إنتاجية عالية في تقييم المختبر من الكمون عكس الوكلاء عن فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

بروتوكول إنتاجية عالية للتقييم الوظيفي لتنشيط فعالية فيروس نقص المناعة البشرية وتخليصها من بروفيروسيس الكامنة الموصوفة ويطبق اختبار أثر التدخلات بشأن فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط. وترد نتائج تمثيلية لتأثير الكمون عكس الوكلاء على النسخ التي يحركها لتر والربط.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Khoury, G., Purcell, D. F. High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing. J. Vis. Exp. (143), e58753, doi:10.3791/58753 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وما زال فيروس نقص المناعة البشرية المستعصية بسبب وجود مستودع للخلايا التي تأوي شكل مستقر والكامنة للفيروس، الذي يبقى غير مرئية للجهاز المناعي، وهي ليست موجهة بالعلاج المضاد للفيروسات الرجعية الحالية (عربة). قد ثبت النسخ والربط إلى تعزيز زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية-1 في استراحة خلايا CD4 + T. عكس الكمون باستخدام الكمون عكس وكلاء (لراس) في النهج "الصدمة وقتل" درست على نطاق واسع في محاولة لتطهير هذا الخزان ولكن لم تظهر حتى الآن أي نجاح في التجارب السريرية بسبب الافتقار إلى التنمية الصغيرة الكافية الجزيئات التي يمكن التشويش كفاءة هذا الخزان. ينص البروتوكول على المقدمة هنا طريقة لموثوقية وكفاءة تقييم الكمون عكس وكلاء (لراس) في النسخ فيروس نقص المناعة البشرية والربط. ويستند هذا النهج استخدام يحركها لتر لون مزدوج مراسل وكالة فرانس أنه في نفس الوقت يمكن قياس الأثر جيش الرب للمقاومة على النسخ والربط بالتدفق الخلوي. بروتوكول الموصوفة هنا كاف للخلايا ملتصقة، فضلا عن الخلايا الموجودة في التعليق. أنها مفيدة لاختبار عدد كبير من الأدوية في نظام إنتاجية عالية. الأسلوب من الناحية التقنية البسيطة لتنفيذ وفعالية من حيث التكلفة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام التدفق الخلوي يسمح تقييم سلامة الخلية وهكذا المخدرات سمية في نفس الوقت.

Introduction

وعلى الرغم من فعالية العلاج المضاد للفيروس طويلة الأجل، استمرت فيروس نقص المناعة البشرية في حالة كامنة بروفيروس متكاملة في الذاكرة خلايا CD4 + "تي"1. هيكل الكروماتين من فيروس نقص المناعة البشرية-1 5 ' المروج تكرار طويلة طرفية (لاتينية) وتعديلات جينية مثل مثلايشن هيستون وديسيتيلاتيون بالحمض النووي ميثيلترانسفيراسيس (دنمت) وهيستون ديسيتيلاسيس (هداك) هي آليات هامة تؤدي إلى النسخي القمع ومن ثم التكامل بعد الكمون2،3. مجموعة كبيرة ومتنوعة من الكمون عكس وكلاء (لراس) قد تم التحقيق لفعاليتها للحث على إنتاج الفيروس في المختبر وخفية في المجراة من المصابين في استراحة CD4 + "تي" الخلايا4،،من56،7 ،8. بين لراس اختبارها، هداسي (مثبطات HDAC) وبيت برومودومين مثبطات (بيتيس) حمل ديكوندينسيشن الكروماتين والإفراج عن النسخ الإيجابية استطالة عامل ب (P-تيفب) على التوالي، والمؤدية إلى اللاحقة التخفيف من النسخي القمع في 5 ' لتر والتنشيط لفيروس نقص المناعة البشرية التعبير9،،من1011،،من1213. بيد أن حجم إعادة التنشيط التي حققتها هذه لراس كانت محدودة، كما لوحظ زيادة متواضعة فقط في الخلية المرتبطة أونسبليسيد فيروس نقص المناعة البشرية مرناً (الرنا لنا)، يدل على النسخ الفيروسية، السابقين فيفو14،15. الأهم من ذلك، فشلت هذه لراس أيضا للحث على تخفيض تواتر الخلايا المصابة خفية.

فيروس نقص المناعة البشرية التعبير لا يجوز تقييده كذلك بعدم كفاءة الربط16 فضلا عن عيوب في الصادرات النووية لضرب المقسمة "فيروس الحمض النووي الريبي" (الرنا MS)17. وبالتالي، هناك حاجة إلى تحديد فئات جديدة من لراس التي هي أكثر قوة، ويمكن أن تؤثر على جوانب متميزة من الفيروسات التكامل ما بعد الإنتاج. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب وضع فحوصات الرواية التي تساعد على تحديد المركبات الأمثل لكفاءة عكس الكمون.

ويرد هنا، بروتوكول، التي تستخدم نهجاً الفائق للوظيفية تقييم أثر التدخلات على النسخ التي يحركها "لتر فيروس نقص المناعة البشرية" والربط. وباختصار، لون مزدوجة جديدة يحركها لتر مراسل نظام pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/دسريد (الشكل 1) يستخدم لتقييم إعادة تنشيط فيروس نقص المناعة البشرية بالتدفق الخلوي. في هذا المراسل الفلورسنت، التعبير عن أونسبليسيد فيروس نقص المناعة البشرية مرناً (4 كيلوبايت) يؤدي إلى التعبير البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)، بينما التعبير عن مرناً المقسمة (2 kb) سيؤدي إلى تعبير البروتينات الفلورية ديسكوسوما sp. الحمراء (دسريد). بإيجاز، استخدمنا بروتين فلوري انصهار الحياة الفطرية-اجفب، gp140unc. اجفب، حيث كان وضع تسلسل الترميز اجفب في الإطار مع نموذج الأمم المتحدة ملصوق ومبتورا المغلف (الحياة الفطرية). وأدخلت تغييرات يجتذ الموقع الانقسام ومنع الانفصال من الحياة الفطرية في gp120 و gp41-اجفب، واقتطاع البروتين gp160 قبل المجال transmembrane خلق تناظرية الحياة الفطرية القابلة لذوبان، مما يسهل الطي الصحيحة و التعبير عن اجفب. عند التعبير داخل خلية، يموضع Rev لنواة حيث أنها تتوسط الصادرات النووية هيولى من 4 كيلو بايت الحياة الفطرية مرناً عن طريق التفاعل مع عنصر استجابة القس (رر). الاقتطاع من الحياة الفطرية لا يضر رر، التي تقع بين gp120 و gp41، وموقع الوصلة 3 ' A7. وفي هذا النظام، الربط في فيروس نقص المناعة البشرية-1 لصق المانحة 4 (SD4) ولصق يقبلون 7 (SA7) النتائج في إنتاج 2 ك. بايت تنصهر مرناً ترميز بروتين Rev غير وظيفية اقتطاع في 38 من الأحماض الأمينية للبروتينات الفلورية دسريد، RevΔ38-دسريد. بإيجاز، كان دسريد إدراج إكسون 2nd من رؤيا في الأحماض الأمينية 38 بتداخل ملحق18. لتسهيل الصادرات النووية مرناً أونسبليسيد، transfected ناقل تعبير الثدييات ترميز Rev (بكمف-القسNL4.3) كان يشترك مع بناء مراسل الفلورسنت (الشكل 2). هذا البناء الفريد مراسل الموصوفة هنا مفيدة في تقييم الفائق لفيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط، دون الحاجة إلى استخدام النواقل الفيروسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: التحول وتسلسل الإجراءات للاستنساخ، ناقش18،19في أماكن أخرى. البروتوكولات هنا تبدأ من تعداء ناقلات التعبير الثدييات (الشكل 3).

1-تعداء الخلايا HEK293T مع مراسل اللون المزدوج بناء

  1. زراعة الخلايا HEK293T في المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) وتستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) والبنسلين (100 U/mL) ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية. بعد ذوبان الجليد، تجارب الخلايا HEK293T مرور 2-3 مرات قبل استخدامها في تعداء. وهذا سيعطي الوقت الخلايا للتعافي من الإجراء ذوبان.
    تنبيه: تلوث مفطورة من الثقافات الخلية لا يزال يمثل مشكلة خطيرة. الممارسة الجيدة للمختبرات والفحص الروتيني للثقافات الخلية ضرورية لتقليل خطر التلوث مفطورة، وتجنب نشر20.
  2. تقسيم الخلايا 1:2 يوم واحد قبل البذر وتحويلها إلى الطازجة دميم المتوسطة. زراعة الخلايا ح 24 في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
  3. إزالة المتوسطة من قارورة بتطلع اليوم قبل تعداء، وتغسل الخلايا مع دولبيكو للفوسفات مخزنة (دببس) المحلول الملحي خالية من الكالسيوم (Ca2 +) والمغنيسيوم (Mg2 +) لإزالة آثار المصل.
  4. الاستغناء عن 5 مل محلول يدتا التربسين (0.05%-10 ملم في برنامج تلفزيوني) في سفينة الثقافة ووضعه في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لمدة 2 إلى 5 دقائق.
  5. عندما يتم فصل الخلايا، إضافة 5 مل دميم وتستكمل مع 10% (v/v) FBS تمنع زيادة النشاط التربسين التي قد تلحق الضرر الخلايا.
  6. ريسوسبيند بلطف من بيبيتينج تعليق خلية صعودا وهبوطاً لكسر في كتل.
  7. تضعف الخلايا 01:10 بوصمة عار تريبان الأزرق (0.4 في المائة).
  8. عد الخلايا الحية التي لا يستغرق تريبان الأزرق باستخدام مجهر (10 x الهدف) وهايموسيتوميتير.
  9. حساب عدد الخلايا قادرة على البقاء في المليلتر بأخذ متوسط عدد الخلايا وضرب من قبل 10,000 ومعامل التخفيف (01:10) من تريبان الأزرق بوصمة عار.
  10. لوحة 2 × 104 خلايا في 100 ميكروليتر من دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS دون المضادات الحيوية في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا ح 24.
  11. لكل بئر، تمييع 400 نانوغرام pLTR.gp140/EGFP. RevD38/دسريد، 20 نانوغرام من القس بكمفNL4.3 و 100 نانوغرام من بكمف-Tat101AD8-"علم الحمض النووي" في 50 ميكروليتر من المصل المتوسطة الحرة. المزيج بلطف. لإجراء التجارب دون تأت، استخدم مطابقة فارغة تأت متجه pcDNA3.1 (-).
    ملاحظة: ينصح بشدة استخدام الحمض النووي خالية من الذيفان. لذلك، تعد خالية من الذيفان الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية ميدي أو ماكسيبريب في حمض النووي. تحديد نقاء الحمض النووي عن طريق قياس نسبة OD 260/280، التي ينبغي أن تكون بين 1.7 و 1.9.
  12. خلط الكاشف الدهون بلطف قبل استخدام، ثم يضعف ميكروليتر 0.65 في 50 ميكروليتر من المصل المتوسطة الحرة. المزيج بلطف واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  13. الجمع بين الحمض المخفف مع الكاشف الدهون المخفف.
  14. المزيج بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قد يبدو الحل الملبدة بالغيوم.
    ملاحظة: تابع إلى الخطوة 1، 15. خلال 30 دقيقة.
  15. الاستغناء عن 100 ميكروليتر كل بئر المجمعات الحمض النووي كاشف دهن دروبويسي أعلى الخلايا.
  16. المزيج بلطف هزاز لوحة ذهابا وإيابا.
  17. احتضان لوحة ح 5 في 5% CO حاضنة هوميديفيد2 في 37 درجة مئوية.
    1. كل رد فعل مزيج غير كافية تعداء بئر واحدة (96-أيضا). ضبط مقدار وحجم المكونات وفقا للعدد من المخدرات وتركيبة التي سيتم اختبارها، وحسابات للاختلافات بيبيتينج. وعادة ما يتم اختبار كافة الشروط في تريبليكاتيس.
    2. ترانسفيكت آبار إضافية مع 100 نانوغرام من يحركها CMV بلازميد اجفب ودسريد في التعبير عن الحمض النووي لأغراض التعويض.

2-معاملة Transfected HEK293T الخلايا مع الكمون عكس وكلاء

ملاحظة: قبل كل فحص، تحديد الحالة الفسيولوجية لكل جيش الرب للمقاومة عن طريق قياس صلاحية الخلايا بعد التعرض لجرعة عالية ومنخفضة من المخدرات مع خلية انتشار المقايسة.

  1. تمييع كل جيش الرب للمقاومة إلى تركيز العمل المناسبة مع متوسط النمو (مثل، 1 ميكرومتر ل JQ1(+)).
    تنبيه: إعادة تشكيل الأدوية المجففة بالتبريد مع المذيب المناسب لتركيز من 10 ملم. تخزين جميع الأسهم لراس في-80 درجة مئوية واحدة استخدم قاسمة (5 ميكروليتر في كل) تفاديا لتكرار دورات ذوبان التجميد.
  2. بعناية نضح المتوسطة تعداء مع القنوات المتعددة واستبدال 100 ميكروليتر المتوسطة التي تحتوي على جيش الرب للمقاومة المناسبة (الجدول 1). إضافة المتوسطة بلطف جداً جنبا إلى جنب مع جدار البئر لتجنب فصل الخلايا HEK293T ترانسفيكتيد، التي هي معروفة لفصلها بسهولة من سطح لوحة الثقافة.
  3. احتضان لوحة ح 48 في 5% CO حاضنة هوميديفيد2 في 37 درجة مئوية.

3-تلطيخ Transfected الخلايا مع صبغة الجدوى يمكن حلها لتحليل التدفق الخلوي

تنبيه: إزالة الخلايا الميتة والحطام ضروري للقضاء على إيجابيات كاذبة، والحصول على نتائج ذات جودة أعلى.

  1. فصل الخلايا في وسائل الإعلام استخدام 100 ميكروليتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كل بئر وقبل بلطف بيبيتينج صعودا ونزولاً (5 مرات ~) مع القنوات المتعددة، مع تجنب مزبد لوسائل الإعلام. إذا لزم الأمر، قم بفصل الخلايا من لوحة استخدام 35 ميليلتر لكل بئر الحل يدتا التربسين (0.05%-10 ملم في برنامج تلفزيوني) وتفرخ 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية، قبل تحييد مع المتوسطة التي تحتوي على المصل.
  2. نقل الخلايا إلى لوحة الخامس-أسفل 96-جيدا.
  3. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 500 x ز في 4 درجات مئوية، ثم نضح المتوسطة/برنامج تلفزيوني بعناية دون لمس الخلايا.
  4. تغسل الخلايا مرة واحدة على الأقل مع 200 ميكروليتر من البروتين/المصل مجاناً برنامج تلفزيوني.
  5. الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم تجاهل المادة طافية بإمالة اللوحة وإزالة المخزن المؤقت يغسل دون لمس الخلايا.
  6. يعد إيجاد حل عملي لصبغ صلاحية يمكن حلها بتمييع صلاحية صبغ 1: 1000 في البروتين/المصل مجاناً برنامج تلفزيوني. إعداد 50 ميليلتر من وصمة عار المخفف كل بئر.
    ملاحظة: الجدوى الأصباغ متوفرة في مجموعة من الألوان مناسبة للاستخدام مع أجهزة الليزر الأزرق والأحمر والبنفسجي. إعداد حل أسهم لصبغ صلاحية يمكن حلها قبل ريسوسبيندينج قنينة واحدة من الصبغة المجففة بالتبريد (المكون A) مع محرك القرص الصلب (العنصر ب) 50 ميكروليتر اللامائى [دمس]. مخزن في-20 درجة مئوية في الكوة استخدام الفردي (1 ميكروليتر في كل)، محمية من الضوء.
  7. إضافة 50 ميكروليتر من الصبغة صلاحية المخفف لكل بئر وخلط الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع القنوات المتعددة.
  8. وصمة عار لمدة 10-15 دقيقة على 4 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
  9. أغسل 1-2 مرات مع 150 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (برنامج تلفزيوني مع يدتا الزلال ومم 2 الأبقار 1%).
  10. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  11. إصلاح الخلايا مع 100 ميكروليتر من طازجة 1% فورمالدهايد في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لمدة 10-15 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
    تنبيه: الفورمالديهايد سامة جداً. إعداد 1% فورمالدهايد الحل في غطاء دخان لتجنب استنشاق أثناء ارتداء القفازات ونظارات السلامة للحماية.
  12. تغسل الخلايا 1-2 مرات مع 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  13. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  14. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 70 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يمكن تخزين خلايا ثابتة عند 4 درجة مئوية في الظلام للتحليل في اليوم التالي في سيتوميتير تدفق.

4-اجفب والقياسات دسريد بالتدفق الخلوي وتحليل البيانات

ملاحظة: تحليل فيروس النسخ (% اجفب) والربط (% دسريد) في سيتوميتير تدفق. تصفية العينة قبل التشغيل مع خلية-مصفاة ميكرومترات 70 أو 100 ميكرومتر النايلون شبكة لتجنب انسداد الفوهة.

  1. بدء تشغيل سيتوميتير والكمبيوتر على الأقل 10 دقيقة قبل استخدامها للتأكد من أشعة الليزر الاحماء.
  2. قبل تشغيل عينات والبدء في الحصول على البيانات، ملء خزان غمد مع المحلول الملحي 0.9% وضمان أن تتم إضافة قرص تحت كلوريت الصوديوم إلى خزان النفايات.
  3. فحص الخلية تدفق لفقاعات الهواء.
  4. تحقق من أن كاشفات وعوامل التصفية المناسبة للتجربة.
    ملاحظة: بالنسبة اجفب، استخدم الليزر الأزرق (488 نانومتر) وممر الموجه 530/30، بينما يتم الكشف عن استخدام الليزر الأصفر على النحو الأمثل إكسبريس دسريد (561 nm) وممر الموجه 610/20. ليزر أزرق (488 نانومتر) ويمكن أيضا استخدام ممر الموجه 610/20 للكشف عن التعبير دسريد.
  5. التحقق من الأداء سيتوميتير وحساسية عبر أجهزة الكشف عن طريق تشغيل الخرز المعايرة.
  6. ضبط الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ) والجانب مبعثر (SSC-أ) الفولتية مع أونستاينيد عينة حيث يكون السكان الرئيسية التي تظهر على الشاشة ووضوح ملموس.
    ملاحظة: منتدى التعاون الأمني (ضوء متناثرة إلى الأمام) مقياس الضوء الحيود في زاوية مسطحة، الذي يعتمد على حجم الخلية (خلية المساحة أو الحجم)، بينما SSC (الجانب-متناثرة الضوء) هو قياس حيود الضوء في زاوية الحق، الذي يتناسب مع مستوى الخلية والتعقيد الداخلي.
  7. إجراء تعويض اليدوي أو التلقائي باستخدام عينات الملطخة بمفرده كفالة امتداد الحد الأدنى من اجفب + السكان إلى كاشف دسريد والعكس بالعكس.
    تنبيه: ولأغراض التعويض، استخدام عينة خلايا معربا عن كل من البروتين الفلورسنت لون واحد، فضلا عن خلايا منفردة ملطخة بصبغة الجدوى يمكن حلها. لا تستخدم الخرز التعويض فيتك والمؤسسة العامة للتعويضات البروتينات الفلورية اجفب ودسريد بسبب الخصائص الطيفية المختلفة. يجب أن تكون ضوابط التعويض مشرق بما فيه الكفاية لحل السكان الإيجابية والسلبية.
  8. خلق المؤامرات وتعيين غيتس fluorescence ناقص واحد (FMO) عناصر التحكم باستخدام.
  9. حيازة وتسجيل الحد ني أحداث خلية صالحاً 10,000 كل عينة. تشغيل عينات بسرعة متوسطة أو منخفضة لتجنب doublets مرورا باعتراض الليزر. استخدام نبض الهندسة النابضة مثل التعاون بين بلدان الجنوب-أ مقابل ح ال SSC للقضاء على دوبليتس. تحقق الاستقرار للتشغيل برسم الوقت مقابل SSC-أ لترى كيف حتى يتم التدفق أثناء التشغيل.
  10. في نهاية الشوط، تنظيف فلويديكس الخلوي التدفق مع وكلاء التنظيف المركزة ثم الماء لمدة 5 دقائق.
  11. إيقاف تشغيل النظام، التخلص من النفايات وإعادة ملء خزان غمد بعد اكتساب.
  12. تحليل البيانات استخدام برنامج تحليل بيانات تدفق الخلوي. استبعاد الخلايا الحطام واجمه (دوبليتس) استناداً إلى مبعثر إلى الأمام والجانب، ثم القضاء على الخلايا الميتة استخدام صلاحية صبغ وصمة عار (سلبية السكان = الخلايا الحية). تحديد الخلايا وإذ تعرب عن اجفب ودسريد (الشكل 4)، فضلا عن النسبة المئوية للمنتج المقسمة دسريد/(DsRed + EGFP) (الشكل 5).
  13. تحديد تأثير جيش الرب للمقاومة على النسخ فيروس نقص المناعة البشرية، والربط بمقارنة خلايا غير المعالجة والخلايا المعرضة لفرد أو مجموعة من لراس (الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتظهر نتائج الممثل في الشكل 5 للتعبير عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 أونسبليسيد (اجفب)، وتقسم المنتجات (دسريد) بعد المعالجة بمثبطات برومودومين JQ1. JQ1(+) وتأت زيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا معربا عن اجفب (FC 2.18 و 4.13 عبر [دمس] على التوالي; n = 3) يدل على النصوص أونسبليسيد. وعلاوة على ذلك، JQ1(+) زيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا معربا عن دسريد (46.6 FC على [دمس]) فضلا عن نسبة المنتجات المقسمة (FC 7.37 عبر [دمس]) إلى مستوى مماثل تأت (FC 59.6 و 5.83 عبر [دمس]، على التوالي) مما يؤكد قدرة JQ1(+) لتشغيل النسخ فيروس نقص المناعة البشرية والربط. من ناحية أخرى، يلغي المعاملة مع عنصر التحكم ستيريويسومير JQ1(-) JQ1(+) تأثير على فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط يؤكد نجاح البروتوكول.

في منشور صدر مؤخرا، وقد أظهرنا بتحليل الحمض النووي الريبي تقسم النصوص بعد العلاج JQ1(+)21من تراكم لفيروس نقص المناعة البشرية. وفي الواقع، كشفت البيانات المتوفرة لدينا تتفق التغييرات في مستويات النصوص أونسبليسيد والمقسمة التي تم نسخها نسخاً متطابقاً بتعبير البروتين اجفب ودسريد في هذا النموذج بعد العلاج مع JQ1(+). تشير هذه النتائج إلى أن اجفب ودسريد التعبير عن خلايا يعكس قدرة مثبط برومودومين JQ1(+) لحمل فيروس النسخ والربط.

باختصار، نحن التحقق من صحة استخدام pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/دسريد مراسل في إنشاء الفائق لتقييم تأثير لراس على فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ والربط. المبلغ دون المستوى الأمثل من جيش الرب للمقاومة أو زيادة السمية يمكن أن يؤدي إلى نتائج صواريخ سكود. تحسين كمية المخدرات المستخدمة مع الحفاظ على بقاء الخلية يمكن تحسين دقة النتائج.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي للنموذج المستخدم لتحديد تأثيرات الكمون عكس الوكلاء على النسخ التي يحركها لتر والربط- تعزيز البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب) لتر وتعرب عن بناء تنصهر فيها أما البروتين المغلف أونسبليسيد (الحياة الفطرية) أو تقسم البروتين Δ38rev مع دسريد. وقد أعيد طبع هذا الرقم من خوري et al.21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تصميم بنيات. (أ) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/دسريد مراسل الربط يتيح اقتطاع التعبير عن المغلف تنصهر فيها اجفب (gp140-اجفب) والبروتين Rev غير وظيفية في الأحماض الأمينية 38 تنصهر فيها دسريد نيون البروتين (RevΔ38-دسريد). (ب) بكمف-القسNL4.3 يسمح التعبير عن البروتين Rev. (ج) بكمف-Tat101AD8-العلم يتيح التعبير عن البروتين Tat101(AD8) مع علامة علم ج--المحطة طرفية. والبلازميدات التعبير هي التي شيدت باستخدام PCR التداخل وخلاصة القيد. جميع ناقلات الخرائط تم إنشاؤها باستخدام برنامج سنابجيني ، الإصدار 4.1.9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تصميم للتقييم السريع لفيروس نقص المناعة البشرية الكمون عكس وكلاء الاعتداء. يتضمن الأسلوب الحالي لتقييم تأثير لراس على فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ والربط ط) البذر للخلايا HEK293T يوم واحد قبل الثاني) تعداء مع ناقلات التعبيرات متبوعاً بالعلاج الثالث) جيش الرب للمقاومة. رابعا) خلايا يتم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي 48 ساعة بعد العلاج. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أن تختبر 32 (في ثلاث نسخ) إلى 96 الشروط للوحة الواحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: مثال لإنشاء لوحة والضوابط اللازمة. تناظر الأعمدة 1 إلى 3 عناصر سالبة (-) مع لا المخدرات والمذيبات فقط ([دمس] بينها) فضلا عن عناصر إيجابية (+) مثل تأت (100 نانوغرام)، سلطة النقد الفلسطينية/فا = phorbol myristate خلات/فيتوهايماجلوتينين (10 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية، 10 ميكروغرام/مل فا)، JQ1 (+/-) (1 ميكرومتر)، VOR = (فورينوستات 0.5 ميكرومتر)، وعموم = بانوبينوستات (30 نانومتر). ويتم اختبار لراس غير معروف في ثلاث نسخ أكثر من مجموعة من تركيزات (15.625 إلى 1000 نانومتر). لأغراض التعويض، معربا عن كل من البروتين أحادي اللون الفلورسنت (اجفب + ودسريد +) فضلا عن الخلايا خلايا ملطخة بصبغ صلاحية ويتم تضمين الخلايا أونستينيد في كل تشغيل. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Figure 4
الشكل 4: النابضة الاستراتيجية المستخدمة في تحليل التدفق الخلوي- الخطوة الأولى في استراتيجية النابضة يستند المبعثر إلى الأمام والجانب، مما يسمح تمييز الخلايا من الفائدة استناداً إلى حجم ومستوى خصائص هذه الخلايا. من المستحسن أن هذا النابضة تكون سخية قدر الإمكان لتضمين كافة الأحداث، أثناء إزالة الحطام الخلوية والخلايا الميتة، التي توجد في الزاوية اليسرى السفلي من كثافة الأرض. قم بإزالة دوبليتس من dataset استخدام هندسة نبض النابضة بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل SSC-ح وضيقة كذلك على الخلايا الحية باستخدام الصبغة البقاء. وأخيراً، تفريغ قناة (الأشعة فوق البنفسجية) واجفب أو دسريد تستخدم لتعريف للخلايا للفائدة. استخدام fluorescence ناقص واحد من عناصر التحكم (FMO) الحاسمة في تحديد سكان اهتمام ومعالجة القضايا المتعلقة بالفائض من فلوروتشرومي آخر في القناة للفائدة. بعد اكتساب، يتم تحليل البيانات استخدام التدفق الخلوي برامج تحليل البيانات. وقد أعيد طبع هذا الرقم في تكييف نموذج خوري et al.21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: نتائج تمثيلية لتأثير مثبطات برومودوماين على النسخ فيروس نقص المناعة البشرية والربط- أمثلة (A) للمعلمة اثنين المزدوج الألوان الفلورية اجفب مقابل دسريد كثافة قطع من الخلايا أونترانسفيكتيد (-تأت)، transfected الخلايا مع 100 نانوغرام من بكمف-Tat101AD8-العلامة (+ تأت) والخلايا تعامل مع [دمس]، JQ1 (+) أو JQ1 (-). (ب) المتوسط النسبة المئوية (%) للخلايا معربا عن اجفب، دسريد أو المنتج المقسمة (دسريد/دسريد + اجفب) يظهر من 3 التجارب المستقلة. أجريت مقارنات لكل شرط إلى [دمس] باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه. إلا ترد مقارنات يعتد به إحصائيا. ف < 0.05؛ ف < 0.01؛ ف < 0.001. تمثل خطوط سوداء mean±SEM-[دمس] (بينها)، JQ1 (+) و JQ1(-) (1 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نظراً لصعوبة قياس تنشيط الفيروس السابقين فيفو، طائفة واسعة من المختبر ووضعت نماذج مع مرور الوقت من أجل دراسة زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية بما في ذلك خفية المصابة خطوط الخلايا T (J-لاتس لاتفيا، ACH2، U1)، النماذج الأولية للعدوى الكامنة ليستريح ( نماذج O'Doherty، لوين، وغرين والمشقوقه) أو خلايا CD4 + "تي" مفعّلة (ساهو، ماريني، بلانيليس، سيليسيانو، نماذج كانج) مع واحدة مستديرة أو النسخ المتماثل مراسل المختصة الفيروسات22. لنموذج الظروف الفسيولوجية لزمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية في استراحة خلايا CD4 + T، تبع ذلك نظم مراسل الفلورسنت مزدوجة مثل مراسل رغ (أحمر-أخضر-فيروس نقص المناعة البشرية) التي وضعتها المجموعة إيفان سادوفسكي مع علامة اجفب هفوة يحركها لتر ومشري يحركها CMV في مكان Nef23. مماثلة اللون المزدوج مراسل الفيروس، ديو-فلوو، وقد وضعته في مختبر Verdin هاء مع تعبير يحركها لتر اجفب وعلامة نيون مشري مدفوعا مروج EF1α24. في هذا النظام، تم إدراجها في اجفب في نهاية 3 ' بروفيروس بدلاً من Nef. يمنع الحذف في المغلف في كلا من هذه النظم جولات متعددة من الإصابات. وعلاوة على ذلك، مزيج البروتينات الفلورية اثنين يسمح الكشف عن منتجة (اجفب + متشيري +) وخفية المصابة (اجفب-متشيري +) الخلايا. بيد أن العديد من أوجه القصور من الفيروسات مراسل اللون المزدوج كانت ملحوظ في خلايا CD4 + T كما العدوى مباشرة من الخلايا المصابة خفية يعتمد إلى حد كبير على حالة التنشيط الخلوية23،خلايا تي24. وفي الواقع، لوحظ انخفاض معدل الإصابة باستخدام هذه الفيروسات اثنين مراسل في استراحة خلايا CD4 + T: 0.1% لرغ23 و 0.2 في المائة دوفلو25. وباﻹضافة إلى ذلك، كما CMV أظهرت المروج التعبير عن مستويات أدنى في الخلايا غير تنشيط26،27،28، CMV غير نشط أو مروج EF1α سيؤدي إلى التقليل من المصابين خفية والسكان.

لدينا التي تم إنشاؤها ويتميز ناقل مراسل فيروس نقص المناعة البشرية جديدة لدراسة إنشاء الكمون وإعادة تنشيط الفيروس في مقايسة إنتاجية عالية. تتضمن العديد من المزايا لأسلوب الفحص لدينا فعالية تكلفة ط) مع القدرة على تقييم النسخ والربط في وقت واحد، ثانيا) القدرة على اختبار عدد كبير من العقاقير أو تركيبات في تجربة واحدة، التقييم الثالث) سريعة أثر لراس بالتدفق الخلوي (30-45 دقيقة نموذجي قراءة الوقت 96 جيدا لوحة مستقلة عن عدد المعلمات الفلورسنت)، الرابع) مجموعة ديناميكية عالية، والخامس) مناسبة للألى تعداء عالية الإنتاجية والتدفق الخلوي استخدام الأسلحة الروبوت ومنصة HTS، علاج السادس) سريع للبيانات باستخدام تدفق الخلوي مساحة عمل قالب، سابعا) الأمثل لتعليق وخلايا ملتصقة، والثامن) البساطة النموذجي والقدرة على التكيف لقياسات القارئ التﻷلؤ ولوحة (لوسيفراس المزدوج اليراع ورينيلا)، والتاسع) قابلية (96-384 جيدا وبات الأشكال).

يمكن دراسة ميل جيش الرب للمقاومة أو مزيج من لراس إلى تنشيط النسخ التي يحركها "لتر فيروس نقص المناعة البشرية" والربط وهكذا تعبير البروتينات الفلورية اجفب ودسريد بالتدفق الخلوي استخدام مراسلنا الربط فيروس نقص المناعة البشرية. ومع ذلك، قبل اختبار التآزر بين رواية لراس، المستحسن جداً لتحديد الظروف الفسيولوجية لكل جيش الرب للمقاومة عن طريق قياس صلاحية الخلايا بعد التعرض لمجموعة من تركيزات الدواء واحد. ولذلك، بما في ذلك علامة على الخلايا الحية والميتة ضروري للقضاء على إيجابيات كاذبة، والحصول على نتائج ذات جودة أعلى. هو جانب مهم آخر لتحليل التدفق الخلوي ضوابط التعويض أو FMO. فإنه ينصح بشدة استخدام عينات منفردة الملون ضمان امتداد الحد الأدنى من اجفب + السكان في دسريد والعكس بالعكس. وعلاوة على ذلك، من الضروري لحساب أوتوفلوريسسينسي الخلايا بها بما في ذلك الخلايا أونستينيد. وأخيراً، عنصر تحكم عادية سيتوميتير الأداء والحساسية عبر الكشف عن أمر بالغ الأهمية معظمها عند قياس العينات لدراسة تمتد فترة طويلة من الزمن.

على الرغم من أن لم تناقش في قسم البروتوكول، هناك العديد من القيود من نظامنا مراسل الربط. لإجراء مناقشة أكثر استفاضة، الرجاء انظر لدينا منشور سابق (خوري et al., 2018). تصدير جزئيا أو يسر أونسبليسيد المتغيرات من فيروس نقص المناعة البشرية مرناً بالبروتين الفيروسي القس وارتباطه مع عنصر Rev استجابة (رر) في هذه مرناً29،الأنواع30،،من3132. تقسم overexpression رؤيا في نظامنا يسمح لنا للالتفاف حول كتلة الكبرى النووية الاحتفاظ بضرب ولاحظ مرناس أونسبليسيد في خفية المصابين خلايا T17 والتركيز على فهم كيف لراس حمل النسخ والربط ومن ثم إعادة تنشيط الفيروس. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأن لدينا نظام يتطلب تعداء البلازميدات 3، اخترنا HEK293T الخلايا لأن كفاءة عالية تعداء من هذه الخلايا. بسبب توافر العوامل الخلوية في الخلايا تي مقارنة بخط خلية سرطان زمنية ومكانية مختلفة، من المهم التحقق من نتائج المراسل الربط التي اكتسبها في الخلايا HEK293T في خطوط الخلايا T والخلايا الأولية، التي يمكن أن توفر كبيرة التحديات التقنية بسبب ما ترانسفيكتابيليتي المحدودة. ولذلك، استخدام الكواشف إيصال الحمض النووي البديلة تعداء مثل دمريي-ج، التي أظهرت أن تكون فعالة بشكل خاص تعداء الخلايا تعليق (مثلاً، جوركات)، أو أساليب نوكليوفيكتيون مثل نوكليوفيكتور أماكسا أو نيون نظام تعداء التي ثبت لتيسير إيصال فعالة وموثوق بها من أحادية أو متعددة والبلازميدات للخلايا صعبة ترانسفيكت بما في ذلك خلايا CD4 + T أولية. وبدلاً من ذلك، سيكون من المثير للاهتمام أن اختبار هذا النظام مراسل في سياق كامل طول الفيروس في نموذج خلية الأولية من الكمون باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه تعداء. وفي الواقع، قد تؤثر على الاختلافات في توافر النسخ المضيف واستطالة والربط العوامل في خلية T rCD4 + قدرة جيش الرب للمقاومة إعادة تنشيط بروفيروس الكامنة. وأخيراً، لا تتناول نموذجنا سواء جيش الرب للمقاومة يمكن أن تؤثر على النسخ والربط للخلايا المارة، وما إذا فإنه يمكن حمل الفيروس المختصة النسخ المتماثل. ومع ذلك، أن نشك في أن بقياس زيادة في فيروس نقص المناعة البشرية الولايات المتحدة المرتبطة بالخلية والحمض النووي الريبي مرض التصلب العصبي المتعدد، وهذا سيؤدي إلى إنتاج فيروس النسخ المتماثل المختصة في المادة طافية الثقافة. يمكن أن يكون أكد هذا إجراء المقايسة (كفا) ثمرة كمية الفيروس معيار الذهب33.

نظراً للطبيعة المعقدة من الكمون وضمان إعادة تنشيط الفيروسات فعالة، قد تكون استراتيجية متعددة الأوجه اندماجي المطلوبة34. يحتاج علاج محتمل لتحفيز مسارات متعددة بما في ذلك النسخ والربط، الذي قد ثبت سابقا أن تلعب دوراً أساسيا في إنشاء الكمون16،35،36، 37. يحركها "لتر لدينا" مراسل الربط سيسمح لفحص إنتاجية عالية من العقاقير التي يمكن أن تستهدف على النحو الأمثل في كل الخطوات والنسخ والربط، زيادة فرصة لجزيئات النتيجة التي يمكن أن التآزر كفاءة، مما يؤدي إلى انخفاض مستويات الجرعة وهكذا السمية لكل دواء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

أيد هذا العمل المشروع منحة APP1129320 ومنحة برنامج APP1052979 من "تمويل لأستراليا". ونحن نشكر الدكتور آدم ويتلي، الدكتور ألكسندر مارينا، والدكتور جيني L. أندرسون وميشيل يوسف لي لتقديم المشورة والبنيات الأساسية للنجاح في إنجاز هذا العمل. ونشكر أيضا موظفي مرفق تدفق DMI لتقديم المشورة والمساعدة السخية للحفاظ على سيتوميتير تدفق المستخدمة في هذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) ATCC CRL-3216 Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) Gibco 10569-010 + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serum Gibco 10099-141 Origin Australia
Penicillin-Streptomycin Sigma P4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
Trypan blue Stain, 0.4% Gibco 15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium Gibco 31985-070 Serum free medium
NucleoBond Xtra Maxi Marcherey-Nagel 740414.50
pEGFP-N1 plasmid Clontech (TaKaRa) 6085-1 Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1 Clontech (TaKaRa) 632429 Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed Addgene 115775
pCMV-RevNL4.3 Addgene 115776
pCMV-Tat101AD8-Flag Addgene 115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore 67-68-5
JQ1(+) Cayman Chemical 11187 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-) Cayman Chemical 11232 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Sigma-Aldrich 16561-29-8 Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA) Remel HA15/R30852701 Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR) Cayman Chemical 10009929 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN) TRC P180500 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega 63581
Venor GeM Classic Minerva Biolabs 11-1100 Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry reagents
LSR Fortessa BD Biosciences Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR II BD Biosciences Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34976 Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
EDTA 0.5M pH8 Gibco 15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%) Chem-Supply FA010
BD FACS Diva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) BD Biosciences 559123 3.0 - 3.4 mm
Sheath solution Chem-Supply SA046 90 g NaCl in 10 L water
HAZ-Tabs Guest Medical H8801 Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90 Decon Laboratories Limited N/A Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) Labco SODHYPO-5L Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7x MPBio IM76670 Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) Corning 430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) Costar 3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) Costar 3896
Centrifuge tubes (10 mL) SARSTEDT 62.9924.284 100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL) CellStar 227261 30x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Corning Axygen MCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterile Corning CLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterile Corning CLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterile Corning CLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterile Corning CLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap Corning 352235 12 x 75 mm style, 70 mm
Nylon Mesh SEFAR 03-100/32 100 mm
Titertube Micro test tubes, bulk BIO-RAD 2239391 microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap Corning 352008 12x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes Corning 352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) ProSciTech SVZ4NIOU 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser) Grale Scientific HCS2026 20 x 26 mm
Microscope Nikon TMS 310528
Centrifuge 5810R refrigerated Eppendorf 5811000487 with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech N/A Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
FACS Diva BD Biosciences Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJo FlowJo FlowJo 10.4.2 Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
Omega BMG Labtech FLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data Analysis BMG Labtech MARS FLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft Excel Microsoft Excel:mac 2011 version 14.0.0
Prism GraphPad Prism 7 version 7.0c

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9, (6), 727-728 (2003).
  2. Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
  3. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  4. Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
  5. Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
  6. Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
  7. Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
  8. Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
  9. Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
  10. Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
  11. Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284, (11), 6782-6789 (2009).
  12. Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, (5), 993-1001 (2013).
  13. Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10, (4), e1004071 (2014).
  14. Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206, (5), 765-769 (2012).
  15. Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20, (4), 425-429 (2014).
  16. Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  17. Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
  18. Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
  19. Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
  20. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13, (4), 203-212 (2012).
  21. Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15, (1), 36 (2018).
  22. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36, (3), 706-716 (2012).
  23. Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
  24. Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446, (1-2), 283-292 (2013).
  25. Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11, (6), e1004955 (2015).
  26. Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63, (7), 3026-3033 (1989).
  27. Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
  28. Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8, (13), 4251-4258 (1989).
  29. Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
  30. Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1, (2), 116-133 (2012).
  31. Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8, (2), 195-199 (2011).
  32. Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23, (18), 6618-6630 (2003).
  33. Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
  34. Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
  35. Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78, (12), 6122-6133 (2004).
  36. Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
  37. Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4, (2), 123-133 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics