Stabil DNA motiver, 1D og 2D nanostrukturer bygget fra små cirkulære DNA molekyler

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol for T4 ligatur og denaturering side rensning af små cirkulære DNA molekyler, udglødning og indfødte SIDERS analyse af cirkulære fliser, montage og AFM billeddannelse af 1D og 2D DNA-nanostrukturer samt Agarosen gel elektroforese og centrifugering rensning af finite DNA-nanostrukturer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol for syntese af små cirkulære DNA molekyler, Udglødning af cirkulære DNA motiver, og opførelsen af 1D og 2D DNA-nanostrukturer. I årtier, er den hurtige udvikling af DNA nanotechnology tilskrives brugen af lineære DNAs som udgangsmaterialer. For eksempel, er DAO (dobbelt crossover, antiparallel, ulige halv-vender) flise kendt som en byggesten for opførelsen af 2D DNA lattices; den centrale struktur af DAO er lavet af to lineære enkeltstrenget (ss) oligonukleotider, ligesom to reb gør en højre hånd granny knude. Heri, en ny form for DNA fliser kaldet cDAO (koblede DAO) er bygget ved hjælp af en lille cirkulær ss-DNA i c64nt eller c84nt (cirkulære 64 eller 84 nukleotider) som stillads strand og flere lineær ss-DNAs som de korte tråde. Perfekt 1D og 2D nanostrukturer samles fra cDAO fliser: uendelig nanowires, nanospirals, nanorør, nanoribbons; og endeligt nano-rektangler. Detaljerede protokoller er beskrevet: 1) forberedelse af T4 ligase og rensning af denatureringen side (polyacrylamid gelelektroforese) i små cirkulære oligonukleotider, 2) Udglødning af stabil cirkulære fliser, efterfulgt af indfødte SIDERS analyse, 3) montering af uendelig 1D nanowires, nanorings, efterfulgt nanospirals, uendelig 2D lattices af nanorør og nanoribbons og finite 2D nano-rektangler, af AFM (Atomic Force mikroskopi) billeddannelse. Metoden er enkel, robust og overkommelige for de fleste labs.

Introduction

DNA-molekyler er blevet brugt til at bygge mange typer af nanostrukturer i årtier. Typiske Motiverne omfatter DAE (dobbelt crossover, antiparallel, selv halv-sving) og DAO fliser1,2,3, stjerne fliser4,5,6,7, single strandede (ss) fliser8,9,10, og DNA origami11,12,13. Disse DNA motiver og lattices er samlet fra lineær ss-DNAs. For nylig, andre, og vi har rapporteret anvendelse af cirkulære ss-oligonukleotider som stilladser at bygge motiver, 1D nanorør og 2D lattices14,15,16,17. Ved at indsætte en Holliday junction (HJ)18,19,20,21 i midten af c64nt, kan et par af to koblede DAO fliser være dannet17. Denne nye cDAO motiv og dets afledninger er stabil og stiv nok til at samle 2D DNA lattices op til 3 × 5 µm2. I dette papir bruger vi udtrykket "cirkulær flise", der defineres som en stabil DNA komplekst molekyle konstrueret med en cirkulær stillads og andre lineære hæfteklammer af ss-oligonukleotider, og et andet ord for "lineær flisen", som er bygget fra et komplet sæt af lineær SS-oligonukleotider.

Denne protokol demonstrerer, hvordan at konstruere fem former for DNA nanostrukturer med små cirkulære DNA molekyler som stilladser: 1) uendelig 1 D c64nt og c84nt nanowires, 2) uendelig 2D cDAO-c64nt-O og cDAO-c64nt-E (-O repræsenterer et ulige antal 5 halv-sving og -E repræsenterer en nummer 4 halv-sving) lattices, 3) uendelig 2D cDAO-c84nt-O og cDAO-c84nt-E lattices, 4) finite 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O-rektangler, 5) uendelig 1 D acDAO-c64nt-E nanorings og nanospirals (henvises til Figur 3-5 for den skematiske tegninger og billeder af de ovenstående fem former for DNA nanostrukturer). 1D c64nt og c84nt nanowires er samlet fra hver c64nt og c84nt stillads forbundet med to lineære hæfteklammer henholdsvis. Hver cirkulære flise cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt eller cDAO-c84nt er udglødet fra dens tilsvarende stillads af c64nt, c74nt eller c84nt med fire lineær hæfteklammer henholdsvis. De uendelige 2D lattices er samlet fra den samme type af to cirkulære fliser med forskellige sekvenser. De to finite 2D rektangel lattices er samlet fra to sæt af 32 cirkulære sub fliser hhv. For at spare penge, bruges kun én-sekventeret c64nt, c74nt og c84nt som den respektive stillads mens forskellige udhæng er vant til at anneal 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt og 20 cDAO-c84nt cirkulære sub fliser henholdsvis i den første sub flise udgloedning skridt, derefter Bland de tilsvarende 32 cirkulære sub fliser og anvende anden gitter udglødning skridt for at samle finite 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O lattices, henholdsvis. Definitely, anderledes sekventeret cirkulære stilladser kan blive vedtaget for at samle en række begrænsede størrelse nanostrukturer, men det vil koste flere penge og arbejde. Uendelig 1D acDAO-c64nt-E nanorings og nanospirals er udglødet fra one-sekventeret asymmetriske acDAO-c64nt fliser med lineær forbindelser af et lige antal 4 halv-sving. Der er to tilgange til at samle uendelig 2D lattices fra cirkulære fliser cDAO-c64nt og cDAO-c84nt, som er kendetegnet ved de intertile afstande af et lige antal 4 og et ulige antal 5 halv-sving henholdsvis. Den tidligere kræver alle fliser skal justeres ens; sidstnævnte kræver vekslen af ansigterne på to tilstødende fliserne langs de heliske akser. Hvis flisen er stive og plane, såsom cDAO-c64nt, vil begge tilgange generere planar nanoribbons; Hvis flisen er buet i én retning, såsom cDAO-c84nt, intertile tilslutning af et lige antal 4 halvt sving vil generere nanorør, hvorimod intertile tilslutning af et ulige antal 5 halve omgange vil producere planar nanoribbons på grund af afskaffelsen af krumning-partisk vækst af alternative justering af buet fliser. Den succesfulde forsamling af 1D og 2D DNA nanostrukturer fra cirkulære fliser angiver flere fordele ved denne nye tilgang: håndhæves stabilitet og stivhed af cirkulære fliser over lineær fliser, chiral fliser til montering af asymmetrisk nanostrukturer som nanorings og nanoribbons, nye visioner på forståelse DNA mekanik og molekylære strukturer, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af cirkulære DNAs

  1. Bruge alle lineære DNAs leveret af kommercielle virksomheder direkte uden yderligere rensning.
  2. Der centrifugeres DNA-prøver på 5.000 × g for 5 min til at indsamle alle DNA pellets i bunden af rørene. Tilsættes en passende mængde af TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) opløses DNA.
  3. Måler koncentrationen af "a" ng/µL for hver ss-DNA løsning ved hjælp af en mikro UV spektrometer på 260 nm. Konvertere "en" ng/µL til "b" µM efter b = en × 103 / (molekylevægt af DNA strand). Justere mængden af TE løsning at gøre en 10 µM DNA stamopløsning.
  4. Med T4 DNA ligase tilsluttes 3' og 5' enderne af 5'-fosforyleret lineære DNA skabeloner ( figur 1) c64nt, c74nt og c84nt leveret fra kommercielle virksomheder direkte.
  5. Bland den 5'-fosforyleret lineære DNA strand (3,5 µM) og dens tilsvarende skinne DNA strand (4,5 µM) i 80 µL TE buffer i en 200 µL PCR reagensglas15. Inkuber røret i en åben termo flaske fyldt med 95 ° C vand. Køle ned det varme vand til stuetemperatur (25 ° C) i ca 2-3 timer under lab atmosfære.
  6. Tilsæt 10 µL af 10 x T4 buffer (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, 1 mM ATP) og 10 µL af T4 ligase (300 U/µL) til blandingen til en endelige rumfang af 100 µL. Inkuber blandingen i en thermocycler i 16 timer ved 16 ° C.
    Bemærk: Ovenstående DNA koncentrationer og reaktion volumen af ~ 100 µL er optimeret til høj ligatur effektivitet og den højt udbytte af korrekte oligo-monomer cyclization. Køre to eller flere rør af ligatur reaktioner på samme tid efter forsøgets udformning. En alternativ inkubation procedure for ligatur udskiftning trin 1,6 er 4 timer ved 25 ° C.
  7. Efter inkubation, inaktivere T4 ligase i 95 ° C vand for 5 minminutes. Derefter overføre røret til en is vandbad og Inkuber i 5 minutter for at køle ned.
  8. Tilsæt 10 µL af 10 x Exonuclease jeg buffer og 10 µL af Exonuclease I (5 U/µL) til quenched blandingen og inkuberes rør ved 37 ° C i et vandbad i 30 min. til selektivt fordøje de resterende lineær DNAs og lade de circularized DNAs intakt.
  9. Forberede en 10% denatureringen side gel.
    1. Bære gummihandsker og beskyttelsesbriller, når du forbereder side gel i stinkskab. Tilføje 6,67 mL 30% (w/v) acrylamid/bisacrylamide løsning (19:1), 2 mL af 10 x TAE· Mg buffer (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8,0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g urea (7 M) og deioniseret vand til en endelige mængden af 20 mL i en 40 mL-centrifugerør.
      Forsigtig: 30% (w/v) acrylamid/bisacrylamide løsning (19:1) løsning er giftigt.
    2. Tilføj 20 µL af tetramethylethylenediamine (TEMED) og 100 µL af ammonium persulfat (APS, 10% w/v) til 40 mL tube før overførsel gelopløsning til elektroforese systemet straks. Indsæt en 1,5 mm tyk og 10-well kam. Vent mindst 20 min indtil gelopløsning er størknet.
    3. Angive en konstant spænding på 80 V for en gel 85 × 80 × 1,5 mm3 (bredde × højde × tykkelse). Tilføj 1 x TAE· Mg buffer til elektroforese system og prerun gel i 20 min. på 10 V/cm.
  10. Sætte PCR test tube fra trin 1.8 i 95 ° C vand i 5 min. til at inaktivere Exonuclease jeg. Derefter overføre røret til en is vandbad og inkuberes i en anden 5 min.
  11. Tilføj 20 µL af formamid i røret til en endelige mængden af 140 µL og bland løsningen. Distribuere løsning til 7-9 denaturering side gel brønde ligeligt med 16-20 µL af hver gel godt. Bland 2 µL for at indlæse farvestof (0,05% bromophenol blå, 0,05% xylen cyanol FF, 60% glycerol, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7,6) med 8 µL af den tilsvarende forløber lineære DNA (10 µM) og indsprøjtes blandingen til en separat godt for reference.
    Bemærk: Tilsætning af formamid er at øge tætheden af ladning opklaring nemlig synker til bunden af side gel godt og også for at frigøre nogle dobbelt strandede DNA restkoncentrationer.
  12. Kør gelen i ca 2 timer på 10 V/cm og stop løb når xylen cyanol FF er på 2/3 stilling glasplade med det blotte øje.
  13. Bære gummihandsker og beskyttelsesbriller til at beskytte hud og øjne. Tag gelen ud af glasplade. Placer gel på en fluorescerende TLC (tyndtlagskromatografi) plade. Cut off gel målzoner med et barberblad så nøjagtigt så skygget af UV-bestråling (figur 2).
    Forsigtig: UV-lys er skadeligt for øjnene og skind.
    Bemærk: Under UV-bestråling ved 254 nm, DNA vil absorbere lyset og kaste en skygge på TLC-pladen. Den cirkulære DNA løb lidt langsommere end dens tilsvarende forløber lineære DNA. Nogle ufordøjet lineær DNAs og uønskede cirkulære DNAs i små mængder, som omgiver skygget target band vil forurene cirkulært DNA, hvis de er indsamlet.
  14. Overføre gel bands i en 2,0 mL microcentrifuge rør. Luft tørre eller blæse tør gel bands og derefter mash geler til en pasta af en spatel eller fladtrykte glasstav. Sørg for gel har været helt knust i en pasta, som er kritiske for den højt udbytte af cirkulære DNA. Tilføje dobbelte af gel volumen deioniseret vand ind i røret og ryste røret ved rumtemperatur natten over.
  15. Filtrer blandingen for at indsamle analysere i en 2,0 mL microcentrifuge tube. Genoprette eventuelle resterende DNA ved at skylle med lille volumen af deioniseret vand og filter igen at kombinere analysere.
  16. Uddrag elueringsvæsken med lige saa stort volumen af n-butanol. Gentag denne procedure, indtil den vandige volumen er reduceret til ca. 200 µL.
  17. Tilsættes 500 µL absolut ethanol (−20 ° C) og 20 µL af 3 M NaOAc (pH 5.1) til blandingen DNA fældningen. Gemme tube −20 ° C i 30 min.
  18. Centrifugeres tube på 12.000 × g i 10 min. ved 4 ° C, supernatanten. Resterende DNA bundfaldet er ca. 100 µL i røret.
  19. Tilføje 600 µL af 75% ethanol (−20 ° C) til røret og gemme det på −20 ° C i 30 min. Derefter centrifugeres på 12.000 × g i 10 min. ved 4 ° C, supernatanten. Resterende DNA bundfaldet er ca. 100 µL løsning i røret igen. Gentag proceduren to gange.
  20. Efter den sidste centrifugering, ved at fjerne supernatanten så meget som muligt. Tørre resterne med en vakuum koncentrator.
  21. Gemme den renset cirkulære DNA i røret på −20 ° C.
  22. Resuspend cirkulære DNA i TE buffer til at gøre en 10 µM cirkulære DNA stamopløsning ifølge trin 1.3 når det er nødvendigt.

2. Udglødning af forsamling løsninger

  1. Forberede hver flise eller nanostructural assembly-løsning af c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt og acDAO-c64nt-E med en designet sæt af lineære og cirkulære DNAs one-pot udglødning.
    1. For hver forsamling løsning, Bland 2 µL af 10 x TAE· Mg buffer, 1 µL af hver DNA stamopløsning af et sæt af lineære og cirkulære tråde i samme molære forhold, og yderligere TE buffer i en 200 µL PCR test tube til en endelig koncentration på hver strand på 0,5 µM og en endelige mængden af 20 µL. Anneal forsamling løsning i en termo flaske fra 95 ° C til 25 ° C over 48 timer.
  2. Forberede hver forsamling løsning af 2D uendelig lattices cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E og cDAO-c84nt-O med en designet sæt af lineære og cirkulære DNAs totrins udglødning.
    1. Forberede hver forløber sub flise montage løsning ved at blande 2 µL af 10 x TAE· Mg buffer, 1 µL af hver DNA stamopløsning af et sæt af lineære og cirkulære tråde i samme molære forhold, og yderligere TE buffer i en 200 µL PCR test tube til en endelig koncentration på 0,5 µM for hver linje og en endelige mængden af 20 µL. I den første sub flise udgloedning skridt, at anneal hver forløber sub flise løsning i en PCR thermocycler ved hjælp af en fast-lineær afkøling metode fra 95 ° C til 25 ° C over 2,5 h.
    2. Forberede hver forsamling løsning af de ovenstående fire uendelig lattices ved at blande 10 µL af hver af de to tilsvarende sub flise løsninger sammen til en endelig koncentration på 0,25 µM for hver linje. I det andet gitter udglødning skridt, bind 20 µL blandingen i en PCR thermocycler ved en langsom afkøling metode opholder sig på 50 ° C i 2 timer og køle ned med en sats på 0,1 ° C pr. 5 minutter til 20 ° C, omkring 24 timer i alt.
      Bemærk: To parallelle eksperimenter kan køre samtidig eller senere i det andet udgloedning trin for hver 2D uendelig gitter.
  3. Forberede forsamling løsninger af to finite rektangel forsamlinger af 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O to-trins udglødning.
    1. Forberede hver forløber sub flise montage løsning ved at blande 1 µL af 10 x TAE· Mg buffer, 0,5 µL af hver DNA stamopløsning af et sæt af lineære og cirkulære tråde i samme molære forhold, og yderligere TE buffer i en 200 µL PCR test tube til en endelig koncentration på 0,5 µM for hver linje og en endelige mængden af 10 µL. I den første udgloedning skridt, at anneal hver forløber sub flise løsning i en PCR thermocycler ved hjælp af en fast-lineær afkøling metode fra 95 ° C til 25 ° C over 2,5 h.
    2. Forberede hver finite rektangel gitter forsamling løsning ved at blande 32 x (2 µL af hver sub flise løsning) sammen i en 200 µL PCR test tube til en endelig koncentration på ~ 15 nM for hver sub flise og en endelige mængden af 64 µL. I andet trin af optimerende bind 64 µL blandingen i en PCR thermocycler ved en langsom afkøling metode opholder sig på 50 ° C i 2 timer og køle ned med en sats på 0,1 ° C pr. 5 min til 20 ° C, omkring 24 timer i alt.
      Bemærk: Fem parallelle eksperimenter kan køres samtidig eller senere i det andet udgloedning trin for hver finite rektangel forsamling.

3. hjemmehørende SIDERS analyse

  1. Forberede en 10% hjemmehørende side følgende trin 1,9 med undtagelse af urea-komponent.
  2. For kontrolprøver af c64bp og c84bp, tilføje 2 µL af hver forsamling løsning og 1 µL af lastning farvestof til 3 µL af TE buffer som kontrollerne separat. For hver af andre assemblies, der er angivet i figur 3, tilføje 1 µL af hver forsamling løsning og 1 µL af lastning farvestof til 4 µL af TE buffer.
  3. Indsprøjtes hver af de ovenstående løsninger til en gel godt. Tilsæt 5 µL DNA markør (25-500 bp) til en separate brønd for reference.
  4. Kør gelen i ca 4 timer på 10 V/cm i et bad med is vand. Xylen cyanol FF vil løbe tør for glasplade.
  5. Bære gummihandsker og beskyttelsesbriller til at beskytte hud og øjne. Tag gelen ud af glasplade og fordybe den i 100 mL med deioniseret vand med 10 µL af en nukleinsyre gel pletten i 30 min.
    Forsigtig: Nukleinsyre gel pletten løsning er giftigt.
  6. Observere gel under en UV-imaging system og tage et billede af den farvede gel (figur 3).

4. rensning af Finite Lattices

  1. Forberede elektroforese rensning af finite lattices en native 2%-agarosegel.
    1. Bland 1 g Agarosen pulver, 5 mL af 10 x TBE· Mg buffer (89 mM Tris, 89 mM borsyre, 2 mM EDTA, pH 8,0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 2 µL af nukleinsyre gel pletten og 47,5 mL deioniseret vand i en 250 mL trekant flaske. Kog blandingen indtil boblerne bliver små og tætte. Tilføje varmt vand i flasken til et samlet volumen på 50 mL og en koncentration af 2% agarosegelelektroforese.
    2. Bær tykke handsker. Hæld gelopløsning i en plastik gel æske 7 x 10 x 1 cm3 (bredde × længde × tykkelse). Indsæt en 1,5 mm tyk og 12-godt gel kam. Vente på gel til at køle ned til stuetemperatur. Hvis det er nødvendigt, skal du sætte gelen i 4 ° C køleskab.
      Advarsel: Vær opmærksom på skoldning fordi løsningen er meget varmt.
    3. Tilføje 0,5 x TBE· Mg buffer i ordningen elektroforese. Prerun gel på 5 V/cm i 20 min. i et bad med is vand på en konstant spænding af 50 V.
    4. Indsprøjtes 20 µL af den finite gitter løsning forberedt i trin 2.3 i hver agarosegel godt og tilsæt 5 µL af en DNA markør (100-3.000 bp) til en separat godt. Køre gel for 2 h 5 V/cm i et bad med is vand.
    5. Bære gummihandsker og beskyttelsesbriller til at beskytte hud og øjne. Cut målet gel bands med en stilling svarende til 1.000 bp markøren under UV-lys og skær dem i fine stykker og læg de knuste geler i et filter kolonne8.
    6. Centrifugeres kolonnen på 2.000 x g i 5 min. ved 4 ° C. Uddrag prøveopløsningen gennem kolonnen. Indsamle løsning til AFM billeddannelse.
  2. Rense finite lattices af PIND nedbør.
    1. Mix 50 µL af de finite gitter rengøringsopløsning i trin 2.3 med en tilsvarende mængde af 15% PEG8000 (w/v) buffer (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 EDTA og 505 mM NaCl)22. Der centrifugeres løsning på 18.000 × g ved 4 ° C i 30 min.
    2. Fjern supernatanten og tilsæt 100 µL af PIND buffer. Gentag centrifugeringen.
    3. Efter fjernelse af supernatanten, opløse pellet i 1 x TAE· Mg buffer til AFM billeddannelse.
      Bemærk: Rensning er nødvendig for de finite lattices 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O til AFM billedbehandling og andre programmer. Hvis udbyttet er for lav, øge centrifugering hastighed. Hvis produktet ikke er ren nok, skal du gentage trin 4.2.2.

5. AFM Imaging

  1. For c64nt nanotråd, c84nt nanotråd, acDAO-c64nt-E deponere uendelig 2D lattices af cDAO-c64nt-E(O) og cDAO-c84nt-E(O), 2 μl af udglødet prøve på en frisk kløvet glimmer overflade. Lad for 2 min for adsorption af DNA lattices glimmer overflade. Vask overfladen med 100 µL med deioniseret vand to gange og tør det af trykluft.
  2. Få AFM billeder af uendelig DNA lattices i luften ved at scanne glimmer overflade med trekantede AFM sonder under trykke tilstand. Angiv følgende parametre for scanningen: Skan størrelsen på 0,5 ~ 5 µm, scanne opløsning på 512 linjer, og scan rate af 3,5 Hz (figur 4).
  3. For finite DNA lattices 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O, deponere 80 µL af 1 x TAE· Mg buffer på en frisk kløvet glimmer overflade. Derefter tilsættes 5 µL af finite prøver i bufferen. Lad for 2 min for adsorption af DNA lattices glimmer overflade. Tilføje en anden 50 µL af 1 x TAE· Mg buffer på AFM sonden.
  4. Få AFM billeder af finite DNA lattices i væske ved scanning glimmer overflade med trekantede AFM sonder under trykke tilstand. Angiv følgende parametre for scanningen: Skan størrelse af 0,5-1 µm, scanne opløsning på 256 linjer, og scan rate af 1,5 Hz (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den cirkulære DNA flyttes lidt langsommere end sin forløber lineære DNA i denatureringen side (figur 2), fordi pore inde den cirkulære DNA er trængt og retarderede gel fibre23,24,25. Den korrekte ligatur reaktion effektivitet for oligo-monomer cyclization afhænger substrat sekvens og koncentration, reaktion temperatur, tid, osv. Som koncentrationen af et forstadie lineære DNA er høj nok på omkring 3,5 µM, cyclization produkter af c64nt (eller c84nt) og forløber reference i denne protokol kan være direkte skygget som bands i TLC-pladen under UV-lys uden at dø. Hvis bands af cirkulære DNA er uklare eller usynlig, som angiver en manglende reaktion ved ligatur eller en meget lav produkt udbytte. Nogle gange er der to bands ovenfor lineær forløber band, henviser en yderligere oligo-dimer ring med undtagelse af den korrekte oligo-monomer ring. Bare lade de højere bands alene og indsamle de lavere dem. De renset cirkulære DNA produkter kan ses som hvide pulver i røret efter vakuum tørring. Bortset fra siden denaturering kan DNA renhed også måles ved UV spektrometer. Absorption peak af DNA er på 260 nm. To standardkriterier for DNA renhed er absorption forholdet mellem 280 nm/260 nm ved 1,8 og for 280 nm/230 nm almindeligt i rækken af 2,0-2,2. Hvis de ovennævnte to nøgletal afviger fra de standard værdier, skal resterne udvindes igen af følgende trin 1.18-1,20. Udbyttet af c64nt og c84nt til den korrekte oligo-monomer cyclization måles på vifte af 30-60% i henhold til denne protokol.

Native SIDERS analyse giver en masse information om det motiv stabilitet, renhed, stivhed, forsamling tilstand af monomere eller polymer, osv (figur 3). C64nt forsamling familier af c64bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, cDAO-c64nt og acDAO-c64nt har kun ét klart og rent band for hver samling, der repræsenterer de er stabile monomer motiver. Mens c84nt forsamling familierne af HJ-c84nt, tHJ-c84nt og cDAO-c84nt fliser har udstrygningspræparater omkring deres vigtigste bands, der angiver mindre biprodukter undtagen målet monomer motiver. Uanset de mindre biprodukter af forkert associates, kan fremragende cDAO-c84nt-O (E) lattices med høje udbytter samles. For at få en klar og ren elektroforese billede, lastning diskenheden skal ikke mere end 10 µL og mængden af DNA bør være 0,01 ~ 0,02 µg/mL.

Succesen med eksperimenter er endelig evalueret af 1D og 2D DNA nanostrukturer afbildet af AFM (figur 4 og figur 5). Hver forsamling har sin egen morfologiske træk i mikrometer skala som nanowires, nanorør, nanospirals, nanoribbons, osv. Derudover detaljerede teksturer af DNA forsamlinger i nanometer skala korreleret til deres teoretiske cirkulære flise størrelser og organisation modes meget godt er henholdsvis nøglen til verifikation af vellykkede og korrekt montering. Derfor skal der indhentes panoramaudsigt og høj opløsning AFM billeder i mikrometer og nanometer skala. Valg af AFM metoder og sonder er afgørende for høj kvalitet AFM billeder. Scan force bør justeres så små som 50 pN26. Hvis scanningen kraft er for stor, vil det skade DNA nanostructural mønstre. Den miljømæssige renlighed er en anden vigtig parameter at få en ren og smuk AFM billede i høj opløsning i væske. Alle buffere skal filtreres efter 0,22 µm filter; sonden indehaveren og pincet skal vaskes med rengøringsmiddel og skylles af deioniseret vand. Hvis miljøet er forurenet af partikler vragrester, ville sonde tip være beskadiget eller klyngede sig af partikler i bufferen, der således påvirker kvaliteten af AFM billeder.

Figure 1
Figur 1 . Syntese af cirkulære DNA. Flow diagram repræsenterer, hvordan en lang 5'-fosforyleret lineær oligonukleotid i blå udvikler sig til et cirkulært DNA-molekylet. De to korte røde tråde repræsenterer skinne oligonukleotider. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Denatureringen side fotografi af DNA cyclization produkter under UV-lys uden at dø. En forløber lineære 64nt DNA band er den længst til venstre vognbane og dens cyclization produkter af cirkulære 64nt (c64nt) DNA vises som 9 bands på den samme vandrette plan i andre 9 baner. De 9 bånd af c64nt vil blive afskåret for abstrahere cirkulære DNAs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Indfødte side fotografier efter døende og skematisk dobbelt heliske modeller af cirkulære fliser. Begge polymerer af c64nt Nanotråd og c84nt Nanotråd er repræsenteret af deres simpleste folde enhed celler, hvor de to justeret prikker over og under hver enhed celle angive uendelig justeringen af enhed celler lodret op og ned, med lige store afstande mellem dobbelthuse til form nanowires. Monomer cirkulære fliser af c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt og tHJ-c84nt i har A) ingen fremspringende udhæng ud af deres ringe, mens cDAO-c64nt, acDAO-c64nt og cDAO-c84nt i B) har begge blunt-ended 10 bp udhæng henholdsvis. Sekvenser, henvises til tabel af DNA-sekvenser. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere udgivne figur17Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. AFM billeder af typiske 1D og 2D uendelig DNA forsamlinger scannet i luften. A) c64nt nanotråd, B) uendelig acDAO-c64nt-E, C) uendelig cDAO-c64nt-E, D) uendelig cDAO-c64nt-O, E) uendelig cDAO-c84nt-E og F) uendelig cDAO-c84nt-O er udglødet af klistrede slutningen samhørighed. Alle tekstur detaljer i disse AFM billeder er i overensstemmelse med den flise størrelser og organisation tilstande meget godt. Sekvenser, henvises til tabel af DNA-sekvenser. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere udgivne figur17Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . AFM billeder af finite rektangel forsamlinger scannet i væske. Finite rektangel samling af A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O består af 32 cDAO-c64nt sub fliser, og B) 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O består af 12 cDAO-c74nt og 20 cDAO-c84nt sub fliser. Sekvenser, henvises til tabel af DNA-sekvenser. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere udgivne figur17Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel af DNA-sekvenser. Venligst klik her for at downloade denne fil. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De protokoller, der er præsenteret i denne artikel fokus på syntesen af små cirkulære DNA molekyler og samling af DNA nanostrukturer. De fleste af tilfældigt sekventeret DNA mønstre kan bruges i denne protokol. Renheden af cirkulære DNAs er afgørende for succes af DNA forsamlinger. Produktion udbyttet af cyclization kan forbedres ved at sænke koncentrationen af 5'-fosforyleret lineære DNA; Dette vil dog øge arbejdsbyrden for at producere de samme mængder af cirkulære DNAs. Længden af DNA-strenge, skinne påvirker også den korrekte ligatur reaktion, det er optimeret til at være omkring 20 nukleotider lange for både c64nt og c84nt.

En passende koncentration af magnesium kationer (fx., 12,5 mM) i løsning under og efter forsamling er meget vigtigt for dannelsen og vedligeholdelse af DNA nanostrukturer. Således en magnesium kation koncentration af 12,5 mM er altid holdes under processerne af udglødning, native side, Agarosen gelelektroforese og PIND buffer centrifugering purifications, AFM billedbehandling, osv.

For finite rektangel forsamlinger af 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O, Agarosen gel rensning ikke påvirker tekstur detaljer, mens PIND buffer centrifugering rensning skader tekstur detaljer af DNA nanostrukturer i den AFM højopløsningsbilleder.

Drage fordel af stabiliteten og stivhed af cirkulære fliser, det er meget nemmere at producere velorganiseret og store enkelt krystallinsk 2D lattices fra cirkulære moduler end fra lineær fliser og scaffolded origami9,11, selv om ekstra arbejde for at syntetisere og rense de cirkulære DNA molekyler. Med kun én cirkulære DNA som den samme kerne struktur, kan mange cirkulære moduler være genereret med forskellige udhæng; ved hjælp af specifikke klistrede slutningen samhørighedsfondene af udhæng kan finite nanostrukturer bygges; denne strategi reducerer arbejdsbyrden og udgifterne til finite nanostrukturer. En væsentlig fordel ved cirkulære DNA-nanostrukturer er opløsning af sekundære og tertiære strukturer af DNA-molekyler og deres nøgleelementer såsom Holliday krydset fra tekstur detaljer af enkelt krystallinsk lattices. 1D, 2D og 3D nanostrukturer bygget fra cirkulære moduler og deres potentielle anvendelser i biologi, medicin og nano-teknik vil blive et nyt familie medlem af DNA nanoteknologi i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for finansiel støtte fra NSFC (tilskud no. 91753134 og 21571100), og den nøgle laboratorium for bioelektronik af sydøst Statsuniversitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32, (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394, (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121, (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301, (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126, (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138, (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338, (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6, (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5, (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136, (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8, (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19, (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5, (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1, (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78, (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55, (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55, (15), 1579 (1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41, (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9, (5), 1113-1130 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics