कैंसर कोशिकाओं को सिरना डिलिवरी के लिए Exosomes की तैयारी

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

एक exosome दवा वितरण वाहक की एक नई पीढ़ी है । हम उच्च उपज और सिरना वितरण के लिए पवित्रता के साथ एक exosome अलगाव प्रोटोकॉल की स्थापना की । हम भी exosomes में गैर विशिष्ट सिरना लेबल की गई और कैंसर की कोशिकाओं में सिरना-भरी exosomes के सेलुलर के बारे में जांच की ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Extracellular बुलबुले, विशेष रूप से exosomes में, हाल ही में उपंयास दवा वितरण उनके जैविक मूल, बहुतायत, और विभिंन जैव अणुओं के सेलुलर प्रसव में आंतरिक क्षमता के कारण वैक्टर के रूप में ब्याज प्राप्त की है । यह काम सिरना डिलीवरी के लिए exosomes की उच्च उपज और उच्च शुद्धता प्राप्त करने के लिए एक आइसोलेशन प्रोटोकॉल स्थापित करता है । मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK-२९३ कोशिकाओं) के लिए एक साप्ताहिक आधार पर काटा जाता है के लिए HEK-२९३ exosomes के संवर्धन के लिए अनुमति देने के लिए प्रतिक्रियात्मक कुप्पी और संस्कृति supernatant (वातानुकूलित माध्यम के रूप में संदर्भित hereon) में किया जाता है । वातानुकूलित मध्यम (सेमी) विभेदक केंद्रापसारक द्वारा मृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे के पूर्व मंजूरी दे दी है और एक सुक्रोज तकिया पर ultracentrifugation के अधीन है एक धुलाई कदम के बाद, exosomes इकट्ठा करने के लिए । पृथक HEK-२९३ exosomes क्रमशः nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण, प्रोटीन ठहराव, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फ्लो cytometry द्वारा उपज, आकृति विज्ञान और exosomal मार्कर अभिव्यक्ति के लिए विशेषता है । छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना), फ्लोरोसेंट Atto655 के साथ लेबल, electroporation द्वारा exosomes में भरी हुई है और अतिरिक्त सिरना जेल निस्पंदन द्वारा निकाल दिया जाता है । PANC में सेल तेज-1 कैंसर की कोशिकाओं, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 ज मशीन के बाद, प्रवाह cytometry द्वारा की पुष्टि की है । HEK-२९३ exosomes व्यास में १०७.० ± ८.२ एनएम हैं । exosome उपज और कण करने के लिए प्रोटीन अनुपात (P:P) अनुपात ६.९९ ± ०.२२ × 1012 कण/एमएल और ८.३ ± १.७ × 1010 कण/µ जी, क्रमशः हैं । exosomes में सिरना के encapsulation दक्षता ~ 10-20% है । कोशिकाओं के ४० प्रतिशत 24 एच बाद में Atto655 के लिए सकारात्मक संकेत दिखा । अंत में, सुक्रोज कुशन पर ultracentrifugation द्वारा exosome अलगाव अच्छी उपज और पवित्रता का एक संयोजन प्रदान करता है । सिरना सफलतापूर्वक electroporation द्वारा exosomes में लोड किया जा सकता है और बाद में इन विट्रो में कैंसर कोशिकाओं में दिया । यह प्रोटोकॉल कैंसर कोशिकाओं को कुशल प्रसव के लिए सिरना-लोडेड exosomes के विकास के लिए एक मानक प्रक्रिया प्रदान करता है ।

Introduction

Exosomes extracellular बुलबुले के एक उपप्रकार (EV) व्यास में 50-200 एनएम से लेकर, प्रतिरक्षा कोशिकाओं1,2, कैंसर कोशिकाओं3,4,5 के रूप में विभिंन प्रकार के सेल द्वारा स्रावित कर रहे हैं, 6 और स्टेम सेल7। Exosomes भी विभिन्न शारीरिक तरल पदार्थ में उपस्थित होने के लिए दिखाया गया है8,9,10,11. exosomes की अंतर्निहित क्षमता के संयोजन के लिए विभिंन अणुओं (जैसे, आरएनए और प्रोटीन)12,13,14 और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में इन अणुओं के प्रभावी वितरण ले जाने के लिए 15 , 16 , 17 नैनो पैमाने पर दवा वितरण वैक्टर के रूप में अपनी क्षमता के लिए ब्याज आकर्षित किया । विभिंन छोटे अणुओं है कि विरोधी के रूप में सेवा कैंसर और विरोधी भड़काऊ दवाओं के लिए सफलतापूर्वक exosomes में भरी हुई है और लक्ष्य कोशिकाओं को दिया18,19,20, प्रदर्शन किया गया है 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. दिलचस्प है, सिरना28,29 और microRNA30 के रूप में न्यूक्लिक एसिड भी सफलतापूर्वक electroporation के माध्यम से exosomes में लोड किया गया है और लक्ष्य कोशिकाओं को दिया ।

हाल ही में, आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) के माध्यम से अपनी उच्च विशिष्टता के कारण जीन मुंह बंद करने में पसंदीदा तंत्र के रूप में अधिक रुचि प्राप्त की है, शक्तिशाली प्रभाव, कम से अधिक दुष्प्रभाव और सिरना संश्लेषण28में आसानी, 29. siRNAs की लंबाई में 19 से 25 न्यूक्लियोटाइड है कि अनुक्रम-विशिष्ट उत्प्रेरक mRNA पछाड़ना ट्रिगर से लेकर डबल-असहाय आरएनए अणु हैं । अपने बड़े आणविक वजन और polyanionic प्रकृति के कारण, कोशिकाओं में नग्न सिरना के निष्क्रिय सालभर28,29बाधा है । यह भी संभव के लिए नग्न सिरना प्लाज्मा nucleases31द्वारा तेजी से क्षरण के कारण प्रणालीगत संचलन में इंजेक्ट किया जा करने के लिए नहीं है । इस प्रकार, एक nanocarrier में सिरना के encapsulation प्रभावी वितरण सहायता और लक्ष्य कोशिकाओं में सिरना के ले जाएगा ।

Exosomes सिरना encapsulation के लिए एक आदर्श प्रणाली के रूप में अपनी संरचना एक खोखले, जलीय एक फॉस्फोलिपिड bilayer द्वारा ढंक कोर के शामिल है । Exosomes न केवल रक्त में अच्छी स्थिरता है, लेकिन यह भी कोशिकाओं३२में कार्यात्मक आरएनए देने के लिए प्राकृतिक लक्ष्यीकरण गुण है । अल्वारेज़ द्वारा किए गए अध्ययन-Erviti एट अल. सफलतापूर्वक लगभग कोई जटिलताओं के साथ इंजीनियर exosomes का उपयोग कर चूहों के दिमाग को सिरना के प्रभावी वितरण का प्रदर्शन किया31. यह कल्पना की है कि exosome-आधारित चिकित्सा अपेक्षाकृत अंय चिकित्सा की तुलना में सुरक्षित है के रूप में exosomes नहीं दोहराने endogenously कोशिकाओं के रूप में होता है और इसलिए मेटास्टेटिक गुण प्रदर्शित नहीं15

विभिंन तरीकों को सफलतापूर्वक या तो सेल संस्कृति या शारीरिक तरल पदार्थ से exosomes को अलग करने के लिए सूचित किया गया है । सबसे लोकप्रिय विधि शुरू सामग्री31,३२,३३से गोली exosomes को ultracentrifugation का उपयोग करता है । इस विधि exosomes पर काफी कठोर हो सकता है और आम तौर पर सह नमूना से प्रोटीन हाला । इस तरह के सुक्रोज ढाल के रूप में एक घनत्व आधारित जुदाई के साथ ultracentrifugation संयोजन अधिक आम होता जा रहा है, अलग exosomes19,३४में प्रोटीन और गैर exosomal संदूषण को कम करने के लिए । आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) extracellular बुलबुले के अंय प्रकार से exosomes के पृथक्करण (EV) आकार से अनुमति देता है और यह भी ंयूनतम प्रोटीन संदूषण में परिणाम कर सकते है लेकिन शुरू सामग्री यह३५प्रक्रिया कर सकते है की छोटी राशि से सीमित है, ३६. Immunoaffinity कैप्चर एंटीबॉडी के साथ लेपित मोती का उपयोग करता है कि इस तरह के tetraspanins या अंय सेल विशेष मार्कर कि exosomes के बजाय ईवीएस या अंय प्रोटीन के विशिष्ट कब्जा की अनुमति देता है के रूप में exosomal सतह प्रोटीन को बांध, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग उप जनसंख्या exosomes पूरे नमूनों से, लेकिन फिर से शुरू सामग्री की राशि से सीमित है और३६,३७महंगा है । exosomes के बहुलक आधारित वर्षण लोकप्रिय भी हुआ करते थे, लेकिन चूंकि यह एक जगह कच्चे तेल वर्षण है, यह एक उच्च गैर exosomal पुटिका और प्रोटीन संदूषण३८,३९की ओर जाता है ।

Electroporation प्रोटीन एकत्रीकरण के कारण सिरना के साथ exosomes लोड करने के लिए एक विधि के रूप में अपनी अक्षमता के लिए सूचित किया गया है15,28,31. अभिकर्मक आधारित दृष्टिकोण बेहतर लदान दक्षता और प्रोटीन स्थिरता के लिए प्रदर्शन कर रहे थे, लेकिन अपनी विषाक्तता और अभिकर्मक एजेंटों के साइड इफेक्ट के कारण अवांछनीय सेलुलर जीन अभिव्यक्ति28फेरबदल में । इस प्रकार, electroporation गया है और अधिक व्यापक रूप से exosomes में सिरना लोडिंग में इस्तेमाल के रूप में यह एक सुरक्षित तरीका है । हालांकि, एक अनुकूलित encapsulation विधि के क्रम में एक शक्तिशाली जीन पछाड़ना के लिए लक्ष्य साइट के लिए सिरना की पर्याप्त मात्रा में वितरित करने के लिए स्थापित करने की जरूरत है ।

यहां, हम एक exosome अलगाव घनत्व का उपयोग कर प्रोटोकॉल का प्रस्ताव सिर्फ एक ही 25% (डब्ल्यू/डब्ल्यू) सुक्रोज ड्यूटेरियम ऑक्साइड में तैयार तकिया, बजाय एक सुक्रोज घनत्व ढाल पर ultracentrifugation आधारित है । यह एक लागत प्रभावी तरीका है कि श्रमसाध्य घनत्व ढाल तैयारी दरकिनार और सामग्री शुरू करने की बड़ी मात्रा के प्रसंस्करण की अनुमति देता है, अभी तक उच्च उपज और सिरना के साथ बाद में लदान के लिए उपयुक्त पवित्रता के बरकरार exosomes में परिणाम है । फ्लोरोसेंट Atto655-संयुग्मित गैर विशिष्ट सिरना मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में भरी हुई थी (HEK-२९३ कोशिकाओं) exosomes के माध्यम से electroporation व्युत्पंन और मानव अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता को दिया (PANC-1) इन विट्रो में कैंसर की कोशिकाओं ।

Protocol

1. एक प्रतिक्रिया की कुप्पी में सेल संस्कृति

Figure 1
चित्रा 1: exosome उत्पादन के लिए प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में कोशिकाओं की संस्कृति । () प्रतिप्रतिक्रिया कुप्पी की सरलीकृत एनाटॉमी । () प्रसंस्कृत में संस्कृति शुरू करने के लिए । सामांय और exosome-समाप्त मध्यम () हार्वेस्टिंग वातानुकूलित मध्यम (सेमी) और संस्कृति के रखरखाव के लिए सामग्री की तालिका के लिए देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. संस्कृति HEK-२९३ सामान्य मध्यम में कोशिकाओं ( सामग्री की तालिका देखें; 5% सह2, ३७ ° c) और उंहें 4 x T75 कुप्पी में विस्तार (जब तक ९०% धाराप्रवाह) ।
  2. विश्लेषन कुप्पी के मध्यम जलाशय में सामान्य माध्यम के 50-100 मिलीलीटर को जोड़कर प्रतिप्रतिक्रियात्मक कुप्पी की झिल्ली को गीला किया.
  3. 4 एक्स T75 से सभी HEK-२९३ कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें exosome-समाप्त मध्यम के 15 मिलीलीटर में resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  4. HEK-२९३ सेल निलंबन के सेल डिब्बे में जोड़ें एक 20 मिलीलीटर एक कुंद भरने सुई से जुड़े सिरिंज का उपयोग कर ( सामग्री की मेजदेखें), देखभाल के साथ किसी भी बुलबुला है कि गठन हो सकता है हटाने के लिए ।
  5. सामान्य मध्यम से ५०० मिलीलीटर तक के मध्यम जलाशय को भरें और एक सप्ताह के लिए मशीन (5% CO2, ३७ ° c) में कुप्पी रखें ।

2. वातानुकूलित मध्यम (सेमी) की कटाई से प्रतिक्रियात्मक कुप्पी

  1. 1 सप्ताह के बाद, सभी माध्यमों को त्यागें कुप्पी के मध्यम जलाशय में छोड़ें ।
  2. सेल डिब्बे में सभी मध्यम निकालें (यानी, CM) एक कुंद भरण सुई से जुड़े एक 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर.
  3. मध्यम जलाशय में सामान्य माध्यम के 50-100 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. पुराने माध्यम को हटाने और एक कुंद भरण सुई से जुड़ा एक 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर ताजा exosome-समाप्त मध्यम जोड़ने के द्वारा सेल डिब्बे के लिए exosome-घट मध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. सामान्य मध्यम से ५०० मिलीलीटर तक के मध्यम जलाशय को भरें और एक सप्ताह के लिए मशीन (5% CO2, ३७ ° c) में कुप्पी रखें ।
    नोट: संस्कृति को एक वर्ष से अधिक समय तक जारी रखा जा सकता है । चरण २.२ के लिए, पहली फसल से सेमी exosome अलगाव के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाएगा और खारिज कर दिया है । 2एन डी और बाद में फसल के लिए, मुख्यमंत्री exosome अलगाव के लिए रखा जाता है ।

3. एक सुक्रोज तकिया पर Exosome अलगाव

Figure 2
चित्रा 2: अलगाव और exosomes का लक्षण वर्णन । () मृत कोशिकाओं और कोशिका के मलबे से पूर्व-समाशोधन संचयन वातानुकूलित मध्यम (सेमी). () सुक्रोज तकिया पर मुख्यमंत्री से अलग exosomes । (ग) सुक्रोज और दूषित प्रोटीन को दूर करने के लिए धुलाई कदम । () पृथक exosomes तो भौतिक, जैव रासायनिक और रूपात्मक लक्षण वर्णन के अधीन थे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. पूर्व स्पष्ट (चरण २.२ से) अंतर केंद्रापसारक और निस्पंदन द्वारा इस प्रकार के रूप में मुख्यमंत्री ।
    1. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर केंद्रापसारक । एक नई ट्यूब में supernatant हस्तांतरण और गोली त्यागें । दोहराएं इस केंद्रापसारक कदम एक बार फिर, supernatant उबरने और गोली त्याग ।
    2. 15 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए २,००० x g पर कदम 3.1.1 से supernatant केंद्रापसारक और फिर गोली त्यागें । ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से एक बार बरामद supernatant को फ़िल्टर करें ।
  2. पूर्व समाशोधन के दौरान, ड्यूटेरियम ऑक्साइड में 25% (डब्ल्यू/डब्ल्यू) सुक्रोज समाधान सही एक सार्वभौमिक ट्यूब में सुक्रोज के १.९ जी (± ०.००१ जी) वजन से तैयार है, और फिर ड्यूटेरियम ऑक्साइड के साथ टॉपिंग तक वजन ७.६ ग्राम (± ०.००१ ग्राम) तक पहुंचता है ।
  3. एक ultracentrifuge ट्यूब को भरने ( सामग्री की तालिकादेखें) पूर्व के २२.५ मिलीलीटर के साथ साफ सेमी । ०.२२ µm-फ़िल्टर्ड पंजाबियों के साथ २२.५ मिलीलीटर करने के लिए सेमी अप करें यदि वर्तमान वॉल्यूम उससे कम है ।
  4. एक ग्लास पिपेट प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) ट्यूब में और, इसके माध्यम से, सुक्रोज समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें ताकि समाधान सेमी के नीचे एक अलग परत रूपों ।
  5. ध्यान से एक स्विंग बाहर रोटर की बाल्टी में स्तरित CM/सुक्रोज समाधान युक्त ट्यूब जगह ( सामग्री की तालिकादेखें), और रोटर में बाल्टी सुरक्षित ।
  6. ultracentrifuge में रोटर प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) और 4 डिग्री सेल्सियस पर १.५ ज के लिए १००,००० x g पर स्पिन ।
  7. सुक्रोज परत के 2 मिलीलीटर लीजिए और एक ultracentrifuge बोतल ( सामग्री की मेजदेखें) एक धुलाई कदम के लिए फ़िल्टर्ड पंजाबियों के 20 मिलीलीटर से युक्त इस जोड़ें ।
  8. एक निश्चित कोण रोटर में ट्यूबों प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) और 4 डिग्री सेल्सियस पर १.५ घंटे के लिए १००,००० x g पर स्पिन ।
  9. ध्यान से एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ supernatant निकालें और ४०० µ एल फ़िल्टर्ड पंजाबियों के साथ गोली resuspend । अल्पकालिक और दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्रमशः 4 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस पर इस exosome शेयर रखें ।

4. Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा Exosome आकार और उपज का लक्षण वर्णन (ंत्)

  1. Make 1:1000-1: exosome शेयर के 50000 कमजोरियां 1 मिलीलीटर (ंयूनतम ७५० µ l) मात्रा में इतनी के रूप में ंत् साधन के देखने के फ्रेम में 20-80 कणों को प्राप्त करने के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें) प्रदर्शन ।
  2. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर ंत् साधन नमूना चैंबर में पतला exosome स्टॉक सुई, और तापमान जांच प्रवेश में एक थर्मामीटर की तापमान जांच डालें.
  3. ंत् सॉफ्टवेयर सेट ( सामग्री की तालिकादेखें) के रूप में रिकॉर्डिंग के लिए इस प्रकार है: 3 मानक माप, 30 एस प्रत्येक, मैनुअल तापमान विकल्प अनियंत्रित; और उन्नत टैब के अंतर्गत कमजोर पड़ने फैक्टर दर्ज करें ।
  4. 13 के लिए कैमरा स्तर सेट और ंत् सॉफ्टवेयर पर कब्जा स्क्रिप्ट चलाने के लिए, नमूना के एक ताजा बैच इंजेक्शन और प्रत्येक पढ़ने के बाद जब संकेत नमूना चैंबर के तापमान में प्रवेश.
  5. बाद के विश्लेषण भाग के लिए थ्रेशोल्ड को 4 पर सेट करें, और माप से exosome स्टॉक के औसत मोडल आकार और कण एकाग्रता को नोट करें ।

5. कण द्वारा Exosome शुद्धता का लक्षण वर्णन: प्रोटीन अनुपात निर्धारण

  1. एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट ( सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा exosome स्टॉक के प्रोटीन सामग्री को मापने के रूप में इस प्रकार है ।
    1. निर्धारित मानकों को तैयार करें ।
      1. BSA शेयर समाधान के ४५ µ एल जोड़कर उच्चतम एकाग्रता (५०० µ g/एमएल) के मानक तैयार करें (2 मिलीग्राम/एमएल-परख किट में प्रदान की) एक microcentrifuge ट्यूब के लिए, और यह करने के लिए पंजाब के साथ १८० µ l तक ।
      2. पंजाब के ९० µ एल के साथ 8 microcentrifuge ट्यूबों भरें ।
      3. सबसे BSA मानक से ९० µ एल लेने और इस ट्यूब से 1सेंट microcentrifuge ट्यूब में इस जोड़ने (मिश्रण अच्छी तरह से), तो इस tube से ९० µ एल लेने और 2एन डी microcentrifuge ट्यूब में जोड़ने के द्वारा धारावाहिक कमजोर पड़ने (फैक्टर: ०.५) बनाओ ।
      4. 7 microcentrifuge ट्यूब जब तक यह दोहराएं । 8 ट्यूब सिर्फ पंजाबियों होगा (यानी, रिक्त: 0 µ g/एमएल) ।
    2. exosome नमूनों को 1:2 की कुल मात्रा में पंजाबियों के साथ नमूनों के ९० µ l (४५ µ l के नमूने, पंजाब के ४५ µ एल) बनाने के नमूने तैयार करें ।
    3. बीसीए वर्किंग रिएजेंट मिक्स तैयार करें ।
      1. बीसीए कार्य रिएजेंट मिश्रण की जरूरत कुल मात्रा की गणना (५० µ एल प्रति अच्छी तरह से, डुप्लिकेट में, मानकों सहित).
      2. निम्नलिखित अनुपात के अनुसार व्यक्तिगत बीसीए रिएजेंट मिश्रण: 25 पार्ट्स रिएजेंट A: 24 पार्ट्स रिएजेंट B: 1 भाग रिएजेंट C.
    4. परख और विश्लेषण करते हैं ।
      1. प्रत्येक मानक और exosome एक अच्छी तरह से प्लेट के एक कुआं में ऊपर तैयार नमूना के ४० µ एल जोड़ें (प्रत्येक मानक और नमूने के लिए डुप्लिकेट) ।
        नोट: चूंकि यह एक वर्णमिति परख है, उचित pipetting तकनीक सही परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रत्येक कुओं में प्रत्येक मानक/नमूना दोहराने जोड़ने के बाद पिपेट बदलें
      2. जोड़ें ५० µ प्रोटीन परख काम कर रहे एजेंट के एक अच्छी तरह से मिश्रण में, और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
        नोट: दोहराने के बीच विचलन को कम करने के लिए, 1st को जोड़ने से पहले एक ही नमूना /मानक के 2nd दोहराने के बाद, एक मानक की प्रतिकृति में प्रोटीन परख काम कर एजेंट जोड़ें/ एक और नमूना/मानक की प्रतिकृति ।
      3. प्लेट रीडर पर ५६२ एनएम पर अवशोषक उपाय ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      4. मानकों के अवशोषक मूल्यों से एक मानक वक्र भूखंड, और वक्र के समीकरण का उपयोग कर प्रत्येक नमूने में प्रोटीन एकाग्रता बाहर काम करते हैं ।
  2. कण की गणना: exosome उपज विभाजित करके प्रोटीन अनुपात exosome स्टॉक के प्रोटीन एकाग्रता के साथ पहले प्राप्त की ऊपर मापा ।

6. प्रवाह Cytometry द्वारा Exosomal मार्कर अभिव्यक्ति का लक्षण वर्णन

  1. exosomes के ४० µ एल की मशीन (≥ 1x1011 कण/µ के 10 एल्डिहाइड एल के साथ/सल्फेट लेटेक्स मोती (स्टॉक से पतला) कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए (RT) ।
  2. जोड़ें 5 µ एल के १०० µ m BSA समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) को exosome-मनका मिश्रण को प्राप्त करने के लिए एक 10 मिमी अंतिम एकाग्रता और 15 मिनट के लिए आरटी पर गर्मी ।
  3. एक कमाल की शेखर (~ १५० rpm) पर हल्के आंदोलन के साथ एक microcentrifuge ट्यूब में आरटी में ७५ मिनट के लिए पंजाब और गर्मी के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. ५८० आरटी पर 5 मिनट के लिए एक्स जी पर निलंबन केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  5. १०० mM glycine समाधान की 1 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) और आर टी पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  6. ५८० x जी में 5 मिनट के लिए निलंबन केंद्रापसारक supernatant त्यागें और 3% FBS/पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  7. इस धुलाई कदम दोहराएं और ३५० में गोली resuspend 3% FBS के µ l/
  8. निलंबन 7 ट्यूबों, निलंबन के ५० µ एल और उंहें fluorophore-संयुग्मित विरोधी CD81, विरोधी CD9 और विरोधी CD63 एंटीबॉडी और उनके इसी isotype नियंत्रण (1:10 कमजोर पड़ने), क्रमशः, ४५ मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के साथ गर्मी में विभाजित । एक दाग नियंत्रण के रूप में ट्यूबों के 1 रखो, लेकिन एक ही प्रसंस्करण के दौर से गुजर ।
  9. प्रत्येक ट्यूब के लिए 3% FBS/पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें, ५८० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  10. 3% FBS/पंजाब के 200-400 µ एल के साथ गोली resuspend और प्रवाह cytometer पर नमूने का विश्लेषण ( सामग्री की तालिकादेखें) उपयुक्त चैनल के अंतर्गत ।

7. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) द्वारा Exosome आकृति विज्ञान का लक्षण वर्णन

  1. फिक्स exosome उचित सांद्रता में जलीय फैलाव जैसे 1010 पी/एमएल समाधान फिक्सिंग में 15 मिनट के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. ३०० मेष कार्बन लेपित तांबे ग्रिड पर नमूने प्लेस और सूखी हवा के लिए छोड़ दें ।
  3. नकारात्मक ०.२२ µm के साथ नमूने दाग-जलीय uranyl एसीटेट फ़िल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए 4 २ ५०% मेथनॉल/एच2ओ धोने के बाद मिनट ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  4. हवा का नमूना सूख गया ।
  5. उनि के तहत नमूनों का निरीक्षण ( सामग्री की तालिकादेखें) । ८० केवी और 2 पर स्थान आकार में तेजी वोल्टेज सेट । सभी नमूनों के साथ उद्देश्य एपर्चर का उपयोग करें ।

8. Electroporation द्वारा Exosomes में सिरना encapsulation

  1. पूर्व चिल electroporation cuvette ( सामग्री की तालिकादेखें) electroporation से पहले 30 मिनट के लिए बर्फ पर ।
  2. मिक्स ७.० µ जी ऑफ़ exosomes (३२ µ l से 7 x 1012 p/एमएल स्टॉक इन पंजाब) के साथ ०.३३ µ g के साथ सिरना (12 µ l से 2 µ m शेयर में RNase-फ्री वॉटर) में microcentrifuge ट्यूब. साइट्रिक एसिड बफर के साथ १५० µ l को मात्रा बनाओ ( सामग्री की तालिकादेखें) । इस मामले में exosome को सिरना दाढ़ अनुपात 1:60 है ।
  3. मिश्रण को electroporation cuvette पर ट्रांसफर कर दीजिये । टोपी cuvette और यह electroporator के cuvette धारक में जगह ( सामग्री की तालिकादेखें) । टर्निंग व्हील १८० ° दक्षिणावर्त घुमाएं ।
    नोट: व्हील cuvette इलेक्ट्रोड से संपर्क करने के लिए आदेश में, बंद कर दिया स्थिति के लिए पूरी तरह से चालू होना चाहिए.
  4. वांछित electroporation प्रोग्राम (उदा., x-01, x-05, A-20, t-20, t-30 आदि) का चयन करें और स्टार्ट बटन दबाकर electroporation शुरू कर दीजिये ।
    नोट: एक सफल पल्स प्रदर्शन पर "ठीक" दिखाकर संकेत दिया है ।
  5. एक बार electroporated, वापस पहिया १८० ° काउंटर दक्षिणावर्त मोड़ के बाद cuvette निकालें । आगे की प्रोसेसिंग के लिए प्लास्टिक पिपेट के साथ cuvette से सैंपल को वापस ले लें ।

9. मुक्त सिरना के हटाने के आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग

  1. Equilibrate स्तंभ (२.९ cm [H] x १.३ cm [W]; सामग्री की तालिकादेखें) दो बार फ़िल्टर्ड पंजाबियों के ३.५ मिलीलीटर गुजर द्वारा ।
  2. फ़िल्टर किए गए पंजाबियों के ३५० μL में electroporated सैंपल के १५० μL को भंग करना और फ्री सिरना रिमूवल को निष्पादित करने के लिए इसे सेकंड कॉलम में ट्रांसफर करना.
  3. पहले ५०० μL अंश लीजिए जो कॉलम (F0) से eluted.
  4. स्तंभ में फ़िल्टर किए गए पंजाबियों की ५०० μL जोड़ें और अगले ५०० μL अंश (F1) एकत्र करें ।
  5. ऊपर चरण को दोहराएँ जब तक कि कुल 10 x ५०० μL भिन्न (F9 तक) एकत्र किया जाता है. F1 और F2 सिरना-encapsulated exosomes शामिल होना चाहिए ।
  6. किसी भी नमूना अवशेषों को निकालने के लिए फ़िल्टर किए गए पंजाबियों के साथ कॉलम (दो बार कम से कम) धो लें ।

10. इन विट्रो में सिरना-लोडेड Exosomes की PANC-1 कोशिकाओं में

  1. बीज PANC-24-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटों में 1 कोशिकाओं ( सामग्री की मेजदेखें) ५०,००० कोशिकाओं के एक घनत्व पर अच्छी तरह से 24 एच प्रति लेने से पहले अध्ययन करने के लिए और मशीन में कोशिकाओं मशीन (5% CO2, ३७ डिग्री सेल्सियस) ।
  2. Electroporate HEK-२९३ exosomes (७.० μg) के साथ Atto655-सिरना (०.३३ μg) के अनुसार चरण 8.
  3. 9 कदम के अनुसार शुद्ध electroporated exosome और पंजाब के १०० μL में पुनर्निलंबित ।
  4. electroporated exosomes के ५० μL को PANC-1 सेल में जोड़ें और ३७ ° c और 5% सह2 के लिए 4 एच में मशीन ।
  5. मशीन के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  6. बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो और polystyrene दौर में नीचे ट्यूब ( सामग्री की तालिकादेखें) में पंजाब के २०० μL में resuspend ।
  7. प्रति नमूना प्राप्त १०,००० घटनाओं के साथ प्रवाह cytometer ( सामग्री की तालिकादेखें) के द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण ।
    नोट: अन-electroporated exosome-सिरना मिश्रण नमूनों और फ़िल्टर किए गए पंजाबियों के साथ अनुपचारित कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया.

Representative Results

HEK-२९३ कोशिकाओं (HEK-२९३ Exo) से अलग exosomes के भौतिक लक्षण वर्णन तालिका 1में संक्षेप हैं । आकार nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) साधन का उपयोग कर मापा १०७.० ± ८.२ एनएम था । HEK-२९३ कोशिकाओं से Exosome उपज, भी ंत् साधन का उपयोग कर विश्लेषण किया, ६.९९ ± ०.२२ x 1012 पी/एमएल से ~ 24 मिलीलीटर (फसल के 2 दौर से प्राप्त) था । HEK की पवित्रता-२९३ Exo कण-से-प्रोटीन अनुपात (P:P) की गणना करके मूल्यांकन किया गया ८.३ ± १.७ × 1010 पी/µ जी ।

अलग HEK-२९३ Exo का आकार वितरण चित्र 3ए में दिखाया गया है । रूपात्मक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) का उपयोग कर विश्लेषण दिखाया HEK-२९३ Exo गोलाकार संरचनाओं थोड़ा आकार में १०० एनएम (चित्र बी)से ऊपर थे । इस परिणाम से सहमत है कि ंत् माप (3 ए आंकड़ा) से । अलग HEK-२९३ Exo CD81, CD9 और CD63, जो विहित मार्करों exosomes (चित्रा 3सी) के रूप में बुलबुले की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे है के लिए सकारात्मक थे ।

exosomes के शुद्धिकरण के लिए आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 4) का उपयोग कर, exosomes की प्रतिशत वसूली कुल exosome कण संख्या में बरामद 10 अंश (F0-F9) प्रारंभिक exosome के साथ में विभाजित द्वारा गणना की गई थी कण संख्या का उपयोग किया है, जबकि सिरना की प्रतिशत वसूली कुल प्रतिदीप्ति सभी 10 अंश एकत्र से प्राप्त की तीव्रता के साथ F3, F4 और F5 से प्राप्त प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजित करके गणना की गई थी । exosome और सिरना पद-शुद्धिकरण की वसूली क्रमशः ७५.०% और ८०.४% की गणना की गई । exosomes में सिरना के encapsulation दक्षता ~ 10-20% था, सिरना मानक वक्र (चित्र 4c) की स्थापना का उपयोग कर की गणना की ।

में गुणात्मक विश्लेषण इन विट्रो exosomes के तेज फ्लोरोसेंट Atto655-सिरना प्रवाह cytometry के साथ भरी हुई है कि PANC-1 सिरना के साथ इलाज कोशिकाओं-encapsulated exosomes प्रतिदीप्ति संकेत में सबसे बड़ा बदलाव दर्ज (आंकड़ा 5 ए) . PANC-1 सिरना के साथ इलाज कोशिकाओं-encapsulated exosomes Atto655 संकेत के लिए सकारात्मक जनसंख्या का एक उच्च प्रतिशत दर्ज (३९.४%) उस के साथ इलाज की तुलना में उतारा exosomes और सिरना मिश्रण (०.५६%), जो ऊपर प्रेक्षण पुष्टि ( चित्रा 5B). सिरना की सेलुलर की डिग्री (मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (mfi) में अंतर के रूप में व्यक्त की है कि अनुपचारित कोशिकाओं से मूल्यों) भी PANC में काफी अधिक है-1 सिरना-encapsulated exosomes के साथ इलाज किया कोशिकाओं (MFI गुना मनाया गया अंतर = ५.१) कि exosome-सिरना मिश्रण (MFI गुना अंतर = १.१) (चित्रा 5C) के साथ इलाज की तुलना में । इन टिप्पणियों का प्रदर्शन किया कि सिरना-encapsulated exosomes PANC-1 कोशिकाओं द्वारा आंतरिक थे और है कि वे प्रभावी ढंग से सिरना intracellularly दिया ।

Figure 3
चित्रा 3: जैव रसायन और HEK की आकृति विज्ञान विश्लेषण-२९३ exosomes । (A) आकार वितरण HEK-२९३ Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) का उपयोग exosomes । वक्र (n = 3) माप के बीच मानक विचलन को ध्यान में लाल क्षेत्रों के साथ 30 s अंतराल पर 3 अलग कब्जा से एक आरोपित हिस्टोग्राम दिखाता है । () भोले HEK के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) की छवियाँ-२९३ exosomes. स्केल बार: १०० एनएम । () exosomal मार्करों का पता लगाना CD81, CD9 और CD63 का उपयोग प्रवाह cytometry पर HEK-२९३ exosomes. Exosomes एल्डिहाइड/सल्फेट लेटेक्स मोती का पता लगाने से पहले युग्मित थे । Exosome-मोती परिसर बाद में fluorophore-संयुग्मित विरोधी CD81, विरोधी CD9 और विरोधी CD63 एंटीबॉडी के साथ दाग थे । मार्कर की अभिव्यक्ति की डिग्री माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) है कि नियंत्रण (exosome-मोती जटिल इसी isotype के साथ दाग) से मूल्यों में गुना अंतर के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । मान ± एसडी, जहां n = 3 मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Exosome शुद्धि पद-electroporation । () Atto655-सिरना और electroporated exosomes का रेफरेंस प्रोफाइल (F0-F9) आकार बहिष्करण chormatography का उपयोग करना. () दोनों Atto655 के ंत् विश्लेषण-सिरना और exosome F0 से F9 करने के लिए आकार अपवर्जन chormatography का उपयोग कर । () Atto655 बला सिरना के अंशांकन वक्री । प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लेट रीडर द्वारा पूर्व में प्राप्त किया गया/640-10/680 एनएम; नफा २८००. मान मतलब ± एसडी (एन = 3) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सिरना-encapsulated exosomes PANC-1 कोशिकाओं में 4 एच में सेलुलर के ऊपर ले । () exosomes + सिरना मिश्रण और सिरना-encapsulated exosomes के सेलुलर ऊपर की तुलना हिस्टोग्रामs । () pseudocolor प्लाट द्वारा 4h पर उतारे गए exosomes + सिरना मिश्रण के ऊपर की तुलना में । () का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) में अंतर अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में परीक्षण नमूनों के मूल्यों । मान ± एसडी, जहां n = 3 मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । P < ०.००१ । एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Exosome आकार1, 2
एनएम
उपज1, 2, 3
(पी/एमएल)
प्रोटीन 2, 4
(µ g/mL)
कण-से-प्रोटीन (P:P) अनुपात5
(p/µ g)
HEK-२९३ १०७.० ± ८.२ ६.९९ ± ०.२२ x 1012 ८४.३ ± ९.८ ८.३ ± १.७ x 10 10 
1 nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग कर मापा (ंत् साधन)
2 मान मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, जहां n = 3
3 उपज सेल द्वारा प्राप्त किया गया था मध्यम-प्रतिक्रियात्मक कुप्पी से हार्वेस्टिंग के 2 दौर से परित (~ 24 एमएल)
4 एक प्रोटीन परख किट का उपयोग कर मापा
5 सूत्र का उपयोग करके प्राप्त मूल्य: P:P अनुपात = उपज/

तालिका 1: exosomes के भौतिक लक्षण वर्णन ।

Discussion

प्रसंस्कृत कोशिकाओं से एक सभ्य exosome उपज प्राप्त करने, जो इन विट्रो में या vivo अध्ययन में कई दौर के लिए पर्याप्त हैं, अभी भी एक चुनौती है । निर्माता के अनुसार, प्रतिक्रियात्मक कुप्पी विभिंन अमर सेल लाइनों की संस्कृति से उच्च उपज के साथ एंटीबॉडी और प्रोटीन के उत्पादन के लिए इरादा कर रहे थे । यह कोशिकाओं को लगातार वांछित उत्पाद के साथ संस्कृति माध्यम को समृद्ध करने की अनुमति देता है, कोशिका-डिब्बे में एक केंद्रित वातानुकूलित मध्यम (सेमी) में जिसके परिणामस्वरूप । सैद्धांतिक रूप से, एक ही अवधारणा विभिंन सेल लाइनों से exosome उत्पादन में लाभप्रद होगा, और वास्तव में संवर्धन में इन कोशिकाओं को प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में काफी exosome उपज४०वृद्धि का प्रदर्शन किया गया । बड़े मध्यम जलाशय लगातार पोषक तत्वों की आपूर्ति करने के लिए और सेल डिब्बे से एक 10 केडीए अर्द्ध पारगंय झिल्ली के माध्यम से अपशिष्टों को हटा, मध्यम की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता के बिना लंबे समय तक संस्कृति की अनुमति के लिए कोशिकाओं के संपर्क में है, या नियमित रूप से कुप्पी बदल रहा है, जो अंततः उच्च पैमाने पर exosome उत्पादन४०की कुल लागत और श्रम को बचा सकता है । यह भी प्रदर्शित किया गया था कि आकृति विज्ञान, phenotype के रूप में के रूप में अच्छी तरह से exosomes पृथक कोशिकाओं के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी कार्य लंबे समय तक प्रतिक्रिया की कुप्पी संस्कृतियों नियमित रूप से ७५ सेमी2 कुप्पी४०में प्रसंस्कृत कोशिकाओं से स्रोत के समान हैं । exosome सूत्रों के रूप में प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में अन्य अमर कोशिका लाइनों की संस्कृति इसलिए उनकी अखंडता और समारोह को बनाए रखते हुए उनके exosome उपज में वृद्धि में मदद करेगा । संस्कृति का यह रूप है लेकिन सीमित विभाजन चक्र के साथ प्राथमिक कोशिकाओं के लिए लागू नहीं है, और उन है कि उच्च घनत्व में नहीं किया जा सकता है ।

मुख्यमंत्री की फसल के बाद से साप्ताहिक किया जाता है, और संस्कृति में कोशिकाओं पारित कभी नहीं थे, यह माना जा सकता है कि एक monolayer में नियमित सेल संस्कृति की तरह प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में कोशिकाओं नहीं बढ़ रहे हैं । वे सबसे अधिक है, या बस सतह से अलग है और मर जाते है जब कोशिकाओं को भी एक monolayer के लिए धाराप्रवाह हैं । प्रतिक्रियात्मक कुप्पी के कक्ष डिब्बे का दृश्य निरीक्षण इस धारणा की पुष्टि करने के लिए संभव नहीं है, लेकिन मुख्यमंत्री संचयन के दौरान प्राप्त मृत कोशिकाओं की बड़ी संख्या से परिलक्षित होता है. से खराब अनुयाई और गैर व्यवहार्य कोशिकाओं के नियमित रूप से हटाने के लिए प्रतिक्रिया की कुप्पी के निर्माण को रोकने के कर सकते है अर्द्ध पारगंय झिल्ली पर सामग्री की है कि प्रतिकूल गैस, पोषक तत्वों और सेल डिब्बे और मध्यम के बीच अपशिष्ट के आदान प्रदान को प्रभावित कर सकते है जलाशय, इस प्रकार की अनुमति के लिए लंबे समय तक संस्कृति के लिए प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में > 6 महीने४०। इस संदर्भ में, इस गैर-प्रतिक्रियात्मक कुप्पी में सेल विकास की नियमितता के रूप में हम सोचते है कि यह vivo में ट्यूमर के विकास की वास्तविक स्थिति की नकल और अधिक बारीकी से पारंपरिक monolayer सेल संस्कृति की तुलना में आदर्श है, और यह आशा व्यक्त की है कि exosomes इस में कैंसर की कोशिकाओं द्वारा उत्पादित प्रतिक्रियात्मक कुप्पी और अधिक है कि vivo मेंट्यूमर द्वारा स्रावित करने के लिए समान होगा । यह ट्यूमर विकृति की प्रगति में ट्यूमर व्युत्पंन exosomes की भूमिका में देख अध्ययन में विशेष रूप से लाभप्रद होगा । ट्यूमर-व्युत्पंन exosomes को आंतरिक रूप से और तरजीही घर३२मूल के अपने ऊतक को सूचित किया गया है, इसलिए एक प्रणाली में उत्पादित exosomes होने vivo उत्पादन में उनके नकल उतार भी अध्ययन में वांछनीय होगा देख ड्रग nanocarriers के रूप में exosomes की निष्क्रिय लक्ष्यीकरण क्षमता की खोज.

P:P अनुपात एक पैरामीटर के रूप में सूचित किया गया था अलग exosomes की शुद्धता का आकलन करने के लिए शारीरिक तरल पदार्थ के संस्कृति माध्यम से जो exosomes से४१स्रोत थे दूषित प्रोटीन से । इस अध्ययन में प्राप्त ८.३ ± १.७ × 1010 P/µ g का P:P अनुपात अध्ययन में प्रस्तावित उच्च शुद्धता सीमा के भीतर आता है । यह अनुपात प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करने के लिए उपज या exosomes की खुराक अलग या नीचे के अध्ययन में क्रमशः इस्तेमाल व्यक्त करने के खतरे पर प्रकाश डाला गया, के रूप में यह exosomes की सही मात्रा में प्रोटीन की समस्या को देखते हुए नमूने में उपलब्ध नहीं दर्शाती है अलगाव के दौरान संदूषण । NanoSight के रूप में उपकरणों के माध्यम से ंत्, जो कण संख्या के मामले में exosomes की एकाग्रता उपाय, exosomes को बढ़ाता का एक अधिक समझदार और सही तरीका है ।

ड्यूटेरियम ऑक्साइड में 25% सुक्रोज समाधान की तैयारी के दौरान अत्यधिक सटीक वजन इस विधि के रूप में महत्वपूर्ण है एक घनत्व आधारित अलगाव है । Exosomes सुक्रोज समाधान में प्लवनशीलता घनत्व के एक जगह संकीर्ण रेंज है सुक्रोज तकिया की तो सटीक तैयारी गैर exosomal बुलबुले जैसे अपोप्तोटिक शरीर या Golgi-४२अलगाव के दौरान बुलबुले व्युत्पंन को कम करेगा । यह बचा हुआ सुक्रोज समाधान रखने के लिए और यह भी एक दिन के बाद इतनी के रूप में कारकों के जोखिम से बचने के लिए है कि इस तरह के नुकसान या पानी के अलावा या तो वाष्पीकरण या ट्यूब में हवा का उपयोग करके समाधान में उसके घनत्व में परिवर्तन कर सकते हैं की सलाह दी जाती है नहीं है । एक स्विंग बाहर रोटर का उपयोग भी सुक्रोज तकिया पर केंद्रापसारक के दौरान आवश्यक है सुक्रोज समाधान के लिए CM से exosomes के प्रवास की अनुमति है ।

सुक्रोज समाधान के बाद वापस लेने-केंद्रापसारक भी एक नाजुक कदम है, और यह बरामद exosomes की मात्रा को अधिकतम करने के बीच एक समझौता खोज शामिल है, और बहुत ज्यादा नहीं है कि संस्कृति माध्यम से प्रोटीन exosome नमूना वापस लिया पेश किया है . सुक्रोज समाधान और हालत मध्यम के बीच इंटरफेस है, जहां संस्कृति माध्यम से प्रोटीन पोस्ट-केंद्रापसारक इकट्ठा होता है, और आम तौर पर एक गहरे भूरे रंग की अंगूठी है कि इंटरफेस पर बैठता है के रूप में देखा जा सकता है । हमारे हाथ में, प्रारंभिक 3 मिलीलीटर से सुक्रोज तकिया के 2 मिलीलीटर वापस लेने जोड़ा इष्टतम मात्रा है कि ऊपर उल्लेख किया समझौते के साथ सहमत है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित खंड उपयोग किए गए विशिष्ट रोटर के लिए हैं; इसलिए, विभिन्न सुविधाओं में उपलब्ध रोटर्स के प्रकारों के लिए वॉल्यूम को स्केलिंग करते समय वापस ले जाने के लिए सुक्रोज की मात्रा ऑप्टिमाइज़ करने की सलाह दी जाती है । यह भी ट्यूब के नीचे के केंद्र पर क्षेत्र सही से बचने के लिए महत्वपूर्ण है जब सुक्रोज वापस लेने, के रूप में यह वह स्थान है जहां सुक्रोज से उच्च घनत्व के कणों तलछट होगा और आम तौर पर एक बंद सफेद गोली के रूप में देखा जा सकता है ।

पंजाबियों की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा के साथ धुलाई कदम exosome अलगाव४१के दौरान प्रोटीन संदूषण की डिग्री को और कम करने में मदद करता है । यह कदम exosomes से अतिरिक्त सुक्रोज को हटाने में भी जरूरी है ताकि exosomes खुद को या exosomal लुमेन के भीतर मौजूद आसमाटिक क्षति से बचा जा सके, साथ ही exosome शेयर में जीवाणु और/या फंगल ग्रोथ के खतरे को कम कर सके । ड्यूटेरियम ऑक्साइड में सुक्रोज समाधान की तैयारी के बजाय पानी के लिए अलगाव के लिए exosome प्लवनशीलता घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक सुक्रोज की मात्रा को कम करने में मदद करता है, इसलिए दोनों आसमाटिक क्षति और माइक्रोबियल संदूषण के जोखिम को कम करने । सुक्रोज तकिया पर पहले केंद्रापसारक के बाद, exosome-सुक्रोज परत से युक्त वापस ले लिया और पंजाबियों को जोड़ा 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और अगले दिन संसाधित अगर समय की कमी के साथ सामना करना पड़ा ।

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, exosome/सिरना दाढ़ अनुपात electroporation की क्षमता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक है । इस प्रोटोकॉल में, हम दाढ़ अनुपात सिरना करने के लिए exosome के रूप में 1:60 का इस्तेमाल किया । के रूप में exosomes के विभिंन प्रकार के encapsulation की क्षमता अलग हैं, हम दृढ़ता से सुझाव है कि यह एक मामला दर मामले के आधार पर अनुकूलित किया जाएगा । हालांकि, encapsulation क्षमता के साथ साथ प्रस्तावित हमेशा इष्टतम electroporation शर्तों का चयन करने के लिए एक पैरामीटर हो सकता है ।

इसके अलावा, सिरना का एकत्रीकरण electroporation में सबसे आम समस्या में से एक माना जा रहा है । यह साबित होता है कि electroporation सिरना के मजबूत एकत्रीकरण पैदा कर सकता है, यह भी कठिन exosomes में प्रवेश करने के लिए बना । सिरना एग्रीगेट अक्सर exosome में सिरना के encapsulation के रूप में व्याख्या कर रहे हैं इसलिए उचित नियंत्रण सिरना समुच्चय के गठन के रूप में इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया28electroporation के दौरान अपरिहार्य है. प्रतिशत encapsulation दक्षता हमारी शुद्धि विधि का उपयोग करके परिकलित की गई थी अंय स्रोतों जैसे पृष्ठभूमि शोर, exosome और सिरना एग्रीगेट से प्रभाव को कम करने के लिए सामान्यीकृत मान डेटा विश्वसनीयता को प्रभावित करेगा । हमारे निष्कर्षों के आधार पर, वहां नगण्य सिरना समुच्चय था नियंत्रण नमूना अर्थात् में मनाया , electroporated और संयुक्त राष्ट्र electroporated सिरना का उपयोग कर ।

इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक exosomes में सिरना के encapsulation का प्रदर्शन किया है और उनके सिरना के बाद intracellular वितरण इन विट्रो मेंकैंसर की कोशिकाओं को । इसलिए, विभिंन प्रकार के सेल लाइनों से exosomes अलग किया जा सकता है और प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उपयोग विशेषता है, और बाद में विभिंन चिकित्सीय सिरना के साथ oncogenic लक्ष्यों के विभिंन प्रकार के लिए भरी हुई विभिंन तरह के कैंसर में व्यक्त की । एक दिलचस्प आवेदन सिरना वितरण का पता लगाने और exosome स्रोत-लक्ष्य सेल जोड़ी के विभिंन परिवर्तन इन विट्रो मेंउपयोग करने के लिए दक्षता होगी । यह तो vivo में सिरना-encapsulated exosomes के वितरण और चिकित्सीय दक्षता दोनों की दक्षता का आकलन करने के लिए पशु मॉडलों के लिए अनुवाद किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgements

एफ एन Faruqu मलेशियाई सरकारी एजेंसी मजलिस Amanah Rakyat (मारा) द्वारा वित्त पोषित है । एल Xu Marie Sklodowska के एक प्राप्तकर्ता है-क्यूरी व्यक्तिगत फैलोशिप (क्षितिज २०२०) (H2020-MSCA-अगर-२०१६) । के. टी. अल जमाल ने BBSRC (BB/J008656/1) और वेलकम ट्रस्ट (WT103913) से फंडिंग स्वीकार की । लेखक भी dr पॉल लैवेंडर और डॉ डेविड डर (श्वसन चिकित्सा और एलर्जी, राजा कॉलेज लंदन के विभाग) electroporator प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zitvogel, L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes. Nature Medicine. 4, (5), 594-600 (1998).
  2. Raffai, R., Li, K., Wong, D., Hong, J. Therapeutic control of systemic inflammation & atherosclerosis with ApoE-polarized macrophage exosomes. Atherosclerosis. e5-e6 (2017).
  3. Masamune, A., et al. Exosomes derived from pancreatic cancer cells induce activation and profibrogenic activities in pancreatic stellate cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495, (1), 71-77 (2018).
  4. Gangoda, L., et al. Proteomic Profiling of Exosomes Secreted by Breast Cancer Cells with Varying Metastatic Potential. Proteomics. 17, (23-24), 1600370 (2017).
  5. Wozniak, M., Peczek, L., Czernek, L., Düchler, M. Analysis of the miRNA Profiles of Melanoma Exosomes Derived Under Normoxic and Hypoxic Culture Conditions. Anticancer Research. 37, (12), 6779-6789 (2017).
  6. Salimu, J., et al. Dominant immunosuppression of dendritic cell function by prostate-cancer-derived exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 6, (1), 1368823 (2017).
  7. Lankford, K. L., et al. Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE. 13, (1), e0190358 (2018).
  8. Khalyfa, A., et al. Plasma Exosomes and Improvements in Endothelial Function by Angiotensin 2 Type 1 Receptor or Cyclooxygenase 2 Blockade following Intermittent Hypoxia. Frontiers in Neurology. 8, 709 (2017).
  9. Manek, R., et al. Protein Biomarkers and Neuroproteomics Characterization of Microvesicles/Exosomes from Human Cerebrospinal Fluid Following Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55, (7), 6112-6128 (2018).
  10. Pathare, G., et al. Changes in V-ATPase subunits of human urinary exosomes reflect the renal response to acute acid/alkali loading and the defects in distal renal tubular acidosis. Kidney International. 93, (4), 871-880 (2018).
  11. Liao, Y., Du, X., Li, J., Lönnerdal, B. Human milk exosomes and their microRNAs survive digestion in vitro and are taken up by human intestinal cells. Molecular nutrition & food research. 61, (11), 1700082 (2017).
  12. Kim, J., et al. Cyclooxygenase-2 expression is induced by celecoxib treatment in lung cancer cells and is transferred to neighbor cells via exosomes. International Journal of Oncology. 52, (2), 613-620 (2017).
  13. Sterzenbach, U., et al. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. Molecular Therapy. 25, (6), 1269-1278 (2018).
  14. Conigliaro, A., Fontana, S., Raimondo, S., Alessandro, R. Exosomes: Nanocarriers of Biological Messages. In Exosomes in Cardiovascular Diseases. 998, 23-43 (2017).
  15. El Andaloussi, S., Lakhal, S., Mäger, I., Wood, M. J. A. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, (3), 391-397 (2013).
  16. Simhadri, V. R., et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE. 3, (10), e3377 (2008).
  17. Santos, J. C., et al. Exosome-mediated breast cancer chemoresistance via miR-155 transfer. Scientific Reports. 8, (1), 829-829 (2018).
  18. Hadla, M., et al. Exosomes increase the therapeutic index of doxorubicin in breast and ovarian cancer mouse models. Nanomedicine. 11, (18), 2431-2441 (2016).
  19. Smyth, T., et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. Journal of Controlled Release. 199, 145-155 (2015).
  20. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35, (7), 2383-2390 (2014).
  21. Kim, M. S., et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 14, (1), 195-204 (2018).
  22. Bellavia, D., et al. Interleukin 3- receptor targeted exosomes inhibit in vitro and in vivo Chronic Myelogenous Leukemia cell growth. Theranostics. 7, (5), 1333-1345 (2017).
  23. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18, (9), 1606-1614 (2010).
  24. Tian, T., et al. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials. 150, 137-149 (2017).
  25. Zhuang, X., et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular Therapy. 19, (10), 1769-1779 (2011).
  26. Iessi, E., et al. Acridine Orange/exosomes increase the delivery and the effectiveness of Acridine Orange in human melanoma cells: A new prototype for theranostics of tumors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32, (1), 648-657 (2017).
  27. Aqil, F., et al. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer. Food & Function. 8, (11), 4100-4107 (2017).
  28. Shtam, T. A., et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Communication and Signaling. 11, (1), 1-10 (2013).
  29. Wahlgren, J., et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Research. 40, (17), e130-e130 (2012).
  30. Yang, J., Zhang, X., Chen, X., Wang, L., Yang, G. Exosome Mediated Delivery of miR-124 Promotes Neurogenesis after Ischemia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 7, 278-287 (2017).
  31. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. 29, (4), 341-345 (2011).
  32. Wiklander, O. P. B., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-13 (2015).
  33. Varga, Z., et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 31, (5), 168-173 (2016).
  34. Smyth, T. J., Redzic, J. S., Graner, M. W., Anchordoquy, T. J. Examination of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1838, (11), 2954-2965 (2014).
  35. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23430 (2014).
  36. Sharma, P., et al. Immunoaffinity-based isolation of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients with melanoma. Journal of Extracellular Vesicles. 7, (1), 1435138 (2018).
  37. Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 247, (1), 163-174 (2001).
  38. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling. In Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. 235-246 (2011).
  39. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82, (9), 1024-1032 (2012).
  40. Mitchell, J. P., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System. Journal of Immunological Methods. 335, (1-2), 98-105 (2008).
  41. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles? Journal of Extracellular Vesicles. 2, (1), 1-6 (2013).
  42. Chiou, N. -T., Ansel, K. M. Improved exosome isolation by sucrose gradient fractionation of ultracentrifuged crude exosome pellets. Nature Protocol Exchange. (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics