Stabile DNA-Motive, 1D und 2D Nanostrukturen aus kleinen kreisförmigen DNA-Moleküle gebaut

Chemistry

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Summary

Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für T4 Ligatur und Geruchsstoffen Seite Reinigung der kleine kreisförmige DNA-Moleküle, Glühen und native Seitenanalyse der kreisförmigen Platten, Montage und AFM Imaging von 1D und 2D DNA Nanostrukturen sowie Agarose-gel Elektrophorese und Zentrifugation Reinigung des endlichen DNA Nanostrukturen.

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Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

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Abstract

Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Synthese der kleine kreisförmige DNA-Moleküle, kreisförmige DNA-Motive und Bau von 1D und 2D DNA Nanostrukturen glühen. Über Jahrzehnte ist die rasante Entwicklung der DNA-Nanotechnologie zur Verwendung von linearen DNA als die Ausgangsstoffe zurückzuführen. Beispielsweise ist die DAO (double Crossover, antiparallel, ungerade halbe Umdrehungen) Fliese bekannt als ein Baustein für den Bau der 2D DNA Gitter; die Kernstruktur des DAO besteht aus zwei lineare einzelsträngige (ss)-Oligonukleotide, wie zwei Seile machen einen rechten Oma Knoten. Hier werden eine neue Art von DNA-Fliesen genannt cDAO (gekoppelte DAO) mit einen kleinen kreisförmigen ss-DNA von c64nt oder c84nt gebaut (Rundschreiben 64 oder 84 Nukleotide) als Gerüst-Strand und mehrere lineare ss-DNA als Grundnahrungsmittel Stränge. Perfekte 1D und 2D Nanostrukturen aus cDAO Fliesen zusammengesetzt sind: unendliche Nanodrähte, Nanospirals, Nanoröhren, Nanoribbons; und endlichen Nano-Rechtecke. Ausführliche Protokolle werden beschrieben: (1) Vorbereitung von T4-Ligase und Reinigung durch Denaturierung (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) Seite der kleinen kreisförmigen Oligonukleotide, 2) Glühen von stabilen kreisförmigen Platten, gefolgt von native Seitenanalyse, (3) Montage der unendliche 1D Nanodrähte, Nanoringe, Nanospirals, unendliche 2D Gitter von Nanoröhren und Nanoribbons und endlichen 2D Nano-Rechtecke, gefolgt von AFM (Atomic Force Microscopy) Bildgebung. Die Methode ist einfach, robust und erschwinglich für die meisten Labore.

Introduction

DNA-Moleküle wurden verwendet, um viele Arten von Nanostrukturen über Jahrzehnte zu bauen. Typische Motive sind DAE (doppelte Crossover, antiparallel, noch halb-Umdrehungen) und DAO Fliesen1,2,3, Sterne Fliesen4,5,6,7, Einzelbett gestrandet (ss) Fliesen8,9,10und DNA Origami11,12,13. Diese DNA-Motive und Gitter sind aus linearen ss-DNAs zusammengesetzt. Vor kurzem berichteten andere und wir die Verwendung von kreisförmigen ss-Oligonukleotide als Gerüste, Motive, Nanoröhren 1D und 2D Gitter14,15,16,17zu bauen. Durch das Einfügen einer Holliday Junction (HJ)18,19,20,21 in der Mitte des c64nt, kann ein paar von zwei gekoppelten DAO Kacheln gebildeten17sein. Dieses neue cDAO Motiv und seine Derivate sind stabil und steif genug, um 2D montieren Salzgitter DNA bis zu 3 × 5 µm2. In diesem Papier verwenden wir eine Laufzeit von "kreisförmige Fliese", definiert als eine stabile komplexe DNA-Molekül mit einem kreisförmigen Gerüst und andere lineare Grundnahrungsmittel der ss-Oligonukleotide gebaut und ein weiterer Begriff "lineare Fliese", die aus einem vollständigen Satz von linear aufgebaut ist SS-Oligonukleotide.

Dieses Protokoll zeigt, wie Sie fünf Arten von DNA Nanostrukturen mit kleinen kreisförmigen DNA-Molekülen als Gerüste zu konstruieren: 1) unendliche 1D c64nt und c84nt-Nanodrähte, 2) unendliche 2D cDAO-c64nt-O und cDAO-c64nt-E (-O steht für eine ungerade Anzahl von 5 halbe Drehungen und -E entspricht einer geraden Anzahl von 4 halbe Drehungen) Gittern, 3) unendliche 2D cDAO-c84nt-O und cDAO-e c84nt Gitter, 4) endlichen 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O und 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O Rechtecke, 5) unendlich 1 D AcDAO-c64nt-E Nanoringe und Nanospirals (siehe Abbildung 3-5 für die schematische Zeichnungen und Bilder der oben genannten fünf Arten von DNA Nanostrukturen). Die 1D c64nt und c84nt-Nanodrähte werden aus jeder c64nt und c84nt Gerüst mit zwei linearen Heftklammern verbunden bzw. montiert. Jede Runde Kachel cDAO-c64nt, AcDAO-c64nt, cDAO-c74nt oder cDAO-c84nt ist von seiner entsprechenden Gerüst von c64nt, c74nt oder c84nt mit vier lineare Heftklammern bzw. geglüht. Die unendliche 2D Gitter sind aus dem gleichen Typ von zwei kreisförmigen Platten mit verschiedenen Sequenzen montiert. Die zwei endliche 2D Rechteck-Gitter werden jeweils aus zwei Sätzen von 32 Runden Sub-Platten montiert. Um Geld zu sparen, nur ein sequenziert c64nt, c74nt und c84nt dient als das jeweilige Gerüst während verschiedenen Überhängen verwendet werden, um die 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt und 20 cDAO-c84nt kreisförmigen Sub-Platten bzw. im ersten Sub Fliese Glühen Schritt, dann glühen Mischen Sie die entsprechenden 32 kreisförmigen Sub-Platten zusammen und auftragen Sie das zweite Gitter Glühen Schritt um die endlichen 5 × 6 cDAO-c64nt-O und 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O-Gittern, bzw. zu montieren. Auf jeden Fall, können anders sequenziert kreisförmige Gerüste zur Montage einer Vielzahl von endlicher Größe Nanostrukturen, verabschiedet, doch es mehr Geld und Arbeit kostet. Die unendliche 1D AcDAO-c64nt-E Nanoringe und Nanospirals sind aus einer sequenziert asymmetrische AcDAO-c64nt-Fliesen mit lineare Verbindungen von einer geraden Anzahl von 4 halbe Drehungen geglüht. Es gibt zwei Ansätze zum unendlichen 2D Gitter aus kreisförmigen Platten cDAO-c64nt und cDAO-c84nt, die sich durch die intertile Entfernungen von einer geraden Anzahl von 4 und eine ungerade Anzahl von 5 halbe Umdrehungen bzw. montieren. Ersteres erfordert alle Fliesen gleich ausgerichtet werden; Letzteres erfordert Wechsel von den Gesichtern der beiden benachbarten Fliesen entlang der spiralförmigen Achsen. Wenn die Fliese starr und planar, z. B. cDAO-c64nt ist, werden beide Ansätze planaren Nanoribbons erzeugen; Wenn die Fliesen in eine Richtung, wie z. B. cDAO-c84nt, die intertile Verbindung aus einer geraden Anzahl von 4 gekrümmt ist halbe Umdrehungen generiert Nanoröhren, während die intertile Verbindung aus einer ungeraden Zahl von 5 halbe Umdrehungen erzeugt planaren Nanoribbons durch Wegfall der Krümmung voreingenommen Wachstum durch alternative Ausrichtung der gebogene Fliesen. Die erfolgreiche Montage von 1D und 2D DNA Nanostrukturen aus kreisförmigen Platten zeigt mehrere Vorteile dieses neuen Ansatzes: Stabilität und Steifigkeit der kreisförmigen Platten über lineare Fliesen, chiralen Fliesen für die Montage von asymmetrischen Nanostrukturen wie erzwungen Nanoringe und Nanoribbons, neue Visionen auf die DNA-Mechanik und molekularen Strukturen, etc.zu verstehen.

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Protocol

1. Vorbereitung des kreisförmigen DNAs

  1. Verwenden Sie alle linearen DNAs von Unternehmen der gewerblichen Wirtschaft direkt ohne weitere Reinigung zur Verfügung gestellt.
  2. Zentrifugieren Sie die DNA-Proben bei 5.000 × g für 5 min um alle DNA-Pellets am Ende der Rohre zu sammeln. Fügen Sie eine entsprechende Volumen der TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0), die DNS aufzulösen.
  3. Messen die Konzentration von "a" ng/µL für jede ss-DNA-Lösung mit einem Mikro UV-Spektrometer bei 260 nm. "A" ng/µL in "b" µM umwandeln nach b = ein × 103 / (Molekulargewicht der DNA-Strang). Passen Sie die Menge an TE Lösung, um eine 10 µM DNA-Stammlösung.
  4. Verwenden Sie T4 DNA-Ligase, die 3' und 5'-Enden von 5' phosphoryliert lineare DNA-Vorlagen ( Abbildung 1) c64nt, c74nt und c84nt zur Verfügung gestellt von Unternehmen der gewerblichen Wirtschaft direkt verbinden.
  5. Mischen Sie 5' phosphoryliert lineare DNA-Strang (3,5 µM) und seine entsprechende Schiene DNA-Strang (4,5 µM) in 80 µL TE-Puffer in einem 200 µL PCR Test Tube15. Inkubieren Sie das Rohr in eine offene Thermo-Flasche mit 95 ° C Wasser gefüllt. Das heiße Wasser auf Raumtemperatur (25 ° C) für ca. 2-3 Stunden unter der Labor-Atmosphäre abkühlen.
  6. Fügen Sie 10 µL 10 x T4 Puffer (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DVB-t, 1 mM ATP) und 10 µL T4-Ligase (300 U/µL) in die Mischung zu einem Endvolumen von 100 µL. Inkubieren Sie die Mischung in einem Thermocycler für 16 Stunden bei 16 ° C.
    Hinweis: Die oben genannten DNA-Konzentrationen und Reaktionsvolumen von ~ 100 µL sind für die hohe Ligatur-Effizienz und die hohe Ausbeute an richtigen Oligo-Monomer Biosyntheseschritt optimiert. Führen Sie zwei oder mehrere Röhren Ligatur Reaktionen in der gleichen Zeit nach dem experimentellen Design. Ein alternativer Inkubation Verfahren zur Ligatur ersetzt Schritt 1.6 beträgt 4 Stunden bei 25 ° C.
  7. Inaktivieren Sie nach der Inkubation die T4-Ligase in 95 ° C Wasser für 5 e. Dann übertragen Sie das Rohr auf ein Eis-Wasserbad und inkubieren Sie für 5 Minuten abkühlen lassen.
  8. Fügen Sie 10 µL 10 x Exonuclease I-Puffer und 10 µL Exonuclease ich (5 U/µL) abgeschreckt dazugeben und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min selektiv die restlichen lineare DNA zu verdauen und circularized DNAs intakt zu lassen.
  9. Bereiten Sie eine 10 % Denaturierung Seite Gel.
    1. Tragen Sie Gummihandschuhe und Schutzbrille, bei der Vorbereitung der Seite Gel in der Dunstabzugshaube. Fügen Sie 6,67 mL 30 % (w/V) Acrylamid/Bisacrylamide Lösung (19:1), 2 mL 10 X TAE· Mg-Puffer (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g Harnstoff (7 M) und deionisiertes Wasser zu einem Endvolumen von 20 mL in einem 40 mL Zentrifugenröhrchen.
      Achtung: Die 30 % (w/V) Acrylamid/Bisacrylamide (19:1) Lösung ist giftig.
    2. Fügen Sie 20 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) und 100 µL Ammonium Bleichen (APS, 10 % w/V) um die 40 mL tube vor der Übertragung die Gel-Lösung für die Elektrophorese-System sofort. Fügen Sie eine 1,5 mm dick und 10-Well-Kamm. Warten Sie mindestens 20 Minuten bis die Gel-Lösung erstarrt ist.
    3. Legen Sie eine konstante Spannung von 80 V für ein Gel von 85 × 80 × 1,5 mm3 (Breite × Höhe × Dicke). Fügen Sie 1 X TAE· Mg-Puffer, der Elektrophorese System und Prerun das Gel für 20 min bei 10 V/cm.
  10. Legte der PCR Test Tube aus Schritt 1,8 bei 95 ° C Wasser für 5 min Exonuclease inaktivieren I. Dann übertragen Sie das Rohr auf ein Eis-Wasserbad und weitere 5 min inkubieren.
  11. Ein Endvolumen von 140 µL 20 µL Formamid in der Röhre hinzu und mischen Sie die Lösung. Verteilen Sie die Lösung für 7-9 denaturierenden Seite Gel Brunnen ebenso mit 16-20 µL für jedes Gel gut. Mix 2 µL Farbstoff (0,05 % Bromophenol blue, 0,05 % Xylol Cyanol FF, 60 % Glycerin, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7.6) mit 8 µL der entsprechenden Vorläufer lineare DNA zu laden (10 µM) und die Mischung auf eine separate gut als Referenz zu injizieren.
    Hinweis: Der Zusatz von Formamid ist die Dichte der Laden-Lösung für Untergang am unteren Rand der Seite Gel gut erhöhen und auch um einige doppelte distanzieren stranded DNA-Rückstände.
  12. Das Gel für ca. 2 h bei 10 V/cm laufen und beendet wenn Xylol Cyanol FF auf 2/3 der Glasplatte mit bloßem Auge steht.
  13. Tragen Sie Gummihandschuhe und Schutzbrille zum Schutz von Haut und Augen. Nehmen Sie das Gel aus der Glasplatte. Legen Sie das Gel auf einen fluoreszierenden TLC (Dünnschichtchromatographie) Teller. Die Ziel-Gel-Bands durch eine Rasierklinge abgeschnitten möglichst genau beschattet durch UV-Bestrahlung (Abbildung 2).
    Achtung: Das UV-Licht ist schädlich für Augen und Haut.
    Hinweis: Unter UV-Bestrahlung bei 254 nm, DNA absorbieren das Licht und wirft einen Schatten auf die TLC Platte. Die kreisförmige DNA lief etwas langsamer als die entsprechenden Vorläufer lineare DNA. Einige unverdaute lineare DNA und unerwünschte kreisförmige DNA in geringen Mengen die schattierte Zielbandes umgeben werden die kreisförmige DNA verschmutzen, wenn sie gesammelt werden.
  14. Übertragen Sie die Gel-Bands zu einem 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch. Lufttrocknen oder Schlag trocknen die Gel-Bands und dann die Gele zu einer Paste mit einem Spachtel oder abgeflachten Glasstab zerdrücken. Stellen Sie sicher, dass das Gel hat völlig zerquetscht worden zu einer Paste ist entscheidend für die hohe Ausbeute an kreisförmigen DNA. Fügen Sie zweimal von Gel Volumen deionisiertes Wasser in das Rohr und schütteln Sie das Rohr bei Raumtemperatur über Nacht.
  15. Filtern Sie das Gemisch um die Überstände in einem 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch zu sammeln. Erholen Sie jede restliche DNA durch Spülen mit kleinen Volumen von entionisiertem Wasser und Filter wieder auf die Überstände zu kombinieren.
  16. Der Eluent in gleicher Lautstärke von n-Butanol zu extrahieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die wässrige Lautstärke auf etwa 200 µL reduziert ist.
  17. Hinzufügen von 500 µL von absoluten Ethanol (−20 ° C) und 20 µL 3 M NaOAc (pH 5,1), die Mischung für DNA Niederschlag. Speichern Sie das Rohr auf −20 ° C für 30 Minuten.
  18. Das Rohr auf 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert, den Überstand verwerfen. Die verbleibenden Ausfällung der DNA ist etwa 100 µL in der Röhre.
  19. Das Rohr 600 µL 75 % Ethanol (−20 ° C) hinzu und speichern Sie es auf −20 ° C für 30 min. Zentrifuge bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C, den Überstand verwerfen. Die verbleibenden Ausfällung der DNA ist etwa 100 µL Lösung in der Röhre wieder. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
  20. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands so weit wie möglich. Trocknen Sie die Reste mit einem Vakuum Konzentrator.
  21. Speichern Sie die gereinigte zirkuläre DNA in der Röhre bei −20 ° C.
  22. Aufschwemmen der kreisförmige DNS in TE-Puffer, eine 10 µM kreisförmige DNA-Stammlösung entsprechend Schritt 1.3 bei Bedarf zu machen.

2. Glühen von Montagelösungen

  1. Bereiten Sie vor, dass jede Fliese oder nanostruktureller Montagelösung von c64bp, c84bp, HJ c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, AcDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt und AcDAO-c64nt-E mit einem gestalteten Satz von linearen und zirkularen DNAs ein-Topf zu glühen.
    1. Mix für jede Montagelösung 2 µL 10 X TAE· Mg-Puffer, 1 µL der Stammlösung jedes DNA aus einer Reihe von linearen und zirkularen Stränge im gleichen molaren Verhältnissen und zusätzliche TE-Puffer in der 200 µL PCR Test Tube, eine Endkonzentration von jeder Strang bei 0,5 µM und einem Endvolumen von 20 µL. Tempern Montagelösung in eine Thermo-Flasche von 95 ° C bis 25 ° C über 48 h.
  2. Bereiten Sie jedes Montagelösung der 2D unendlichen Gitter cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E und cDAO-c84nt-O mit einem gestalteten Satz von linearen und zirkularen DNAs für zweistufige glühen.
    1. Bereiten Sie jedes Vorläufer Sub Fliese Montagelösung durch Mischen 2 µL 10 X TAE· Mg-Puffer, 1 µL der Stammlösung jedes DNA aus einer Reihe von linearen und zirkularen Stränge im gleichen molaren Verhältnissen und zusätzliche TE-Puffer in einem Reagenzglas 200 µL PCR eine Endkonzentration von 0,5 µM für jeden Strang zu einem Endvolumen von 20 µL. Im ersten Sub Fliese Glühen Schritt Tempern Sie jede Vorläufer Sub Kachel-Lösung in einer PCR-Thermocycler mit einer Fast linearen Kühlung Methode von 95 ° C bis 25 ° C über 2,5 h.
    2. Bereiten Sie jedes Montagelösung für die oben genannten vier unendlichen Gitter durch das Mischen von 10 µL eines jeden der beiden entsprechenden Sub-Fliese-Lösungen zusammen, um eine Endkonzentration von 0,25 µM für jeden Strang. Im zweiten Gitter Schritt Glühen Tempern Sie 20 µL Gemisch in einer PCR-Thermocycler mit einer langsamen Kühlung Methode bei 50 ° C für 2 Stunden Aufenthalt und abkühlen mit einer Rate von 0,1 ° C pro 5 Minuten auf 20 ° C, insgesamt ca. 24 h.
      Hinweis: Zwei parallele Experimente können gleichzeitig oder anschließend im zweiten Glühen Schritt für jedes 2D unendlichen Gitter ausgeführt werden.
  3. Bereiten Sie vor, dass Montagelösungen von zwei endliche Rechteck-Baugruppen von 5 × 6 cDAO-c64nt-O und 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O in zwei Schritten zu glühen.
    1. Bereiten Sie jedes Vorläufer Sub Fliese Montagelösung durch Mischen 1 µL 10 X TAE· Mg-Puffer, 0,5 µL der Stammlösung jedes DNA aus einer Reihe von linearen und zirkularen Stränge im gleichen molaren Verhältnissen und zusätzliche TE-Puffer in einem Reagenzglas 200 µL PCR eine Endkonzentration von 0,5 µM für jeden Strang zu einem Endvolumen von 10 µL. Im ersten Schritt Glühen Tempern Sie jede Vorläufer Sub Kachel-Lösung in einer PCR-Thermocycler mit einer Fast linearen Kühlung Methode von 95 ° C bis 25 ° C über 2,5 h.
    2. Bereiten Sie jedes endliche Rechteck-Gitter-Montagelösung durch Mischen 32 x (2 µL jeder Sub-Fliese-Lösung) zusammen in einer 200 µL PCR Test Tube, eine Endkonzentration von ~ 15 nM für jede Sub-Kachel und einem Endvolumen von 64 µL. Im zweiten Schritt Glühen Tempern Sie 64 µL Gemisch in einer PCR-Thermocycler mit einer langsamen Kühlmethode bei 50 ° C für 2 Stunden Aufenthalt und abkühlen mit einer Rate von 0,1 ° C / 5 min. auf 20 ° C etwa 24 Stunden insgesamt.
      Hinweis: Fünf parallele Experimente können gleichzeitig oder anschließend im zweiten Glühen Schritt für jede endliche Rechteck Assembly ausgeführt werden.

(3) native Seitenanalyse

  1. Bereiten Sie eine 10 % Native Seite folgenden Schritt 1,9 mit Ausnahme der Harnstoff-Komponente.
  2. Fügen Sie für Kontrollproben von c64bp und c84bp 2 µL jeder Montagelösung und 1 µL Farbstoff 3 µL TE-Puffer als Steuerelemente separat zu laden. Fügen Sie für jede der anderen Baugruppen in Abbildung 3aufgeführt 1 µL jeder Montagelösung und 1 µL Farbstoff 4 µL TE-Puffer zu laden.
  3. Jede der oben genannten Lösungen zu einem Gel gut zu injizieren. Geben Sie 5 µL DNA-Marker (25-500 bp) in eine separate als Referenz.
  4. Laufen Sie das Gel für ca. 4 Stunden bei 10 V/cm in ein Eis-Wasserbad. Die Glasplatte wird das Xylol Cyanol FF ausgehen.
  5. Tragen Sie Gummihandschuhe und Schutzbrille zum Schutz von Haut und Augen. Nehmen Sie das Gel aus der Glasplatte und Tauchen Sie es in 100 mL entionisiertem Wasser mit 10 µL des Fleckes Nukleinsäure-Gel für 30 min.
    Achtung: Die Nukleinsäure-Gel Fleck Lösung ist giftig.
  6. Beobachten Sie das Gel unter einer UV-imaging-System und fotografieren Sie die gefärbten Gel (Abbildung 3).

4. Reinigung der endlichen Gitter

  1. Bereiten Sie eine native 2 % Agarosegel für Elektrophorese Reinigung der endlichen Gitter.
    1. Mischen Sie 1 g Agarose Pulver, 5 mL 10 X TBE· Mg-Puffer (89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 2 µL der Nukleinsäure gel Fleck und 47,5 mL entionisiertem Wasser in einer Flasche 250 mL Dreieck. Kochen Sie die Mischung, bis die Bläschen werden klein und dicht. Kochendes Wasser in die Flasche zu einem Gesamtvolumen von 50 mL und eine Konzentration von 2 % Agarose hinzufügen.
    2. Tragen Sie dicke Handschuhe. Gießen Sie die Gel-Lösung in eine Kunststoff-Gel-Box von 7 x 10 x 1 cm3 (Breite x Länge x Dicke). Legen Sie einen 1,5 mm dick und 12-Well-Gel Kamm. Warten Sie, bis das Gel auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Bei Bedarf setzen Sie das Gel im Kühlschrank 4 ° C.
      Achtung: Beachten Sie verbrühen, denn die Lösung sehr heiß ist.
    3. Hinzufügen von 0,5 X TBE· Mg-Puffer in der Elektrophorese-System. Das Gel mit 5 V/cm für 20 min in ein Eis-Wasserbad mit einer konstanten Spannung von 50 V prerun.
    4. Auch eine Separate 5 µL DNA-Marker (100-3.000 bp) hinzufügen und 20 µL der endlichen Gitter-Lösung im Schritt 2.3 in jedes Agarosegel gut vorbereitet zu injizieren. Führen Sie das Gel für 2 h mit 5 V/cm in ein Eis-Wasserbad.
    5. Tragen Sie Gummihandschuhe und Schutzbrille zum Schutz von Haut und Augen. Schnitt das Ziel gel-Bands mit einer Position ähnlich der 1.000 bp Marker unter UV-Licht und schneiden sie in feine Stücke und legen Sie die zerkleinerten Gele in einem Filter Spalte8.
    6. Zentrifugieren Sie die Spalte bei 2.000 X g für 5 min bei 4 ° C. Extrahieren Sie die Probenlösung durch die Säule. Die Lösung für die AFM-Bildgebung zu sammeln.
  2. Endliche Gitter durch PEG-Fällung zu reinigen.
    1. Mix 50 µL der endlichen Gitter Lösung vorbereitet im Schritt 2.3 mit ein gleiches Volumen von 15 % PEG8000 (w/V) Puffer (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA und 505 mM NaCl)22. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 18.000 × g bei 4 ° C für 30 min.
    2. Entfernen des Überstands und 100 µL der PEG-Puffer. Wiederholen Sie die Zentrifugation.
    3. Nach dem Entfernen des Überstands, lösen das Pellet in 1 X TAE· Mg-Puffer für die AFM-Bildgebung.
      Hinweis: Reinigung ist notwendig für die endliche Gitter 5 × 6 cDAO-c64nt-O und 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O für AFM Bildgebung und andere Anwendungen. Wenn der Ertrag zu gering ist, erhöhen Sie die Geschwindigkeit der Zentrifugation. Wenn das Produkt nicht rein genug ist, wiederholen Sie Schritt 4.2.2.

5. AFM Imaging

  1. Für c64nt Nanodraht, c84nt Nanodraht, AcDAO-c64nt-E Kaution unendliche 2D Gitter von cDAO-c64nt-E(O) und cDAO-c84nt-E(O), 2 μL der geglühten Proben auf einer frisch gespalten Glimmer-Oberfläche. Die Glimmer-Oberfläche für 2 min Adsorption der DNA Gitter überlassen. Waschen Sie die Oberfläche mit 100 µL deionisiertes Wasser zweimal und mit Druckluft trocknen.
  2. AFM Bilder der unendlichen DNA-Gitter in Luft durch das Scannen der Glimmer-Oberfläche mit dreieckigen AFM Sonden unter Tippen Modus zu erhalten. Legen Sie die folgenden Parameter für das Scannen: Scannen Größe 0,5 ~ 5 µm, scan-Auflösung von 512 Linien und scan-Rate von 3,5 Hz (Abbildung 4).
  3. Für endliche DNA Gitter 5 × 6 hinterlegen cDAO-c64nt-O und 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O, 80 µL 1 X TAE· Mg-Puffer auf eine frisch gespalten Glimmer-Oberfläche. Dann fügen Sie 5 µL des endlichen Proben in den Puffer. Die Glimmer-Oberfläche für 2 min Adsorption der DNA Gitter überlassen. Fügen Sie ein weiteres 50 µL 1 X TAE· Mg-Puffer auf die AFM-Sonde.
  4. AFM Bilder der endlichen DNA-Gitter in Flüssigkeit durch das Scannen der Glimmer-Oberfläche mit dreieckigen AFM Sonden unter Tippen Modus zu erhalten. Legen Sie die folgenden Parameter für das Scannen: Scannen Größe von 0,5-1 µm, scan-Auflösung von 256 Zeilen und scan-Rate von 1,5 Hz (Abbildung 5).

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Representative Results

Die kreisförmige DNA bewegt sich etwas langsamer als seine Vorläufer lineare DNA Denaturierung Seite (Abbildung 2), weil die Pore in die kreisförmige DNA eingedrungen ist und verzögert durch Gel Fasern23,24,25. Die richtige Ligatur Reaktion Effizienz für Oligo-Monomer Biosyntheseschritt hängt von Substrat Sequenz und Konzentration, Reaktionstemperatur, Zeit, etc.. Als die Konzentration einer Vorstufe lineare DNA ist hoch genug, um rund 3,5 µM, die Biosyntheseschritt Produkte der c64nt (oder c84nt) und der Vorläufer Bezugnahme in diesem Protokoll kann direkt als Bänder in der TLC Platte unter UV-Licht Schatten, ohne zu sterben. Wenn die Bänder kreisförmige DNA sind vage oder unsichtbar, Ausfall der Ligatur-Reaktion oder eine viel geringe Produktausbeute angibt. Manchmal gibt es zwei Bänder über dem linearen Vorläufer-Band, gemeint ist einen zusätzliche Oligo-Dimer Ring mit Ausnahme der richtige Oligo-Monomer-Ring. Lassen Sie die höheren Bändern allein und sammeln Sie der niederen zu. Die gereinigten kreisförmige DNA-Produkte können als weißes Pulver in die Röhre nach Vakuumtrocknung erkennbar. Mit Ausnahme der denaturierenden Seite kann die DNA Reinheit auch durch UV-Spektrometer gemessen werden. Die Absorption Höhepunkt der DNA ist bei 260 nm. Zwei Kriterien für die DNA Reinheit sind das Verhältnis der Absorption von 280 nm/260 nm bei 1,8 und die der 280 nm/230 nm allgemein im Bereich von 2.0-2.2. Wenn die oben genannten zwei Verhältnisse von den Normwerten abweichen, sollten die Überreste wieder von folgenden Schritte 1.18-1.20 extrahiert werden. Die Erträge der c64nt und c84nt für die richtige Oligo-Monomer-Biosyntheseschritt sind im Bereich von 30-60 % nach diesem Protokoll gemessen.

Native Seitenanalyse bietet eine Vielzahl von Informationen über das Motiv Stabilität, Reinheit, Steifigkeit, Baugruppenmodus Monomer und Polymer, etc. (Abbildung 3). Die c64nt Montage Familien c64bp, HJ c64nt, aHJ-c64nt, cDAO-c64nt und AcDAO-c64nt haben nur eine klare und saubere Band für jede Assembly, vertreten sie sind stabile Monomer Motive. Während die c84nt Montage Familien der HJ-c84nt tHJ c84nt und cDAO c84nt Fliesen Abstriche um ihre wichtigsten Bands, zeigt kleine Nebenprodukte bis auf die Ziel-Monomer-Motive haben. Unabhängig von der geringfügigen Nebenprodukte der falsche Mitarbeiter können ausgezeichnete cDAO-c84nt-O (E) Gitter mit hohen Erträgen montiert werden. Um eine klare und saubere Elektrophorese-Bild zu erhalten, das Ladevolumen sollte nicht mehr als 10 µL und die Menge an DNA sollte 0,01 ~ 0,02 µg/mL.

Der Erfolg der Experimente wird schließlich von 1D und 2D DNA Nanostrukturen abgebildet von AFM (Abbildung 4 und Abbildung 5) bewertet. Jede Assembly besitzt eine eigene morphologische Merkmale in der Mikrometer Skala wie Nanodrähte, Nanoröhren, Nanospirals, Nanoribbons. Darüber hinaus detaillierten Texturen der DNA-Baugruppen in der Nanometerskala korreliert mit ihrer theoretischen kreisförmige Kachelgrößen und Organisation Modi sehr gut bzw. sind der Schlüssel für die Überprüfung der erfolgreichen und korrekte Montage. Daher ist Panorama und hochauflösende AFM Bilder in Mikrometer und Nanometer-Skalen einzuholen. Auswahl der AFM Methoden und Sonden sind entscheidend für die AFM-Bilder in hoher Qualität. Die Scan-Kraft sollte so klein wie 50 pN26eingestellt werden. Wenn der Scan-Kraft zu groß ist, schadet es der DNA-nanostruktureller Muster. Die saubere Umwelt ist ein weiterer Schlüsselparameter ein sauberes und schönes hochauflösende AFM-Bild in Flüssigkeit zu bekommen. Alle Puffer müssen von 0,22 µm-Filter gefiltert werden; die Sondenhalter und Pinzette werden durch Waschmittel gewaschen und von entionisiertem Wasser gespült. Wenn die Umwelt durch partikuläre Verunreinigungen belastet wird, würde die Sondenspitze beschädigt oder klammerte sich durch Partikel im Puffer, so dass die Qualität der AFM Bilder.

Figure 1
Abbildung 1 . Synthese von kreisförmigen DNA. Das Flussdiagramm stellt dar, wie eine lange 5'-phosphoryliert lineare Oligonukleotid in blau, eine kreisförmige DNA-Molekül entwickelt. Die zwei kurzen roten Stränge repräsentieren die Schiene Oligonucleotides. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Denaturierung Seite Foto von DNA-Biosyntheseschritt Produkte unter UV-Licht, ohne zu sterben. Eine Vorläufer lineare 64nt DNA-Band ist in der linken Spur und seine Biosyntheseschritt-Produkte von kreisförmigen 64nt (c64nt) DNA erscheinen als 9 Bänder auf der gleichen horizontalen Ebene in anderen 9 Bahnen. Die 9 Bands des c64nt werden für kreisförmige DNAs abstrahieren abgeschnitten werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Native Seite Fotos nach dem sterbenden und schematische doppelt-schraubenartigen Modelle der kreisförmigen Platten. Beide Polymere c64nt Nanodraht und c84nt Nanodraht werden vertreten durch ihre einfachste Faltung Einheit Zellen, in denen die beiden oben genannten Punkte ausgerichtet und unten jede Elementarzelle zeigen die unendliche Einheit Zellausrichtung vertikal bis und nach unten, mit gleichmäßigen Abständen zwischen Maisonetten, Form-Nanodrähten. Monomer kreisförmige Platten des c64bp, c84bp, HJ c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt und tHJ-c84nt in haben A) keine hervorstehenden Überhänge aus ihre Ringe cDAO-c64nt, AcDAO-c64nt und cDAO-c84nt in (B) beide stumpf endete 10 bp Überhänge bzw.. Sequenzen entnehmen Sie bitte der Tabelle von DNA-Sequenzen. Diese Zahl wurde von einer zuvor veröffentlichten Zahl17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. AFM-Bilder von typischen 1D und 2D unendliche DNA-Baugruppen in Luft abgetastet. (A) c64nt Nanodraht, (B) unendliche AcDAO-c64nt-E, C) unendliche cDAO-c64nt-E, D) unendliche cDAO-c64nt-O, E) unendliche cDAO-c84nt-E und F) unendliche cDAO-c84nt-O sind von sahnigen Ende Zusammenhalt geglüht. Alle Texturdetails in diesen Bildern AFM stehen im Einklang mit der Fliesenformate und Organisation Modi sehr gut. Sequenzen entnehmen Sie bitte der Tabelle von DNA-Sequenzen. Diese Zahl wurde von einer zuvor veröffentlichten Zahl17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . AFM Bilder von endlichen Rechteck Baugruppen in Flüssigkeit gescannt. Die endliche Rechteck Montage von (A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O aus 32 cDAO-c64nt Sub-Platten, und (B) 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O besteht besteht aus 12 cDAO-c74nt und 20 cDAO-c84nt Sub-Fliesen. Sequenzen entnehmen Sie bitte der Tabelle von DNA-Sequenzen. Diese Zahl wurde von einer zuvor veröffentlichten Zahl17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle von DNA-Sequenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen. 

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Discussion

Die Protokolle, die in diesem Artikel konzentrieren sich auf die Synthese der kleine kreisförmige DNA-Moleküle und die Montage von DNA Nanostrukturen vorgestellt. In diesem Protokoll können die meisten zufällig sequenzierten DNA-Designs verwendet werden. Die Reinheit der kreisförmigen DNAs ist entscheidend für den Erfolg von DNA-Baugruppen. Die Produktionsausbeute des Biosyntheseschritt kann durch Senkung der Konzentration von 5' phosphoryliert lineare DNA verbessert werden; Dies erhöht jedoch die Arbeitsauslastung, um die gleichen Mengen von kreisförmigen DNAs zu produzieren. Die Länge der Schiene DNA-Stränge wirkt sich auch auf die richtige Verbindung-Reaktion, es ist optimiert, um rund 20 Nukleotide werden nach c64nt und c84nt.

Eine geeignete Konzentration von Magnesium-kationen (zB., 12,5 mM) in der Lösung während und nach der Montage ist sehr wichtig für die Bildung und Erhaltung der DNA Nanostrukturen. So ein kation Magnesiumkonzentration von 12,5 mM ist immer während der Prozesse des Glühens, native Seite, Agarose-Gelelektrophorese und PEG Puffer Zentrifugation Reinigungen, AFM Imaging, etc..

Für endliche Rechteck Baugruppen von 5 × 6 cDAO-c64nt-O und 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O, die Agarose-Gel-Reinigung hat keinen Einfluss auf die Texturdetails, während die PEG Puffer Zentrifugation Reinigung der Texturdetails DNA Nanostrukturen in schadet der AFM-Bilder mit hoher Auflösung.

Profitieren Sie von der Stabilität und Steifigkeit des kreisförmigen Platten, es ist viel einfacher, gut organisiert zu produzieren und großformatige einzelne kristalline 2D Salzgitter aus kreisförmigen Module als lineare Fliesen und Strab Origami9,11, obwohl zusätzlicher Arbeit ist erforderlich, reinigen die zirkuläre DNA-Moleküle zu synthetisieren. Mit nur eine kreisförmige DNA als die gleichen Kernstruktur können viele kreisförmige Module mit verschiedenen Überhängen generiert werden; durch spezifische sahnigen Ende Strategiebericht der Überhänge können endliche Nanostrukturen gebaut werden; Diese Strategie reduziert die Arbeitsbelastung und die Kosten für die endliche Nanostrukturen. Ein großer Vorteil von kreisförmigen DNA Nanostrukturen ist die Auflösung des sekundären und tertiären Strukturen der DNA-Moleküle und ihre wichtige Elemente wie Holliday Junction aus der Texturdetails der einzelnen kristalline Gitter. 1D, 2D und 3D Nanostrukturen aus kreisförmigen Module und ihre Einsatzmöglichkeiten in Biologie, Medizin und Nano-Engineering gebaut ein neues Familienmitglied der DNA-Nanotechnologie in der Zukunft werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Wir sind dankbar für finanzielle Unterstützung von der NSFC (Zuschüsse Nr. 91753134 und 21571100) und den Schlüssel Labor der Bioelektronik von Südosten Landesuniversität.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

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References

  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32, (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394, (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121, (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301, (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126, (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138, (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338, (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6, (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5, (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136, (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8, (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19, (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5, (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1, (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78, (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55, (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55, (15), 1579 (1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41, (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9, (5), 1113-1130 (2014).

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