Подготовка Exosomes siRNA доставки раковых клеток

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

Exosome представляет новое поколение перевозчиков поставки наркотиков. Мы создали exosome Протокол изоляции с высокой урожайностью и чистоты для доставки siRNA. Мы также инкапсулировать дневно помечены неспецифической малых интерферирующих РНК в exosomes и исследованы клеточного поглощения малых интерферирующих РНК загружен exosomes в раковых клетках.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Внеклеточные везикулы, в частности exosomes, недавно получили интерес как роман наркотиков векторов доставки из-за их биологического происхождения, изобилия и внутренние возможности в межклеточных доставки различных биомолекул. Эта работа устанавливает Протокол изоляции для достижения высокой урожайности и высокой чистоты exosomes для доставки siRNA. Человеческих эмбриональных почек (ГЭС-293 клетки) культивировали в биореакторе колбы и культуры супернатанта (расписка называют кондиционером среднего) собирают на еженедельной основе для обогащения exosomes ГЭС-293. Кондиционерами среднего (см) предварительно очищается от отмерших клеток и клеточных обломков, дифференциального центрифугирования и подвергается ultracentrifugation на подушке сахарозы последовал Стиральная шаг, чтобы собрать exosomes. Изолированные exosomes ГЭС-293 характерны для урожайности, морфология и exosomal маркер выражения анализа отслеживания наночастиц, белок количественной оценки, электронной микроскопии и проточной цитометрии, соответственно. Малые интерферирующие РНК (siRNA), дневно помечены Atto655, загружается в exosomes путем электропорации и избыток siRNA удаляется путем фильтрации геля. Поглощения клеток в раковые клетки PANC-1, после 24 ч инкубации при температуре 37 ° C, подтверждается проточной цитометрии. Exosomes ГЭС-293 являются 107.0 Нм ± 8.2 в диаметре. Коэффициент соотношения (аналогично) exosome урожайность и частица белка являются 6.99 ± 0,22 × 1012 частиц/мл и 8,3 ± 1,7 × 1010 частиц/мкг, соответственно. Инкапсуляция эффективность малых интерферирующих РНК в exosomes ~ 10-20%. Сорок процентов клеток Показать позитивные сигналы для Atto655 на 24 ч после инкубации. В заключение exosome изоляции по ultracentrifugation на подушке сахарозы предлагает сочетание чистоты и хороший урожай. малых интерферирующих РНК может быть успешно загружены в exosomes путем электропорации и впоследствии доставлены в раковые клетки в пробирке. Этот протокол предоставляет стандартную процедуру для развивающихся малых интерферирующих РНК загружен exosomes для эффективной доставки на раковые клетки.

Introduction

Exosomes являются подтипом внеклеточного везикулы (EV), начиная от 50-200 Нм в диаметре, выделяемый различных типов клеток, таких как иммунные клетки1,2, раковые клетки3,4,5, 6 и стволовых клеток7. Exosomes, также было показано, присутствовать в различных физиологических жидкостях8,9,10,11. Сочетание присущих exosomes способность выполнять различные биомолекул (например, РНК и белков)12,,13-14 и эффективной доставки Эти биомолекулы в получателей клетки 15 , 16 , 17 привлекла интерес для их потенциал как нано-векторов доставки наркотиков. Различные маленькие молекулы, которые служат противораковых и противовоспалительные препараты проявили успешно загружаться в exosomes и доставлены целевых ячеек18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. интересно, что нуклеиновые кислоты как siRNA28,29 и микроРНК30 также были успешно загружены в exosomes через электропорации и доставлены к клеткам-мишеням.

Недавно РНК интерференции (RNAi) через малые интерферирующие РНК (siRNA) приобрел больше интереса как предпочтительный механизм подавления экспрессии гена из-за его высокой специфичности, мощным эффектом, минимальные побочные эффекты и простота малых интерферирующих РНК синтеза28, 29. малые интерферирующие РНК являются молекулы двуцепочечной РНК от 19 до 25 нуклеотидов в длину что триггеры последовательности конкретные каталитические мРНК нокдаун. Благодаря своей большой молекулярной массой и Полианионная природы пассивное поглощение голый интерферирующей РНК в клетки — препятствуют28,29. Это также не возможно для голый siRNA быть введены в кровообращения за счет быстрой деградации плазмы nucleases31. Таким образом инкапсуляции интерферирующей РНК в nanocarrier будет способствовать эффективной доставки и поглощение малых интерферирующих РНК в клетки-мишени.

Exosomes являются идеальной системой для инкапсуляции siRNA, как его структура состоит из полые, водный ядра, окруженная фосфолипидного бислой. Exosomes не только имеют хорошую стабильность в крови, но также имеют природные нацеливания свойств доставить функциональных РНК в клетки32. Исследование, проведенное Альварес-Эрвити et al. успешно продемонстрировал эффективной доставки интерферирующей РНК в мозг мышей с помощью инженерных exosomes с практически без осложнений31. Можно предположить, что на основе exosome терапия является относительно безопаснее, чем другие виды терапии, как exosomes эндогенно не реплицируются как клетки бы и поэтому не проявляют свойства метастатических15.

Различные методы, как сообщается, успешно изолировать exosomes из клеточной культуры или физиологические жидкости. Наиболее популярным методом использует ultracentrifugation для Пелле exosomes от начального материала31,32,33. Этот метод может быть довольно суровой на exosomes и, как правило, Сопредседатель преципитаты белков из образца. Сочетание ultracentrifugation с на основе плотности разделения например сахароза градиенты становится все более распространенным, чтобы уменьшить загрязнение протеина и не exosomal в изолированных exosomes19,34. Размер-гель-проникающей хроматографии (SEC) позволяет разделение exosomes от других видов внеклеточного везикулы (EV) по размеру и может также привести к минимальным белковых загрязнений, но ограничивается небольшое количество исходного материала, он может обрабатывать35, 36. Immunoaffinity захвата использует бисер покрытием с антителами, которые связывают с exosomal поверхности белки, например tetraspanins или других клеток конкретных маркер, позволяющий конкретные захвата exosomes, вместо того, чтобы EVs или другие белки, а также изоляция подгрупп населения в exosomes от всей образцов, но опять же ограничивается количество исходного материала и является дорогостоящим36,37. На полимерной основе осадков exosomes используется для быть популярным тоже, но так как это довольно сырой осадков, это приводит к более не exosomal везикул и белка загрязнение38,39.

Электропорация сообщалось за ее неэффективности как метод для загрузки exosomes с малых интерферирующих РНК за счет белков агрегации15,28,31. Подходы на основе трансфекции были продемонстрированы иметь лучше загрузки эффективность и стабильность белков, но нежелательно из-за своей токсичности и побочные эффекты трансфекции агентов в изменяя клеточных генов выражение28. Таким образом электропорация более широко использовался в siRNA загрузки в exosomes как это безопасный метод. Однако метод оптимизации Инкапсуляция необходимо быть создан для того, чтобы доставить достаточное количество малых интерферирующих РНК на целевой сайт для мощным генов нокдаун.

Здесь мы предлагаем exosome Протокол изоляции с помощью основанных на плотность ultracentrifugation на только один 25% (w/w) сахарозы подушке в окись дейтерия, вместо того, чтобы градиент плотности сахарозы. Это эффективный метод, который обходит градиента подготовка трудоемкий плотности и позволяет обрабатывать большие объемы исходного материала, но приводит к нетронутым exosomes высокой урожайностью и чистоты подходит для последующей загрузки с siRNA. Флуоресцентный конъюгированных Atto655 неспецифической siRNA была загружена в человеческих эмбриональных почек (клетки ГЭС-293) производные exosomes через электропорации и доставлен раковые клетки человеческого аденокарциномы поджелудочной железы (PANC-1) в пробирке.

Protocol

1. клеточной культуры в колбе биореактор

Figure 1
Рисунок 1: Культура клеток в биореакторе Фляга для производства exosome. (A) упрощенный Анатомия биореактор колбу. (B) начиная культуры в биореакторе колбу. Смотрите Таблицу материалов состав нормальной и exosome истощены средних (C) заготовка кондиционером среднего (см) и поддержание культуры в биореакторе колбу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Культура клетки ГЭС-293 в нормальной среде (см. Таблицу материалов; 5% CO2, 37 ° C) и расширить их в 4 x T75 колбы (до 90% притока).
  2. Влажные Мембранный биореактор колбу, добавляя 50-100 мл обычной среды в средних водохранилище биореактор колбу.
  3. Собрать все клетки ГЭС-293 от 4 x T75 и Ресуспензируйте их в 15 мл обедненного exosome среды (см. Таблицу материалы).
  4. Добавить ГЭС-293 суспензию клеток в клетки отсек биореактор флакон 20 мл шприц, подключенных к тупым заливки с помощью иглы (см. Таблицу материалы), с осторожностью, чтобы удалить любые пузырь, который может сформирован.
  5. Заполните средних водохранилище биореактор колбу с нормальной средой до 500 мл и держать колбу в инкубатор (5% CO2, 37 ° C) в неделю.

2. с кондиционером среднего (см) в биореакторе колбу

  1. После 1 недели отбросить все среды в средних водохранилище биореактор колбу.
  2. Удалить все среды в отсеке клеток (т.е., CM) 20 мл шприц, подключенный к тупым заполнить иглой.
  3. Добавьте 50-100 мл обычной среды в средних водохранилище.
  4. Добавьте 15 мл обедненного exosome среды в отсеке клеток, удалив старые среднего и добавляя свежий обедненного exosome средний с помощью подключенного к тупым заполнить иглой шприца 20 мл.
  5. Заполните средних водохранилище биореактор колбу с нормальной средой до 500 мл и держать колбу в инкубатор (5% CO2, 37 ° C) еще на неделю.
    Примечание: Культура может быть продолжена для более чем за год. На шаге 2.2 см от первого урожая не будет использоваться для exosome изоляции и отбрасывается. Для2го и последующих урожая см хранится для exosome изоляции.

3. Exosome изоляции на подушке сахарозы

Figure 2
Рисунок 2: выделение и характеристика exosomes. (A) Предварительная очистка заготовленной кондиционером среднего (см) от мертвых клеток и клеток мусора. (B) изолирующие exosomes от см на подушке сахарозы. (C) стиральные шаг для удаления сахарозы и загрязняясь протеины. (D) изолированные exosomes были затем подвергается физико-химических, биохимических и морфологических характеристик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Предварительно снимите см (от шага 2.2) дифференциального центрифугирования и фильтрации следующим образом.
    1. Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Перевести супернатант в новой трубки и отбросить гранулы. Повторите этот шаг центрифугирования еще раз, восстановление супернатант и отменяя гранулы.
    2. Центрифуга супернатант из шага 3.1.1 на 2000 x g за 15 мин и 4 ° C и затем отменить Пелле. Фильтр восстановленные супернатанта раз через фильтры 0,22 мкм.
  2. Во время предварительной очистки, подготовки 25% раствор сахарозы (w/w) в окись дейтерия точного взвешивания, 1.9 g (± 0,001 г) сахарозы в универсальной трубе и затем долива с окись дейтерия, до тех пор, пока вес достигает 7,6 г (± 0,001 г).
  3. Заполнить ультрацентрифуга трубки (см. Таблицу материалы) с 22,5 мл предварительно отобранных см. составляют см до 22,5 мл с 0,22 мкм фильтруются PBS, если текущий объем меньше, чем это.
  4. Место стеклянная Пипетка (см. Таблицу материалы) в трубку и, через него, добавить 3 мл раствора сахарозы, так что решение образует отдельный слой под см.
  5. Тщательно место трубки содержащие слоистых решение CM/сахарозы в ведро ротора поворотно откидные (см. Таблицу материалы) и закрепите ведро на ротор.
  6. Уложите ротор Ультрацентрифуги (см. Таблицу материалы) и спина на 100,000 x g для 1,5 ч при 4 ° C.
  7. Сбор 2 мл сахарозы слоя и добавить это к бутылке ультрацентрифуга (см. Таблицу материалы) содержащий 20 мл фильтруют PBS для стирки шага.
  8. Место труб в фиксированный угол ротора (см. Таблицу материалы) и спина на 100,000 x g для 1,5 ч при 4 ° C.
  9. Тщательно удалить супернатант с 10 мл Серологические Пипетки и Ресуспензируйте лепешка с PBS 400 мкл фильтруют. Держите этот запас exosome на 4 ° C или ° C-80 для краткосрочного и долгосрочного хранения соответственно.

4. характеристика Exosome размер и урожайность, наночастицы, отслеживания анализа (НТА)

  1. Марка 1:1 000-1:50, 000 разведения exosome акций в томе 1 мл (минимум 750 мкл) с тем, чтобы получить 20-80 частиц в окне просмотра ЗТК инструмент отображения (см. Таблицу материалов).
  2. Придать разбавленных exosome акций в камеру образец НТА инструмент, с помощью 1 мл шприца и вставьте датчик температуры термометр в входе датчика температуры.
  3. Установите программное обеспечение НТА (см. Таблицу материалы) для записи следующим образом: 3 стандартных измерений, 30 s каждый, температуры руководство параметр снят; и введите коэффициент разрежения на вкладке Дополнительно .
  4. Установите уровень камеры 13 и запустите сценарий захвата на НТА программного обеспечения, инъекционных свежий пакет образца и введя температура образца камеры при появлении запроса после каждого чтения.
  5. Установите порог 4 для последующего анализа части и обратите внимание на средний размер модальных и концентрации частиц exosome акций из измерений.

5. характеристика Exosome чистоты определение соотношения частиц: белка

  1. Мера, содержание белка exosome запасов по bicinchoninic кислоты assay протеина (BCA) kit (см. Таблицу материалы) следующим образом.
    1. Подготовка определены стандарты.
      1. Подготовка стандарта высокой концентрации (500 мкг/мл) путем добавления пробки microcentrifuge 45 мкл BSA Стоковый раствор (2 мг/мл-пробирного комплекта) и сделать его до 180 мкл с PBS.
      2. Заполните 8 microcentrifuge трубы с 90 мкл PBS.
      3. Сделать серийных разведений (фактор: 0.5), принимая 90 мкл от высоких BSA стандартных и добавляя это в 1st microcentrifuge трубки с PBS (смесь хорошо), а затем принимая 90 мкл от этой трубки и добавление его в пробки microcentrifuge 2nd .
      4. Повторите это до 7 пробки microcentrifuge. 8 трубка будет просто PBS (т.е. бланк: 0 мкг/мл).
    2. Подготовка образцов exosome путем разбавления 1:2 образцов с PBS в общем объеме 90 мкл (45 мкл пример, 45 мкл PBS).
    3. Подготовка рабочей смеси реагентов BCA.
      1. Вычислите общий объем BCA рабочей смеси реагентов необходимо (50 мкл в скважину, в дубликаты, включая стандарты).
      2. Смешать отдельные реагенты BCA согласно следующей пропорции: 25 частей реагент A: 24 частей реагент B: 1 часть реагент C.
    4. Выполнение анализа и анализа.
      1. 40 мкл каждого стандарта и exosome образца, подготовленный выше в колодец 96-луночных плиты (дубликаты каждого стандарта и образца).
        Примечание: Поскольку это колориметрического анализа, правильная техника дозирования имеет решающее значение для обеспечения точных результатов. Изменить пипетки после добавления каждого стандарта/образца репликации в каждом из скважин
      2. Добавьте 50 мкл рабочей смеси реагентов в каждой скважине assay протеина и инкубировать пластины при 37 ° C за 30 мин.
        Примечание: Для минимизации отклонения между реплицирует, добавить белка пробирного рабочего реагента в 1st реплицировать стандарт/выборки, а затем 2nd повторить тот же образец/стандарт, перед его добавлением в 1st повторить еще один образец/стандарта.
      3. Измерение оптической плотности в 562 Нм на пластине читателя (см. Таблицу материалы).
      4. Участок кривой стандартного из значения поглощения стандартов и выработать концентрацию белка в каждом образце с помощью уравнения кривой.
  2. Рассчитайте коэффициент частиц: белка путем деления exosome урожая, полученного ранее с концентрацией белка exosome акций, измеряется выше.

6. характеристика Exosomal маркер выражения проточной цитометрии

  1. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре (RT) 40 мкл exosomes (≥1x1011 частиц/мл) с 10 мкл альдегид/сульфат латекса бусины (неразбавленный со склада).
  2. 5 мкл раствора 100 мкм БСА (см. Таблицу материалы) в exosome шарик смесь для достижения 10 mM концентрации выпускных и Инкубируйте 15 мин на RT.
  3. Добавьте 1 mL PBS и проинкубируйте 75 мин на RT в пробки microcentrifuge с мягким перемешиванием в шейкере качалки (~ 150 об/мин).
  4. Центрифуга для подвески на 580 x g 5 мин на RT и удалить супернатант.
  5. Ресуспензируйте лепешка с 1 мл раствора глицина 100 мм (см. Таблицу материалы) и Инкубируйте 30 мин на RT.
  6. Центрифуга подвеска 5 мин в 580 x g. удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 1 мл 3% FBS/PBS (см. Таблицу материалы).
  7. Повторите этот шаг стиральные и Ресуспензируйте гранулы в 350 мкл 3% FBS/PBS.
  8. Разделите подвеска на 7 трубок, каждый из которых содержит 50 мкл суспензии и инкубировать их с Флюорофор конъюгированных анти CD81, анти CD9 и анти CD63 антител и их соответствующие элементы управления изотипа (1:10 разрежения), соответственно, для 45 мин при 4 ° C. Держите 1 трубы как безупречный управления но подвергается той же обработки.
  9. Добавьте 1 мл 3% FBS/PBS для каждой трубы, центрифуги для 5 мин на 580 x g и удалить супернатант.
  10. Ресуспензируйте лепешка с 200-400 мкл 3% FBS/PBS и анализировать образец на проточный цитометр (см. Таблицу материалы) по соответствующим каналам.

7. характеристика Exosome морфологии, просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА)

  1. Исправить exosome водных дисперсий в правильной концентрации таких 10 p 10/мл в установлении решение (см. Таблицу материалы) за 15 мин.
  2. Образцы на 300 сетку углеродные покрытием медной сетки и оставить воздух сухой.
  3. Отрицательно пятно образцы с 0,22 мкм фильтруются водный уранила ацетат (см. Таблицу материалы) 4 мин, следуют два 50% метанол/H2O мыть (см. Таблицу материалы).
  4. Воздух сухой образца.
  5. Наблюдать за образцы под ТЕА (см. Таблицу материалы). Установите ускоряющего напряжения на 80 кв и размер пятна на 2. Использование объективных Диафрагма со всеми образцами.

8. siRNA инкапсуляции в Exosomes путем электропорации

  1. Предварительно охладить электропорации кювета (см. Таблицу материалы) на льду за 30 мин до электропорации.
  2. Mix 7.0 мкг exosomes (32 мкл от 7 x 1012 p/мл бульона в PBS) с 0,33 мкг интерферирующей РНК (12 µL из 2 мкм запасов в РНКазы свободной воды) в пробки microcentrifuge. Составляют объем 150 мкл с лимонной кислотой буфера (см. Таблицу материалы). Exosome для малых интерферирующих РНК молярное соотношение 1: 60 в данном случае.
  3. Передача смеси электропорации кювет. Крышка кювет и поместить его в держатель кювет electroporator (см. Таблицу материалы). Вращайте колесо поворота 180° по часовой стрелке.
    Примечание: Колесо должен быть включен полностью заблокированное положение, в порядке для кювет связаться электродов.
  4. Выберите желаемый электропорации программу (например, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, и т.д.) и начать электропорация, нажав кнопку Пуск .
    Примечание: Успешное пульс обозначается показаны «OK» на дисплее.
  5. Однажды electroporated, удалите кювет после поворота назад колесо 180° по часовой стрелке. Снять образец из кювета с пластиковых дозаторов для дальнейшей обработки.

9. удаление свободного siRNA использование размер гель-проникающей хроматографии (сек)

  1. Сбалансировать столбце SEC (2,9 см [H] x 1.3 см [W]; см. Таблицу материалы), передав 3,5 мл отфильтрованных PBS дважды.
  2. Распустить 150 мкл пример electroporated в 350 мкл отфильтрованных PBS и передать это SEC столбец для выполнения удаления бесплатно siRNA.
  3. Сбор первых 500 мкл фракции, что этого eluted из столбца (F0).
  4. Добавить 500 мкл отфильтрованных PBS в столбце и собирать следующий 500 мкл дроби (F1).
  5. Повторите шаг выше, пока не собирается в общей сложности 10 x 500 мкл фракций (до F9). F1 и F2 должен содержать малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes.
  6. Промойте колонку с отфильтрованной PBS (дважды, по крайней мере) чтобы удалить любые остатки образца.

10. в Vitro поглощения Exosomes загружен малых интерферирующих РНК в клетки PANC-1

  1. Семян PANC-1 клетки в 24-ну плоскодонные пластины (см. Таблицу материалы) на плотности 50 000 ячеек на хорошо за 24 часа до поглощение изучать и инкубации клеток в инкубатор (5% CO2, 37 ° C).
  2. Electroporate ГЭС-293 exosomes (7.0 мкг) с Atto655-siRNA (0,33 мкг) в соответствии с шагом 8.
  3. Очистить electroporated exosome соответствии с шагом 9 и Ресуспензируйте в 100 мкл PBS.
  4. Добавьте 50 мкл electroporated exosomes PANC-1 клетка и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 на 4 ч.
  5. Соберите клетки после инкубации.
  6. Вымыть клетки с 1 мл стерильного PBS и Ресуспензируйте в 200 мкл PBS в полистирола раунд дно трубки (см. Таблицу материалы).
  7. Анализировать клетки, проточный цитометр (см. Таблицу материалы) с 10 000 событий, приобретенных на сэмпл.
    Примечание: ООН electroporated exosome-siRNA смесь образцов и неочищенных клетки с отфильтрованной PBS были использованы как элементы управления.

Representative Results

Физико-химическая характеристика exosomes, изолированных от ГЭС-293 клеток (ГЭС-293 Exo) кратко изложены в таблице 1. Размер измеряется с помощью наночастиц, отслеживания инструмент анализа (НТА) был 107.0 Нм ± 8.2. Exosome доходность от ГЭС-293 клеток, также анализируются с помощью инструмента НТА, был 6.99 ± 0,22 x 1012 p/мл от ~ 24 мл см (полученные от 2 раунда сбора урожая). Чистота ГЭС-293 Exo оценены путем расчета коэффициента частиц белка (аналогично) был 8,3 ± 1,7 × 1010 p/мкг.

Распределение по размерам изолированных ГЭС-293 Exo показано на рисунке 3A. Морфологический анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) показали ГЭС-293 Exo сферических структуры слегка выше 100 Нм в размер (рис. 3B). Этот результат соглашается с этим НТА измерения (рис. 3A). Изолированные Exo ГЭС-293 были положительными CD81, CD9 и CD63, которые являются канонические маркеров, используемый для идентификации везикулы как exosomes (рис. 3 c).

Для очистки exosomes, используя размер гель-проникающей хроматографии (рис. 4) процент восстановления exosomes был рассчитан путем деления числа частиц всего exosome, в 10 фракций собранных (F0-F9) с начальной exosome количество частиц используется, в то время как процент восстановления интерферирующей РНК была рассчитана путем деления всего флуоресценции интенсивности, полученные от F3, F4 и F5 с интенсивностью всего флуоресценции, полученные из всех 10 фракций собраны. Восстановление exosome и малых интерферирующих РНК после очистки была рассчитана как 75,0% и 80,4%, соответственно. Инкапсуляция эффективность малых интерферирующих РНК в exosomes был ~ 10-20%, рассчитанных с использованием малых интерферирующих РНК калибровочной кривой установлены (Рисунок 4 c).

Качественный анализ в vitro поглощения exosomes загружен с флуоресцентной Atto655-siRNA подачей cytometry показали, что клетки PANC-1, лечение с малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes записан крупнейший сдвиг в флуоресценции сигнала (Рисунок 5A) . PANC-1 клетки, лечение с малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes Записанная более высокий процент населения позитивного для Atto655 сигнала (39,4%), по сравнению с что лечить смесью выгрузки exosomes и малых интерферирующих РНК (0.56%), который подтверждает замечание выше ( Рисунок 5B). Степень клеточного поглощения малых интерферирующих РНК (выражается как раз разница в средней флуоресценции значения интенсивности (MFI) от того необработанных клеток) было также отмечено будет значительно выше в PANC-1 клетках, обработанных с малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes (раза МФИ разница = 5.1) по сравнению с с exosome-siRNA смесь (МРИ сложите разницы = 1.1) (рис. 5 c). Эти наблюдения показали, что малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes были внутреннюю клетками PANC-1 и что они фактически доставлены siRNA внутриклеточно.

Figure 3
Рисунок 3: биохимические и анализа морфологии ГЭС-293 exosomes. (A) размер распределение exosomes ГЭС-293 с помощью наночастиц отслеживания анализа (НТА). Кривая показывает гистограмму отрываться от 3 различных захватывает интервалом 30 s с красной области, обозначающий стандартное отклонение между измерениями (n = 3). (B) передача электронной микроскопии (ТЕА) образы наивно exosomes ГЭС-293. Линейки: 100 Нм. (C) обнаружения маркеров exosomal CD81, CD9 и CD63 с помощью проточной цитометрии на exosomes ГЭС-293. Exosomes были соединены к альдегид/сульфат латексные шарики до обнаружения. Комплекс Exosome бусы были впоследствии витражи с Флюорофор конъюгированных антител анти CD81, анти CD9 и анти CD63. Степени экспрессии маркеров выражаются как раз разница в значениях интенсивности (МРИ) средний флуоресценции от этого элемента управления (exosome бисер комплекс витражи с соответствующими изотипа). Значения выражаются как означает ± SD, где n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Exosome очистки пост электропорация. (A) профилями элюции (F0-F9) Atto655-siRNA и electroporated exosomes, с помощью исключения chormatography размер. (B) НТА анализ Atto655-siRNA и exosome от F0 до F9, с помощью исключения chormatography размер. (C) калибровочной кривой Atto655 помечены siRNA. Интенсивностью флюоресценции были получены путем пластины читателя в Ex / Em: 640-10/680 Нм; Получите 2800. Значения выражаются как означает ± SD (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: клеточного поглощения малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes в клетки PANC-1 на 4 ч. (A) гистограммы, сравнивая клеточного поглощения выгрузки exosomes + смесь siRNA и малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes. (B) сравнение поглощение выгрузки exosomes + смесь малых интерферирующих РНК в 4 ч в псевдоцветном сюжет. (C) раза разница в виду флуоресцирования (MFI) значения интенсивности исследованных образцов по сравнению с необработанными клеток. Значения выражаются как означает ± SD, где n = 3. P < 0,001. NS: не значительные. Односторонний дисперсионный анализ был использован для статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Exosome Размер1,2
(Нм)
Урожайность1,2,3
(p/мл)
[Белка] 2,4
(мкг/мл)
Частицы белка (аналогично) соотношение5
(p/мкг)
ГЭС-293 107.0 ± 8.2 6.99 ± 0,22 x 1012 84.3 ± 9,8 8.3 ± 1,7 x 1010 
1 измеряется с помощью наночастиц, отслеживания анализа (НТА инструмент)
2 значения выражаются как означает ± SD, где n = 3
3 выход был получен средой клеток кондиционером, объединить 2 раундов заготовки из фляги биореактора (~ 24 мл)
4 измеряется с помощью комплекта assay протеина
5 значение, полученное с помощью формулы: аналогично коэффициент = выход / [белка]

Таблица 1: Физико-химическая характеристика exosomes.

Discussion

Получение достойной exosome доходность от культивируемых клеток, которые являются достаточно для нескольких раундов в vitro или в vivo исследований, по-прежнему является проблемой. По словам производителя биореактор колбы были предназначены для производства антител и белков с высокой доходности от культуры различных увековечен клеточных линий. Это позволяет клеткам непрерывно обогащают питательной среды с желаемого продукта, приводящих к концентрированной кондиционером среднего (см) в клетки купе. Теоретически же концепция будет полезным в exosome производства из различных клеточных линий, и действительно культивирования этих клеток в колбах биореактор была продемонстрирована значительно увеличить урожайность exosome40. Большой средних водохранилища постоянно поставляет питательные вещества и удаление отходов из клеток отсека через 10 кДа полупроницаемую мембрану, позволяя продолжительной культуре не требуя большого количества средних быть в контакте с клетки, или регулярные Фляги изменения, которые могут в конечном счете сохранить общую стоимость и труда крупномасштабных exosome производства40. Было также продемонстрировано, что морфология, фенотип, а также функции иммуномодулирующих exosomes изолированных клеток, что долгосрочные биореактор колбы культур аналогичны, получены из клетки культивировали в регулярных 75 см2 фляги40. Поэтому культура других увековечен клеточных линий как exosome источников в биореакторе колбу поможет увеличить доходность их exosome при сохранении их целостности и функции. Эта форма культуры является, однако не применимо к первичной ячейки с ограниченным разделение циклов и те, которые нельзя культивировали в высокой плотности.

Так как урожай см делается раз в неделю, и никогда не были пассированной клетки в культуре, можно предположить, что клетки в биореакторе настой не растут в монослое как регулярные клеточной культуры. Они, скорее всего, создавать кластеры с некротическими центрами или просто отсоединить от поверхности и умереть, когда клетки слишком вырожденная для монослоя. Визуальный осмотр клеток отсека биореактор фляга невозможно подтвердить это предположение, но отражается на большое количество отмерших клеток, полученные во время сбора урожая см. Регулярное удаление плохо сторонником и нежизнеспособных клеток от биореактор настой может предотвратить накопление материалов на полупроницаемую мембрану, которая может отрицательно сказаться на обмен газа, питательных веществ и отходов между отсеке клеток и среднего водохранилище, таким образом позволяя в биореакторе колбы для длительного культуры > 6 месяцев40. В этом контексте, это не регулярности роста клеток в колбах биореактор является идеальным, как мы предположить, что он имитирует фактического состояния опухолевого роста в естественных условиях более тесно, чем обычные монослойном культивировании клеток, и следует надеяться, что exosomes производимые раковые клетки в биореакторе колбу будет больше похож на что выделяемый опухоли в vivo. Это было бы особенно полезным в исследованиях, глядя в роли опухоли производные exosomes в прогрессии опухоли патологии. Опухоль производные exosomes сообщили неразрывно и преференциально домой, чтобы их ткани происхождения32, поэтому имея exosomes, производимых в системе, имитируя их в естественных условиях производства было бы также желательно в исследованиях, глядя на изучает пассивной ориентации способность exosomes как nanocarriers препарат.

Аналогично соотношение было сообщено как параметр для оценки чистоты изолированных exosomes от загрязнения белки от питательной среды физиологические жидкости, от которых были получены exosomes из41. Аналогично соотношение 8,3 ± 1,7 × 1010 p/мкг, полученные в настоящем исследовании находится в диапазоне высокой чистоты, предложенные в исследовании. Это соотношение подчеркивается опасность использования концентрацию белка выразить урожайности или дозы exosomes изолированные или используется в нижнем течении исследования соответственно, как это не отражает истинное количество доступных в образце, учитывая проблемы белка exosomes загрязнение в изоляции. НТА через инструменты, такие как NanoSight, который измеряет концентрацию exosomes количеству частиц, является более разумным и точным способом количественной оценки exosomes.

Высокоточные весом в ходе подготовки 25% раствора сахарозы в окись дейтерия имеет решающее значение, как этот метод на основе плотность изоляции. Exosomes имеют довольно узкий диапазон плотности флотации в растворе сахарозы, поэтому точная подготовка сахарозы подушки позволит снизить загрязнение не exosomal пузырьки как apoptotic тела или пузырьков Гольджи, полученных во время изоляции42. Рекомендуется не хранить остатки сахарозы решение и использовать его даже после одного дня с тем, чтобы избежать риска факторов, которые могут изменить его плотность таких потерь или добавление воды в растворе на испарение и конденсация воздуха в трубке. Использование поворотно откидные ротора также важно во время центрифугирования на подушке сахарозы чтобы разрешить даже миграции exosomes см для раствора сахарозы.

Снятие после центрифугирования раствор сахарозы также деликатный шаг, и он включает в себя поиск компромисса между максимальное количество exosomes восстановленные и не слишком много, что белок из питательной среды вводится в exosome пример вывода . Интерфейс между раствора сахарозы и состояния среды, где белки от питательной среды будет собирать после центрифугирования и обычно может рассматриваться как темно коричневый кольцо, которое сидит на интерфейсе. В наших руках снятия 2 мл сахарозы подушки из первоначальных 3 мл добавил является оптимальный объем, который соглашается с компромиссом, упомянутых выше. Тома, указанных в настоящем Протоколе, для конкретных роторов используется; Поэтому рекомендуется оптимизировать объем сахарозы быть отменены при масштабировании вверх или вниз томов для типы роторов, доступных в различных учреждениях. Важно также избежать области право в центре нижней части трубки при снятии сахарозы, как это, где частиц плотность выше, чем сахароза будет отложений и обычно может рассматриваться как белые гранулы.

Стиральная шаг с относительно большим количеством PBS помогает дальнейшему сокращению степени загрязнения белков во время exosome изоляции41. Этот шаг необходим также удаление избыточного сахарозы из exosomes избежание осмотического повреждения exosomes сами или биомолекул в Люмене exosomal, а также снизить риск бактериальных или грибковых роста на складе exosome. Подготовка раствора сахарозы в окись дейтерия, вместо того, чтобы вода помогает уменьшить количество сахарозы, необходимых для достижения плотности флотации exosome для изоляции, поэтому снижение риска осмотического повреждения и микробной контаминации. После первого центрифугированием на подушке сахарозы, exosome содержащих сахарозу слой снят и добавлен в PBS можно хранить при 4 ° C и обработаны на следующий день, если сталкивается с нехваткой времени.

В меру наших знаний exosome/siRNA молярное соотношение является важным фактором в определении эффективности электропорации. В этом протоколе мы использовали 1: 60 как exosome чтобы молярное соотношение siRNA. Как способность инкапсуляции различных видов exosomes разные, мы настоятельно рекомендуем это быть оптимизированы на основе case-by-case. Однако инкапсуляции эффективность предлагаемых здесь всегда может быть параметром для выбора оптимального электропорации условий.

Кроме того совокупность малых интерферирующих РНК считается одним из наиболее распространенных проблем в электропорации. Доказано, что что электропорации может вызвать сильный совокупность малых интерферирующих РНК, что делает его еще труднее ввести exosomes. siRNA агрегаты часто ошибочно воспринимается как инкапсуляция интерферирующей РНК в exosome поэтому надлежащего контроля были использованы в этом исследовании, как формирование агрегатов siRNA неизбежны во время электропорации28. Процент инкапсуляции эффективности нашего метода очистки был рассчитан с помощью нормализованных значений для сведения к минимуму влияние из других источников, таких как фоновый шум, exosome и малых интерферирующих РНК агрегатов, влияющие на надежность данных. Основываясь на наших результатах, было незначительным siRNA агрегатов в управления образец т.е., используя electroporated и ООН electroporated siRNA.

Этот протокол успешно продемонстрировала инкапсуляции малых интерферирующих РНК в exosomes и их последующее внутриклеточных доставка малых интерферирующих РНК рака клеток в пробирке. Таким образом, различные виды exosomes от различных клеточных линий могут быть изолированы и характеризуется использованием предложенного протокола и впоследствии загружается с различных терапевтических siRNA для различных типов онкогенных цели чрезмерно выраженная в различных видов рака. Интересные приложения было бы исследовать эффективность доставки и поглощение siRNA с использованием различных комбинаций exosome источник цель клеток пара в пробирке. Это может быть переведено на животных моделей для оценки эффективности доставки и терапевтическую эффективность малых интерферирующих РНК инкапсулированное exosomes в vivo.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgements

Ф. н. Faruqu финансируется Агентством правительства Малайзии Rakyat Amanah Меджлиса (Мара). L. Сюй является получателем индивидуальных стипендий Мария Склодовская-Кюри (Horizon 2020) (H2020-МСКА-если-2016). K. т. Аль-Джамаль признает, финансирование от СИББН (BB/J008656/1) и Уэллком траст (WT103913). Авторы также хотели бы поблагодарить д-р Пол лаванды и д-р Дэвид страх (Департамент респираторной медицины и аллергии, Королевский колледж Лондона) для обеспечения electroporator.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zitvogel, L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes. Nature Medicine. 4, (5), 594-600 (1998).
  2. Raffai, R., Li, K., Wong, D., Hong, J. Therapeutic control of systemic inflammation & atherosclerosis with ApoE-polarized macrophage exosomes. Atherosclerosis. e5-e6 (2017).
  3. Masamune, A., et al. Exosomes derived from pancreatic cancer cells induce activation and profibrogenic activities in pancreatic stellate cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495, (1), 71-77 (2018).
  4. Gangoda, L., et al. Proteomic Profiling of Exosomes Secreted by Breast Cancer Cells with Varying Metastatic Potential. Proteomics. 17, (23-24), 1600370 (2017).
  5. Wozniak, M., Peczek, L., Czernek, L., Düchler, M. Analysis of the miRNA Profiles of Melanoma Exosomes Derived Under Normoxic and Hypoxic Culture Conditions. Anticancer Research. 37, (12), 6779-6789 (2017).
  6. Salimu, J., et al. Dominant immunosuppression of dendritic cell function by prostate-cancer-derived exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 6, (1), 1368823 (2017).
  7. Lankford, K. L., et al. Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE. 13, (1), e0190358 (2018).
  8. Khalyfa, A., et al. Plasma Exosomes and Improvements in Endothelial Function by Angiotensin 2 Type 1 Receptor or Cyclooxygenase 2 Blockade following Intermittent Hypoxia. Frontiers in Neurology. 8, 709 (2017).
  9. Manek, R., et al. Protein Biomarkers and Neuroproteomics Characterization of Microvesicles/Exosomes from Human Cerebrospinal Fluid Following Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55, (7), 6112-6128 (2018).
  10. Pathare, G., et al. Changes in V-ATPase subunits of human urinary exosomes reflect the renal response to acute acid/alkali loading and the defects in distal renal tubular acidosis. Kidney International. 93, (4), 871-880 (2018).
  11. Liao, Y., Du, X., Li, J., Lönnerdal, B. Human milk exosomes and their microRNAs survive digestion in vitro and are taken up by human intestinal cells. Molecular nutrition & food research. 61, (11), 1700082 (2017).
  12. Kim, J., et al. Cyclooxygenase-2 expression is induced by celecoxib treatment in lung cancer cells and is transferred to neighbor cells via exosomes. International Journal of Oncology. 52, (2), 613-620 (2017).
  13. Sterzenbach, U., et al. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. Molecular Therapy. 25, (6), 1269-1278 (2018).
  14. Conigliaro, A., Fontana, S., Raimondo, S., Alessandro, R. Exosomes: Nanocarriers of Biological Messages. In Exosomes in Cardiovascular Diseases. 998, 23-43 (2017).
  15. El Andaloussi, S., Lakhal, S., Mäger, I., Wood, M. J. A. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, (3), 391-397 (2013).
  16. Simhadri, V. R., et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE. 3, (10), e3377 (2008).
  17. Santos, J. C., et al. Exosome-mediated breast cancer chemoresistance via miR-155 transfer. Scientific Reports. 8, (1), 829-829 (2018).
  18. Hadla, M., et al. Exosomes increase the therapeutic index of doxorubicin in breast and ovarian cancer mouse models. Nanomedicine. 11, (18), 2431-2441 (2016).
  19. Smyth, T., et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. Journal of Controlled Release. 199, 145-155 (2015).
  20. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35, (7), 2383-2390 (2014).
  21. Kim, M. S., et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 14, (1), 195-204 (2018).
  22. Bellavia, D., et al. Interleukin 3- receptor targeted exosomes inhibit in vitro and in vivo Chronic Myelogenous Leukemia cell growth. Theranostics. 7, (5), 1333-1345 (2017).
  23. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18, (9), 1606-1614 (2010).
  24. Tian, T., et al. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials. 150, 137-149 (2017).
  25. Zhuang, X., et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular Therapy. 19, (10), 1769-1779 (2011).
  26. Iessi, E., et al. Acridine Orange/exosomes increase the delivery and the effectiveness of Acridine Orange in human melanoma cells: A new prototype for theranostics of tumors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32, (1), 648-657 (2017).
  27. Aqil, F., et al. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer. Food & Function. 8, (11), 4100-4107 (2017).
  28. Shtam, T. A., et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Communication and Signaling. 11, (1), 1-10 (2013).
  29. Wahlgren, J., et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Research. 40, (17), e130-e130 (2012).
  30. Yang, J., Zhang, X., Chen, X., Wang, L., Yang, G. Exosome Mediated Delivery of miR-124 Promotes Neurogenesis after Ischemia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 7, 278-287 (2017).
  31. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. 29, (4), 341-345 (2011).
  32. Wiklander, O. P. B., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-13 (2015).
  33. Varga, Z., et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 31, (5), 168-173 (2016).
  34. Smyth, T. J., Redzic, J. S., Graner, M. W., Anchordoquy, T. J. Examination of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1838, (11), 2954-2965 (2014).
  35. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23430 (2014).
  36. Sharma, P., et al. Immunoaffinity-based isolation of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients with melanoma. Journal of Extracellular Vesicles. 7, (1), 1435138 (2018).
  37. Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 247, (1), 163-174 (2001).
  38. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling. In Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. 235-246 (2011).
  39. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82, (9), 1024-1032 (2012).
  40. Mitchell, J. P., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System. Journal of Immunological Methods. 335, (1-2), 98-105 (2008).
  41. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles? Journal of Extracellular Vesicles. 2, (1), 1-6 (2013).
  42. Chiou, N. -T., Ansel, K. M. Improved exosome isolation by sucrose gradient fractionation of ultracentrifuged crude exosome pellets. Nature Protocol Exchange. (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics