Beredning av Exosomes för siRNA leverans till cancerceller

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

En exosome är en ny generation av drogen leverans bärare. Vi etablerade en exosome isolering protokoll med hög avkastning och renhet för siRNA delivery. Vi också inkapslade fluorescently märkta ospecifika siRNA in exosomes och undersökt det cellernas upptaget av siRNA-loaded exosomes i cancerceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Extracellulära vesicles, i synnerhet exosomes, har nyligen vunnit intresse som romanen drog leverans vektorer på grund av deras biologiska ursprung, överflöd och inneboende kapacitet i intercellulära leverans av olika biomolekyler. Detta arbete fastställs ett isolering protokoll för att uppnå hög avkastning och hög renhet av exosomes för siRNA delivery. Mänskliga embryonala njurceller (HEK-293 celler) odlas i bioreaktor kolvar och kulturen supernatant (härefter benämnd luftkonditionerade medium) skördas på veckobasis för anrikning av HEK-293 exosomes. Konditionerat medium (CM) rensas före av döda celler och cellulära skräp genom differential centrifugering och utsätts för ultracentrifugering på en sackaros kudde följt av en tvätt steg, samla in exosomes. Isolerade HEK-293 exosomes kännetecknas för avkastning, morfologi och exosomal markör uttryck av nanopartiklar spårning analys, protein kvantifiering, elektronmikroskopi och flödescytometri, respektive. Liten störande RNA (siRNA), fluorescently märkt med Atto655, läses in i exosomes av elektroporation och överflödig siRNA avlägsnas genom gelfiltrering. Cell upptag i PANC-1 cancerceller, efter 24 h inkubation vid 37 ° C, bekräftas av flödescytometri. HEK-293 exosomes är 107,0 ± 8,2 nm i diameter. Exosome avkastning och partikel-till-protein baserat (hästar) förhållandet är 6.99 ± 0,22 × 1012 partikel/mL 8,3 ± 1,7 × 1010 partikel/µg, respektive. Inkapsling effektiviteten av siRNA i exosomes är ~ 10-20%. Fyrtio procent av cellerna visar positiva signaler för Atto655 på 24 h efter inkubation. Avslutningsvis erbjuder exosome isolering av ultracentrifugering på sackaros kudde en kombination av god avkastning och renhet. siRNA kunde läsas framgångsrikt in i exosomes av elektroporation och därefter levereras till cancerceller in vitro-. Detta protokoll erbjuder ett standardförfarande för att utveckla siRNA-laddat exosomes för effektiv leverans till cancerceller.

Introduction

Exosomes är en undertyp av extracellulära blåsor (EV) sträcker sig från 50-200 nm i diameter, utsöndras av olika celltyper som immunceller1,2, cancerceller3,4,5, 6 och stamceller7. Exosomes har också visat sig vara närvarande i olika fysiologiska vätskor8,9,10,11. Kombinationen av exosomes inneboende förmåga att bära olika biomolekyler (t.ex., RNA och proteiner)12,13,14 och effektiv leverans av dessa biomolekyler i mottagarens celler 15 , 16 , 17 väckte intresse för deras potential som nano-skala drogen leverans vektorer. Olika små molekyler som tjäna som anti-cancer och antiinflammatoriska läkemedel har visat sig vara framgångsrikt in i exosomes och levererats till målet celler18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. intressant, nucleic syror såsom siRNA28,29 och mikroRNA30 har också varit framgångsrikt lastade in exosomes via elektroporation och levererats till målceller.

Nyligen, RNA interferens (RNAi) via små störande RNA (siRNA) har vunnit mer intresse som Rekommenderad mekanismen i nedtystning på grund av dess hög specificitet, potent effekt, minimala biverkningar och användarvänlighet siRNA syntes28, 29. siRNAs är dubbelsträngat RNA-molekyler som sträcker sig från 19 till 25 nukleotider i längd som utlösare sekvens-specifika katalytisk mRNA knockdown. På grund av dess stora molekylvikt och polyanjonisk natur är passiv upptag av nakna siRNA i celler hindras28,29. Det går inte heller för nakna siRNA att injiceras i den systemiska cirkulationen på grund av snabb nedbrytning av plasma nukleaser31. Således skulle inkapsling av siRNA i nanocarrier stöd effektiv leverans och upptag av siRNA i målceller.

Exosomes är ett idealiskt system för siRNA inkapsling eftersom dess struktur består av en ihålig, vattenhaltigt kärna höljebärande av en fosfolipid lipidens. Exosomes inte bara har bra stabilitet i blodet men också har naturliga inriktning egenskaper att leverera funktionella RNA in celler32. Den studie som genomfördes av Alvarez-Erviti et al. framgångsrikt visat effektiv leverans av siRNA till hjärnan hos möss med konstruerad exosomes med praktiskt taget inga komplikationer31. Det är en hypotes om att exosome-baserad terapi är relativt säkrare än andra terapier som exosomes inte replikeras endogenously som celler och därför inte uppvisar metastaserande boenden15.

Olika metoder har rapporterats att framgångsrikt isolera exosomes från antingen cellkultur eller fysiologiska vätskor. Den mest populära metoden används ultracentrifugering till pellet exosomes från start material31,32,33. Denna metod kan vara ganska hårda på exosomes och oftast samtidig fällningar proteiner från provet. Att kombinera ultracentrifugering med en densitet-baserade separation såsom sackaros lutningar blir allt vanligare, att minska protein och icke-exosomal förorening i den isolera exosomes19,34. Storlek-utslagning kromatografi (SEC) tillåter separation av exosomes från andra typer av extracellulära blåsor (EV) av storlek och kan också resultera i minimal protein kontaminering men begränsas av liten mängd utgångsmaterial som kan bearbeta35, 36. Immunoaffinity datafångsten pärlor belagd med antikroppar som binder till exosomal ytproteiner såsom tetraspanins eller andra cell-specifik markör som tillåter viss avskiljning av exosomes i stället för EVs eller andra proteiner, samt isolera subpopulation av exosomes från hela prover, men igen begränsas av mängden utgångsmaterial och är kostsamma36,37. Polymerbaserade utfällning av exosomes brukade vara populära också, men eftersom det är en ganska rå nederbörd, det leder till en högre icke-exosomal vesikler och protein kontaminering38,39.

Elektroporation har rapporterats för dess ineffektivitet som en metod att ladda exosomes med siRNA på grund av protein sammanläggning15,28,31. Transfection tillvägagångssätt var visat sig ha bättre lastning effektivitet och protein stabilitet, men är inte önskvärt på grund av dess toxicitet och biverkningar av transfection agenter att förändra cellulära gen uttryck28. Således har elektroporation använts mer allmänt i siRNA laddar in exosomes eftersom det är en säkrare metod. En optimerad inkapslingsmetod måste dock fastställas för att leverera tillräckliga mängder av siRNA till målplatsen för en potent gen knockdown.

Här föreslår vi en exosome isolering protokoll använder densitet-baserade ultracentrifugering på bara en enda 25% (w/w) sackaros kudde beredd i deuteriumoxid, snarare än en sackaros täthetlutning. Detta är en kostnadseffektiv metod som kringgår mödosamma täthet lutning beredning och tillåter bearbetning av stora volymer av utgångsmaterial, men resulterar i intakt exosomes av hög avkastning och renhet lämpar sig för efterföljande lastning med siRNA. Fluorescerande Atto655-konjugerad ospecifika siRNA lästes in i mänskliga embryonala njure celler (HEK-293 celler) exosomes via elektroporation och levereras till mänskliga pankreas adenocarcinom (PANC-1) cancerceller in vitro-.

Protocol

1. cell kultur i en bioreaktor kolv

Figure 1
Figur 1: kultur av celler i bioreaktor kolv för produktion av exosome. (A) förenklad anatomi bioreaktor kolvens. (B) Start kultur i bioreaktor kolven. Se Tabell för material för sammansättningen av normala och exosome-utarmat medium (C) skörd luftkonditionerade medium (CM) och underhåll av kultur i bioreaktor kolven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Kultur HEK-293 celler i normal medium (se Tabell av material; 5% CO2, 37 ° C) och expandera dem till 4 x T75 kolvar (till 90% konfluenta).
  2. Våt membranet bioreaktor kolvens genom att lägga 50-100 mL normal medium i reservoaren medium bioreaktor kolvens.
  3. Samla alla HEK-293 celler från 4 x T75 och resuspendera dem i 15 mL exosome-utarmat medium (se Tabell för material).
  4. Häll HEK-293 cellsuspensionen i cell facket i bioreaktor kolven med en 20 mL spruta ansluten till en trubbig fyllning nål (se Tabell för material), med omsorg för att ta bort någon bubbla som kan ha bildats.
  5. Fyll medium reservoaren bioreaktor kolvens med normal medium upp till 500 mL och hålla kolven i inkubatorn (5% CO2, 37 ° C) för en vecka.

2. luftkonditionering Medium (CM) skörd från bioreaktor kolven

  1. Efter 1 vecka, kassera alla medium i reservoaren medium bioreaktor kolvens.
  2. Ta bort alla medium i cell facket (dvs. den CM) med en 20 mL spruta ansluten till en trubbig fyller kanyl.
  3. Tillsätt 50-100 mL normal medium till medium reservoaren.
  4. Tillsätt 15 mL exosome-utarmat medium till cell utrymmet genom att avlägsna den gamla och lägga till färska exosome-utarmat medium med en 20 mL spruta ansluten till en trubbig fyller kanyl.
  5. Fyll medium reservoaren bioreaktor kolvens med normal medium upp till 500 mL och hålla kolven i inkubatorn (5% CO2, 37 ° C) för en annan vecka.
    Obs: Kulturen kan pågå mer än ett år. För steg 2.2, CM från den första skörden kommer inte att användas för exosome isolering och kasseras. 2nd och efterföljande skörd hålls CM för exosome isolering.

3. Exosome isolering på en sackaros kudde

Figure 2
Figur 2: isolering och karakterisering av exosomes. (A) före röjningen skördade luftkonditionerade medium (CM) från döda celler och cellfragment. (B) isolera exosomes från CM på sackaros kudde. (C) tvätt steg ta bort sackaros och kontaminerande proteiner. (D) isolerade exosomes utsattes sedan för fysikalisk-kemiska, biokemiska och morfologisk karakterisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Pre avmarkera CM (från steg 2.2) av differentiell centrifugering och filtrering enligt följande.
    1. Centrifugera vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Överför supernatanten till en ny tub och kassera pelleten. Upprepa detta centrifugering gång återhämta supernatanten och kasta pelleten.
    2. Centrifugera supernatanten från steg 3.1.1 vid 2000 x g i 15 min och 4 ° C och sedan kasta pellet. Filtrera den återvunna supernatant en gång genom 0,22 µm filter.
  2. Under före röjning, förbereda 25% (w/w) sackaroslösning i deuteriumoxid genom exakt vägning ut 1,9 g (± 0,001 g) av sackaros i en universal tub, och sedan toppade med deuteriumoxid tills vikten når 7,6 g (± 0,001 g).
  3. Fylla upp en ultracentrifugen röret (se Tabell för material) med redan avmarkerad CM. se upp till 22,5 mL med 0,22 µm-filtrerad 22,5 mL PBS om den aktuella volymen är mindre än som.
  4. Plats ett glas pipett (se Tabell för material) i röret och, genom det, tillsätt 3 mL sackaroslösning så att lösningen bildar ett separat lager under CM.
  5. Noggrant plats det röret som innehåller lager CM/sackaroslösning i hink med en utfällbar rotor (se Tabell för material), och säkra skopan i rotorn.
  6. Placera rotorn i ultracentrifugen (se Tabell av material) och snurra på 100 000 x g för 1,5 h vid 4 ° C.
  7. Samla 2 mL av lagrets sackaros och lägga detta till en ultracentrifugen flaska (se Tabell för material) som innehåller 20 mL filtreras PBS för en tvätt steg.
  8. Placera rören i en fast vinkel rotor (se Tabell av material) och snurra på 100 000 x g för 1,5 h vid 4 ° C.
  9. Försiktigt bort supernatanten med pipett 10 mL serologiska och återsuspendera pelleten med 400 µL filtreras PBS. Hålla detta exosome bestånd vid 4 ° C eller -80 ° C för kortsiktig och långsiktig lagring respektive.

4. karakterisering av Exosome storlek och avkastning av nanopartiklar spårning analys (NTA)

  1. Gör 1:1, 000-1:50, 000 utspädningar av exosome beståndet i syfte att erhålla 20-80 partiklar i ramen visning av NTA volym på 1 mL (minsta 750 µL) instrument (se Tabell för material) display.
  2. Injicera det utspädda exosome lagret i NTA instrument provkammaren med en 1 mL spruta, och sätt in en termometer temperatursond i temperatur sondens mynning.
  3. Ställa in NTA program (se Tabell för material) för inspelning enligt följande: 3 standardmått, 30 s varje, manuell temperatur alternativet avmarkerad; och ange utspädningsfaktorn under fliken Avancerat .
  4. Ställa in kameran på 13 och kör skriptet capture på NTA programvara, injicera en färsk batch av provet och ange temperaturen på provkammaren när det visas efter varje läsning.
  5. Ange tröskelvärdet 4 för efterföljande analys delen och notera genomsnittlig modala storlek och partikel koncentration av exosome beståndet från mätningarna.

5. karakterisering av Exosome renhet av partikel: Protein baserat bestämning

  1. Mått proteinhalten i exosome beståndet av en bicinchoninic syra (BCA) protein assay kit (se Tabell för material) enligt följande.
    1. Förbereda den definierade standarder.
      1. Förbereda standarden den högsta koncentrationen (500 µg/mL) genom att lägga till 45 µL av BSA stamlösning (2 mg/mL – i assay kit) i en mikrocentrifug rör, och göra det upp till 180 µL med PBS.
      2. Fyll 8 mikrocentrifugrör med 90 µL av PBS.
      3. Gör seriespädningar (faktor: 0,5) genom att ta 90 µL från högsta BSA standard och lägga detta till de 1st mikrocentrifug rör med PBS (blanda väl), och sedan tar 90 µL från denna tube och lägga till det i 2nd mikrocentrifug röret.
      4. Upprepa detta tills 7 mikrocentrifug röret. 8 röret blir bara PBS (dvs. tomrummet: 0 µg/mL).
    2. Bereda exosome prover genom att göra 1:2 utspädning av prover med PBS i en total volym på 90 µL (45 µL prov, 45 µL av PBS).
    3. Förbereda den BCA arbetar reagens mix.
      1. Beräkna den totala volymen av BCA arbetar reagens mix behövs (50 µL per brunn, i dubbletter, inklusive standarder).
      2. Blanda de enskilda BCA reagenserna enligt följande förhållandet: 25 delar reagens s: 24 delar reagens B: 1 del reagens C.
    4. Utföra test och analys.
      1. Tillsätt 40 µL av varje standard och exosome prov som förberetts enligt ovan i en brunn i en plattan med 96 brunnar (dubbletter för varje standard och prov).
        Obs: Eftersom detta är en kolorimetrisk test, korrekt pipettering teknik är avgörande för att uppnå korrekt resultat. Ändra pipetter efter att lägga till varje standard/prov replikat i var och en av brunnarna
      2. Tillsätt 50 µL protein analysens arbetar reagens mix i varje brunn och inkubera plattan vid 37 ° C i 30 min.
        Obs: För att minimera avvikelser mellan replikat, tillsätt protein assay arbetande reagenset i 1st replikera ett standard/urval, följt av 2nd replikera av samma prov/standard, innan den läggs till 1st replikera en annan prov/standard.
      3. Mät absorbansen vid 562 nm på plattan läsaren (se Tabell för material).
      4. Rita en standardkurva från absorptionsvärdena av standarder och räkna ut koncentrationen av protein i varje prov med hjälp av ekvationen för kurvan.
  2. Beräkna förhållandet partikel: protein genom att dividera exosome avkastningen erhålls tidigare med protein koncentrationen av exosome beståndet mätt över.

6. karakterisering av Exosomal markör uttryck av flödescytometri

  1. Inkubera 40 µL av exosomes (≥1x1011 partiklar/mL) med 10 µL av aldehyd/sulfat latex pärlor (outspädd från lager) i 15 minuter i rumstemperatur (RT).
  2. Tillsätt 5 µL 100 µM BSA lösning (se Tabell för material) till exosome-pärla blandningen att uppnå en 10 mM slutlig koncentration och inkubera i 15 min på RT.
  3. Tillsätt 1 mL PBS och inkubera i 75 min på RT i en mikrocentrifug rör med mild agitation på en gungande skakapparat (~ 150 rpm).
  4. Centrifugera suspensionen vid 580 x g i 5 min på RT och kasta bort supernatanten.
  5. Återsuspendera pelleten med 1 mL 100 mM glycin (se Tabell av material) och inkubera i 30 min på RT.
  6. Centrifugera suspensionen för 5 min vid 580 x g. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten med 1 mL 3% FBS/PBS (se Tabell för material).
  7. Upprepa detta tvätt och återsuspendera pelleten i 350 µL av 3% FBS/PBS.
  8. Dela upp suspensionen i 7 rör, varje innehållande 50 µL av suspensionen och inkubera dem med fluorophore-konjugerad anti-CD81, anti-CD9 och anti-CD63 antikroppar och deras motsvarande isotyp-kontroller (1:10 utspädning) respektive 45 minuter vid 4 ° C. Håll 1 av rören som en ofärgade kontroll men genomgå samma behandling.
  9. Tillsätt 1 mL 3% FBS/PBS till varje tube, Centrifugera i 5 min vid 580 x g och kasta bort supernatanten.
  10. Återsuspendera pelleten med 200-400 µL av 3% FBS/PBS och analysera provet på flödescytometer (se Tabell för material) under lämpliga kanaler.

7. karakterisering av Exosome morfologi av transmissionselektronmikroskopi (TEM)

  1. Fixa exosome aqueous dispersioner vid korrekt koncentrationer som 1010 p/mL i fastställande lösning (se Tabell för material) för 15 min.
  2. Plats proverna på 300 mesh kol belagd koppar nät och låt luften torr.
  3. Negativt fläcken av prov med 0,22 µm-filtrerad aqueous uranyl acetat (se Tabell för material) för 4 min följt av två 50% metanol/H2O tvätta (se Tabell för material).
  4. Med luftbläster i provet.
  5. Iaktta proverna under TEM (se Tabell för material). Ange den accelererande spänningen på 80 kV och spot storlek på 2. Använda objektiva bländare med alla prover.

8. siRNA inkapsling i Exosomes av elektroporation

  1. Pre chill den elektroporation kyvetten (se Tabell för material) på is för 30 min innan elektroporation.
  2. Blanda 7.0 µg exosomes (32 µL från 7 x 1012 p/mL lager i PBS) med 0,33 µg av siRNA (12 µL lagervara 2 µM i RNase-fritt vatten) i mikrocentrifug röret. Göra upp volymen till 150 µL med citronsyra buffert (se Tabell för material). Exosome till siRNA molar förhållandet är 1:60 i detta fall.
  3. Överför blandningen till elektroporation kyvetten. Mössa i kyvetten och placera den i kyvetten innehavaren av electroporator (se Tabell för material). Rotera roterande hjulet 180° medurs.
    Obs: Hjulet måste vara helt avstängd till låst läge, för den kyvetten kontakta elektroderna.
  4. Välj önskad elektroporation program (t.ex. X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) och börja elektroporation genom att trycka på knappen Start .
    Obs: En framgångsrik puls indikeras av visar ”OK” på displayen.
  5. En gång electroporated, ta bort kyvetten efter att vrida tillbaka ratten 180° moturs. Dra tillbaka provet från kyvetten med plast pipetten för vidare bearbetning.

9. avlägsnande av gratis siRNA använda storlek utslagning kromatografi (SEK)

  1. Temperera kolumnen SEC (2,9 cm [H] x 1.3 cm [W]; Se Tabell för material) av passerar 3,5 mL filtrerade PBS två gånger.
  2. Lös 150 μl av electroporated provet i 350 μL av filtrerade PBS och överföra detta till kolumnen SEC att utföra gratis siRNA avlägsnande.
  3. Samla in de första 500 μL fraktion som elueras från kolonnen (F0).
  4. Tillsätt 500 μl filtrerade PBS till kolumnen och samla den nästa 500 μL fraktionen (F1).
  5. Upprepa ovanstående steg tills sammanlagt 10 x 500 μL fraktioner (upp till F9) samlas. F1 och F2 bör innehålla den siRNA-inkapslat exosomes.
  6. Tvätta kolonnen med filtrerade PBS (två gånger, minst) ta bort alla prov rester.

10. in Vitro upptag av siRNA-Loaded Exosomes i PANC-1 celler

  1. Utsäde PANC-1 celler i 24-väl platt-botten pläterar (se Tabell för material) med en täthet av 50.000 celler per väl 24 h före upptaget studera och inkubera cellerna i inkubatorn (5% CO2, 37 ° C).
  2. Electroporate HEK-293 exosomes (7,0 μg) med Atto655-siRNA (0,33 μg) per steg 8.
  3. Rena electroporated exosome enligt steg 9 och återsuspendera i 100 μL av PBS.
  4. Tillsätt 50 μl av den electroporated exosomes till PANC-1 cell och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 4 h.
  5. Samla celler efter inkubation.
  6. Tvätta cellerna med 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och återsuspendera i 200 μL av PBS i polystyren runda-nedre röret (se Tabell för material).
  7. Analysera celler genom flödescytometer (se Tabell för material) med 10 000 händelser förvärvade per prov.
    Obs: Un-electroporated exosome-siRNA blandning prover och obehandlad celler med filtrerade PBS användes som kontroller.

Representative Results

Fysikalisk-kemisk karakterisering av exosomes isolerade från HEK-293 celler (HEK-293 Exo) sammanfattas i tabell 1. Storleken mäts med nanopartiklar spårning analysinstrument (NTA) var 107,0 ± 8,2 nm. Exosome avkastning från HEK-293 celler, också analyseras med hjälp av NTA instrumentet, var 6.99 ± 0,22 x 1012 p/mL från ~ 24 mL CM (erhålls från 2 omgångar med skörd). Renhet av den HEK-293 Exo bedömas genom att beräkna förhållandet partikel-till-protein (hästar) var 8,3 ± 1,7 × 1010 p/µg.

Storleksfördelning av isolerade HEK-293 Exo visas i figur 3A. Morfologisk analys använder transmissionselektronmikroskopi (TEM) visade de HEK-293 Exo var sfäriska strukturer något över 100 nm storlek (figur 3B). Detta resultat instämm med det från NTA mätning (figur 3A). Den isolerade HEK-293-Exo var positiva för CD81, CD9 och CD63, som är kanoniska markörer används för att identifiera blåsor som exosomes (figur 3 c).

För rening av exosomes som använder storlek utslagning kromatografi (figur 4), beräknades andel återvinning av exosomes genom att dividera den totala exosome partikeln numrerar återfanns i 10 fraktioner samlas in (F0-F9) med den ursprungliga exosome partikeln numrerar används, medan andel återvinning av siRNA beräknades genom att dividera total fluorescensintensiteten erhålls från F3, F4 och F5 med totala fluorescensintensiteten erhållits från alla 10 fraktioner samlas in. Återvinning av exosome och siRNA beräknades efter rening som 75,0% och 80,4%, respektive. Inkapsling effektivitet siRNA i exosomes var ~ 10-20%, beräknat med siRNA standardkurvan etablerade (figur 4 c).

Kvalitativ analys av in vitro- upptag av exosomes laddad med den fluorescerande Atto655-siRNA av flödescytometri visade att PANC-1 celler behandlas med siRNA-inkapslat exosomes in den största förskjutningen i fluorescens signal (figur 5A) . PANC-1 celler behandlas med siRNA-inkapslat exosomes spelade in en högre andel av befolkningen positivt för Atto655 signalen (39,4%) jämfört med att behandlas med lossas exosomes och siRNA blandning (0,56%), vilket bekräftade observationen ovan ( Figur 5B). Graden av cellernas upptag av siRNA (uttryckt som vik skillnaden i genomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) värden för obehandlade celler) observerades också vara betydligt högre i PANC-1 celler behandlas med siRNA-inkapslat exosomes (MFI-faldigt skillnaden = 5.1) jämfört med att behandlas med exosome-siRNA blandningen (MFI vik skillnaden = 1.1) (figur 5 c). Observationerna visade att de siRNA-inkapslat exosomes var internaliseras av PANC-1 celler och att de faktiskt levererade siRNA intracellulärt.

Figure 3
Figur 3: biokemiska och morfologi analys av HEK-293 exosomes. (A) storlek distribution av HEK-293 exosomes använder nanopartiklar spårning analys (NTA). Kurvan visar en överlagrade histogrammet från 3 olika fångar 30 s intervall med röda områden som betecknar standardavvikelsen mellan mätningar (n = 3). (B) överföring elektronmikroskopi (TEM) bilder av naivt HEK-293 exosomes. Skalstapeln: 100 nm. (C) identifiering av exosomal markörer CD81, CD9 och CD63 med flödescytometri på HEK-293 exosomes. Exosomes var kopplat till aldehyd/sulfat latex pärlor innan upptäckt. Exosome-pärlor komplex var därefter färgas med fluorophore-konjugerad anti-CD81, anti-CD9 och anti-CD63 antikroppar. Graden av uttryck av markörer uttrycks som vik skillnaden i median fluorescens intensitet (MFI) värden från som kontrollen (exosome-pärlor komplex färgas med den motsvarande isotypen). Värdena uttrycks som genomsnitt ± SD, där n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Exosome rening post-elektroporation. (A) eluering profiler (F0-F9) av Atto655-siRNA och electroporated exosomes med storlek uteslutning chormatography. (B), NTA analys av både Atto655-siRNA och exosome från F0 till F9 använder storlek uteslutning chormatography. (C), kalibrering kurvan för Atto655 märkta siRNA. Fluorescens stödnivåer erhölls genom Plattläsare på Ex / Em: 640-10/680 nm. Få 2800. Värdena uttrycks som genomsnitt ± SD (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: cellernas upptag av siRNA-inkapslat exosomes i PANC-1 celler på 4 h. (A) histogram jämföra cellernas upptag av lossas exosomes + siRNA blandning och siRNA-inkapslat exosomes. (B) jämförelse av upptaget av lossas exosomes + siRNA blandningen på 4 h av falsk handling. (C), vik skillnaden i medelvärde fluorescens (MFI) intensitetsvärdena prover testas jämföras med obehandlade celler. Värdena uttrycks som genomsnitt ± SD, där n = 3. P < 0,001. NS: inte betydande. Envägs ANOVA användes för statistisk analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Exosome Storlek1,2
(nm)
Avkastning1,2,3
(p/mL)
[Protein] 2,4
(µg/mL)
Partikel-till-protein (hästar) baserat på5
(p/µg)
HEK-293 107,0 ± 8,2 6.99 ± 0,22 x 1012 84,3 ± 9,8 8,3 ± 1,7 x 1010 
1 uppmätt med nanopartiklar spårning analys (NTA instrument)
2 värden uttrycks som genomsnitt ± SD, där n = 3
3 avkastning erhölls genom cell-villkorade medium poolats från 2 omgångar av skörd från bioreaktor kolvar (~ 24 mL)
4 uppmätt med ett protein assay kit
5 -värde som erhålls med formel: Trucker baserat = avkastning / [Protein]

Tabell 1: Fysikalisk-kemisk karakterisering av exosomes.

Discussion

Att få en anständig exosome avkastning från odlade celler, är som är nog för flera omgångar av in vitro eller in-vivo studier, fortfarande en utmaning. Enligt tillverkaren var bioreaktor kolvar avsedda för produktion av antikroppar och proteiner med hög avkastning från kultur av olika förevigade cellinjer. Detta gör att cellerna att kontinuerligt berika odlingssubstratet med önskad produkt, vilket resulterar i en koncentrerad luftkonditionerade medium (CM) i cell-facket. Teoretiskt sett samma koncept skulle vara fördelaktigt i exosome produktion från olika cellinjer och faktiskt odla dessa celler i bioreaktor kolvar visades att avsevärt öka den exosome avkastning40. Den medelstora vattenmagasin kontinuerligt levererar näringsämnen till och tar bort avfall från cell kupén genom ett 10 kDa halvgenomträngligt membran, så att långvarig kultur utan att kräva en stor volym av medium kommer i kontakt med celler eller regelbunden kolvar som förändras, vilket i slutändan kan spara den totala kostnaden och labor hög skala exosome produktion40. Det visades också att morfologi samt fenotyp och immunmodulerande funktioner exosomes isolerade celler långsiktiga bioreaktor kolvar kulturer är liknande den från celler odlade i regelbundna 75 cm2 kolvar40. Kultur av andra förevigat cellinjer som exosome källor i bioreaktor kolven skulle därför bidra till att öka deras exosome avkastning samtidigt bibehålla sin integritet och funktion. Denna form av kultur är emellertid inte tillämpliga på primära celler med begränsad division cykler, och de som inte kan vara odlade i hög densitet.

Eftersom skörden i GH görs varje vecka, och celler i kultur var aldrig överförda, kan det antas att cellerna i bioreaktor kolven inte växer på en enskiktslager som regelbundna cellkulturen. De är mest sannolikt att bilda kluster med nekrotisk centra, eller helt enkelt loss från ytan och dör när cellerna är alltför konfluenta för en enskiktslager. Okulärbesiktning av cell facket i bioreaktor kolven går inte att bekräfta detta antagande, men återspeglas av det stora antalet döda celler som erhållits under CM skörd. Regelbunden borttagning av dåligt vidhäftande och icke-viabla celler från bioreaktor kolven kan förhindra uppbyggnaden av material på halvgenomträngligt membran som kan inverka negativt på utbytet av gas, näringsämnen och avfall mellan cell facket och mediet reservoar, vilket möjliggör långvarig kultur i bioreaktor kolvar för > 6 månader40. I detta sammanhang denna icke-regelbundenhet av celltillväxt i bioreaktor kolvar är idealisk som vi spekulerar att det härmar skick faktiskt tumör tillväxt i vivo närmare än konventionella enskiktslager cellkulturen, och förhoppningen är att exosomes producerad av cancer celler i bioreaktor kolven skulle likna mer som utsöndras av tumörer i vivo. Detta skulle vara särskilt fördelaktigt i studier som undersöker rollen av tumör-derived exosomes i förloppet av tumör patologin. Tumör-derived exosomes har rapporterats till egensäkra och företrädesvis hem till deras vävnad av ursprung32, därför att exosomes som produceras i ett system som härma deras i vivo produktion vore också önskvärt i studier utforska exosomes passiv inriktning förmåga som drog nanocarriers.

Trucker förhållandet rapporterades som en parameter att bedöma renheten av isolerade exosomes från att förorena proteiner från odlingssubstratet fysiologiska vätskor där exosomes hade sitt ursprung från41. Trucker förhållandet mellan 8,3 ± 1,7 × 1010 p/µg erhölls i denna studie faller inom intervallet hög renhet som föreslås i studien. Detta förhållande belyser faran med att använda proteinkoncentration för att uttrycka den avkastning eller dos av exosomes isolerade eller används i efterföljande studier respektive, eftersom detta inte återspeglar den verkliga mängden exosomes tillgängliga i provet med tanke på problemet med protein kontaminering under isolering. NTA via instrument såsom NanoSight, som mäter koncentrationen av exosomes i form av partikeln numrerar, är ett mer förnuftigt och korrekt sätt att kvantifiera exosomes.

Mycket noggrann vägning under utarbetandet av de 25% sackaroslösning i deuteriumoxid är viktigt eftersom denna metod är en densitet-baserade isolering. Exosomes har ett ganska smalt utbud av flotation densitet i sackaroslösning så korrekt beredning av sackaros dynan kommer att minska förorening av icke-exosomal blåsor såsom apoptotiska kroppar eller Golgi-derived blåsor under isolering42. Det rekommenderas inte att hålla överblivna sackaroslösning och använder det även efter en dag för att undvika risk för faktorer som kan förändra dess täthet såsom förlust eller tillsats av vatten i lösningen genom avdunstning eller kondens luft i röret. Användning av en swing-out rotor är också viktigt under centrifugering på sackaros dynan att låta även migration av exosomes från CM sackaroslösning.

Återkalla sackaros lösning efter centrifugering är också en delikat steg, och det handlar om att hitta en kompromiss mellan att maximera mängden exosomes återvunna och inte alltför mycket att protein från odlingssubstratet införs i exosome urvalet dras tillbaka . Gränssnittet mellan sackaros lösningen och det skick mediet är där proteiner från odlingssubstratet skulle samla efter centrifugering, och kan oftast ses som en mörk brun ring som sitter på gränssnittet. I våra händer är uttag 2 mL av sackaros dynan från den inledande 3 mL som tillsätts den optimala volym som håller med den kompromiss som nämns ovan. De volymer som beskrivs i detta protokoll är för specifika rotorerna används; Därför är det klokt att optimera volymen av sackaros kan dras tillbaka när skala upp eller ner volymerna för typer av rotorer tillgängliga i olika anläggningar. Det är också viktigt att undvika området rätt i mitten av botten av röret när återkalla sackaros, eftersom det är där partiklar av högre densitet än sackaros kommer sediment och kan oftast ses som en benvit pellet.

Tvätt steget med en relativt stor mängd PBS hjälper till att ytterligare minska graden av protein kontaminering under exosome isolering41. Detta steg är också viktigt i att ta bort överflödig sackaros från exosomes för att undvika osmotisk skador på exosomes själva eller biomolekyler inom exosomal lumen, samt minska risken för bakterie eller svamp tillväxt i exosome materiel. Beredning av sackaros i deuteriumoxid snarare än vatten hjälper till att reducera mängden sackaros som behövs för att uppnå exosome flotation densiteten för isolering, därmed minska risken för både osmotisk skador och mikrobiell kontamination. Efter den första centrifugeringen på sackaros dynan, den exosome som innehåller sackaros lager återkallat och lagt till PBS kan lagras vid 4 ° C och bearbetas följande dag om inför tidsbegränsningar.

Till bäst av vår kunskap är exosome/siRNA molar förhållandet en viktig faktor vid fastställandet av elektroporation effektivitet. I detta protokoll använde vi 1:60 som exosome till siRNA molar förhållandet. Inkapsling förmågan hos olika typer av exosomes är olika, rekommenderar vi starkt detta optimeras på fall-till-fall basis. Inkapsling effektivitet föreslås häri kan dock alltid vara en parameter för att välja de optimala elektroporation villkor.

Dessutom är aggregering av siRNA tros vara en av de vanligaste problemet i elektroporation. Det är bevisat att elektroporation kan framkalla stark aggregering av siRNA, vilket gör det ännu svårare att ange exosomes. siRNA aggregeringar tolkas ofta felaktigt som inkapsling av siRNA i exosome därför ordentliga kontroller användes i denna studie som bildandet av siRNA aggregat är oundvikligt under elektroporation28. Procentandel inkapsling effektiviteten i våra reningsmetod beräknades med hjälp av normaliserade värden för att minimera påverkan från andra källor såsom bakgrund buller, exosome och siRNA aggregeringar som skulle påverka datatillförlitlighet. Baserat på våra resultat, var det försumbar siRNA aggregeringar observerades i den kontroll provet dvs med electroporated och un-electroporated siRNA.

Detta protokoll har framgångsrikt visat inkapsling av siRNA in exosomes och deras efterföljande intracellulära leverans av siRNA till cancer celler in vitro. Olika typer av exosomes från olika cellinjer kan därför vara isolerade och kännetecknas med föreslagna protokollet och därefter laddad med olika terapeutiska siRNA för olika typer av onkogena mål över uttryckt i olika cancerformer. En intressant tillämpning skulle vara att utforska siRNA delivery och upptag effektivitet använder olika permutationer av exosome källa-mål cell par in vitro. Detta kan sedan översättas till djurmodeller att bedöma effektiviteten i både leverans och terapeutiska effektivitet siRNA-inkapslat exosomes invivo.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgements

F. N. Faruqu finansieras av Malaysias regering byrån Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu är mottagare av den Marie Sklodowska-Curie stipendier (Horisont 2020) (H2020-behöriga myndigheters-om-2016). K. T. Al-Jamal erkänner finansiering från BBSRC (BB/J008656/1) och Wellcome Trust (WT103913). Författarna vill även tacka Dr Paul Lavender och Dr David Fear (avdelningen för Lungmedicin och allergi, King's College London) för den som tillhandahåller electroporator.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zitvogel, L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes. Nature Medicine. 4, (5), 594-600 (1998).
  2. Raffai, R., Li, K., Wong, D., Hong, J. Therapeutic control of systemic inflammation & atherosclerosis with ApoE-polarized macrophage exosomes. Atherosclerosis. e5-e6 (2017).
  3. Masamune, A., et al. Exosomes derived from pancreatic cancer cells induce activation and profibrogenic activities in pancreatic stellate cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495, (1), 71-77 (2018).
  4. Gangoda, L., et al. Proteomic Profiling of Exosomes Secreted by Breast Cancer Cells with Varying Metastatic Potential. Proteomics. 17, (23-24), 1600370 (2017).
  5. Wozniak, M., Peczek, L., Czernek, L., Düchler, M. Analysis of the miRNA Profiles of Melanoma Exosomes Derived Under Normoxic and Hypoxic Culture Conditions. Anticancer Research. 37, (12), 6779-6789 (2017).
  6. Salimu, J., et al. Dominant immunosuppression of dendritic cell function by prostate-cancer-derived exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 6, (1), 1368823 (2017).
  7. Lankford, K. L., et al. Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE. 13, (1), e0190358 (2018).
  8. Khalyfa, A., et al. Plasma Exosomes and Improvements in Endothelial Function by Angiotensin 2 Type 1 Receptor or Cyclooxygenase 2 Blockade following Intermittent Hypoxia. Frontiers in Neurology. 8, 709 (2017).
  9. Manek, R., et al. Protein Biomarkers and Neuroproteomics Characterization of Microvesicles/Exosomes from Human Cerebrospinal Fluid Following Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55, (7), 6112-6128 (2018).
  10. Pathare, G., et al. Changes in V-ATPase subunits of human urinary exosomes reflect the renal response to acute acid/alkali loading and the defects in distal renal tubular acidosis. Kidney International. 93, (4), 871-880 (2018).
  11. Liao, Y., Du, X., Li, J., Lönnerdal, B. Human milk exosomes and their microRNAs survive digestion in vitro and are taken up by human intestinal cells. Molecular nutrition & food research. 61, (11), 1700082 (2017).
  12. Kim, J., et al. Cyclooxygenase-2 expression is induced by celecoxib treatment in lung cancer cells and is transferred to neighbor cells via exosomes. International Journal of Oncology. 52, (2), 613-620 (2017).
  13. Sterzenbach, U., et al. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. Molecular Therapy. 25, (6), 1269-1278 (2018).
  14. Conigliaro, A., Fontana, S., Raimondo, S., Alessandro, R. Exosomes: Nanocarriers of Biological Messages. In Exosomes in Cardiovascular Diseases. 998, 23-43 (2017).
  15. El Andaloussi, S., Lakhal, S., Mäger, I., Wood, M. J. A. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, (3), 391-397 (2013).
  16. Simhadri, V. R., et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE. 3, (10), e3377 (2008).
  17. Santos, J. C., et al. Exosome-mediated breast cancer chemoresistance via miR-155 transfer. Scientific Reports. 8, (1), 829-829 (2018).
  18. Hadla, M., et al. Exosomes increase the therapeutic index of doxorubicin in breast and ovarian cancer mouse models. Nanomedicine. 11, (18), 2431-2441 (2016).
  19. Smyth, T., et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. Journal of Controlled Release. 199, 145-155 (2015).
  20. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35, (7), 2383-2390 (2014).
  21. Kim, M. S., et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 14, (1), 195-204 (2018).
  22. Bellavia, D., et al. Interleukin 3- receptor targeted exosomes inhibit in vitro and in vivo Chronic Myelogenous Leukemia cell growth. Theranostics. 7, (5), 1333-1345 (2017).
  23. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18, (9), 1606-1614 (2010).
  24. Tian, T., et al. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials. 150, 137-149 (2017).
  25. Zhuang, X., et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular Therapy. 19, (10), 1769-1779 (2011).
  26. Iessi, E., et al. Acridine Orange/exosomes increase the delivery and the effectiveness of Acridine Orange in human melanoma cells: A new prototype for theranostics of tumors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32, (1), 648-657 (2017).
  27. Aqil, F., et al. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer. Food & Function. 8, (11), 4100-4107 (2017).
  28. Shtam, T. A., et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Communication and Signaling. 11, (1), 1-10 (2013).
  29. Wahlgren, J., et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Research. 40, (17), e130-e130 (2012).
  30. Yang, J., Zhang, X., Chen, X., Wang, L., Yang, G. Exosome Mediated Delivery of miR-124 Promotes Neurogenesis after Ischemia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 7, 278-287 (2017).
  31. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. 29, (4), 341-345 (2011).
  32. Wiklander, O. P. B., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-13 (2015).
  33. Varga, Z., et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 31, (5), 168-173 (2016).
  34. Smyth, T. J., Redzic, J. S., Graner, M. W., Anchordoquy, T. J. Examination of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1838, (11), 2954-2965 (2014).
  35. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23430 (2014).
  36. Sharma, P., et al. Immunoaffinity-based isolation of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients with melanoma. Journal of Extracellular Vesicles. 7, (1), 1435138 (2018).
  37. Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 247, (1), 163-174 (2001).
  38. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling. In Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. 235-246 (2011).
  39. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82, (9), 1024-1032 (2012).
  40. Mitchell, J. P., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System. Journal of Immunological Methods. 335, (1-2), 98-105 (2008).
  41. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles? Journal of Extracellular Vesicles. 2, (1), 1-6 (2013).
  42. Chiou, N. -T., Ansel, K. M. Improved exosome isolation by sucrose gradient fractionation of ultracentrifuged crude exosome pellets. Nature Protocol Exchange. (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics