Vorbereitung der Exosomen SiRNA Lieferung an Krebszellen

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Cancer Research
 

Summary

Eine Exosom ist eine neue Generation von Drug Delivery Träger. Wir etabliert eine Exosom Isolierung Protokoll mit hoher Ausbeute und Reinheit für SiRNA Lieferung. Wir auch Eindringmittel gekennzeichneten unspezifische SiRNA in Exosomen gekapselt und die zelluläre Aufnahme von SiRNA geladen Exosomen in Krebszellen untersucht.

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Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).

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Abstract

Extrazelluläre Vesikel in bestimmten Exosomen haben vor kurzem Interesse als neuartiges Medikament Lieferung Vektoren aufgrund ihrer biologischen Ursprungs, Fülle und intrinsische Fähigkeit im interzellulären Lieferung von verschiedenen Biomolekülen gewonnen. Diese Arbeit stellt eine Isolierung-Protokoll um hohe Ergiebigkeit und hohe Reinheit des Exosomen für SiRNA Lieferung zu erreichen. Menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293-Zellen) werden im Bioreaktor Fläschchen kultiviert und überstand die Kultur (hereon konditionierten Medium genannt) wird auf einer wöchentlichen Basis erlauben für die Anreicherung von HEK-293 Exosomen geerntet. Die konditionierte Medium (CM) wird vorab durch differentielle Zentrifugation von abgestorbenen Zellen und Zelltrümmer gelöscht und unterliegt Ultrazentrifugation auf eine Saccharose-Kissen, gefolgt von einem Waschschritt die Exosomen zu sammeln. Isolierte HEK-293 Exosomen sind für Ertrag, Morphologie und Exosomal Marker Ausdruck durch Nanopartikel Tracking Analyse, Protein Quantifizierung, Elektronenmikroskopie und Durchflusszytometrie, gekennzeichnet. Kleine interferierende RNA (SiRNA), Eindringmittel mit Atto655, gekennzeichnet durch Elektroporation in Exosomen geladen wird und überschüssige SiRNA wird durch Gel Filtration entfernt. Zelle Aufnahme in Krebszellen Bowle-1, nach 24 h Inkubation bei 37 ° C wird durch Durchflusszytometrie bestätigt. HEK-293 Exosomen sind 107.0 ± 8.2 nm im Durchmesser. Das Exosom Ertrag und Partikel-Protein-Verhältnis (Best.)-Verhältnis sind 6,99 ± 0,22 × 1012 Partikel/mL bzw. µg/8.3 ± 1,7 × 1010 Partikel. Die Effizienz der Kapselung von SiRNA in Exosomen ist ~ 10-20 %. Vierzig Prozent der Zellen zeigen positive Signale für Atto655 bei 24 h nach dem ausbrüten. Zusammenfassend bietet Exosom Isolation mittels Ultrazentrifugation auf Saccharose Kissen eine Kombination aus guter Ausbeute und Reinheit. SiRNA könnte in Exosomen durch Elektroporation erfolgreich geladen werden und anschließend in Krebszellen geliefert in-vitro-. Dieses Protokoll bietet ein Standardverfahren für die Entwicklung von SiRNA geladen Exosomen für effiziente Lieferung zu Krebszellen.

Introduction

Exosomen sind ein Untertyp von extrazellulären Vesikeln (EV) von 50-200 nm im Durchmesser, abgesondert von verschiedenen Zelltypen wie Immunzellen1,2, Krebszellen3,4,5, 6 und Stammzellen-7. Exosomen zeigen ebenfalls in verschiedenen physiologischen Flüssigkeiten8,9,10,11präsent zu sein. Die Kombination aus die angeborene Fähigkeit der Exosomen verschiedenen Biomolekülen (z. B. RNA und Proteine)12,13,14 durchzuführen und die effiziente Bereitstellung von diese Biomoleküle in Empfängerzellen 15 , 16 , 17 erregte ihr Potenzial als nanoskalige Drug Delivery Vektoren. Verschiedene kleine Moleküle, die als Anti-Krebs- und entzündungshemmende Medikamente wurden nachgewiesen in Exosomen erfolgreich geladen werden und aufs Ziel Zellen18,19,20, dienen 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Interessanterweise Nukleinsäuren wie SiRNA28,29 und MicroRNA30 auch in Exosomen über Elektroporation erfolgreich geladen wurden und an Zielzellen geliefert.

RNA-Interferenz (RNAi) über kleine interferierende RNA (SiRNA) hat vor kurzem mehr Interesse als die bevorzugte Mechanismus gewonnen, in Gen-silencing durch hohe Spezifität, potenten Wirkung, nur minimale Nebenwirkungen und Leichtigkeit von SiRNA Synthese28, 29. SiRNAs sind doppelsträngige RNA-Moleküle zwischen 19 bis 25 Nukleotide in der Länge, dass Trigger Sequenz-spezifische katalytische mRNA Zuschlag. Aufgrund seiner großen Molekulargewicht und anionisches Natur ist die passive Aufnahme von nackten SiRNA in Zellen behindert28,29. Es ist auch nicht möglich für nackt SiRNA in den systemischen Kreislauf aufgrund der raschen Abbau von Plasma Nukleasen31injiziert werden. Kapselung von SiRNA in einem Nanocarrier würde so die effektive Bereitstellung und Aufnahme von SiRNA in den Zielzellen unterstützen.

Exosomen sind ein ideales System für SiRNA Kapselung, da seine Struktur aus einem hohlen, wässrigen Kern besteht, umhüllt von einem Phospholipid Bilayer. Exosomen nicht nur guten Stabilität im Blut haben, sondern haben auch natürliche targeting Eigenschaften, funktionalen RNA in Zellen32zu liefern. Alvarez-Erviti Et Al. erfolgreich durchgeführte Studie gezeigt, dass effektive Bereitstellung von SiRNA, die Gehirne von Mäusen mit Exosomen mit praktisch keine Komplikationen31entwickelt. Es wird vermutet, dass Exosom-basierte Therapie relativ sicherer als andere Therapien ist wie Exosomen nicht endogen replizieren wie Zellen würden und daher nicht metastasiertem Eigenschaften15aufweisen.

Verschiedene Methoden wurden berichtet, um erfolgreich Exosomen aus Zellkultur oder physiologischen Flüssigkeiten zu isolieren. Die beliebteste Methode nutzt Ultrazentrifugation, Exosomen ab dem Start Material31,32,33pellet. Diese Methode ist ziemlich hart auf Exosome und in der Regel Co Ausscheidungen Proteine aus der Probe. Ultrazentrifugation mit einer Dichte basierenden Trennung wie Saccharose Steigungen zu verbinden ist immer häufiger, Eiweiß und nicht Exosomal Kontamination in der isolierten Exosomen19,34zu reduzieren. Größe-Exclusion Chromatography (SEC) ermöglicht die Trennung von Exosomen von anderen Arten von extrazellulären Vesikeln (EV) durch Größe und kann auch in minimalen Protein Verschmutzung führen aber ist begrenzt durch kleine Menge des Ausgangsmaterials35verarbeitet werden können, 36. Immunoaffinitäts Erfassung verwendet Perlen beschichtet mit Antikörpern, die an Exosomal Oberflächenproteine wie Tetraspanins oder andere zellspezifische Marker, die spezifische Capture Exosomen anstatt EVs kann oder andere Proteine binden, sowie Sub-Bevölkerung zu isolieren Exosomen von ganzen Proben, aber wieder ist begrenzt durch die Menge des Ausgangsmaterials und kostspielige36,37. Polymer-basierten Ausfällung von Exosomen verwendet, populär zu sein, aber da es eine eher grobe Niederschlag ist, es führt zu einer höheren nicht-Exosomal Vesikel und Protein Kontamination38,39.

Elektroporation wurde für seine Ineffizienz als Methode berichtet Exosomen mit SiRNA durch Protein Aggregation15,28,31zu laden. Transfektion basierende Ansätze wurden demonstriert haben, bessere Effizienz und Proteinstabilität laden, aber aufgrund seiner Toxizität und Nebenwirkungen der Transfektion Agenten in die zelluläre gen Ausdruck28Änderung unerwünscht ist. So hat Elektroporation mehr verbreitet in SiRNA in Exosomen zu laden, da es eine sicherere Methode ist. Eine optimierte Kapselung-Methode muss jedoch festgelegt werden, um ausreichende Mengen von SiRNA an den Zielstandort für eine potente gen-Knockdown zu liefern.

Hier schlagen wir eine Exosom Isolierung Protokoll mit Dichte basierenden Ultrazentrifugation auf nur einem einzigen 25 % (w/w) Saccharose Kissen Deuteriumoxid, anstatt ein Dichtegradient Saccharose vorbereitet. Dies ist eine kostengünstige Methode, die umgeht die mühsamen Dichte Gradienten Vorbereitung und ermöglicht die Verarbeitung großer Mengen an Ausgangsmaterial noch intakt Exosomen hohe Ausbeute und Reinheit für anschließende Beladung mit SiRNA führt. Fluoreszierende Atto655 konjugiert unspezifische SiRNA wurde in menschliche embryonale Nieren-Zellen (HEK-293) abgeleitet Exosomen über Elektroporation geladen und an menschlichen Pankreaskarzinom (Bowle-1) Krebszellen in-vitro-.

Protocol

(1) Zellkultur in einem Bioreaktor-Kolben

Figure 1
Abbildung 1: Kultur der Zellen im Bioreaktor Kolben für Exosom Produktion. (A) vereinfachte Anatomie der Bioreaktor-Küvette. (B) ab Kultur in den Bioreaktor-Kolben. Sehen Sie Tabelle der Materialien für die Zusammensetzung des normalen und Exosom erschöpft Mittel (C) Ernte bedingt Mittel (CM) und Erhaltung der Kultur in den Bioreaktor-Kolben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. HEK-293 Kulturzellen in normales Mittel (siehe Tabelle der Materialien; 5 % CO2, 37 ° C) und expandieren 4 x T75 Flaschen (bis 90 % Zusammenfluss).
  2. Die Membran des Kolbens Bioreaktor durch Zugabe von 50-100 mL normales Mittel im mittleren Behälter des Bioreaktors Kolbens nass.
  3. Sammle alle HEK-293-Zellen von 4 x T75 und Aufschwemmen Ihnen in 15 mL Medium Exosom erschöpft (siehe Tabelle der Materialien).
  4. Hinzufügen die HEK-293-Zellsuspension Zellkompartiment der Bioreaktor-Küvette mit einer 20 mL Spritze mit einer stumpfen Füllung verbunden (siehe Tabelle der Materialien), Nadel, mit Sorgfalt, jede Blase zu entfernen, die sich gebildet haben könnte.
  5. Füllen Sie die Mediumspeicher des Kolbens Bioreaktor mit normalen Medium zu 500 mL und halten Sie die Flasche in den Inkubator (5 % CO2, 37 ° C) für eine Woche.

(2) konditionierten Medium (CM) Ernte aus dem Bioreaktor-Flasche

  1. Entsorgen Sie nach 1 Woche das Medium in das mittlere Reservoir an den Bioreaktor-Kolben.
  2. Entfernen Sie das Medium in die Zelle Fach (z.B. CM) mit einer 20 mL Spritze, eine stumpfe Füllung Nadel verbunden.
  3. Die Mediumspeicher 50-100 mL normale Medium hinzufügen.
  4. Die Zellkompartiment fügen Sie 15 mL Medium Exosom erschöpft durch das alte Medium entfernen und Hinzufügen von frischen Exosom erschöpft Medium mit einer 20 mL Spritze mit einer stumpfen Füllung Nadel verbunden hinzu.
  5. Füllen Sie die Mediumspeicher des Kolbens Bioreaktor mit normalen Medium zu 500 mL und halten Sie die Flasche in den Inkubator (5 % CO2, 37 ° C) für eine weitere Woche.
    Hinweis: Die Kultur kann mehr als ein Jahr lang fortgesetzt werden. Für Schritt 2.2 CM aus der ersten Ernte wird nicht für die Exosom Isolierung verwendet werden und wird verworfen. Für die 2Nd und spätere Ernte wird die CM Exosom Isolation gehalten.

(3) Exosom Isolation auf eine Saccharose-Kissen

Figure 2
Abbildung 2: Isolierung und Charakterisierung von Exosomen. (A) Pre-Clearing geernteten konditionierten Medium (CM) aus abgestorbenen Zellen und Zellenrückstand. (B) Exosomen von CM auf Saccharose Kissen zu isolieren. (C) Waschschritt, Saccharose und kontaminierende Proteine zu entfernen. (D) isolierte Exosomen wurden dann physikalisch-chemische, biochemische und morphologische Charakterisierung unterzogen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Pre-löschen Sie die CM (aus Schritt 2.2) durch differentielle Zentrifugation und Filtration wie folgt.
    1. Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr und entsorgen Sie das Pellet. Wiederholen Sie dies Zentrifugation nochmals, erholt sich des Überstands und verwirft das Pellet.
    2. Den Überstand von Schritt 3.1.1 bei 2.000 x g für 15 min und 4 ° C zentrifugiert und verwerfen Sie Pellet. Filtern Sie die wiederhergestellten überstand einmal durch 0,22 µm-Filter.
  2. Während der Pre-Clearing, bereiten Sie 25 % (w/w) Saccharoselösung in Deuteriumoxid durch präzise wiegen 1,9 g (± 0,001 g) von Saccharose in einem universellen Rohr, und dann auffüllen mit Deuteriumoxid, bis das Gewicht 7,6 g (± 0,001 g) erreicht.
  3. Füllen Sie eine Ultrazentrifuge Schlauch (siehe Tabelle der Materialien) mit 22,5 mL des bereits geräumten cm Make-up CM bis 22,5 mL mit 0,22 µm filtriert PBS, wenn die aktuelle Lautstärke ist geringer als die.
  4. Ort, ein Glas pipette (siehe Tabelle der Materialien), in der Röhre und durch es, 3 mL Zuckerlösung hinzufügen, so dass die Lösung eine separate Ebene unterhalb der CM bildet.
  5. Sorgfältig geschichteten Ort Rohr mit CM/Zuckerlösung in den Eimer ein ausschwenkbares Rotor (siehe Tabelle der Materialien), und sichern Sie den Eimer in den Rotor.
  6. Legen Sie den Rotor in der Ultrazentrifuge (siehe Tabelle der Materialien) und Spin bei 100.000 x g für 1,5 h bei 4 ° C.
  7. 2 mL der Saccharose-Schicht zu sammeln und zu einer Ultrazentrifuge Flasche hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) mit 20 mL PBS für ein Waschschritt gefiltert.
  8. Legen Sie die Rohre in einem festen Winkel-Rotor (siehe Tabelle der Materialien) und Spin bei 100.000 x g für 1,5 h bei 4 ° C.
  9. Nehmen Sie des Überstands mit einer serologischen 10 mL-Pipette vorsichtig und Aufschwemmen der Pellet mit 400 µL gefiltert PBS. Halten Sie diesen Exosom Bestand bzw. bei 4 ° C oder-80 ° C für kurz- und langfristige Lagerung.

4. Charakterisierung der Exosom Größe und Ertrag durch Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA)

  1. Machen 1:1, 000-1:50, 000 Verdünnungen die Exosom Bestandsgröße in 1 mL (mindestens 750 µL) Volumen um 20-80 Partikel im Rahmen der NTA Anzeige zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien) Display instrument.
  2. Injizieren Sie den verwässerte Exosom bestand in der NTA Instrument Probenkammer mit einer 1 mL Spritze, und legen Sie den Temperaturfühler eines Thermometers in den Temperatur-Fühler-Einlauf.
  3. Die NTA-Software eingestellt (siehe Tabelle der Materialien) für die Aufzeichnung von wie folgt: 3 Standardmaße, 30 s, manuelle Temperatur Option deaktiviert; und geben Sie den Verdünnungsfaktor unter der Registerkarte " erweitert ".
  4. Stellen Sie die Kamera auf 13 und das Capture-Skript auf der NTA-Software, Injektion eine neue Charge von Probe und Eingabe der Temperatur die Probenkammer Aufforderung nach jeder Lesung.
  5. Setzen Sie den Schwellenwert für die anschließende Analyse-Teil 4, und beachten Sie die modale Durchschnittsgröße und Partikelkonzentration Exosom bestand aus den Messungen.

5. Charakterisierung von Exosom Reinheit durch Partikel: Proteinbestimmung Verhältnis

  1. Maßnahme der Proteingehalt der Exosom Aktie durch eine Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay kit (siehe Tabelle der Materialien) wie folgt.
    1. Vorbereiten der definierten Standards.
      1. Bereiten Sie den Standard der höchsten Konzentration (500 µg/mL) durch Zugabe von 45 µL der Stammlösung BSA (2 mg/mL – im Assay Kit enthalten) zu einem Microcentrifuge Schlauch, und machen Sie es bis zu 180 µL mit PBS.
      2. Füllen Sie 8 Mikrozentrifugenröhrchen mit 90 µL PBS.
      3. Verdünnungsreihen machen (Faktor: 0,5) 90 µL aus der höchsten BSA standard und Hinzufügen dieser in 1St Microcentrifuge Schlauch mit PBS (gut mischen), dann 90 µL von diesem Rohr nehmen und in den 2Nd Microcentrifuge Schlauch hinzufügen.
      4. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der 7. Microcentrifuge Schlauch. Das 8. Rohr werden nur PBS (d. h. der Blank: 0 µg/mL).
    2. Bereiten Sie die Exosom Proben mit 1:2 Verdünnung von Proben mit PBS in einem Gesamtvolumen von 90 µL (45 µL der Probe, 45 µL PBS vor).
    3. Bereiten Sie die BCA Reagenz Mischung arbeiten.
      1. Das Gesamtvolumen der BCA arbeiten Reagenz Mischung benötigt (50 µL pro Bohrloch in Duplikate, einschließlich Standards) zu berechnen.
      2. Mischen Sie die einzelnen BCA Reagenzien entsprechend dem folgenden Verhältnis: 25 Teile Reagenz A: 24 Teile Reagenz B: 1 Teil Reagenz C.
    4. Führen Sie den Test und Analyse.
      1. Fügen Sie 40 µL jeder Standard und Exosom Probe vorbereitet oben in einen Brunnen einer 96-Well-Platte (Duplikate für jeden Standard und Probe hinzu).
        Hinweis: Da dies ein farbmetrischen Assay, ist richtige Pipettieren Technik entscheidend, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Ändern von Pipetten nach Zugabe von jedem Standard/Probe replizieren in jede der Vertiefungen
      2. Fügen Sie 50 µL der Protein Assay Reagenz Mischung in jedes gut arbeiten und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 30 min.
        Hinweis: Zur Minimierung von Abweichungen zwischen Wiederholungen hinzufügen das Protein Assay arbeiten Reagenz in 1St replizieren einer Standard/Probe, gefolgt von den 2Nd replizieren von der gleichen Probe/Standard, bevor Sie hinzufügen 1St Replizieren von einer anderen Probe/Norm.
      3. Messung der Extinktion bei 562 nm auf dem Teller-Leser (siehe Tabelle der Materialien).
      4. Plotten einer Standardkurve von den Werten der Extinktion des Standards, und erarbeiten die Proteinkonzentration in jeder Probe unter Verwendung der Gleichung der Kurve.
  2. Berechnen Sie die Partikel: Protein-Verhältnis dividiert die Exosom Ausbeute erhalten früher mit der Proteinkonzentration von die Exosom Lager oben gemessen.

6. Charakterisierung der Exosomal Marker Ausdruck durch Durchflusszytometrie

  1. 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren Sie 40 µL Exosomen (≥1x1011 Partikeln/mL) mit 10 µL Aldehyd/Sulfat Latex Perlen (unverdünnt ab Lager).
  2. 5 µL 100 µM-BSA-Lösung hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien), die Exosom-Bead-Mischung zu erzielen eine Endkonzentration von 10 mM und 15 min bei RT inkubieren
  3. Fügen Sie 1 mL PBS und inkubieren Sie 75 min bei RT in einem Microcentrifuge Schlauch mit milden Agitation auf einen rockigen Shaker (~ 150 u/min).
  4. Zentrifugieren Sie die Federung bei 580 X g für 5 min bei RT und verwerfen Sie den überstand.
  5. Aufschwemmen der Pellet mit 1 mL 100 mM Glycin-Lösung (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie für 30 min bei RT
  6. Zentrifugieren Sie der Suspension für 5 min bei 580 X g. verwerfen den Überstand und Aufschwemmen der Pellet mit 1 mL 3 % FBS/PBS (siehe Tabelle der Materialien).
  7. Wiederholen Sie diese Waschschritt, und Aufschwemmen das Pellet in 350 µL 3 % FBS/PBS.
  8. Teilen Sie die Aufhängung in 7 Rohre, jeweils 50 µL der Aussetzung und inkubieren sie mit Fluorophor-konjugierten Anti-CD81, Anti-CD9 und Anti-CD63 Antikörper und ihre entsprechenden Isotype Kontrollen (01:10 Verdünnung) jeweils für 45 min bei 4 ° C. Halten Sie 1 der Rohre als einem ungefärbten Kontrolle aber die gleiche Verarbeitung unterzogen.
  9. Fügen Sie 1 mL 3 % FBS/PBS zu jedem Rohr, für 5 min bei 580 X g Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  10. Aufschwemmen der Pellet mit 200-400 µL 3 % FBS/PBS und analysieren Sie die Probe auf das Durchflusszytometer (siehe Tabelle der Materialien) unter die entsprechenden Kanäle.

(7) Charakterisierung der Exosom Morphologie von Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)

  1. Exosom wässrige Dispersionen in entsprechenden Konzentrationen wie 1010 p/mL bei der Festsetzung der Lösung zu beheben (siehe Tabelle der Materialien) für 15 Minuten.
  2. Die Proben auf 300 mesh-Carbon beschichtet Kupfer Netze und an der Luft trocknen lassen.
  3. Negativ Färben die Proben mit 0,22 µm filtriert wässrigen Uranyl-Acetat (siehe Tabelle der Materialien) für 4 min, gefolgt von zwei 50 % Methanol/H2O waschen (siehe Tabelle der Materialien).
  4. Die Probe der Luft trocknen lassen.
  5. Die Proben unter TEM zu beobachten (siehe Tabelle der Materialien). Legen Sie die Beschleunigungsspannung bei 80 kV und die Punktgröße auf 2. Verwenden Sie Objektiv Blende mit allen Proben.

8. SiRNA Kapselung in Exosomen durch Elektroporation

  1. Pre-chill die Elektroporation Küvette (siehe Tabelle der Materialien) für 30 min vor der Elektroporation auf Eis.
  2. Mix 7,0 µg von Exosomen (32 µL von 7 x 1012 p/mL Brühe mit PBS-Puffer) mit 0,33 µg von SiRNA (12 µL 2 µM in ab Lager RNase-freies Wasser) in den Microcentrifuge Schlauch. Make up das Volumen um 150 µL mit Zitronensäure Puffer (siehe Tabelle der Materialien). Die Exosom SiRNA molare Verhältnis ist 1: 60 in diesem Fall.
  3. Übertragen Sie die Mischung auf Elektroporation Küvette. Kappe die Küvette und legen Sie sie in den Küvettenhalter der Electroporator (siehe Tabelle der Materialien). Drehen Sie das drehende Rad 180° im Uhrzeigersinn.
    Hinweis: Das Rad muss vollständig in der verriegelten Position, in der Reihenfolge für die Küvette, die Elektroden zu kontaktieren aktiviert sein.
  4. Wählen Sie das gewünschte Elektroporation-Programm (z. B. X-01, X-05, a-20, T-20, T-30, etc.) und Elektroporation durch Drücken der Schaltfläche " Start " starten.
    Hinweis: Ein erfolgreiche Puls wird durch zeigt "OK" auf dem Display angezeigt.
  5. Einmal elektroporiert, entfernen Sie die Küvette nach wieder das Rad 180° gegen den Uhrzeigersinn drehen. Die Küvette mit Kunststoff Pipette für die Weiterverarbeitung entziehen Sie die Probe.

9. Entfernen der freien SiRNA Using Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC)

  1. Equilibrate die SEC-Spalte (2,9 cm [H] x 1,3 cm [W]; siehe Tabelle of Materials) von 3,5 mL gefilterte PBS zweimal vorbei.
  2. Lösen Sie 150 μL elektroporiert Probe in 350 μL des gefilterten PBS auf und übertragen Sie diese auf der SEC-Spalte frei SiRNA Entfernung durchführen.
  3. Sammeln Sie die erste 500 μL-Fraktion, die eluiert aus der Spalte (F0).
  4. Hinzufügen der Spalte 500 μL des gefilterten PBS und sammeln Sie die nächsten 500 μL Bruchteil (F1).
  5. Wiederholen Sie die oben genannten Schritte, bis insgesamt 10 x 500 μL Brüche (bis F9) gesammelt werden. F1 und F2 sollte die SiRNA-gekapselte Exosomen enthalten.
  6. Waschen Sie die Spalte mit gefilterten PBS (zweimal, mindestens), keine Probe-Rückstände zu entfernen.

10. in-vitro- Aufnahme von SiRNA geladen Exosomen in Bowle-1 Zellen

  1. Bowle-1 Samenzellen in 24 wohlen flach-Boden-Platten (siehe Tabelle der Materialien) in einer Dichte von 50.000 Zellen pro gut 24 h vor der Aufnahme zu studieren und inkubieren Sie die Zellen in den Inkubator (5 % CO2, 37 ° C).
  2. Electroporate HEK-293 Exosomen (7.0 μg) mit Atto655-SiRNA (0,33 μg) nach Schritt 8.
  3. Reinigen Sie elektroporiert Exosom nach Schritt 9 und in 100 μl PBS aufzuwirbeln.
  4. Bowle-1 Zelle 50 μL elektroporiert Exosomen hinzu und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 4 h.
  5. Sammeln Sie Zellen nach Inkubation.
  6. Die Zellen mit 1 mL sterile PBS waschen und in 200 μl PBS in Polystyrol Rundboden Aufschwemmen Rohr (siehe Tabelle der Materialien).
  7. Zellen durch Durchflusszytometer analysiert (siehe Tabelle der Materialien) mit 10.000 Veranstaltungen pro Probe erworben.
    Hinweis: Un-elektroporiert Exosom SiRNA Mischung Proben und unbehandelten Zellen mit gefilterten PBS dienten als Kontrollen.

Representative Results

Die physikalisch-chemischen Charakterisierung von Exosomen isoliert von HEK-293-Zellen (HEK-293 Exo) sind in Tabelle 1zusammengefasst. Die Größe mit Nanopartikel tracking-Analysegerät (NTA) gemessen wurde 107.0 ± 8.2 nm. Exosom Ausbeute aus den HEK-293-Zellen, auch unter Verwendung der NTA-Instrument analysiert war 6,99 ± 0,22 x 1012 p/mL von ~ 24 mL CM (2 Runden der Ernte eingeholt). Reinheit der HEK-293-Exo bewertet durch die Berechnung der Partikel-Protein-Verhältnis (Best.) war 8.3 ± 1,7 × 1010 p/µg.

Abbildung 3Azeigt die Größenverteilung der isolierten HEK-293 Exo. Morphologische Analyse mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) zeigte der HEK-293-Exo kugelförmigen Strukturen leicht über 100 nm Größe (Abb. 3 b). Dieses Ergebnis stimmt mit dem von NTA-Messung (Abb. 3A). Die isolierten HEK-293-Exo waren positiv für CD81, CD9 und CD63, die kanonische Marker zur Identifizierung von Vesikeln als Exosomen (Abbildung 3).

Zur Reinigung von Exosomen mit Größe Ausgrenzung Chromatographie (Abbildung 4) war die Prozentsatz Erholung der Exosomen berechnet, indem die gesamte Exosom Partikelanzahl erholte sich in den 10 Fraktionen gesammelt (F0-F9) mit der ersten Exosom Partikelanzahl verwendet, während die Prozentsatz Erholung von SiRNA errechnet sich wurde durch Division der gesamten Fluoreszenzintensität gewonnenen F3, F4 und F5 mit der gesamten Fluoreszenzintensität gewonnen aus allen 10 Fraktionen gesammelt. Die Erholung der Exosom und SiRNA wurde nach Reinigung als 75,0 % und 80,4 % bzw. berechnet. Die Effizienz der Kapselung von SiRNA in Exosomen war ~ 10-20 %, anhand der SiRNA Standardkurve hergestellt (Abbildung 4).

Qualitative Analyse von in-vitro- Aufnahme von Exosomen geladen mit fluoreszierenden Atto655-SiRNA durch Durchflusszytometrie zeigte, dass Bowle-1-Zellen mit SiRNA-gekapselte Exosomen behandelt die größte Verschiebung in Fluoreszenzsignal (Abbildung 5A) aufgezeichnet . Bowle-1-Zellen mit SiRNA-gekapselte Exosomen behandelt verzeichnete einen höheren Prozentsatz der Bevölkerung positiv auf das Atto655 Signal (39,4 %) im Vergleich zu, das mit entladen Exosomen und SiRNA-Gemisch (0,56 %) behandelt, die die Beobachtung über ( bestätigt Abbildung 5 b). Der Grad der zelluläre Aufnahme von SiRNA (ausgedrückt als der Falte Unterschied im mittleren Fluoreszenz Intensitätswerte (MFI) von der unbehandelten Zellen) wurde auch beobachtet, um deutlich in Bowle-1-Zellen mit SiRNA-gekapselte Exosomen (MFI Falten behandelt werden Differenz = 5.1) im Vergleich zu jener behandelt die Exosom SiRNA-Mischung (MFI Falten Unterschied = 1,1) (Abbildung 5). Diese Beobachtungen zeigten, dass durch die Bowle-1-Zellen die SiRNA-gekapselte Exosomen verinnerlicht wurden und dass sie effektiv die SiRNA intrazellulär geliefert.

Figure 3
Abbildung 3: biochemische und Morphologie-Analyse der HEK-293 Exosomen. (A) Größenverteilung der HEK-293 Exosomen mit Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA). Die Kurve zeigt eine überlagerte Histogramm aus 3 verschiedenen fängt bei 30 s Intervall mit roten Bereiche für Standard-Abweichung zwischen den Messungen (n = 3). (B) Transmission Electron Microscopy (TEM) Bilder des naiven HEK-293 Exosomen. Maßstab: 100 nm. (C) Erkennung der Exosomal Marker CD81, CD9 und CD63 HEK-293 Exosomen Durchflusszytometrie über. Exosomen wurden an Aldehyd/Sulfat Latex Perlen vor Erkennung gekoppelt. Exosom-Perlen-Komplex wurden anschließend mit Fluorophor-konjugierten Anti-CD81, Anti-CD9 und Anti-CD63 Antikörper befleckt. Grad des Ausdrucks der Marker wird als der Falte Unterschied im Median Fluoreszenz Intensitätswerte (MFI) für das Steuerelement festlegen (Exosom-Perlen-Komplex mit den entsprechenden Isotype befleckt) ausgedrückt. Werte werden ausgedrückt als ± SD bedeuten wobei n = 3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Exosom Reinigung Post-Elektroporation. (A) Elution Profile (F0-F9) der Atto655-SiRNA und elektroporiert Exosomen mit Größe Ausgrenzung Chormatography. (B) NTA Analyse des Atto655-SiRNA und Exosom von F0 bis F9 mit Größe Ausgrenzung Chormatography. (C) die Kalibrierung-Kurve des Atto655 gekennzeichnet SiRNA. Fluoreszenz-Intensitäten stammen von Platte Leser bei Ex / Em: 640-10/680 nm; Gewinnen Sie 2800. Werte werden ausgedrückt als ± SD bedeuten (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: zelluläre Aufnahme von SiRNA-gekapselte Exosomen in Bowle-1-Zellen um 4 Uhr (A) Histogramme vergleichen zelluläre Aufnahme entladen Exosomen + SiRNA-Mischung und SiRNA-gekapselte Exosomen. (B) Vergleich der Aufnahme von unbelasteten Exosomen + SiRNA Mischung um 4 Uhr durch Pseudofarben Plot. (C) der Falte Unterschied bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI) Werte der getesteten Proben im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Werte werden ausgedrückt als ± SD bedeuten wobei n = 3. P < 0,001. NS: nicht signifikant. Einfache ANOVA war für statistische Analysen verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Exosom Größe1,2
(nm)
Ausbeute1,2,3
(p/mL)
[Protein] 2,4
(µg/mL)
Partikel-Protein (Best.) Verhältnis5
(p/µg)
HEK-293 107.0 ± 8.2 6,99 ± 0,22 x 10-12 84.3 ± 9,8 8.3 ± 1,7 x 1010 
1 gemessen mit Nanopartikel tracking-Analyse (NTA Instrument)
2 Werte werden ausgedrückt, wie meine ± SD, wobei n = 3
3 Ertrag wurde durch Zelle konditioniertes Medium gebündelt aus 2 Runden der Ernte aus Bioreaktor Kolben (~ 24 mL) erhalten.
4 -gemessen mit einem Protein Assay kit
5 Wert mittels Formel gewonnen: Best.-Verhältnis = Rendite / [Protein]

Tabelle 1: Physikochemische Charakterisierung von Exosomen.

Discussion

Eine anständige Exosom Ausbeute von kultivierten Zellen erhalten, ist die genug für mehrere Runden in Vitro oder in Vivo Studien sind immer noch eine Herausforderung. Nach Angaben des Herstellers wurden die Bioreaktor-Fläschchen für Produktion von Antikörper und Proteine mit hoher Rendite aus der Kultur der verschiedenen immortalisierte Zelllinien bestimmt. Dadurch können die Zellen kontinuierlich das Kulturmedium mit dem gewünschten Produkt, woraus sich ein konzentrierter konditionierten Medium (CM) in der Zellkompartiment bereichern. Theoretisch das gleiche Konzept wäre vorteilhaft Exosom Produktion aus verschiedenen Zelllinien, und in der Tat Kultivierung dieser Zellen im Bioreaktor Fläschchen zeigte sich die Exosom Ertrag40deutlich steigern. Die große Mediumspeicher kontinuierlich liefert Nährstoffe auf und beseitigt Abfälle aus der Zelle Fach durch eine semipermeable Membran von 10 kDa, so dass längere Kultur ohne eine große Menge von Mittel, Kontakt zu den Zellen oder regelmäßige Fläschchen ändern, die letztlich die Gesamtkosten und die Arbeit von hoch-Skala Exosom Produktion40sparen können. Es wurde auch gezeigt, dass die Morphologie, Phänotyp, sowie die immunmodulatorischen Funktionen der Exosomen Zellen isoliert sind langfristige Bioreaktor Fläschchen Kulturen ähnlich dem von Zellen kultiviert in regelmäßigen 75 cm2 Flaschen40bezogen. Kultur von anderen verewigt Zelllinien als Exosom Quellen in den Bioreaktor Kolben würde daher dazu beitragen, ihre Exosom Ertrag unter Wahrung ihrer Integrität und Funktion. Diese Form der Kultur ist jedoch nicht anwendbar auf Primärzellen mit begrenzten Bereich Zyklen, und diejenigen, die in hoher Dichte kultiviert werden kann nicht.

Da Lese der CM wöchentlich erfolgt, und die Zellen in der Kultur wurden nie passagiert, auszugehen, dass die Zellen im Bioreaktor Gefäss nicht in einem monomolekularen Film wie die regelmäßige Zellkultur wachsen. Sie sind am wahrscheinlichsten Cluster mit nekrotischen Zentren bilden, oder einfach von der Oberfläche und sterben zu lösen, wenn die Zellen auch konfluierende für einen monomolekularen Film sind. Sichtprüfung der Zellkompartiment Bioreaktor-Flasche ist nicht möglich, diese Annahme zu bestätigen, sondern spiegelt sich durch die große Zahl der toten Zellen während der CM-Ernte erhalten. Regelmäßig schlecht anhaftende und nicht lebensfähige Zellen aus dem Bioreaktor-Flasche zu entfernen kann die Ansammlung von Materialien auf die semipermeable Membran verhindern, die den Austausch von Nährstoffen, Gas, Abfall zwischen den Zellkompartiment und dem Medium beeinträchtigen können Reservoir, wodurch längere Kultur in den Bioreaktor-Kolben für > 6 Monate40. In diesem Zusammenhang, diese nicht-Regelmäßigkeit des Zellwachstums in der Bioreaktor-Fläschchen ist ideal, da wir spekulieren, dass es den tatsächlichen Zustand der Tumor Wachstum in Vivo genauer als die herkömmlichen Monolayer-Zellkultur imitiert, und es ist zu hoffen, dass die Exosomen produziert von Krebs Zellen im Bioreaktor Gefäss, die abgesondert von Tumoren in Vivoähnlich wäre. Dies wäre besonders vorteilhaft in Studien, die in die Rolle des Tumor-abgeleitete Exosomen in der Progression der Tumor Pathologie. Tumor-abgeleitete Exosomen intrinsisch und bevorzugt nach Hause, ihr Gewebe von Ursprung32berichtet worden, daher mit Exosomen produziert in einem System imitiert ihre in Vivo Produktion wäre auch wünschenswert in Studien erkunden targeting Passivfähigkeit Exosomen als Medikament darin.

Best.-Verhältnis wurde als Parameter zur Beurteilung der Reinheit der isolierten Exosomen von kontaminierende Proteine aus dem Kulturmedium des physiologischen Flüssigkeiten aus denen Exosomen von41bezogen wurden berichtet. Das Best.-Verhältnis von 8.3 ± 1,7 × 1010 p/µg dieser Studie fällt im Bereich hoher Reinheit in der Studie vorgeschlagen. Dieses Verhältnis zeigt die Gefahr der Verwendung Proteinkonzentration Ausdrücken der Ausbeute oder Dosis von Exosomen isoliert oder in nachfolgenden Studien bzw. verwendet, wie dies nicht die wahre Höhe der Exosomen in der Probe, die angesichts des Problems des Proteins zur Verfügung spiegelt Kontamination während der Isolation. NTA über Instrumente wie NanoSight, die die Konzentration von Exosomen in Bezug auf die Partikelanzahl misst, ist eine vernünftige und korrekte Weise Exosomen zu quantifizieren.

Sehr genaues Wägen bei der Vorbereitung der 25 % Saccharose-Lösung in Deuteriumoxid ist entscheidend, da diese Methode eine Dichte-basierte Isolation ist. Exosomen haben einen eher schmalen Flotation Dichteumfang in Zuckerlösung so präzise Vorbereitung der Saccharose Kissen Kontamination nicht Exosomal Vesikel wie Apoptotic Körper oder abgeleitet von Golgi-Vesikel während Isolierung42verringert wird. Es wird empfohlen nicht, halten übrig gebliebene Saccharoselösung und benutze es auch nach einem Tag um Gefahr Faktoren, die seine Dichte wie Verlust ändern kann oder Zugabe von Wasser in der Lösung zu vermeiden durch Verdampfung oder Kondensation von Luft in die Röhre. Ein ausschwenkbares Rotor dient auch bei der Zentrifugation auf Saccharose Kissen auch Migration von Exosomen von den CM der Saccharose-Lösung zu ermöglichen.

Aberkennung der Saccharose-Lösung nach Zentrifugation ist auch eine heikle Schritt, und es handelt sich um einen Kompromiss zwischen maximiert die Menge der Exosomen erholt und nicht zu viel Protein aus Kulturmedium zurückgezogen Exosom Probe eingeführt ist . Die Schnittstelle zwischen der Zuckerlösung und dem Zustand Medium ist Proteine aus dem Kulturmedium nach Zentrifugation sammeln würde, wobei in der Regel als ein dunkles Braun Ring, der sitzt auf der Oberfläche gesehen werden können. In unseren Händen ist die ersten 3 mL hinzugefügt 2 mL des Kissens Saccharose entziehen die optimale Lautstärke, die mit den oben erwähnten Kompromiss einverstanden ist. Die Bände, die in diesem Protokoll beschrieben werden für die spezifischen Rotoren verwendet; Daher ist es ratsam, die Lautstärke von Saccharose zu zurückgenommen werden, wenn nach oben oder unten die Volumina für die Arten von Rotoren in verschiedenen Einrichtungen verfügbar Skalierung zu optimieren. Es ist auch wichtig, die direkt in der Mitte der Unterseite des Rohres zu vermeiden, als Saccharose, zurückziehen, wie das ist, wo Partikel höhere Dichte als Saccharose Sediment werden und kann in der Regel als eine wollweiße Pellet betrachtet werden.

Waschschritt mit einer relativ großen Menge an PBS hilft um Protein Verschmutzungsgrad während Exosom Isolierung41weiter zu reduzieren. Dieser Schritt ist ebenfalls wesentlich entfernen überschüssige Saccharose aus Exosomen osmotische Schäden an den Exosomen zu vermeiden, selbst oder die Biomoleküle innerhalb der Exosomal Lumen, sowie die Verringerung des Risikos für bakterielle oder pilzartige Wachstum die Exosom vorrätig. Vorbereitung der Zuckerlösung in Deuteriumoxid anstatt Wasser hilft, die Reduzierung der Saccharose benötigt, um die Exosom Flotation Dichte für die Isolierung zu erreichen, damit Verringerung der Gefahr von osmotische Schäden und mikrobielle Kontamination. Nach der ersten Zentrifugation auf den Saccharose-Kissen, die Exosom-haltigen Saccharose Schicht zurückgezogen und hinzu kommt die PBS kann bei 4 ° C gelagert und am nächsten Tag bearbeitet, wenn mit zeitlichen Einschränkungen konfrontiert.

Nach bestem Wissen und gewissen ist das Exosom/SiRNA molare Verhältnis ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Effizienz der Elektroporation. In diesem Protokoll haben wir als die Exosom, SiRNA Molverhältnis 1: 60 verwendet. Wie unterscheiden sich die Kapselung Fähigkeit der verschiedenen Arten von Exosomen, empfehlen wir dies auf einer Schachtel-durchschachtel Grundlage optimiert werden. Die Kapselung Effizienz schlug hierin kann jedoch immer einen Parameter für die Auswahl der optimalen Elektroporation Bedingungen.

Darüber hinaus wird die Aggregation von SiRNA geglaubt, um eines der häufigsten Probleme in Elektroporation werden. Es ist erwiesen, dass die Elektroporation starke Aggregation von SiRNA, macht es noch schwerer zu Exosomen geben induzieren kann. SiRNA Aggregationen werden oft fälschlicherweise interpretiert, wie Kapselung von SiRNA in Exosom daher geeignete Kontrollen wurden in dieser Studie verwendet, wie die Bildung von SiRNA Aggregate während Elektroporation28unvermeidbar ist. Die Prozentsatz Kapselung Effizienz unserer Reinigung Methode war berechnet, indem normalisierte Werte Einfluss aus anderen Quellen wie z. B. Lärm, Exosom und SiRNA Aggregationen Hintergrund zu minimieren, die die Zuverlässigkeit der Daten beeinträchtigen würde. Auf der Grundlage unserer Erkenntnisse gab es vernachlässigbar SiRNA Aggregationen in der Steuerung Probe z.B. mit elektroporiert und un-elektroporiert SiRNA beobachtet.

Dieses Protokoll hat die Verkapselung von SiRNA in Exosomen erfolgreich unter Beweis gestellt und ihre intrazellulären Nachlieferung der SiRNA zu Krebs Zellen in Vitro. Daher können verschiedene Arten von Exosomen aus verschiedenen Zelllinien werden isoliert und mit der vorgeschlagenen Protokolls charakterisiert und anschließend mit verschiedenen therapeutischen SiRNA für verschiedene Arten von onkogenen Ziele stark ausgedrückt in verschiedenen Krebsarten geladen. Eine interessante Anwendung wäre die SiRNA Delivery und Aufnahme Effizienz mit verschiedenen Permutationen der Exosom Quelle-Ziel Zelle paar in Vitrozu erkunden. Dies kann dann in Tiermodellen zur Bewertung der Effizienz der Lieferung und therapeutische Effizienz der SiRNA-gekapselte Exosomen übersetzt in-vivo.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgements

F. N. Faruqu wird von der malaysischen Regierungsagentur Majlis Amanah Rakyat (MARA) finanziert. L. Xu ist ein Empfänger von Marie Sklodowska-Curie Einzelstipendien (Horizont 2020) (H2020-MSCA-IF-2016). K. T. Al-Jamal erkennt Finanzierung von BBSRC (BB/J008656/1) und Wellcome Trust (WT103913). Die Autoren möchten auch Dr. Paul Lavender und Dr. David Fear (Department of Respiratory Medicine und Allergie, Kings College London) Danke für die Bereitstellung der Electroporator.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.

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