Med hjälp av Ustilago maydis som en trojansk häst för i Situ leverans av majs proteiner

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Detta arbete beskrivs kloning av en Ustilago maydis trojansk häst stam för jordbaserad leverans av utsöndrade majs proteiner in i tre olika typer av majs vävnader.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fiedler, I. C., Weiberg, A., van der Linde, K. Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins. J. Vis. Exp. (144), e58746, doi:10.3791/58746 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Inspirerad av Homer´s Trojan Häst myt, vi konstruerat majs patogenen Ustilago maydis att leverera utsöndras proteinerna i den majs apoplast möjliggör invivo fenotypiska analys. Denna metod förlitar sig inte på majs omvandling men utnyttjar mikrobiell genetik och sekretoriska funktioner av patogener. Häri, tillåter den inspektion av invivo levereras utsöndrade proteiner med hög spatiotemporal upplösning på olika sorters infektionsställen och vävnader. Trojansk häst strategin kan utnyttjas för att komplettera normalnivå majs förlust-av-funktion fenotyper, för att karakterisera funktionellt protein domäner, att analysera off-target protein effekter, eller att studera onside protein överdosering, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för protein studier i systemet majs gröda. Detta arbete innehåller ett exakt protokoll på hur till generera en trojansk häst stam följt av standardiserade infektion protokoll att tillämpa denna metod på tre olika majs vävnadstyper.

Introduction

Biotrophic patogenen Ustilago maydis är vilka smittämnen av majs smut sjukdom1. Det infekterar alla antenn delar av majs vilket resulterar i stora tumörer som innehåller melanized, svarta sporer. På global nivå bedöms U. maydis orsaka en årlig förlust på omkring 2% av majs avkastning, medan tumörer är uppskattade som en gastronomisk delikatess i Mexiko. Anläggningen infektion initieras av en appressorium som utsöndrar cellväggen lyseringslösning enzymer för att tränga igenom det första lagret av majs epidermala celler. Från en primär infektion webbplats, U. maydis växer intracellulärt och intercellularly, invaderar en till två cell lager varje dag1,2. Framgångsrik infektion resultat i växten hypertrofi som förvandlar till synliga tumörer vid fem dagar efter infektion1,3,4. Under alla faser för infektion invaginate svampinfektion hyfer växt cytoplasman membranet utan direkt kontakt till värd cytoplasman1,2. Snäva apoplasmic utrymmet mellan de infekterande hyfer och växt plasmamembranet anses vara värd/pathogen interaktiva webbplatsen, kallas zonen biotrophic interaktion. För att övervinna det medfödda immunsystemet växt, utsöndrar U. maydis en rad effektor proteiner in i biotrophic interaktion zon1. Vissa effektorer tas upp av växtceller, medan andra förblir i biotrophic interaktion zon5,6,7,8. En apoplastisk effektor är UmPit2, som interagerar med apoplastisk majs proteaser att förhindra utsläpp av signalering peptid ZmZIP1 från ZmPROZIP av apoplastisk proteas aktivitet9,10.

Under de senaste årtiondena, U. maydis blev inte bara en modell för svamp genetik i växt-patogen interaktion, men också ett värdefullt verktyg i bioteknik på grund av en väl förstått livscykel, enkla genetiska tillgänglighet och heterologa uttryck för utsöndras proteiner11,12,13. Signaler för både konventionella och okonventionella protein sekretion har bestämts så att kontroll av posttranslationell ändringar14. Nyligen, U. maydis var anställd som en trojansk häst-verktyg för att studera små, utsöndras majs proteiner i situ15. Metoden trojansk häst har framgångsrikt använts för att analysera funktionen hos små, utsöndrade proteinet ZmMAC1 som är involverad i anther utveckling. ZmMAC1 inducerar periclinal uppdelningen av pluripotenta celler och cell öde specificering av de nybildade celler15. Med samma metod avslöjades den biologiska funktionen av majs skador-associerade peptiden ZmZIP1. U. maydis utsöndrar majsen ZmZIP1 resulterade i försämrad tumör bildandet10. Således, den trojanska häst tillvägagångssätt representerar en värdefull alternativ rutt till protein i situ studier spatiotemporal med hög upplösning som gör varken kräver generation av stabil majs omvandling linjer eller vävnad infiltration med heterologously uttryckt och renade proteiner. I synnerhet kan trojansk häst strategin utsöndringen av något heterologa protein in i majs apoplast och direkt jämförelse av infekterade kontra icke-infekterade växtceller inom samma vävnaden.

Detta protokoll illustrerar de stora steg för att generera en U. maydis trojansk häst stam för att studera ett protein av intresse. Vidare ingår exakt information om infektion förfaranden av tre olika majs vävnadstyper (vuxna blad, Tofsar och öron) med U. maydis, vilket är en förutsättning för att studera funktionen spatiotemporal infektion progression och protein i dessa vävnader. Inga ytterligare specifikationer är given på majs gen förstärkning och mikroskopiska avbildningstekniker, eftersom dessa steg är mål-specifika och instrument-beroende. Sålunda, detta protokoll riktar sig till erfarna användare av standarden molekylärbiologiska tekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. konstruktion av ett U. maydis trojansk häst

Obs: Se figur 1.

  1. Förstärka en gen av intresse från majs cDNA med gen-specifika primers och en korrekturläsning DNA-polymeras. Klona den primära PCR-produkten och omvandla konstruktionen till E. coli efter plasmid leverantörens instruktioner. Kontrollera den rätta genen av intresse sekvens av Sanger sekvensering före användning för kloning härnäst.
    Obs: PCR-specifikationer behöver optimeras på grund av primer sekvens särdrag och optimal DNA-polymeras reaktion villkor.
  2. Design grundfärger att förstärka den majs gen av intresse utan den sekvens som kodning en signal peptid (SP).
  3. Förlänga 5´ slutet av reverse primer med RSIATA motivet och en Ncojag skära plats (tabell 1).
  4. Förstärka den majs gen av intresse med en korrekturläsning DNA-polymeras som använder den PCR-bygga genereras i 1.1 som PCR-mall.
  5. Dubbel-digest PCR-produkten och U. maydis omvandling plasmid, p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, med Xbajag och Nco I. renar smält PCR-produkten och plasmid.
  6. Ligera smält PCR-produkten i p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha mallen med T4 DNA-ligase följa tillverkarens instruktioner. Omvandla ligering produkten till E. coli och kontrollera den rätta genen av intresse sekvens av Sanger sekvensering.
  7. Linjär det p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgen av intresse-mCherry-Ha med enzymet begränsning Sspjag och omvandla DNA in i den solopathogenic U. maydis stam SG20016. Isolera U. maydis transformants genom carboxin urval och bekräfta isolerade transformants av Southern blot analys16.
    Obs: För varje protein av intresse, minst tre oberoende U. maydis transformants bör isoleras och analyseras för att uppskatta eventuella fenotyp effekter av slumpmässiga bakgrund mutationer.

2. kultur Media

  1. Förbereda YEPSlight flytande medium16: 1,0% (w/v) jästextrakt, 0,4% (w/v) Bacto-pepton och 0,4% (w/v) sackaros. Lös alla komponenter i ddH2O och autoklav vid 121 ° C i 15 min; autoklavering vid en högre temperatur, under en längre tid eller vid upprepade tillfällen skulle minska kvaliteten på mediet.
  2. Förbered potatis-dextros-agar (PD-agar)20: 3,9% (w/v) potatis dextros agar och 1,0% (w/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (FC 0,01 M). Blanda alla komponenter direkt i flaskan för autoklavering och ddH2O plus en magnetiska rör bar. Autoklav vid 121 ° C i 15 min; autoklavering vid en högre temperatur, under en längre tid eller vid upprepade tillfällen skulle minska kvaliteten på mediet.
  3. Förbereda PD-träkol agar20: 3,9% (w/v) potatis dextros agar, 1% (w/v) träkol och 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (FC 0,01 M). Blanda alla komponenter direkt i flaskan för autoklavering och ddH2O plus en magnetiska rör bar. Autoklav vid 121 ° C i 15 min; autoklavering vid en högre temperatur, under en längre tid eller vid upprepade tillfällen skulle minska kvaliteten på mediet.

3. anläggningen infektion

  1. Utför analys av majs celldelning i svar på trojansk häst levereras protein (t.ex. mikroskopi-baserade cell räknat) i förväg. U. maydis -inducerad majs cellproliferation och efterföljande tumörbildning börjar runt 4-5 dagar efter infektion. Kvantitativa sjukdom bedömningar är beroende av vävnad och bör utföras från 6 till 14 dagar efter infektion.
    Obs: Distinkta majs sorter visar olika nivåer av U. maydis infektionskänslighet. Majs cvs. W23, A188, Gaspe flinta, tidig Golden Bantam eller Va35 visar känslighet mot denna patogen och är således lämpliga sorter för trojansk häst studier.
  2. Förberedelse av den U. maydis inokulatet
    1. Inkludera stamceller stam SG200 som en negativ kontroll i alla trojansk häst experiment för att uppskatta biverkningar på infektion av transgena stammen. Här använda ett U. maydis stam uttrycker en icke-utsöndras version av proteinet av intresse som en negativ kontroll. Av (t.ex. större filmvisningar) skäl, kan stamceller stammen dock lättare val av kontroll.
    2. Innan du börjar experimentet, uppskatta vilka mängder av infektion kultur behövs. Tänk på att infektion i varje planta kräver 1-1,5 mL U. maydis suspension beroende av majs vävnadstyp.
      Obs: Ungefär 1 mL av en övernattning kultur är tillräcklig för spädning till en OD600 av 0,2 i 20 mL YEPSljus medium, och 25 mL av en U. maydis kultur med en OD600 av 0,8-1,0 räcker för infektion i 13-16 växter.
    3. Scratch U. maydis från en PD-agar plattan med hjälp av en steril Pasteur-pipett, Inokulera i 5 mL YEPSljus medium och låt kulturen växa vid 28 ° C under ständig skakning på 200 rpm för 16 h.
    4. Före infektion, undersöka U. maydis inympning kulturen genom standard ljusmikroskopi för god tillväxt och bakteriell kontamination vid 400 X förstoring.
      Obs: En lämplig kultur är endast cigarr-formade svampen synlig (figur 2).
    5. Blanda 900 µL av färska YEPSljus med 100 µL av övernattning kultur och mäta OD600 med YEPSljus medium som en tom i spektrofotometer analysen.
    6. Späd den nattliga kulturen med färska YEPSljus medium till en OD600 av 0,2 och låt kulturen växa vid 28 ° C under ständig skakning på 200 rpm tills nå mitten av log tillväxtfasen indikeras av en OD600 nm 0.8-1.0.
      Obs: U. maydis celler duplicera varje 2 h under dessa förhållanden, alltså den önska OD600 nås efter 4-5 h för odling.
    7. Skörda cellerna på OD600 för 0.8-1.0 av snurrande vid 3 000 x g i 10 min och kasta bort supernatanten.
    8. Tvätta cellpelleten en gång med ddH2O. För detta ändamål, Lägg till en kultur volym ddH2O, spin med 3000 x g i 10 min och kasta bort supernatanten.
    9. Återsuspendera cellpelleten noggrant i ddH2O med pipett 20 mL glas därmed justera den slutliga OD600 till 3.0 (för en trojansk häst assay) eller 1.0 (för sjukdom rating).
  3. Verifiering av den trojanska hästen: i planta sekretion av proteinet majs fusion
    1. Infektera majs plantor med en trojansk häst stam17.
    2. Utföra mikroskopbilder av infekterade plantor på 2-3 dagar efter infektion med confocal laserskanning Mikroskop. I detta syfte punktskatt en rektangulär bit av blad 1 cm under peka av injektion, placera provet på ett objektglas och Lägg en droppe av ddH2O. För att visualisera mCherry fusionsprotein, excitera preparatet vid λ = 561 nm och rekord utsläpp vid λ = 580-630 nm.
  4. Infektion av vuxen majs blad
    1. Odla majs växter på scenen av vuxna blad (när minst blad 7 växer inom stjälken).
      Obs: Detta skede uppnås efter fyra veckor vid sådd av växthusgaser villkor 14 h, 28 ° C dag/10 h, 22 ° C nattrytmen med cv. W23. Varaktighet kan variera med majs av sorten och växthus villkoren.
    2. Överföra U. maydis kulturen (se 3.2.9) i en 3 mL spruta med 20G x 1 injektionsnål.
    3. Tryck på stjälken noggrant för att lokalisera meristem vävnaden i stjälken. Basen av meristemen kan särskiljas genom en övergång från hårdare stjälk till mjukare vävnad.
    4. Markera av meristem på stjälken med en penna.
    5. Injicera 1,5 mL U. maydis kultur 1 cm ovanför skjuta meristem eller blomställning meristem.
    6. Betygsätt sjukdomssymtomen vid 6 och 12 dagar efter infektion.
  5. Infektion av tofsar
    1. Odla majs växter tills de når tofs scenen.
      Obs: En detaljerad tidslinje på anther och tofs utveckling i majs cv. W23 var tidigare beskrivna1819. Tofsar som innehåller pre meiotiska ståndarknappar är mycket mottagliga för U. maydis infektion; i den majs cv. W23 är tofsar storleken på 4-7 cm.
    2. Tryck på stjälken noggrant för att lokalisera tofs i stammen.
    3. Markera spetsen och basen av toffs på stammen med hjälp av en penna.
    4. Överföra U. maydis kulturen (se 3.2.9) i en 3 mL spruta med 20G x 1 injektionsnål.
    5. Injicera 1,5 mL av inokulatet runt toffs. För att säkerställa jämn fördelning av inokulatet, långsamt placera 0,5 mL varje spets, den mellersta delen och basen av toffs markerade med pennan.
    6. Betygsätt sjukdomssymtom på 10 dagar post infektion.
  6. Infektion i öron
    Obs:
    öra vävnad utveckling skiljer sig distinkt majs sorter och växthusgaser villkor och måste observeras noga före ympningen. Öronen börjar växa ur silks är mycket mottagliga för U. maydis infektion.
    1. Överföra U. maydis kulturen (se 3.2.9) i en 3 mL spruta med 20 G x 1 injektionsnål.
    2. Injicera inympning nålen i utrymmet mellan skalet bladen så djupt som möjligt utan att skada örat.
    3. Släppa 1,5 mL av inokulatet runt örat.
    4. Ta bort den spruta plus nål och försiktigt massera cob för att distribuera U. maydis lösningen lika.
    5. Betygsätt sjukdomssymtom på 14 dagar post infektion.
  7. Bekräfta genomförbarheten av U. maydis inokulum
    1. Släpp 10 µL av inokulatet på en PD träkol agarplatta och odla i rumstemperatur i 2 dagar.
      Obs: Om respektive U. maydis kultur kan bilda filament, fluffiga, vitt mycel blir synlig (figur 5)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Konstruktioner för U. maydis trojansk häst experiment är klonade in plasmid p123-PUmpit2-SpUmpit2-gen av intresse-mCherry-Ha. Den majs gen av intresse smälts samman till en mCherry fluorescens reporter och en epitop HA-tagg. Uttrycket av proteinet fusion är under kontroll av promotorn U. maydis Umpit2 som aktiveras specifikt under infektion21. Till direkta utsöndringen av proteinet av intresse peptid till zonen biotrophic interaktion smälts kodande regionen på sekvensen signal peptid U. maydis Umpit221 (figur 1). Vid U. maydis omvandling, transgenens sätts in SG200 ip-locus av homolog rekombination och riktade genomet införande kan bli verifierade av Southern blot analys. Utsöndringen av proteinet fusion bekräftas av confocal laserscanning mikroskopbilder i plantan lämnar infekterad med en Trojan Häst stam (figur 3). Som ett exempel, plantor smittade med antingen U. maydis trojansk häst stam SG200Zmmac1 utsöndrar en ZmMAC1-mCHERRY eller en icke-Trojan horse kontroll stam uttrycker noSP-Zmmac1-mCHERRY som saknar de Umpit2- SP, och därefter gör inte hemligheten den ZmMAC1-mCHERRY-HA protein, visas i figur 315. Hyfer utsöndrar ZmMAC1 omges av fluorescerande mCherry signal (figur 3A). Däremot Visa icke utsöndrar hyfer bara fluorescens signal i svamp cytoplasman (figur 3B).

I synnerhet bygger tofs infektion med U. maydis på korrekt vävnad Inympning, som beskrivs i steg 3.5. Felaktig tofs lokalisering eller ojämlik fördelning av inokulatet kan resultera i icke-infekterade tofs (figur 4A) eller endast delvis infektion i toffs (figur 4B). För att säkerställa jämn fördelning, behöver inokulatet frigöras långsamt från inympning nålen att förvärva hela vävnad infektion (figur 4 c). Lönsamheten för inokulatet kan verifieras genom att placera en droppe på PD-träkol agar. Infektiös stammar bilda filament som förekommer som skriver fluff på plattan som visas för solopathogenic trojansk häst stamceller stam SG200 (figur 5A) medan U. maydis stammen FB1 kräver parning före smittsamma filament bildning ( Figur 5B).

Namn Primer tillägg Sekvens (5´→3´)
Framåt XbaI-majs gen GCTCTAGA...
Omvänd NcoI-RSIATA-majs gen CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG...

Tabell 1: Sekvenser av primer tillägg att lägga till begränsning sidor och RSIATA motivet kodande sekvens till majs-genen av intresse.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk översikt över den U. maydis trojansk häst plasmid kloning strategi. ZMmac1 (ljusgrå) frigörs genom dubbel digest från p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha. Samtidigt förstärks genen av intresse (gul) med PCR. För kloning syfte, framåt och bakåt primers är utformade som inkluderar Xbajag och Ncojag kloning av platser och en RSIATA länkare (lila). PCR-produkten rötas med Xbajag och Ncojag. Efter ligering, trojansk häst plasmiden innehåller följande element: Driven av Umpit2 promotorn, en Umpit2-SP (blå) smälts N-terminalt på en majs gen av intresse ORF (gul). På C-terminus, en RSIATA länkare, en mCHERRY reporter gen (röd) och en HA epitop tagg (grön) är smält följt av ett stop-kodon. Innan U. maydis omvandling, trojansk häst plasmiden rötas med Sspjag tillåta homologa integrering i den U. maydisip-locus (grå).  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Ljus-mikroskopisk undersökning av U. maydis inympning kultur. Flera cigarr-formade U. maydis sporidia syns, av vilka några genomgå spirande (markeras med asterisker). Inga ytterligare celler är närvarande som skulle indikera en förorening av kulturen. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : I planta confocal laserscanning mikroskopbilder av en Ustilago Trojansk häst stam. Imaging av mCherry-smält majs protein ZmMAC1 efter majs planta infektion med hjälp av den trojanska häst stammen SG200Zmmac1 (A) eller en icke-Trojan horse stam SG200Zmmac1- noSP saknar Umpit2-SP (B). Utsöndrade ZmMAC1-mCHERRY-HA fusionsprotein ligger på ytan av U. maydis hyfer (A)15, indikeras av pilen huvuden. I SG200Zmmac1- noSP endast cytoplasmiska lokalisering av ZmMAC1 är synliga (B), anges av asterisk 15. Skala barer = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Tofs infektion med U. maydis. Misslyckade infektion i tofs med U. maydis (A), partiell tofs-infektion (B) och komplett tofs (C) 12 dagar efter infektion visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Inokulum lönsamhet analysen på PD-träkol agar. Den solopathogenic stammen SG2001 användes för trojansk häst generation. SG200 är själv stimulerande och bildar smittsamma filament på en PD-träkol agarplatta (A). Haploid U. maydis stam FB1 kräver parning med en kompatibel stam före fintrådiga tillväxt (B)22. Skala barer = 2 mm.  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Moderna gröda forskning kräver protokoll för molekylär analys på genetiska och proteinnivåer. Genetiska tillgänglighet via omvandling är inte tillgänglig eller ineffektivt och tidskrävande för de flesta grödor arter såsom majs. Dessutom är pålitliga genetiska verktyg som arrangören reporter system knappa, vilket gör det svårt att studera jordbaserad proteinfunktion spatiotemporal med hög upplösning på distinkt vävnad platser. Apoplastisk proteiner kan studeras genom infiltration av heterologously uttryckta och renade proteiner i vävnader. Trots framsteg inom heterologa proteiner kvarstår dock riktade infiltration i gröda vävnader svårt och ofta ineffektiva för protein funktionell analys. Trojansk häst strategin är en alternativ metod som inte kräver omvandling eller protein infiltration. Genom att anställa till sekretion apparater majs patogenen U. maydis, kan leverans av teoretiskt något protein av intresse till den växt apoplast av infekterad vävnad uppnås. Angående storleken av ett protein av intresse har gränserna för denna teknik ännu inte utforskas. I tidigare var den 290 aminosyror U. maydis effektor Cmu1 smält till mCherry framgångsrikt utsöndrade7. Tillämpligheten av metoden trojansk häst till större proteiner återstår emellertid testas. Om tillägg av proteinet posttranslationell ändringar av intresse är oönskade, kan okonventionella sekretion användas som en alternativ rutt till klassiskt sekretion via SP14.

U. maydis är anställd som ett standardverktyg i protein bioteknik på grund av tillförlitliga proteinveckning, posttranslationell modifiering och sekretion effektivitetsvinster11,12,13. Dock behöver protein secretionen för varje ny trojansk häst stam analyseras noggrant enligt beskrivningen i steg 3. Det rekommenderas att utföra en första provning av varje nygenererad trojansk häst stam genom att infektera plantor som är lätt att infektera och inspektera av mikroskopbilder.

SG200 är en solopathogenic stam som kräver inte parning före experiment som trojansk häst och är därmed lättare att hantera. Även om infektion effektivitet kompatibel stammar som FB1 och FB2 är högre23, effektiviteten i SG200 är tillräcklig för trojansk häst experiment. Vissa U. maydis effektor proteiner tas upp av värdceller, medan andra förblir i apoplast. Differentieringen mellan båda grupperna verkar vara en kontrollerad och specifika process. dock de underliggande mekanismerna förbli svårfångade8 och kan inte beaktas när man utformar ett experiment. Proteiner av intresse som har integreras i cellväggen eller som har att agera intracellulärt är därför inga lämpliga kandidater för metoden trojansk häst.

Eftersom U. maydis är allsmäktig i infekterar olika antenn majs vävnader, trojansk häst metoden kan tillämpas för flera proteiner, i olika vävnader och i olika utvecklingsstadier, såsom plantan bladen, vuxna blad, Tofsar, och öronen. För att nämna bara några användbara applikationer, tillåter den trojanska hästen testning lokal överdosering, offside protein effekter eller funktionell karakterisering av olika protein domäner.

Att upprätthålla en oförorenad U. maydis är kultur avgörande för alla beskrivs experiment eftersom samtidig infektion med en stor mängd bakterier utlöser växtens immunsvar och förändrar dess reaktion mot proteinet sevärdheter, vilket gör någon resultaten är inte övertygande. Trojansk häst studier i vuxen lämnar, Tofsar och öron måste utföras med maximally 1.5 mL infektion kultur eftersom högre volymer kan leda till vävnadsskador. Tofs och öroninfektioner kan tränas med mat färg-färgade vatten istället för Ustilago inokulum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella och Armin Hildebrand för att tillhandahålla lab utrymme och plant material. Det ursprungliga arbetet på metoden trojansk häst stöddes av en Leopoldina postdoc fellowship och NSF projektet IOS13-39229. Det arbete som presenteras i denna artikel stöddes av SFB924 (projekt A14 och B14) av DFGEN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL syringe  B. Braun 4606027V
23 G x 1 1/4 hypodermic needle B. Braun 4657640
Bacto Peptone  BD 211677
cDNA from maize from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal Sigma-Aldrich 05105
Confocal laser scanning microscope use locally available equipment
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) Sarstedt 67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification use locally available equipment
Nco I NEB R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha please contact the corresponding author 
Pasteur pipet (glass, long tip) VWR 14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO Thermo Fisher Scientific K280002 can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar  VWR 90000-745
Sharpie pen use locally available equipment
Spectrophotometer use locally available equipment
Ssp I NEB R0132
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
T4 DNA ligase NEB M0202
TRIS Sigma-Aldrich TRIS-RO
Xba I NEB R0145
Yeast extract  BD 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  2. Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
  3. Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. (2018).
  4. Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
  5. Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
  6. Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
  7. Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
  8. Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
  9. Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
  10. Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
  11. Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
  12. Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. Springer International Publishing. 183-200 (2016).
  13. Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
  14. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  15. van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
  16. Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. e54522 (2016).
  17. Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
  18. Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
  19. Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
  20. Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. Springer US. 575-595 (1974).
  21. Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
  22. Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
  23. Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics