新鲜分离和内联小鼠脑内皮细胞内钙和膜电位的同时测量

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Biology

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Summary

这里演示的是 (1) 新鲜隔离完整的大脑内皮 "管" 和 (2) 同时测量内皮钙和膜电位的协议, 在内皮衍生的超极化过程中。此外, 这些方法允许药理调节内皮细胞钙和电信号作为个人或交互式实验变量。

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Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

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Abstract

大脑动脉及其各自的微循环通过血液流动调节向大脑输送氧气和营养物质。内皮细胞排列血管腔, 并根据需要控制血管直径的变化, 以满足神经元的代谢需求。膜电位 (vm) 和一氧化氮超极化的初级内皮依赖性信号通路通常平行调节血管扩张, 从而增加血液流动。虽然在几个毫米的血管长度的血管扩张协调不可或缺的一部分, 内皮衍生的超极化 (edh) 的组成部分一直是很难测量的历史。edh 的这些成分包含细胞内 ca2 + [ca2 +]i增加并随后激活小型和中间电导 ca2 +-激活 k + (skca/ik ca)通道.

在这里, 我们提出了一个从小鼠大脑动脉中分离新鲜内皮细胞的简化说明;同时测量内皮 [ca2 +] i 和 v m 分别使用 fura-2 分光光度法和细胞内尖锐电极;以及在生理条件下 (ph 7.4, 37°c) 下盐溶液和药理剂的连续超融合。从威利斯圆环的脑后动脉被移除后部沟通和基底动脉。经清理的脑后动脉段的酶消化和随后的三口治疗有助于切除外膜、血管周围神经和平滑肌细胞。然后, 在显微镜下固定下断陷的后脑动脉内皮 "管", 并在连续超融合的情况下使用相机、光电倍增管和一到两个静电计进行检查。总之, 这种方法可以同时测量在离散细胞位置的内皮 [ca2 +]i和 vm 的变化, 除了通过间隙连接传播 edh, 直到毫米的距离沿完整内皮。这种方法有望产生一个高通量分析大脑内皮功能的基础机制的血液流动调节在正常和患病的大脑。

Introduction

血管网络1中脑动脉和动脉之间血管舒张的协调调节整个大脑的血液流动.大脑阻力动脉内的内皮细胞根据需要控制血管直径的变化, 以满足神经元1,2,3的代谢需求。特别是在内皮细胞产生的超极化 (俗称 edh) 期间, 细胞内 ca2 + ([ca2 +]i) 和内皮细胞中的电信号键协调内皮细胞之间的血管舒张作用。周围的平滑肌细胞通过缝隙连接动脉放松4。edh 的生理启动顺序意味着刺激 gq偶联受体 (gpcr), 增加 [ca2 +]i, 激活内皮小和中-钙 2 + 激活 k+(skca/ik ca)通道超极化脑血管电位 (vm)5,6,7。因此, 内皮 [ca2 +]i和 vm 之间的亲密关系是血液流动调节的组成部分, 也是心脑血管功能68 不可缺少的。在广泛的文献中, 大量的研究报告了血管内皮功能障碍与慢性病的发展 (如高血压, 糖尿病, 心力衰竭, 冠状动脉疾病, 慢性肾功能衰竭,外周动脉疾病)9,10, 表明研究内皮功能在生理和病理条件的意义。

血管内皮是产生超极化、血管扩张和组织灌注的组成部分, 因此, 检查其自身的自身特性至关重要。作为一般的研究模型, 小鼠动脉内皮管模型的制备已发表之前为骨骼肌11,12, 肠 13,14, 最近为大脑6。特别是同时进行的 [ca2 +]i和 vm 测量的研究已经发表了骨骼肌动脉内皮 15,16以及淋巴管内皮细胞 17.除了使用内皮管方法的初步研究外, 还可以参考对其优缺点全面审查, 8 以确定这一实验工具是否适合于特定的研究。简而言之, 一个优点是保留了内皮细胞功能的关键生理成分 (例如, ca2+流入和细胞内释放, vm 的超极化到 nernstk +的潜力通过skca/ikca 激活, 和内皮细胞间耦合通过缝隙连接), 没有混淆因素, 如血管周围神经输入, 平滑肌电压门控通道功能和收缩力,血液循环, 和荷尔蒙的影响8。相反, 常用的细胞培养方法在形态 18和离子通道表达19方面有显著的改变, 这种改变可以极大地模糊与在体内确定的生理观察的比较。在体内。限制包括缺乏与调节血液流动的其他基本成分的整合, 如平滑肌和实验时间表中的灵活性受限, 因为该模型在完整的血管段隔离4小时内进行了最佳测试从动物。

根据 socha 和 segal12编写的前一段视频协议以及在中间61516 的最新实验发展, 我们在此演示了从后脑动脉和同时测量内皮 [ca2 +]i和 v m分别使用 fura-2 分光光度法和细胞内尖锐电极。此外, 这项实验需要在生理条件下 (ph 7.4, 37°c) 持续超融合盐溶液和药理剂。我们选择了大脑后动脉, 因为它产生的是具有结构完整性 (细胞通过缝隙连接结合) 和足够尺寸 (宽度≥50μm, 长度≥300μm) 的孤立内皮, 适合细胞内和细胞间信号。内皮细胞。此外, 啮齿类动物大脑后动脉的研究在文献中得到了大量的体现, 包括对基本内皮信号机制、血管发育和病理20的检查,21,22. 这一实验应用预计将产生对大脑内皮功能 (和功能障碍) 的高通量分析, 从而使整个过程中对血液流动调节的理解有重大进展。衰老和神经退行性疾病的发展。

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Protocol

在进行以下实验之前, 请确保所有动物护理使用和协议都得到机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 的批准, 并按照国家研究委员会的"动物护理和使用指南" 进行。实验动物" (第8版, 2011) 和 arrive 指南。洛玛·琳达大学的 iacuc 已经批准了这份手稿中用于雄性和雌性 c57bl6 小鼠的所有协议 (年龄范围: 3至30岁)。

1. 设备和材料

请注意:协议所需材料的详细信息可在"材料表"、 "试剂" 以及与相关供应商关联的手册或网站中找到。

  1. 流动室
    1. 将超融合室与玻璃覆盖底部固定在阳极氧化铝平台上。将带箱体的平台固定在一个紧凑的铝制舞台上。
    2. 在铝舞台上的平台两端设置一个微型机械手, 用于固定移液器。
      请注意:作为一个实用的选择, 使用这种可转移的舞台装置与流动室单位固定, 以促进从隔离的内皮管的过程中的性能的实验。
  2. 显微镜
    1. 使用配备光纤光源的立体显微镜 (5倍至50x 放大范围) 进行宏观和微解剖程序。
    2. 对于内皮管的制备, 请使用配有相对比度或差分干涉对比度 (dic) 兼容目标 (10倍、20x 和 40x) 和铝级的倒置显微镜。
    3. 要将内皮管与部分消化的血管分离, 请将微注射器泵控制器置于内皮管制备装置旁边。
    4. 对于实验设备, 除了荧光目标 (20x 和 40x, 数字孔径 0.75) 和振动隔离台上的手动铝级外, 还使用配备标准目标 (4倍和 10倍) 的倒置显微镜。
  3. 细胞内记录设备
    1. 要记录隔离内皮管中内皮细胞的 vm,请将静电计连接到兼容的头部。如有必要, 将功能发生器或刺激器连接到静电计, 以进行需要电流注入的实验。
    2. 将放大器输出连接到数据采集系统、可听到的基线监视器和示波器。在实验过程中, 将参考电极 (ag/agcl 颗粒) 固定在流动室出口附近。
    3. 使用带有荧光系统接口、高强度电弧灯和电源、超开关、光电倍增管 (或 pmt) 和相机的集成组件的光度测量系统来测量内皮细胞中的 [ca2 +]i
    4. 在整个实验过程中, 使用配备内联加热器的温度控制器来提高和保持生理温度 (37°c)。
    5. 使用连接到带有内联流量控制阀的阀门控制器的六个水库平台, 以控制将相应的溶液输送到固定在腔内的内皮管。
  4. 微移液器和尖锐电极
    请注意:为了制造用于分离内皮管的三化和机械稳定的移液器, 使用电子拉拔器和微型锻造器进行破碎和火焰抛光。
    1. 要将外膜、平滑肌和内皮管与部分消化的动脉段分离, 请使用硼硅酸盐玻璃毛细管和火焰, 准备适当的三尖移液器 (每个移液口直径为 80–120μm)擦亮尖端。
    2. 为了将内皮管固定在超融合室的底部, 请使用带钝的球形端的移液器 (热抛光, 100-150μm 的 od; 由薄壁硼硅酸盐玻璃管制备)。
    3. 要记录内皮细胞的 vm,请使用电子拉拔器从玻璃毛细管制备具有约 150±30 mω抗尖端电阻的尖锐电极。

2. 溶液和药物的制备

  1. 生理盐溶液 (pss)
    1. 对于一个药物制剂的实验, 使用: 140 mm ncl、5 mm kcl、2 mm ccl 2、1 mm mgcl 2、10 mm n-2-羟基哌嗪-n '-2-乙氨酸 (hepes)和 10 mm 葡萄糖制备 pss。
    2. 为准备解剖、脑动脉隔离和内皮管制备所需的溶液, 制备缺乏 ccl 2 (零 ca2 + pss) 的 pss.
    3. 准备超纯去离子化 h2o 中的所有溶液, 将 ph 值调整到 7.4, 通过过滤器 (0.22μm 孔径) 对其进行灭菌, 并确保溶液的渗透性在290至 300 mosm 之间。
      请注意:溶液可在4°c 下储存约两周。
  2. 10% 牛血清白蛋白 (bsa)
    1. 制备 10% bsa, 将1克冻干粉溶解到10毫升零 ca 2+ pss 的烧杯中。
    2. 用石蜡膜覆盖烧杯, 并允许几个小时的时间通过, 缓慢搅拌的 bsa 溶解。
    3. 使用10毫升注射器加0.22μm 过滤器过滤最终溶液, 并使1毫升的脂肪储存在-20°c。
  3. 解剖解决方案
    1. 要制备50毫升的解剖溶液, 请在 49.5 ml 零 ca 2+ pss 中加入500μl 的 bsa (10%)。
    2. 准备后, 立即将这一解剖溶液转移到培养皿中进行动脉解剖。
  4. 分离解决方案
    1. 要制备50毫升的离解溶液, 请在 49.5 ml 零 ca2 + pss 中加入5μl 的 ccl 2 (1 m) 和500μl 的 bsa( 10%)。允许溶液在室温 (rt) 下放置。
    1. 对于动脉段的部分消化, 用 0.31 mg/ml 木瓜、0.5 mg/ml 二硫霉醇、0.31 mgml 胶原酶 (h 型共混物) 和 0.31 mg/ml 弹性酶制备1毫升的消化溶液。
      请注意:酶活性可能不同;然而, 对于我们成功的协议, 商业提供的酶活性已被使用如下: 木瓜蛋白酶≥10 units/mg;胶原酶≥1 units/mg mg, 用于 n-[3-(2-furyl) 丙烯酸酯]-leu-gly-pro-ala 或 fabgpa 基板周转;和弹性酶≥5 units/mg mg。
  5. fura-2 的制备及药理作用剂
    1. 在 dmso 中制备富拉-2 am 染料的库存浓度 (1 mm)。在 495μl pss 中加入5μl 的库存进行加载, 以制备工作浓度 (10μm)。
    2. 酌情在 pss 中制备≥50毫升的药理剂 (如 atp) 的工作浓度。
  6. 实施解决方案
    1. 准备一个导电溶液, 2m kcl, 通过溶解 kcl 在去电离 h2o (7.455 g kcl 在 50 ml h2o)
    2. 在回填尖锐电极之前, 通过0.22μm 注射器过滤器对溶液进行过滤。
  7. 碘化钾 (0.1%)
    1. 在 2m kcl 的10毫升中溶解10毫克的碘化氢冻干性钠。
    2. 混合好, 存放在 rt。

3. 脑动脉的解剖和分离

请注意:所有解剖程序都需要通过立体显微镜和光纤光源提供的照明来放大试样 (高达 50x)。要执行大脑和动脉隔离的解剖程序, 请使用锐化的解剖仪器。用于隔离和清洁动脉的微解剖工具包括锐化的细尖钳和 vannas 风格的解剖剪刀 (3 至9.5 毫米刀片)。

  1. 小鼠大脑的分离
    1. 通过吸入异氟醚 (3% 2-3分钟) 对 c57bl6 小鼠 (3-30个月大; 男性或女性) 进行麻醉, 然后在完全诱导麻醉后立即将动物斩首。将头部放在一个培养皿中 (直径为10厘米, 深度1.5 厘米), 在立体显微镜下含有冷 (4°c) 零 ca2 + pss。
    2. 通过显微镜观察, 去除头骨上的皮肤和头发, 用冷零度 ca2 + pss 去除过多的血液。仅使用标准解剖剪刀的尖端 (例如, 24 毫米刀片) 进行切口, 从枕骨开始, 向上延伸到颅骨的鼻骨。
    3. 用粗尖的钳子小心地打开切口的头骨, 并分离结缔组织, 用完整的威利斯圆圈隔离大脑。
      请注意:或者, 利特托骨切割钳可以用来打开头骨和暴露大脑。
    4. 用冷零 ca 2+ pss 在烧杯中轻轻清洗孤立的大脑, 以去除血液。将前脑侧朝上放置在含有冷解剖溶液的腔内, 用于脑动脉的隔离 (图 1a)。
  2. 脑动脉的分离
    请注意:该方案选择大脑后动脉作为具有代表性的脑血管内皮研究模型。
    1. 使用不锈钢引脚 (直径 0.2 mm, 长度 ~ 11–12 mm) 将隔离的大脑固定在冷解剖溶液中, 插入玻璃 petri 培养皿底部 (深度≥ 50 cm) 的含焦硅聚合物涂层中。
    2. 为了在解剖过程中保持 pss 的冷却温度, 请使用由制冷剂系统冷却的解剖室, 不断循环1:1 水-乙二醇混合物。或者, 可以在新鲜的冰上进行解剖。
    3. 使用微解剖仪器 vannas 风格的剪刀和锐化的细尖钳, 将大脑后动脉 (~ 0.3 至0.5 厘米段, 无轴向张力) 与后部通信和基底动脉隔离开来 (图 1 b)).使用不锈钢引脚 (直径0.1 毫米, 长度 ~ 13–14毫米), 以固定两个孤立的大脑后动脉在解剖溶液中的培养皿 (图 1c)。
    4. 通过使用锐化的细尖钳切除结缔组织, 仔细清洁孤立的大脑后动脉 (图 1d)。将完整的动脉切割成部分 (长度为 1-2 mm), 用于酶消化 (图 1d; 插入)。

4. 内皮管和超融合的制备

请注意:内皮管是按照前面述的12准备的, 对大脑动脉进行了修改6。

  1. 使用配备目标 (10倍、20x 和 40x) 的显微镜、相机以及装有室内和微机械手的铝制舞台准备三体装置。用与舞台和试样相邻的泵控制器固定微注射器 (图 2a)。
  2. 完全回填用矿物油的三口移液器, 并将其固定在微型注射器活塞上。然后, 使用带有泵控制器的微注射器, 将离解提取到矿物油顶部的移液器 (~ 130 nl) 中, 同时确保移液器中没有气泡。
  3. 将完整的动脉段放入 10 ml 玻璃管 (图 2b) 中的离解溶液中, 含有 0.31 mg/ml 木瓜、0.5 mg/ml 二硫霉醇、0.31 mg/ml 胶原酶和 0.31 mg/ml 弹性酶。在34°c 下孵化 10-12分钟, 进行部分消化。
  4. 消化后, 用 ~ 5 毫升的新鲜离解取代酶溶液。使用1毫升移液器, 将一个段转移到包含 rt 离解的腔中。
  5. 将移液器放入腔内的离解液中, 并将其放置在被消化容器的一端附近。在泵控制器上设置2到 5 nls 的速率, 以实现温和的三化 (图 2c; 插入)。
  6. 在通过100x 到200x 的放大倍率观察时, 提取并弹出动脉段, 以分离平滑肌细胞, 同时产生内皮管。如有必要, 请小心使用细尖钳将离解的外膜和内部弹性层与内皮管分离。确认所有平滑肌细胞都是分离的, 只有内皮细胞保持为完整的 "管" (图 2c)。
  7. 使用微机械手, 使用硼硅酸盐玻璃固定移液器, 将内皮管的每一端固定在超聚变室的玻璃盖上 (图 2d)。
  8. 洗脱外膜和平滑肌细胞从腔内, 并取代离解 2 mm ccl 2 pss.用固定内皮管将移动平台转移到超融合和实验钻机的显微镜上。
  9. 在实验期间, 使用6清洁50毫升的水库 (图 3 a) 在实验期间连续输送 pss 和相应的药物溶液。使用内联流量控制阀手动设置整个流量与层流一致, 同时将流量进给与真空吸力相匹配。在记录背景数据和染料负荷之前, 将 pss 输送到腔内 (图 3b), 用于热融合内皮管≥5分钟。

5. 染色、洗涤和温度设置

  1. 打开用于测量 [ca2 +]i的测光系统的所有组件。使用实验设备上的显微镜 (图 3c) 以400x 放大倍率查看内皮管, 并使用测光系统软件套件聚焦于光度窗口中的细胞。
  2. 在340和380纳米 (≥10 hz) 的交替激发过程中, 测量内皮管的直径并记录与 510 nm 发射一致的背景自荧光值。
  3. 要测量 [ca2 +]i响应, 请在 rt 上用 fura-2 am 染料 (10μm 最终浓度) 加载内皮管, 并在没有光线的情况下允许约30-40分钟。
  4. 重新启动内皮管与新鲜 pss 的超融合约30-40分钟洗出多余的染料, 并允许细胞内 fura-2 am 去酯化。在冲洗过程中, 使用带有内联加热器的温度控制器 (图 3 a) 将温度从 rt 逐渐提高到 37°c, 然后在整个实验过程中保持在37°c。
    注: 建议 rt 到37°c 之间的增量转换需要三个步骤 (例如, 5°c), 每个步骤的平衡时间为≥5分钟。

6. 同时测量 [ca2 +]i和 vm

  1. 打开所有其他设备和测量 vm 的静电计软件套件 (参见图 3,图 4)。相应地调整数据采集速率 (≥10 hz)。
  2. 拉一个尖锐的电极和回填与 2m kcl。对于通过染料转移进行细胞间耦合的研究, 将微电极填充在 2m kcl 中溶解0.1% 的碘化物。
  3. 将电极固定在带有微机械手固定的电管理器头级的移液器支架上涂有氯化物的银线上。使用微机械手将电极的尖端短暂地定位到腔内流动的 pss 中, 同时通过4倍目标观察。
  4. 将休息的 vm 设置为 0, 使其与接地的沐浴电位一致。将电极尖端放置在内皮管的细胞上。如果需要, 请使用链接到静电计的可听到基线监视器, 将声场与潜在的录音相关联。
  5. 使用40x 目标将放大倍率增加到 400x, 并根据需要重新定位电极尖端。使用测光软件调整光度窗口, 将焦点集中在 ~ 50 到80个内皮细胞上。
  6. 用微机械手轻轻地将电极放入内皮管的细胞之一, 等待≥2分钟才能稳定休息的 vm.同样, 将第二电极插入另一个电池 (距离≥100μm), 而不是与第一电极接触的第一个电池。
  7. 一旦静息 vm 在其预期值 (-30 至-40 mv)6时稳定, 在没有光线的情况下打开荧光界面上的 pmt, 并开始获取细胞内 [ca2 +]i由刺激的 fura-2 交替 (10 hz) 在340和 380 nm, 而在 510 nm 收集荧光发射。
    请注意:为了测试细胞间的电耦合, 电流 (±0.5-3 n a, ~ 20s 脉冲持续时间)可以通过一个静电计作为 "站点 1" 传递, vm 的变化可以用另一个静电计记录为 "站点 2" (距离≥100μm)。
  8. 一旦建立了 vm 和[ca2 +]i 的同时测量, 在药物应用前, 允许 ~ 5分钟的内皮管与 pss 的超融合。
  9. 将 pss 中制备的药物 (如 atp) 应用于流量恒定的超融合室。约3分钟后 (或适合药物动力学的一段时间) 后, 用 pss 清洗至 vm f340/f380 比率返回到其基线条件。在解决方案的每次转换过程中, 将各自的录音标记为在分光光度计和静电计软件套件之间的时间同步。
  10. 实验完成后, 使用微机械手从电池中取出电极, 并注意到浴电极所引用的 vm ~ 0 mv。停止 vm 和[ca2 +]i 的相应录制, 并将记录保存在文件中进行数据分析。

7. 细胞间耦合的可视化

  1. 通过碘化物可视化细胞间耦合, 请使用具有相对较高的数值孔径 (例如 0.95) 的40x 或60x 荧光目标和带有固态照明的罗丹明过滤器 (高分辨率摄像机) (例如, 16-百万像素) 和成像软件套件。

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Representative Results

上述协议的示意图如所附数字所示。图 1 a显示了从年轻成年雄性 c57bl/6n 小鼠 (5个月) 中分离出的大脑。脑后动脉从威利斯的圆圈仔细分离, 在没有结缔组织的情况下切除, 并切割成段 (图 1b-d)。从部分消化的动脉段, 完整的内皮管产生, 并固定在玻璃盖滑使用固定移液器。采用两个固定移液器进行温和的机械拉伸, 以近似体内线性长度, 而不具有血管扭矩。这一点已在手稿中得到进一步澄清 (图 2a-d)。从大脑后动脉中分离出的内皮管宽度约为 90–100μm, 长度为≥300μm。管装有 fura-2 am, 然后用 pss 冲洗。通过 ca2 +分光光度法以及尖锐电极电生理学 (如图 3和图4所示的实验台) 同时测量内皮管中的 [ca 2 +] i 和vm.

在生理条件下, 应用传统的内皮 gpcr 激动剂 (如 atp) 对血管内皮管进行功能评估。如图 5所示, [ca2 +]i和 vm 在响应 atp (100μm) 时同时记录。vm ( ≥5 mv) 的显著超极化伴随着细胞内 [ca2 +]i的增加, 这表明 [ca2 +]i的增加激活了 skca/ik ca通道从而使 x+外排穿过质膜产生 edh。在我们最近发表的著作中可以找到使用电流注入 (±0.5 至 3 na, ~ 20s 脉冲) 的细胞间耦合的证据 (参考6, 图 1)。请注意, 碘化钠的质量为 ~ 668 da, 指的是已知通过缝隙连接点的第二信使, 如肌醇三磷酸 (ip3, ~ 420 达), 环腺苷单磷酸酯 (camp, ~ 329 da)。

Figure 1
图 1: 从大脑中分离大脑动脉.(a) 在脱除溶液中, 用完整的动脉隔离的大脑 (白色箭头表示大脑后动脉)。(b) 大脑后动脉的放大视图 (白色箭头; ~ 3倍 vs.a 小组)。(c) 在标本盘中使用不锈钢引脚固定的孤立的大脑后动脉。(d) 切除结缔组织后的脑后动脉。插网显示动脉的切割段;刻度栏 = 500μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 脑内皮管的制备.(a) 用于对部分消化的动脉段进行试验的设备;a = 微机械手, b = 用于制备管的室, c = 铝级, d = 微注射器, e = 显微镜, f = 微注射器泵控制器。(b) 酶消化溶液中的动脉段 (白色箭头)。(c) 经三化制备的内皮管;a = 过度式移液器, b = 完整的内皮管。插入显示了切除外膜和平滑肌细胞的三化过程;刻度杆 = 100μm. (d) 固定在玻璃盖滑上的完整的内皮管, 并固定移液器;a = 固定移液器, b = 直径约100μm 的完整内皮管. 请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 超融合和同步设备 [ca2 +]i和 v量.(a) 用于内皮管的超融合和温度控制的设备, a = 高强度 arc 灯电源, b = 荧光系统接口, c = 温度控制器, d = 超融合系统的六个水库, e = 光纤光源, f = 阀门控制器, g = [ca2 +]i分光系统的超开关。(b) 超聚变室装置;a 和 b = 头级, c = 接地电极, d = 内联加热器, e = 超融合管, f = 真空吸力, g = 超融合室, h = 铝级保持室。(c) 隔振台上的实验平台;a = 带照相机的单元框架适配器, b = 显微镜光, c = 显微镜, d = 铝级, e = 用于头部控制的微机械手, f = 隔振表。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 操作电生理和数据记录的设备.a = 示波器, b = 函数发生器, c = 可听到基线监测仪, d = 50/60 hz 噪声滤波器, e 和 f = 静电计, g = 数据采集系统。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 同时 [ca2 +]i和 v录音.(a) 小鼠脑动脉内皮管的微分干涉对比图像 (400x), 使用40x 目标在光度窗口中进行实验调整。一个尖锐的电极被放置到一个细胞中, 如图所示 (白色箭头)。(b) 用于同时测量 f340/f 380 比 (顶部) 和 vm (底部) 以响应 atp (100μm) 的原始痕迹。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

根据最近的发展 6,15,16, 17, 我们现在演示的方法, 分离小鼠脑动脉内皮, 准备同时测量 [ca2 +]i和 vm 在37°c 下始终为 ~ 2小时的 edh 基础。虽然技术上困难, 但我们也可以测量细胞间耦合 (参见参考6, 图 1)。通过这种方式, 我们可以同时测量离散和传导信号事件。有关隔离小鼠动脉内皮细胞时面临的一般挑战的说明, 请参考文献11,12。我们强调分离小鼠大脑动脉的关键步骤, 我们对内皮 [ca2 +]i 和 v m 的特殊测量, 排除故障的建议, 以及考虑到其他方法实验强度/下面的弱点。

大脑后动脉需要仔细隔离从威利斯圈和结缔组织没有损害平滑肌和内皮细胞。手术工具 (钳子和剪刀) 应适用于小鼠微循环解剖程序, 同时保持干净, 锋利的边缘。相对于骨骼肌12, 我们减少了酶孵育的时间周期三分之二, 并将木瓜蛋白酶、胶原酶和二硫霉醇的浓度减少了一半, 同时增加了经验优化的弹性酶浓度。为了在分离大脑动脉内皮管方面取得持续的成功, 重要的是要分批从一个信誉良好的供应商那里订购酶 (2 至4瓶), 他们的制造实践与使用频率和保质期一致。即使酶活性有可能从大量酶到下一次酶的变化, 也建议在10到12分钟内优化消化时间的同时保持酶的浓度。值得注意的是, 在我们的经验中, 动物的性别和年龄 (3至30个月) 都不是从大脑动脉中制备孤立内皮细胞的重要障碍。因此, 建议在年龄和性别研究中, 酶鸡尾酒的组成和酶消化时间保持不变。

正如所强调的, 在温和的三化和分离的内皮细胞外膜和纺丝状平滑肌细胞, 以避免损害内皮细胞12。对于三化步骤, 粘性矿物油作为微注射器活塞和水 pss 之间的液压介质, 以便提取或排出沐浴在 pss 中的容器段。需要注意的是, 如果容器段接触矿物油, 则必须使用连续回填矿物油和 pss 的清洁三口移液器重复这一步骤。在实验之前, 建议尽可能将体内近似线性的长度恢复到内皮管, 即单个细胞具有 "扁平" 的纵向形态 (例如, 直径 ~ 5μm; 长度 ~ 100μm;厚度 ~ 0.5μm)8。但是, 轴向张力不应施加到样品边缘的细胞从相应的固定移液器下方抽离的程度, 从而损害机械稳定性, 以便在...... 期间进行可靠的细胞测量。实验。

该技术中使用的光度测量 [ca2 +]i测量系统适用于使用比例测量的内皮 [ca2 +]i 。单个协议通常可以持续≥ 10分钟, 而不会有明显的光漂白。此外, 我们通常使用这种方法来测量 [ca2 +]i,因为它可以在数据采集中及时暂停, 并根据需要频繁移动显微镜目标, 以确保 vm 测量的尖锐电极。请注意, 这是一种光度测量方法, 它只捕获多个单元格中的全局平均 [ca2 +]i 。一般来说, 对于 [ca2 +] i测量, 我们建议使用测光来初步表征内皮细胞对药理剂的反应 (例如,峰值和高原阶段的时间过程), 同时确保计划使用标准共聚焦或多光子显微镜1223对微域信令事件进行定量。

尖锐电极电生理学方法适用于生理多细胞制剂中的综合 vm 记录。细胞内 vm 的测量是迄今为止最具技术挑战性的许多关键步骤, 可以促进或抹杀测量的成功。首先, 实验人员需要确定玻璃拉拔器上的最佳程序条件, 以便持续制造尖端电阻约为 150±30 mω的尖锐电极。使用灯丝热斜坡测试读数作为参考, 建议实验人员根据经验确定参数, 特别是在 "热" 设置的变化方面, 同时最大限度地延长拉力时间。其次, 微机械手、机头、移液器支架和试样的机械稳定性是绝对关键的。除了明显需要隔振表之外, 实验人员还需要确保所有配件都是安全的, 并且机械手周围和下面的舞台区域是干净的。理想情况下, 应将外部噪声降低到尖锐电极记录分辨率在 1 mv 以内的程度。根据我们的经验, 最常见的噪声源是固定在需要足够氯化物涂层或完全更换的移液器支架中的银线。如果常见的 50/60 hz 噪声存在, 则可以使用 "嗡嗡声静音" 技术, 并采用现代静电计作为标准。如果噪音完全无法控制, 请检查在浴缸中是否有泄漏或溢出, pss 将与电阻器接触以进行温度控制。如果获得稳定的 vm 信号仍然存在并发症, 请检查电源线和 t 连接器的完整性。

总之, 如果建立尖锐的电极记录不成功, 通常是由于电极不合适、机械不稳定或细胞健康不良。或者, 实验者也可能需要考虑在单个电解耦合细胞上的膜片钳技术的配置, 在这种情况下, 可以获得关于整个细胞电流和单个离子通道记录的信息。虽然面临着使用荧光染料的一般挑战 (例如,异质细胞内负载、漂白、使用电离器进行校准、检测分辨率适中), 但对电压敏感的染料 (如 dii-8-anepps) 也是商用。

随着人类人口的迅速老龄化和慢性心血管和神经退行性疾病发病率的上升, 我们对大脑和整个大脑血液流动调节中内皮细胞的理解至关重要。因此, 我们提供了一种从重要的大脑动脉中分离完整内皮细胞的方法, 这种方法可以适应大脑中的其他血管结构。此外, 我们还展示了一种用于同时测量底层 [ca2 +]i 和 v m 的有用方法。最后, 使用双蜂窝内电极, 还可以评估细胞间通过间隙连接的耦合。通过精心规划的药理和遗传干预, 目前的协议合理和定量地包括研究大脑内皮功能的本土形式。我们的期望是, 实验者将建立和调整这些信息, 以推进血管生物学和神经科学的一般。特别是, 看到电气测量完全最小化所涉及的常见实验斗争将是令人满意的。尽管该协议无论如何都不是一套独立的技术, 但它可以作为一种补充方法, 准确地确定内皮生物物理决定因素如何转化为血管阻力的变化, 以及它们如何微调调节血液流动相对于代表健康与疾病条件。

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Disclosures

提交人声明没有利益冲突。

Acknowledgments

我们感谢查尔斯·休伊特提供了出色的技术援助, 同时建立了目前协议所需的设备和用品。我们感谢 llu 围产儿生物学中心的 sean m. wilson 博士和 christopher g. wilson 博士分别为我们提供了一个额外的倒置显微镜和静电计。这项研究得到了国家卫生研究院 r00-ag047198 (ejb) 和 loma linda 大学医学院新教师启动资金的支持。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

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References

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