g i 5 minuter vid 4 ° C. Extrahera provlösningen genom kolonnen. Samla lösningen för AFM imaging.
  2. Rena ändliga galler genom PEG nederbörd.
    1. Blanda 50 µL av den ändliga galler lösningen bereddes i steg 2.3 med en lika stor volym 15% PEG8000 (w/v) buffert (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA och 505 mM NaCl)22. Centrifugera lösningen vid 18.000 × g vid 4 ° C i 30 min.
    2. Avlägsna supernatanten och tillsätt 100 µL av PEG buffert. Upprepa centrifugeringen.
    3. Efter bort supernatanten, lös pelleten i 1 x TAE· Mg buffert för AFM avbildning.
      Obs: Rening är nödvändigt för de ändliga galler av 5 × 6 cDAO-c64nt-O och 5 × 6 cDAO-c 74 & c84nt-O för AFM imaging och andra applikationer. Om avkastningen är för låg, öka hastigheten med centrifugering. Om produkten inte är ren nog, upprepa steg 4.2.2.

5. AFM Imaging

  1. För c64nt nanotråd, c84nt nanotråd, acDAO-c64nt-E insättning oändlig 2D galler av cDAO-c64nt-E(O) och cDAO-c84nt-E(O), 2 μL av glödgad prov på en färsk klyvs glimmer yta. Lämna för 2 min för adsorption av DNA galler till glimmer ytan. Tvätta ytan med 100 µL avjoniserat vatten två gånger och torka den med tryckluft.
  2. Få AFM bilder av oändlig DNA galler i luften genom att skanna glimmer ytan med trekantiga AFM sonder under trycka läge. Ange följande parametrar för skanning: Skanna storlek 0,5 ~ 5 µm, scan resolution av 512 linjer och skanna frekvens på 3,5 Hz (figur 4).
  3. För ändliga DNA galler 5 × 6 cDAO-c64nt-O och 5 × 6 cDAO-c 74 & c84nt-O, insättning 80 µL av 1 x TAE· Mg buffert på en färsk klyvs glimmer yta. Sedan Tillsätt 5 µL av ändliga prover in i bufferten. Lämna för 2 min för adsorption av DNA galler till glimmer ytan. Lägga till en annan 50 µL av 1 x TAE· Mg buffert på AFM sonden.
  4. Få AFM bilder av ändliga DNA galler i vätska genom att skanna glimmer ytan med trekantiga AFM sonder under trycka läge. Ange följande parametrar för skanning: Skanna storlek 0,5-1 µm, scan resolution av 256 rader och skanna hastighet av 1,5 Hz (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cirkulära DNA flyttas något långsammare än dess föregångare linjära DNA i denatureringen sida (figur 2) eftersom pore inuti cirkulär DNA blir penetrerad och efterbliven gel fibrer23,24,25. Den rätta ligering reaktion effektiviteten för oligo-monomer ringbildning beror på substrat sekvens och koncentration, reaktion temperatur, tid, etc. Som koncentrationen av en föregångare linjära DNA är tillräckligt hög på omkring 3,5 µM, ringbildning produkter av c64nt (eller c84nt) och föregångare hänvisningen i detta protokoll kan vara direkt skugga som band i TLC plattan under UV-ljus utan att dö. Om banden av cirkulära DNA är vaga eller osynliga, som indikerar ett fel i ligatur reaktionen eller en mycket låg produkt direktavkastning. Ibland finns det två band ovanför linjär föregångare bandet, hänvisar en ytterligare oligo-dimer ring utom rätta oligo-monomer ringen. Bara lämna högre banden ensam och samla de lägre vibrationerna. De rena cirkulär DNA-produkterna kan ses som vitt pulver i röret efter vakuumtorkning. Med undantag för denatureringen sidan, kan DNA renhet också mätas av UV spektrometer. Peak absorptionen av DNA är på 260 nm. Två vanliga kriterier för DNA renhet är absorptionen förhållandet mellan 280 nm/260 nm vid 1,8 och som 280 nm/230 nm vanligtvis i intervallet 2,0-2,2. Om de ovanstående två skadekvoterna avviker från schablonvärden, bör resterna extraheras igen genom följande steg 1,18-1,20. Avkastningarna av c64nt och c84nt för den rätta oligo-monomer ringbildning värderas till mellan 30-60% enligt detta protokoll.

Infödda sidanalys ger en hel del information om motivets stabilitet, renhet, styvhet, församlingen funktionsläget av monomer eller polymer, etc (figur 3). C64nt montering familjer c64bp, HJ-c64nt, åhj-c64nt, cDAO-c64nt och acDAO-c64nt har endast en tydlig och ren band för varje sammansättning, som representerar de är stabila monomer motiv. Medan c84nt församlingen familjer HJ-c84nt, tHJ-c84nt och cDAO-c84nt plattor har fläckar runt deras viktigaste band, som visar mindre biprodukter förutom målet monomer motiven. Oavsett de mindre biprodukter av felaktiga medarbetare, kan utmärkt cDAO-c84nt-O (E) galler med hög avkastning monteras. För att få en tydlig och ren elektrofores bild, lastning volymen bör vara högst 10 µL och mängden DNA ska vara 0,01 ~ 0.02 µg/mL.

Framgången för experiment utvärderas slutligen av 1D och 2D DNA nanostrukturer fotograferad av AFM (figur 4 och figur 5). Varje församling har sin egen morfologiska egenskaper i mikrometer skalan som nanorör, nanobanden, nanospirals, nanotrådar, etc. Dessutom detaljerade texturer för DNA församlingar i nanometerskalan korrelerade till deras teoretiska cirkulär kakel storlek och organisation lägen mycket väl är respektive nyckeln för verifiering av framgångsrika och korrekt montering. Därför skall både panoramautsikt och högupplösta AFM bilder i mikrometer och nanometer skalor erhållas. Val av AFM metoder och sonder är avgörande för de AFM bilderna av hög kvalitet. Scan kraft bör justeras så små som 50 pN26. Om scan kraften är alltför stor, skulle det skada DNA nanostrukturella mönster. Den miljön renligheten är en annan viktig parameter att få en ren och vacker högupplösta AFM bilden i vätska. Alla buffertar måste filtreras genom 0,22 µm filter; de sondhållaren och pincett måste tvättas av rengöringsmedel och sköljas av avjoniserat vatten. Om miljön är förorenad av partikulära rester, skulle sondens spets vara skadad eller clung av partiklar i bufferten, vilket påverkar kvaliteten på AFM bilder.

Figure 1
Figur 1 . Syntesen av cirkulära DNA. Flöde diagrammet representerar hur en lång 5'-fosforyleras linjär oligonukleotiden i blått utvecklas till en cirkulär DNA-molekyl. De två korta röda trådar representerar de splint oligonukleotider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Denatureringen sida fotografi av DNA ringbildning produkter under UV-ljus utan att dö. En föregångare linjär 64nt DNA band är den längst till vänster körfältet och dess ringbildning produkter av cirkulära 64nt (c64nt) DNA visas som 9 band på samma horisontella nivå i andra 9 lanes. I c64nt 9 band kommer att skäras av för att abstrahera cirkulär DNAs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Native sida fotografier efter döende och Schematisk dubbel-spiralformade modeller av cirkulära plattor. Båda polymerer av c64nt nanotråd och c84nt nanotråd representeras av deras enklaste fällbara enhet celler, där linje de två punkter ovan och nedanför varje enhet cell ange enhet oändlig celljusteringen vertikalt upp och ner, med lika avstånd mellan Duplex till formuläret nanotrådar. Monomer cirkulära plattor av c64bp, c84bp, HJ-c64nt, åhj-c64nt, HJ-c84nt och tHJ-c84nt i har A) inga utskjutande överhäng av deras ringar, medan cDAO-c64nt, acDAO-c64nt och cDAO-c84nt i B) har båda blunt-slutade 10 bp överhäng respektive. För sekvenser, hänvisas till de tabell av DNA-sekvenser. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur17Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. AFM bilder av typiska 1D och 2D oändlig DNA församlingar skannas i luft. C64nt nanotråd A), B) oändlig acDAO-c64nt-E, C) oändlig cDAO-c64nt-E, D) oändlig cDAO-c64nt-O, E) oändlig cDAO-c84nt-E och F) oändlig cDAO-c84nt-O är glödgas av klibbiga slutet sammanhållning. Alla textur detaljer i dessa AFM bilder är i linje med kakel storlekar och organisation lägen mycket väl. För sekvenser, hänvisas till de tabell av DNA-sekvenser. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur17Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . AFM bilder av ändliga rektangel församlingar skannas in vätska. Ändliga rektangel montering av A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O består av 32 cDAO-c64nt sub kakel, och B) 5 × 6 cDAO-c 74 & 84nt-O består av 12 cDAO-c74nt och 20 cDAO-c84nt sub kakel. För sekvenser, hänvisas till de tabell av DNA-sekvenser. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur17Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell över DNA-sekvenser. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De protokoll som presenteras i denna artikel fokuserar på syntesen av små cirkulära DNA-molekyler och montering av DNA nanostrukturer. De flesta av slumpmässigt sekvenserade DNA-mönster kan användas i detta protokoll. Renhet av cirkulär DNAs är avgörande för framgången av DNA församlingar. Produktionen avkastningen av ringbildning kan förbättras genom att sänka koncentrationen av 5'-fosforyleras linjära DNA; emellertid kommer detta öka arbetsbelastningen för att producera samma mängder av cirkulär DNAs. Längden på skena DNA-strängar påverkar också rätt ligering reaktionen, den är optimerad för att vara runt 20 nukleotider långa med både c64nt och c84nt.

En lämplig koncentration av magnesium katjoner (t.ex., 12,5 mM) i lösningen under och efter montering är mycket viktiga för bildandet och underhållet av DNA nanostrukturer. Således en magnesium ering koncentration av 12,5 mM hålls alltid under processerna för glödgning, infödda sida, agaros gel-elektrofores och PEG buffert centrifugering reningar, AFM imaging, etc.

För ändliga rektangel sammansättningar av 5 × 6 cDAO-c64nt-O och 5 × 6 cDAO-c 74 & 84nt-O, agaros gel rening inte påverkar textur detaljer, medan PEG buffert centrifugering rening skadar textur Detaljer av DNA nanostrukturer i den högupplösta AFM bilder.

Dra nytta av stabilitet och styvhet av cirkulära plattor, det är mycket lättare att producera välorganiserad och stora enda kristallina 2D galler från cirkulär moduler än från linjär kakel och scaffolded origami9,11, även om extra arbete behövs för att syntetisera och rena de cirkulära DNA-molekylerna. Med endast en cirkulär DNA som samma core struktur, kan många cirkulär moduler genereras med olika överhäng; med hjälp av specifika klibbiga slutet struktur av överhäng kan ändliga nanostrukturer byggas; denna strategi minskar arbetsbördan och kostnaden för ändliga nanostrukturer. En betydande fördel med cirkulära DNA nanostrukturer är upplösningen av sekundära och tertiära strukturer DNA-molekyler och deras nyckelelement såsom Holliday korsningen från textur Detaljer av enda kristallina galler. 1D, 2D och 3D nanostrukturer byggt från cirkulär moduler och deras potentiella tillämpningar inom biologi, medicin och nano-teknik kommer att bli en ny familjemedlem av DNA nanoteknik i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för finansiellt stöd från NSFC (bidrag nr 91753134 och 21571100), och den nyckel laboratorium av bioelektronik av Southeast delstatsuniversitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32, (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394, (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121, (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301, (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126, (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138, (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338, (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6, (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5, (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136, (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8, (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19, (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5, (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1, (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78, (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55, (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55, (15), 1579 (1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41, (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9, (5), 1113-1130 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics