SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

Bir eksozom ilaç teslim taşıyıcıları yeni nesil olduğunu. Bir eksozom yalıtım protokolü ile yüksek verim ve saflık siRNA teslimat için kurduk. Biz de fluorescently etiketli non-spesifik siRNA exosomes kapsüllenir ve siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri hücresel alımını araştırıldı.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücre dışı veziküller, belirli exosomes, son zamanlarda onların biyolojik kökenli, bereket ve hücreler arası çeşitli biomolecules teslimini içsel yeteneği nedeniyle teslim vektörel çizimler roman uyuşturucu olarak ilgi kazanmıştır. Bu eser yüksek verimli ve exosomes siRNA teslimat için yüksek saflıkta elde etmek için bir yalıtım protokolü oluşturur. İnsan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-293 hücreleri) biyoreaktör şişeler içinde kültürlü ve kültür süpernatant (Bu andan klimalı ortam olarak da adlandırılır) HEK-293 exosomes zenginleştirme için izin vermek için haftalık olarak hasat edilir. Klimalı Orta (CM) ölü hücreleri ve hücresel enkaz önceden tarafından fark Santrifüjü temizlenir ve ultrasantrifüj exosomes toplamak için bir yıkama adım gelir bir sükroz yastık üzerine tabi tutulur. İzole HEK-293 exosomes verim, Morfoloji ve exosomal işaret ifade için nanopartikül izleme analizi, protein miktar, elektron mikroskobu ve akış sitometresi, sırasıyla karakterizedir. Fluorescently etiketli Atto655 ile küçük müdahale RNA (siRNA), exosomes Elektroporasyon tarafından yüklenir ve aşırı siRNA jel filtrasyon tarafından kaldırılır. 37 ° C'de 24 saat kuluçka sonra PANC-1 kanser hücrelerinin hücre Anlamazdın akış sitometresi tarafından onaylanır. HEK-293 exosomes 107.0 ± 8.2 nm çapında vardır. Ya verim ve parçacık protein oranı (P:P) oranı are 6.99 ± 0,22 × 1012 parçacık/mL ve 8.3 ± 1,7 × 1010 parçacık/µg, anılan sıraya göre. Exosomes siRNA kapsülleme verimliliği ~ % 10-20. Hücreleri yüzde kırkı, 24 h Atto655 için olumlu sinyaller sonrası kuluçka göster. Sonuç olarak, ya yalıtım ultrasantrifüj sükroz yastık üzerine tarafından iyi verim ve saflık bir arada sunuyor. siRNA Elektroporasyon tarafından exosomes başarıyla yüklenmiş olabilir ve daha sonra kanser hücrelerinin teslim tüp bebek. Bu iletişim kuralı siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri için verimli bir şekilde teslim geliştirmek için standart bir yordam sunar.

Introduction

Exosomes bir alt türü hücre dışı veziküller (EV) çapında bağışıklık hücreleri1,2gibi çeşitli hücre tiplerinin tarafından salgılanan, 50-200 nm arasında değişen, kanser hücreleri3,4,5, 6 ve kök hücreleri7. Exosomes ayrıca çeşitli fizyolojik sıvıları8,9,10,11' in bulunması için gösterilmiştir. Exosomes doğal yeteneğini çeşitli biomolecules (Örneğin, RNA ve proteinler)12,13,14 taşımak ve bu biomolecules etkili teslim alıcı hücreye 15 , 16 , 17 nano ölçekli ilaç teslim vektör olarak potansiyellerini için ilgi çekici. Anti-kanser ve anti-inflamatuar ilaçlar exosomes başarıyla yüklenebilmesi için gösterdi ve hedef hücreleri18,19,20, teslim hizmet çeşitli küçük moleküller 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. ilginçtir, nükleik asitler siRNA28,29 ve mikroRNA30 gibi Ayrıca exosomes üzerinden Elektroporasyon başarıyla yüklendiğinde ve hedef hücrelere teslim.

Son zamanlarda, RNA müdahale (RNAi) yolu ile küçük müdahale RNA (siRNA) yüksek özgüllük, güçlü etkisi, en az yan etkileri ve siRNA sentez28kolaylığı nedeniyle gen suskunluğu tercih edilen mekanizması olarak daha fazla ilgi kazanmıştır, 29. Çift Çift iplikçikli RNA molekülleri 19 25 nükleotid uzunluğunda bu Tetikleyicileri fingerprinting katalitik mRNA nakavt arasında değişen vardır. Onun büyük molekül ağırlığı ve polyanionic doğa, hücre içine çıplak siRNA pasif alımını engel28,29gelir. Ayrıca plazma nükleaz31tarafından sistemik dolaşım hızlı yıkımı nedeniyle içine enjekte edilir çıplak siRNA mümkün değildir. Böylece, bir nanocarrier içinde siRNA encapsulation etkili teslim ve siRNA alımını hedef hücrelere yardım.

Fosfolipid bilayer tarafından zarflı bir içi boş, sulu çekirdek yapısı oluşan siRNA Kapsülleme için ideal bir sistemdir Exosomes şunlardır. Exosomes sadece iyi istikrar kan içinde var ama aynı zamanda işlevsel RNA hücre32sunmak için doğal hedefleme özellikleri vardır. Alvarez-Erviti ve ark. tarafından başarıyla yürütülen çalışma kullanarak farelerin beyinlerinin etkili teslim edilmesi siRNA, hemen hemen hiçbir komplikasyon31' le exosomes mühendislik gösterdi. Ya tabanlı terapisi hücreleri ve bu nedenle metastatik özellikleri15sergi değil exosomes endogenously çoğaltılmaz gibi diğer tedaviler nispeten daha güvenli olan.

Başarılı bir şekilde exosomes hücre kültürü veya fizyolojik sıvıları izole etmek için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. En popüler yöntem ultrasantrifüj başlangıç malzeme31,32,33üzerinden exosomes cips için kullanır. Bu yöntem oldukça exosomes ve genellikle eş precipitates proteinler örnekten sert olabilir. Sükroz gradyan gibi Yoğunluk tabanlı ayırmalı ultrasantrifüj birleştirerek protein ve sigara exosomal kirlenme izole exosomes19,34azaltmak için daha yaygın hale geliyor. Boyut-dışlama Kromatografi (sn) boyutuna göre exosomes ayırma ekstraselüler veziküller (EV) diğer tür verir ve de en az protein kontaminasyonu neden olabilir ama35işleyebilir malzeme başlayan küçük miktarda sınırlıdır, 36. Exosomal tetraspanins veya EVs yerine exosomes özel yakalama sağlar diğer hücre özgü marker gibi yüzey proteinleri veya diğer proteinler bağlamak antikorlar ile kaplanmış gibi alt nüfusu yalıtma boncuk Immunoaffinity yakalamanın kullandığı exosomes gelen tüm örnekleri, ama tekrar malzeme başlayan miktarla sınırlı ve pahalı36,37. Polimer esaslı yağış exosomes, eskiden çok popüler olduğu, ama bu oldukça kaba bir yağış olduğundan, bir daha yüksek exosomal sigara vezikül ve protein kontaminasyonu38,39için yol açar.

Elektroporasyon exosomes siRNA nedeniyle protein toplama15,28,31ile yüklemek için bir yöntem olarak onun verimsizlik için bildirilmiştir. Transfection tabanlı yaklaşımlar daha iyi verim ve protein istikrar yükleme için gösterdi ama toksisite ve hücresel gen ifade28değiştiren içinde transfection ajanların yan etkileri nedeniyle istenmeyen. Böylece, Elektroporasyon daha güvenli bir yöntem olduğu gibi exosomes siRNA yüklenirken daha yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bir en iyi duruma getirilmiş sarma yöntemi hedef site için güçlü gen köşenize siRNA yeterli miktarda sunmak amacıyla kurulan gerekir.

Burada, yoğunluk tabanlı ultrasantrifüj döteryum oksit yerine sukroz yoğunluğu degrade hazır sadece bir tek %25 (w/w) sükroz yastık üzerine bir eksozom yalıtım iletişim kuralı'nı öneriyorum. Bu zahmetli yoğunluk gradient hazırlık kaçınmanızı sağlar ve malzeme başlayan geniş hacimli işleme izin verir, yine de yüksek verim ve saflık siRNA ile sonraki yükleme için uygun olduğu gibi exosomes sonuçlanan düşük maliyetli bir yöntemdir. Floresan Atto655 Birleşik non-spesifik siRNA insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-293 hücreleri) elde edilen exosomes üzerinden Elektroporasyon yüklenen ve insan pankreas adenokarsinom (PANC-1) kanser hücrelerinin teslim tüp bebek.

Protocol

1. hücre kültüründe bir biyoreaktör şişesi

Figure 1
Resim 1: bir biyoreaktör şişesi eksozom üretim için hücre kültür. (A)Basitleştirilmiş biyoreaktör şişeye anatomisi. (B) başlangıç biyoreaktör şişeye kültür. Normal ve ya tükenmiş Orta (C) hasat şartına Orta (CM) bileşimi ve biyoreaktör şişeye kültür için Tablo malzemeleri görmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Kültür HEK-293 hücreleri normal ortamda (bakınız Tablo malzemeler; %5 CO2, 37 ° C) ve onları 4 x T75 şişeler (kadar % 90 birleşmesi) genişletin.
  2. Biyoreaktör şişeye membran biyoreaktör şişeye orta rezervuarı 50-100 mL normal Orta ekleyerek ıslak.
  3. 4 x T75 ve resuspend tüm HEK-293 hücreleri toplamak onları eksozom tükenmiş orta 15 mL ( Tablo malzemelerigörmek).
  4. Künt dolgu bağlı 20 mL şırınga kullanarak biyoreaktör şişeye hücre bölmesinin HEK-293 hücre süspansiyon eklemek (bkz. Tablo reçetesi) oluşmuş herhangi bir kabarcık kaldırmak için özenle iğne.
  5. Biyoreaktör şişeye orta rezervuarı normal Orta ile bir hafta boyunca 500 mL ve devam inkübatör (%5 CO2, 37 ° C) şişeye doldurun.

2. şartına Orta (CM) biyoreaktör Flask hasat

  1. 1 hafta sonra biyoreaktör şişeye orta rezervuarı ortamda atmak.
  2. Tüm Orta kaldırın (Örneğin, CM) hücre kompartımanda 20 mL şırınga kullanarak bir künt dolgu iğneye bağlı.
  3. 50-100 mL normal orta orta havzanın ekleyin.
  4. Ya tükenmiş orta 15 mL eski orta kaldırma ve taze eksozom tükenmiş orta bir künt dolgu iğneye bağlı 20 mL şırınga kullanarak ekleyerek hücre bölmesi ekleyin.
  5. Biyoreaktör şişeye orta rezervuarı normal Orta ile 500 mL ve devam inkübatör (%5 CO2, 37 ° C) şişeye bir hafta daha doldur.
    Not: Kültür fazla bir yıl boyunca devam edilebilir. Adım 2.2, ilk hasat CM eksozom yalıtım için kullanılmaz ve atılır. 2nd ve sonraki hasat için CM eksozom yalıtım için tutulur.

3. eksozom yalıtım sükroz yastık üzerine

Figure 2
Şekil 2: izolasyon ve exosomes karakterizasyonu. (A)öncesi takas hasat şartına ortamından (CM) ölü hücreleri ve hücre artıkları. (B) sükroz yastık üzerine cm exosomes izole. (C) sükroz ve bulaşıcı proteinlerin kaldırmak için adım yıkama. (D) izole exosomes sonra fizikokimyasal, biyokimyasal ve morfolojik karakterizasyonu için tabi tutuldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. (Kimden adım 2.2) CM fark Santrifüjü ve filtrasyon tarafından aşağıdaki gibi önceden temizleyin.
    1. 4 ° C'de 5 min için 500 x g, santrifüj Süpernatant yeni bir tüp içine aktarmak ve Pelet atın. Süpernatant kurtarma ve Pelet atarak bu aralıklarla bir kez daha tekrarlayın.
    2. Adım 3.1.1 2.000 x g 15 dk ve 4 ° C de süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet atın. Kurtarılan süpernatant bir kez 0,22 µm filtreler aracılığıyla filtre.
  2. Ön temizleme sırasında döteryum oksit % 25 (w/w) sükroz çözümde 1.9 g (± 0.001 g) sükroz evrensel bir tüp dışarı doğru tartım ve ağırlığı 7.6 g (± 0.001 g) ulaşıncaya kadar sonra döteryum oksit ile kontör hazırlayın.
  3. Bir ultracentrifuge doldurmak tüp ( Tablo malzemelerigörmek) önceden temizlenmiş CM. makyaj 0,22 µm filtre ile 22,5 ml CM 22,5 mL ile geçerli birim ise PBS bu daha az.
  4. Bir cam tüp pipet ( Tablo malzemelerigörmek) ve, 3 mL sukroz çözüm çözüm CM altında ayrı bir katman oluşturur, ekleyin bir yer.
  5. Dikkatli bir şekilde yer tüp içeren bir swing-out rotor kova içine CM/sükroz çözüm katmanlı (bkz. Tablo reçetesi) ve kova rotor güvenli.
  6. Rotor ultracentrifuge yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve 100.000 x g 4 ° C'de 1,5 saat için spin
  7. 2 mL sukroz tabakasının toplamak ve bu bir ultracentrifuge biberondan Ekle ( Tablo malzemelerigörmek) 20 mL içeren filtre uygulanmış PBS için bir yıkama adım.
  8. Tüpler bir sabit açılı rotor yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve 100.000 x g 4 ° C'de 1,5 saat için spin
  9. Dikkatle süpernatant 10 mL serolojik pipet ile kaldırın ve Pelet 400 filtre µL PBS ile resuspend. Bu ya hisse senedi 4 ° C veya-80 ° C kısa vadeli ve uzun vadeli depolama için sırasıyla tutun.

4. eksozom boyutu ve verim nanopartikül izleme çözümlemesi (NTA) tarafından karakterizasyonu

  1. Yapmak 1:1, 000-1:50, 20-80 parçacıklar NTA görüntüleme çerçevesinde elde etmek için 1 mL (en az 750 µL) birimindeki eksozom stokunun 000 dilutions aleti (bakınız Tablo reçetesi) görüntüleme.
  2. Seyreltilmiş eksozom hisse senedi 1 mL şırınga kullanarak NTA enstrüman örnek odasına enjekte ve sıcaklık probu giriş bir termometre sıcaklık probu takın.
  3. NTA yazılım ayarlayın (bkz. Tablo reçetesi) aşağıdaki gibi kayıt için: 3 standart ölçüleri, 30 s her, el ile Sıcaklık seçeneği işaretlenmemiş; ve Gelişmiş sekmesi altında seyreltme faktörü girin.
  4. 13 için kamera düzeyini ayarlayın ve örnek taze toplu enjekte ve her okuduktan sonra istendiğinde örnek oda sıcaklığını girerek NTA yazılım yakalama komut dosyasını çalıştırın.
  5. 4 daha sonraki analiz bölümü için küme eşik ve ortalama kalıcı boyutu ve ölçümler eksozom stoktan parçacık konsantrasyonu unutmayın.

5. eksozom saflık parçacık: Protein oranı tayini tarafından karakterizasyonu

  1. Protein içeriği bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil tarafından eksozom stokunun kıt ( Tablo malzemelerigörmek) aşağıdaki gibi ölçü birimi.
    1. Hazırlamak standartları tanımlanan.
      1. Microcentrifuge tüp 45 µL BSA hisse senedi çözüm (2 mg/mL – tahlil Seti'nde sağlanan) ekleyerek en yüksek konsantrasyonu (500 µg/mL) standartları hazırlamak ve PBS ile 180 µL olun.
      2. 8 microcentrifuge tüpler PBS 90 µL ile doldurun.
      3. Seri dilutions yapmak (faktör: 0.5) 90 µL en yüksek BSA standart alarak ve bu 1st microcentrifuge eklemek tüp PBS ile (mix iyi), o zaman bu tüp 90 µL alma ve 2nd microcentrifuge tüp içine ekleyerek.
      4. 7 microcentrifuge tüp kadar bu işlemi yineleyin. 8 tüp sadece PBS olacak (Yani, boş: 0 µg/mL).
    2. Ya örnekleri 1:2 seyreltme PBS ile örneklerinin toplam hacmi çok 90 µL (45 µL örneği, PBS 45 µL) yaparak hazırlamak.
    3. Reaktif mix çalışma BCA hazırlayın.
      1. BCA gerekli reaktif mix (başı kuyuda çoğaltmaları, standartlar dahil olmak üzere 50 µL) çalışma hacmi hesaplamak.
      2. Aşağıdaki oranı göre bireysel BCA reaktifler mix: 25 parça reaktif A: 24 parça reaktif B: 1 Bölüm reaktif C.
    4. Tahlil ve çözümlemesi gerçekleştirin.
      1. 96-şey plaka (yineleme her standart ve örnek için) bir kuyuya yukarıda hazırlanan her standart ve ya örneğinin 40 µL ekleyin.
        Not: Bu kolorimetrik bir tahlil olduğu için uygun pipetting tekniği doğru sonuçlar elde etmek çok önemlidir. Her standart/örnek çoğaltılır her kuyu içine ekledikten sonra pipetler değiştirmek
      2. Reaktif karışımı her kuyuya çalışma protein testin 50 µL ekleyin ve plaka için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
        Not: sapmalar çoğaltır arasında en aza indirmek için protein tahlil çalışma reaktif bir standart/örnek, 1st REPLICATE eklemek için 1st eklemeden önce 2nd REPLICATE aynı örnek/standart, ardından başka bir örnek/standartları çoğaltmak.
      3. 562 absorbans ölçmek nm plaka okuyucu üzerinde ( Tablo malzemelerigörmek).
      4. Standartların absorbans değerleri üzerinden standart bir eğri arsa ve eğrinin denklemi kullanarak her örnek protein konsantrasyonu çalışmak.
  2. Partikül: protein oranı yukarıdaki ölçülen eksozom stok protein konsantrasyonu ile edindiğiniz eksozom verim bölerek hesaplayın.

6. Exosomal Marker ifade tarafından akış sitometresi karakterizasyonu

  1. Exosomes (≥1x1011 parçacıklar/mL) 40 µL 10 µL aldehid/sülfat lateks boncuk (stoktan su katılmamış) ile 15 dakika oda sıcaklığında (RT) kuluçkaya.
  2. 5 µL 100 µM BSA çözüm ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) 10 mM nihai toplama ulaşmak için ve RT., 15 dk için kuluçkaya eksozom-boncuk karışıma
  3. PBS 1 mL ekleyin ve bir microcentrifuge tüp üzerinde sallanan bir shaker (~ 150 devir/dakika) hafif ajitasyon ile RT, 75 dk için kuluçkaya.
  4. Süspansiyon 580 x g RT, 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  5. Pelet 1 mL 100 mM glisin çözeltisi ile resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) ve 30 dk RT. az için kuluçkaya
  6. 580 x g. atma, 5 min için süspansiyon süpernatant santrifüj kapasitesi ve pelet 1 mL % 3 ile resuspend FBS/PBS ( Tablo malzemelerigörmek).
  7. Bu yıkama işlemi tekrarlayın ve Pelet % 3 350 µL içinde resuspend FBS/PBS.
  8. Süspansiyon 7 tüpler içine her 50 µL süspansiyon içeren bölmek ve onları fluorophore Birleşik anti-CD81, anti-CD9 ve anti-CD63 antikorları ve karşılık gelen izotip denetimlerini kuluçkaya (1:10 seyreltme), sırasıyla 4 ° C'de 45 dk 1 tüplerinin günahı bir denetim, ancak aynı işlem gören olarak tutmak.
  9. 3 FBS/PBS her tüp, 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak % 1 mL ekleyin.
  10. Pelet 200-400 µL % 3 ile resuspend FBS/PBS ve akış sitometresi örneği analiz ( Tablo malzemelerigörmek) uygun kanallar altında.

7. eksozom morfoloji transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından karakterizasyonu

  1. 1010 p/çözüm tespiti mL gibi uygun konsantrasyonlarda sulu dağıtıcıları ya tamir ( Tablo malzemelerigörmek) 15 dakika.
  2. 300 üzerinde örnekleri karbon kaplama mesh yer ızgaraları bakır ve hava kuru bırakın.
  3. Olumsuz örnekleri 0,22 µm filtre sulu uranyl asetat ile leke ( Tablo malzemelerigörmek) ( Tablo malzemelerigörmek) 4 min iki % 50 metanol/H2tarafından O takip için yıkayın.
  4. Hava kuru örnek.
  5. TEM altında örnekleri gözlemlemek ( Tablo malzemelerigörmek). Hızlanan gerilim 80 küme kV ve spot boyut olarak 2. Objektif diyafram ile tüm örneklerini kullanın.

8. siRNA kapsülleme Exosomes Elektroporasyon tarafından içine

  1. Elektroporasyon küvet önceden chill ( Tablo malzemelerigörmek) buz Elektroporasyon önce 30 dk için.
  2. Mix 7.0 µg 0,33 µg siRNA (12 µL RNase free suda 2 µM stoktan) microcentrifuge tüp ile exosomes (7 x 1012 p/mL stok PBS 32 µL) in. Sitrik asit tampon ile 150 µL sesini yapmak (bkz. Tablo malzeme). SiRNA molar oranı ya 1:60 Bu durumda olur.
  3. Karışım Elektroporasyon küvet için transfer. Küvet kap ve electroporator küvet tutucu yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). Dönüm tekerleği 180 ° saat yönünde döndürün.
    Not: Tekerlek ekseninde elektrotlar başvurun küvet için kilitli konuma tamamen açılması gerekir.
  4. İstenen Elektroporasyon programı seçin (Örneğin, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, vb) ve çoğalmasıyla Başlat düğmesine basıldığında başlayın.
    Not: Başarılı bir darbe "OK" ekranda göstererek gösterilir.
  5. Bir kez electroporated, küvet tekerlek 180 ° saat yönünün tersine dönüş sonra kaldırın. Örnek için daha fazla alay plastik pipet ile küvet çekmek.

9. ücretsiz siRNA kullanma boyutu dışlama Kromatografi (sn) kaldırılması

  1. SN sütun equilibrate (2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]; bkz: Malzemeler tablo) filtre uygulanmış PBS 3,5 mL iki kez geçirerek.
  2. Filtre uygulanmış PBS 350 μL electroporated örneğinin 150 μL dağıtılması ve bu ücretsiz siRNA kaldırma işlemini gerçekleştirmek için sn sütuna aktarmak.
  3. Eluted ilk 500 μL kesir sütundan (F0) toplamak.
  4. Filtre uygulanmış PBS 500 μL sütununu ekleyin ve sonraki 500 μL kesir (F1) toplamak.
  5. 10 x 500 μL kesirler (F9) en fazla toplam toplanan kadar yukarıdaki adımı yineleyin. F1 ve F2 siRNA kapsüllü exosomes bulunması gerekmektedir.
  6. Sütun filtre uygulanmış PBS ile yıkayın (iki kez, en az) herhangi bir örnek artıkları kaldırmak için.

10. siRNA yüklü Exosomes PANC-1 hücrelere alımını Vitro

  1. Tohum PANC-1 ( Tablo malzemelerigörmek) 24-şey düz-alt plaka alımı öncesinde de 24 h başına 50.000 hücre yoğunluğu, hücrelerde çalışma ve kuluçka (%5 CO2, 37 ° C) hücreleri kuluçkaya.
  2. Electroporate HEK-293 exosomes (7.0 μg) ile Atto655-siRNA (0.33 μg) göre Adım 8.
  3. Electroporated ya adım 9 göre arındırmak ve PBS 100 μL içinde resuspend.
  4. Electroporated exosomes 50 μL PANC-1 hücreye ekleme ve 37 ° C ve % 5 CO2 4 h için kuluçkaya.
  5. Hücreleri kuluçka sonra toplamak.
  6. 1 mL steril PBS hücrelerle yıkama ve PBS 200 μL polistren yuvarlak-alt resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) tüp.
  7. Hücreleri akış sitometresi tarafından analiz ( Tablo malzemelerigörmek) ile 10,000 olayları örnek satın aldı.
    Not: BM-electroporated ya-siRNA karışımı örnekleri ve filtre uygulanmış PBS ile tedavi edilmezse hücreleri denetimleri kullanılmıştır.

Representative Results

HEK-293 hücrelerden (HEK-293 Exo) izole exosomes fizikokimyasal karakterizasyonu Tablo 1' de özetlenmiştir. Analiz (NTA) araç izleme nanopartikül kullanarak ölçülen 107.0 ± 8.2 nm büyüklüğündeydi. Ya verim NTA enstrüman kullanılarak da analiz HEK-293 hücrelerden 6.99 ± 0,22 x 1012 p/mL ~ 24 mL (hasat 2 tur elde edilen) cm üzerinden yapıldı. Parçacık protein oranı (P:P) hesaplayarak değerlendirildi HEK-293 Exo saflığı 8.3 ± 1,7 × 1010 p/µg yapıldı.

İzole HEK-293 Exo boyutu dağılımı Şekil 3Aiçinde gösterilir. Morfolojik analiz transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak gösterdi HEK-293 Exo edildi küresel yapıları biraz 100 nm boyutunda (Şekil 3B). Bu sonuç bununla NTA ölçüm (Şekil 3A) kabul eder. İzole HEK-293 Exo CD81, CD9 ve CD63, veziküller exosomes (Şekil 3 c) tanımlamak için kullanılan kurallı işaretleri için olumlu.

Boyutu dışlama Kromatografi (Şekil 4) kullanarak exosomes arıtma için exosomes yüzde kurtarılması toplanan 10 kesirler (F0-F9) ilk eksozom ile Kurtarılan toplam eksozom parçacık sayısı bölünerek hesaplanır Parçacık numarası kullanılan, siRNA yüzde kurtarılması F3, F4 ve F5 toplanan tüm 10 kesirler elde edilen toplam floresan yoğunluğu ile elde edilen toplam floresan yoğunluğu bölünmesi ile hesaplanır. Kurtarma eksozom ve siRNA sonrası arıtma 75.0 ve % 80.4 anılan sıraya göre hesaplanmıştır. Exosomes siRNA kapsülleme verimliliğini ~ 10-%20, kurulan siRNA standart eğri (Şekil 4 c) kullanılarak hesaplanan yapıldı.

Floresan Atto655 siRNA ile akış sitometresi tarafından yüklenen exosomes alımını vitro kalitatif analiz siRNA kapsüllü exosomes ile tedavi PANC-1 hücreleri floresan sinyal (5A rakam) en büyük üst karakter kaydedilen gösterdi . SiRNA kapsüllü exosomes ile tedavi PANC-1 hücreleri nüfus olumlu gözlem ( yukarıda doğruladı boş exosomes ve siRNA karışım (%0.56) ile tedavi göre Atto655 sinyal (%39.4) için daha yüksek bir yüzdesi kaydedildi Şekil 5B). SiRNA (Bu tedavi edilmeyen hücrelerin ortalama floresans yoğunluk (MFI) değerleri içinde kat fark olarak ifade) hücresel alımını derecesini de siRNA kapsüllü exosomes (MFI kat ile tedavi PANC-1 hücrelerdeki önemli ölçüde yüksek olduğu gözlenmiştir fark 5.1 =) eksozom-siRNA karışımı ile tedavi ile karşılaştırıldığında (MFI kat fark 1.1 =) (Şekil 5C). Bu gözlemler siRNA kapsüllü exosomes PANC-1 hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve onlar etkili siRNA intracellularly teslim olduğunu gösterdi.

Figure 3
Şekil 3: biyokimyasal ve morfoloji Analizi HEK-293 exosomes. (A)boyutu nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanarak HEK-293 exosomes dağılımı. Üst üste bir çubuk grafik 3 farklı standart sapma ölçümleri arasında ifade eden kırmızı bölgeler ile 30 s aralıklarla yakalar eğri gösterir (n = 3). (B) saf HEK-293 exosomes transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüler. Ölçek çubuğu: 100 nm. (C) algılama CD81, CD9 ve CD63 exosomal işaretlerinin akış sitometresi HEK-293 exosomes kullanarak. Exosomes aldehid/sülfat lateks boncuk algılama önce birleştiğinde. Boncuk eksozom kompleksi daha sonra anti-CD81, anti-CD9 ve anti-CD63 antikorlar fluorophore Birleşik lekeli. Derecesini ifade veri işaretleyicilerini kat farkı olarak medyan floresan yoğunluğu (MFI) değerleri bu denetimin (ile ilgili izotip lekeli boncuk eksozom kompleksi) ifade. Değerleri ifade ± SD, demek gibi burada n = 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: eksozom arıtma post-Elektroporasyon. (A)elüsyon profilleri (F0-F9) boyutu dışlama chormatography kullanarak Atto655-siRNA ve electroporated exosomes. Atto655-siRNA ve boyutu dışlama chormatography kullanarak eksozom F0 üzerinden F9 (B) NTA analizi. Atto655 (C) kalibrasyon eğrisi siRNA etiketli. Floresans yoğunluklarda plaka okuyucu tarafından elde edilen Ex / Em: 640-10/680 nm; 2800 kazanç. Değerleri ifade ± SD anlamına (n = 3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: siRNA kapsüllü exosomes 4 h PANC-1 hücreleri içine hücresel alımını (A)çubuk grafikler boş exosomes + siRNA karışımı ve siRNA kapsüllü exosomes hücresel alımını karşılaştırma. (B) boş exosomes + 4 h yalancı Arsa tarafından karisimin siRNA alımını karşılaştırılması. Tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla (C) ortalama kat farkı floresan yoğunluğu (MFI) değerleri test örnekleri. Değerleri ifade ± SD, demek gibi burada n = 3. P < 0,001. NS: önemli değil. Tek yönlü ANOVA istatistiksel analiz için kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ya Boyutu1,2
(nm)
Verim1,2,3
(p/mL)
[Protein] 2,4
(µg/mL)
Parçacık-protein (P:P) oranı5
(p/µg)
HEK-293 107.0 ± 8.2 6.99 ± 0,22 x 1012 84.3 ± 9,8 8.3 ± 1.7 x 1010 
1 nanopartikül izleme çözümlemesi (NTA enstrüman) kullanılarak ölçülür
2 ± SD, demek gibi değerleri ifade edilir burada n = 3
3 hücre şartına orta biyoreaktör şişeler (~ 24 mL) hasat 2 tur üzerinden havuzda çalıştırılır tarafından verim elde edildi
4 bir protein tahlil kiti kullanılarak ölçülür
5 formülü kullanarak alınan değeri: P:P oranı verim = / [Protein]

Tablo 1: Exosomes fizikokimyasal karakterizasyonu.

Discussion

Bir terbiyeli eksozom verim kültürlü hücrelerinden elde etme, hangi içinde vitro veya in vivo çalışmalar, birkaç tur için yeterli olmasıdır hala bir meydan okuma. Üreticiye göre biyoreaktör şişeler üretim antikorlar ve proteinler çeşitli ölümsüzleştirdi hücre hatları kültüründen yüksek verim ile için amaçlı olduğunu. Bu sürekli bir konsantre klimalı ortamda (CM) hücre kompartımanda kaynaklanan istenen ürün ile kültür orta zenginleştirmek için hücreleri sağlar. Teorik olarak, aynı kavram çeşitli hücre satırlarını eksozom üretiminde faydalı olacağını ve gerçekten biyoreaktör şişeler bu hücreler kültür eksozom verim40önemli ölçüde artırmak için gösterilmiştir. Büyük Orta rezervuar sürekli besin kaynakları ve uzun süreli kültür hücreleri ile temas halinde olmak orta veya normal çok fazla gerek kalmadan sağlayan 10 kDa yarı geçirgen membran aracılığıyla hücre bölme atıkların kaldırır Şişeler, değişen hangi sonuçta genel maliyet ve yüksek ölçekli eksozom üretim40emek kaydedebilirsiniz. Ayrıca morfolojisi, fenotip yanı sıra exosomes immunomodulatory fonksiyonları uzun vadeli biyoreaktör şişeler kültürler içinde düzenli 75 cm2 şişe40kültürlü hücrelerden kaynaklı benzer hücreleri izole gösterilmiştir. Kültür biyoreaktör şişeye eksozom kaynağı olarak diğer ölümsüzleştirdi hücre satırlarının bu nedenle kendi bütünlüğü ve işlev koruyarak kendi eksozom verim artışı yardımcı olacaktır. Bu tür kültür ancak sınırlı bölümü döngüleri ve bu ile primer hücre için geçerli değildir bu yüksek yoğunluklu kültürlü değil göre.

Hasat cm haftalık yapılır ve kültür hücrelerde asla pasajlı beri Bu biyoreaktör şişeye hücrelerde bir monolayer normal hücre kültür gibi içinde büyüyen değil kabul edilebilir. Onlar nekrotik merkezleri olan kümeleri oluşturmak veya hücreleri bir monolayer için çok konfluent olduğunda sadece yüzeyi ve die ayırmak büyük olasılıkla vardır. Biyoreaktör şişeye hücre bölmesinin görsel muayene Bu varsayım onaylamak mümkün değil ama ölü hücreleri CM hasat sırasında elde edilen çok sayıda yansıtır. Biyoreaktör şişeye kötü yapışık ve uygun olmayan hücre düzenli temizleme malzemeleri, besin ve hücre bölmesi ve orta arasında atık gaz Satım olumsuz yönde etkilenebilir yarı geçirgen membran üzerinde birikmesi engelleyebilirsiniz Depo, böylece uzun süreli kültür biyoreaktör şişeler için izin > 6 ay40. Bu bağlamda, Sigara bu düzenlilik biyoreaktör şişeler hücre büyüme biz spekülasyon tümör büyüme vivo içinde gerçek durumunu geleneksel monolayer hücre kültürü daha yakından taklit eder, ve bu ümit ediliyor olarak idealdir bu exosomes Biyoreaktör şişeye hücrelerde-cekti var olmak daha benzer tümörleri içinde vivotarafından salgılanan kanser tarafından üretilir. Bu çalışmalarda tümör kaynaklı exosomes tümör patoloji ilerleme rolü bakarak özellikle yararlı olacaktır. Tümör kaynaklı exosomes özünde ve tercihen ev sahipliği doku kökenli32bildirilmiştir, bu nedenle kendi içinde vivo taklit eden bir sistemde üretilen exosomes sahip üretim bakarak çalışmalarda arzu cekti da var olmak exosomes pasif hedefleme yeteneği uyuşturucu nanocarriers olarak keşfetmek.

P:P oranı proteinler--dan hangi41kimden exosomes kaynaklı fizyolojik sıvıların kültür çevre kirletici dan izole exosomes saflığı değerlendirmek için bir parametre olarak bildirildi. Çalışmada önerilen yüksek saflıkta Aralık içinde 8.3 ± 1,7 × 1010 p/Bu çalışmada elde edilen µg P:P oranı düşüyor. Bu oran verim veya izole veya bu exosomes protein problemini verilen örnekte kullanılabilir gerçek tutar yansıtmak zorunda değildir gibi akış yönündeki çalışmalar sırasıyla, kullanılan exosomes doz ifade etmek için protein konsantrasyonu kullanarak tehlikesi vurgulamaktadır yalıtım sırasında kirlenme. NTA üzerinden aletleri exosomes parçacık sayısı açısından konsantrasyon ölçer, NanoSight gibi exosomes miktarının daha mantıklı ve doğru bir şekilde var.

Döteryum oksit % 25 sükroz çözümde hazırlanması sırasında son derece hassas tartım yoğunluğu tabanlı yalıtım bu yöntem olduğu gibi çok önemlidir. Sükroz yastık doğru hazırlanması sırasında yalıtım42apoptotik organları gibi sigara exosomal veziküller veya veziküller Golgi kaynaklı kirlenme azaltır bu yüzden Exosomes sükroz çözümde flotasyon yoğunluğu oldukça dar bir aralığı vardır. Bu artık sükroz çözüm ve böylece risk faktörlerin yoğunluğu kaybı gibi değiştirebilir veya çözümde su ilavesi önlemek için bile bir gün sonra kullanmaya aldırmaya buharlaşma ya da tüp havada yoğunlaşma tarafından tavsiye edilir. Santrifüjü exosomes bile göç CM sükroz çözüm için izin vermek için sükroz yastık üzerine sırasında bir swing-out rotor kullanımı önemlidir.

Sükroz çözüm sonrası Santrifüjü çekilmesi aynı zamanda hassas bir adımdır ve exosomes kurtarılan ve çok fazla protein kültür ortamdan eksozom örnek içine kapanık giriliyor miktarını en üst düzeye çıkarma arasında bir uzlaşma bulmak içerir . Sükroz çözüm ve koşul orta arasındaki nerede proteinler kültür ortamdan sonrası Santrifüjü toplayacak ve genellikle arabirimde oturur bir koyu kahverengi halka olarak görülebilir arabirimdir. Bizim ellerde 2 mL sukroz yastık eklendi ilk 3 mL çekilmesi yukarıda belirtilen uzlaşma ile aynı fikirde optimum birimdir. Bu protokol için açıklanan birimleri kullanılan belirli rotorlar için vardır; Bu nedenle, bu birimler rotor farklı tesislerde kullanılabilir türleri için aşağı ve yukarı ölçeklerken geri sükroz hacmi optimize etmek için tavsiye edilir. Bu parçacıkların sükroz daha yüksek yoğunluğu tortu nerede olacak ve genellikle sukroz, çekilmesi bir off-beyaz Pelet görülebilir alan sağ tüp alt ortasına önlemek önemlidir.

PBS nispeten büyük miktarda çamaşır adımla daha fazla protein kontaminasyonu eksozom yalıtım41sırasında derecesini azaltmaya yardımcı olur. Bu adımı da aşırı sükroz kendileri veya biomolecules exosomal lümen içinde exosomes için ozmotik zarar görmemesi için exosomes kaldırarak hem bakteriyel ve/veya mantar büyüme ya hisse senedi riskini azaltır esastır. Yerine su yalıtım için eksozom flotasyon yoğunluğu elde etmek için gerekli sükroz azaltmak için yardımcı olur döteryum oksit sükroz çözümde hazırlanıyor, bu nedenle ozmotik hasar ve mikrobiyal kontaminasyon riskini azaltır. Sükroz eksozom içeren yastık üzerine ilk Santrifüjü sonra geri çekildi ve PBS için eklendi sükroz katman 4 ° C'de depolanan ve zaman kısıtlamaları ile karşı karşıya ertesi gün işlenen.

Bizim bilgi en iyi şekilde eksozom/siRNA molar oranı Elektroporasyon etkinliğini belirlemede önemli bir faktördür. Bu protokol için eksozom siRNA molar oranı olarak 1:60 kullanılır. Kapsülleme yetenek exosomes farklı türleri farklı olduğundan, bu bir harf tarafından ayrı ayrı optimize için öneririz. Ancak, burada önerilen kapsülleme verimliliği her zaman en iyi Elektroporasyon koşulları seçmek için bir parametre olabilir.

Buna ek olarak, toplama siRNA Elektroporasyon'en yaygın bir sorun biri olduğuna inanılıyor. Bu o Elektroporasyon siRNA, yapım o daha da zor exosomes girmek güçlü agregasyon tetikleyebilir kanıtlanmıştır. siRNA toplamları oluşumu sırasında Elektroporasyon28kaçınılmaz olduğu gibi bu çalışmada siRNA kapsülleme ya bu nedenle uygun denetimlere kullanıldı gibi siRNA toplamalardan çoğu zaman yanlışlıkla yorumlanır. Bizim arıtma yöntemi yüzde kapsülleme verimliliğini veri güvenilirliğini etkileyebilir arka plan gürültü, ya ve siRNA toplamalardan gibi diğer kaynaklardan etkisi en aza indirmek için normalleştirilmiş değerleri kullanarak hesaplanır. Bizim bulgularına dayanarak, electroporated ve BM-electroporated siRNA kullanarak denetim örnek Yani, içinde gözlenen ihmal edilebilir siRNA toplamalardan vardı.

Bu iletişim kuralı başarıyla siRNA kapsülleme exosomes içine göstermiştir ve içinde vitrosiRNA onların sonraki hücre içi teslim kanser hücreleri. Bu nedenle, farklı hücre satırlarından exosomes türleri olabilir izole ve önerilen iletişim kuralı kullanılarak karakterize ve daha sonra farklı kanser aşırı ifade oncogenic hedeflerinden farklı türleri için çeşitli tedavi siRNA yüklü. İlginç bir uygulama çeşitli eksozom kaynak-hedef hücre çift içinde vitropermütasyon kullanarak siRNA teslim ve alımı verimliliği keşfetmek olacaktır. Bu o zaman hayvan modelleri hem teslim verimliliğini ve siRNA kapsüllü exosomes tedavi edici verimliliğini değerlendirmek için tercüme edilebilir içinde vivo.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgements

F. N. Faruqu Meclis Amanah Rakyat (MARA) Malezya hükümeti ajansı tarafından finanse edilmektedir. L. Xu Marie Sklodowska-Curie bireysel Burslar (ufuk 2020) (H2020-MSCA-Eğer-2016) bir alıcı var. K. T. Al-Jamal BBSRC (1/J008656/BB) ve Wellcome Trust (WT103913) fon kabul eder. Yazarlar ayrıca Dr Paul lavanta ve Dr David Fear (solunum tıp bölümü ve alerji, Londra'daki King's College) electroporator sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zitvogel, L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes. Nature Medicine. 4, (5), 594-600 (1998).
  2. Raffai, R., Li, K., Wong, D., Hong, J. Therapeutic control of systemic inflammation & atherosclerosis with ApoE-polarized macrophage exosomes. Atherosclerosis. e5-e6 (2017).
  3. Masamune, A., et al. Exosomes derived from pancreatic cancer cells induce activation and profibrogenic activities in pancreatic stellate cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495, (1), 71-77 (2018).
  4. Gangoda, L., et al. Proteomic Profiling of Exosomes Secreted by Breast Cancer Cells with Varying Metastatic Potential. Proteomics. 17, (23-24), 1600370 (2017).
  5. Wozniak, M., Peczek, L., Czernek, L., Düchler, M. Analysis of the miRNA Profiles of Melanoma Exosomes Derived Under Normoxic and Hypoxic Culture Conditions. Anticancer Research. 37, (12), 6779-6789 (2017).
  6. Salimu, J., et al. Dominant immunosuppression of dendritic cell function by prostate-cancer-derived exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 6, (1), 1368823 (2017).
  7. Lankford, K. L., et al. Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE. 13, (1), e0190358 (2018).
  8. Khalyfa, A., et al. Plasma Exosomes and Improvements in Endothelial Function by Angiotensin 2 Type 1 Receptor or Cyclooxygenase 2 Blockade following Intermittent Hypoxia. Frontiers in Neurology. 8, 709 (2017).
  9. Manek, R., et al. Protein Biomarkers and Neuroproteomics Characterization of Microvesicles/Exosomes from Human Cerebrospinal Fluid Following Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55, (7), 6112-6128 (2018).
  10. Pathare, G., et al. Changes in V-ATPase subunits of human urinary exosomes reflect the renal response to acute acid/alkali loading and the defects in distal renal tubular acidosis. Kidney International. 93, (4), 871-880 (2018).
  11. Liao, Y., Du, X., Li, J., Lönnerdal, B. Human milk exosomes and their microRNAs survive digestion in vitro and are taken up by human intestinal cells. Molecular nutrition & food research. 61, (11), 1700082 (2017).
  12. Kim, J., et al. Cyclooxygenase-2 expression is induced by celecoxib treatment in lung cancer cells and is transferred to neighbor cells via exosomes. International Journal of Oncology. 52, (2), 613-620 (2017).
  13. Sterzenbach, U., et al. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. Molecular Therapy. 25, (6), 1269-1278 (2018).
  14. Conigliaro, A., Fontana, S., Raimondo, S., Alessandro, R. Exosomes: Nanocarriers of Biological Messages. In Exosomes in Cardiovascular Diseases. 998, 23-43 (2017).
  15. El Andaloussi, S., Lakhal, S., Mäger, I., Wood, M. J. A. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, (3), 391-397 (2013).
  16. Simhadri, V. R., et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE. 3, (10), e3377 (2008).
  17. Santos, J. C., et al. Exosome-mediated breast cancer chemoresistance via miR-155 transfer. Scientific Reports. 8, (1), 829-829 (2018).
  18. Hadla, M., et al. Exosomes increase the therapeutic index of doxorubicin in breast and ovarian cancer mouse models. Nanomedicine. 11, (18), 2431-2441 (2016).
  19. Smyth, T., et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. Journal of Controlled Release. 199, 145-155 (2015).
  20. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35, (7), 2383-2390 (2014).
  21. Kim, M. S., et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 14, (1), 195-204 (2018).
  22. Bellavia, D., et al. Interleukin 3- receptor targeted exosomes inhibit in vitro and in vivo Chronic Myelogenous Leukemia cell growth. Theranostics. 7, (5), 1333-1345 (2017).
  23. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18, (9), 1606-1614 (2010).
  24. Tian, T., et al. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials. 150, 137-149 (2017).
  25. Zhuang, X., et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular Therapy. 19, (10), 1769-1779 (2011).
  26. Iessi, E., et al. Acridine Orange/exosomes increase the delivery and the effectiveness of Acridine Orange in human melanoma cells: A new prototype for theranostics of tumors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32, (1), 648-657 (2017).
  27. Aqil, F., et al. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer. Food & Function. 8, (11), 4100-4107 (2017).
  28. Shtam, T. A., et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Communication and Signaling. 11, (1), 1-10 (2013).
  29. Wahlgren, J., et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Research. 40, (17), e130-e130 (2012).
  30. Yang, J., Zhang, X., Chen, X., Wang, L., Yang, G. Exosome Mediated Delivery of miR-124 Promotes Neurogenesis after Ischemia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 7, 278-287 (2017).
  31. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. 29, (4), 341-345 (2011).
  32. Wiklander, O. P. B., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-13 (2015).
  33. Varga, Z., et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 31, (5), 168-173 (2016).
  34. Smyth, T. J., Redzic, J. S., Graner, M. W., Anchordoquy, T. J. Examination of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1838, (11), 2954-2965 (2014).
  35. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23430 (2014).
  36. Sharma, P., et al. Immunoaffinity-based isolation of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients with melanoma. Journal of Extracellular Vesicles. 7, (1), 1435138 (2018).
  37. Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 247, (1), 163-174 (2001).
  38. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling. In Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. 235-246 (2011).
  39. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82, (9), 1024-1032 (2012).
  40. Mitchell, J. P., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System. Journal of Immunological Methods. 335, (1-2), 98-105 (2008).
  41. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles? Journal of Extracellular Vesicles. 2, (1), 1-6 (2013).
  42. Chiou, N. -T., Ansel, K. M. Improved exosome isolation by sucrose gradient fractionation of ultracentrifuged crude exosome pellets. Nature Protocol Exchange. (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics