Samtidige målinger av intracellulær kalsium og membran potensialet i fersk isolert og intakt musen Cerebral endotelet

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Demonstrert her er protokoller for (1) ferske isolere intakt cerebral endothelial "rør" og (2) samtidig måling av endothelial kalsium og membran potensial under endotelet-avledet hyperpolarization. Videre tillater disse metodene farmakologiske tuning av endothelial celle kalsium og elektriske signalene som individuelle eller interaktive eksperimentelle variabler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cerebral arterier og deres respektive mikrosirkulasjonen levere oksygen og næringsstoffer til hjernen via blod flyte regulering. Endotelceller linje lumen blodkar og kommandoen endringer i vaskulær diameter for å møte de metabolske behovet av neurons. Primære endothelial-avhengige signalveier av hyperpolarization membran potensial (Vm) og nitrogenoksid vanligvis operere parallelt å megle vasodilatasjon og dermed øke blodstrøm. Selv om integrert å koordinere vasodilatasjon over flere millimeter vaskulær lengde, har komponenter i endotelet-avledet hyperpolarization (EDH) vært historisk vanskelig å måle. Disse komponentene av EDH innebærer intracellulær Ca2 + [Ca2 +]jeg øker og påfølgende aktivering av små - og middels konduktans Ca2 +-aktivert K+ (SKCa/IKCa) kanaler.

Her presenterer vi en forenklet illustrasjon av isolering av fersk endotelet fra musen cerebral arterier; samtidig måling av endothelial [Ca2 +]jeg og Vm med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis; og en kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter under fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Bakre hjerne arterier fra sirkel av Willis fjernes uten den bakre kommunikasjon og basilar arteriene. Enzymatisk fordøyelsen av renset bakre hjerne arteriell segmenter og påfølgende føden forenkler fjerning av adventitia, perivascular nerver og glatt muskelceller. Resulterende bakre hjerne arteriell endothelial "rør" er deretter festes under et mikroskop og undersøkt ved hjelp av et kamera, photomultiplier rør, og en til to electrometers under kontinuerlig superfusion. Kollektivt kan denne metoden samtidig måle endringer i endothelial [Ca2 +]jeg og Vm diskret mobilnettet steder, i tillegg til spredning av EDH gjennom gapet veikryss til millimeter avstander langs den intakt endotelet. Denne metoden er forventet å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjonene underliggende mekanismene av blod flyte i normal og syke hjernen.

Introduction

Blodstrøm gjennom hjernen er regulert av samordning av vasodilatasjon blant cerebral arterier og arterioler i vaskulære nettverk1. Endotelceller fôr cerebral motstand arterier kommandoen endringer i vaskulær diameter som trengs for å oppfylle metabolske neurons1,2,3. Spesielt i endotelet-avledet hyperpolarization (kjent som EDH), intracellulær Ca2 + ([Ca2 +]jeg) og elektriske signalene i endotelceller koordinere vasodilatasjon blant endotelceller og deres rundt glatte muskelcellene gjennom gapet veikryss for arteriell avslapning4. Fysiologiske initiering av EDH sekvensielt innebærer stimulering av Gq-kombinert reseptorer (GPCRs), en økning i [Ca2 +]jeg, og aktivering av endothelial små og middels Ca2 +-aktivert K+ (SKCa/IKCa) kanaler hyperpolarize cerebral endothelial membran potensial (Vm)5,6,7. Dermed er intime forholdet mellom endothelial [Ca2 +]jeg og Vm integrert i blodet flyt regulering og uunnværlig til kondisjons- og cerebrovascular funksjon6,8. Gjennom bredere litteratur, har flere studier rapportert foreningen av vaskulær endotelial dysfunksjon med utviklingen av kroniske sykdommer (f.eks hypertensjon, diabetes, hjertesvikt, koronarsykdom, kroniske nyre-svikt, perifer karsykdom)9,10, angir betydningen av studere endothelial funksjon i fysiologiske samt patologiske forhold.

Vaskulære endotelet er integrert produksjon av hyperpolarization, vasodilatasjon og vevsperfusjon og dermed undersøkelse av innfødte mobilnettet egenskapene er avgjørende. Som en generell studie er utarbeidelsen av musen arteriell endothelial røret modellen publisert før Skjelettmuskel11,12, gut13, lunge14, og nylig for hjernen6. Studier samtidig [Ca2 +]jeg og Vm målinger er spesielt publisert for Skjelettmuskel arteriell endotelet15,16 samt lymfatisk fartøy endotelet17. I tillegg til primære studier utnytte endothelial tube tilnærming, kan en omfattende gjennomgang av sine fordeler og ulemper8 bli konsultert om eksperimentell verktøyet er passende for en bestemt studie. I korte trekk en fordel er at fysiologiske hovedkomponentene i endothelial celle funksjon beholdes (, Ca2 + tilstrømningen og intracellulær utgivelse, hyperpolarization Vm opp til han potensialet for K+ via SKCa/IKCa aktivering og endothelial intercellulære kobling via gapet veikryss) uten confounding faktorer som perivascular nerve inndata, glatt muskel spenning-gated kanal funksjon og contractility, blodsirkulasjonen, og hormonelle påvirkninger8. I kontrast, brukte celle kultur tilnærminger introdusere betydelige endringer i morfologi18 og ion kanal uttrykk19 på en måte som kan sterkt Beskytt sammenligninger fysiologiske observasjoner fastslått ex vivo eller i vivo. Begrensninger omfatter mangel på integrasjon med andre viktige komponenter for å regulere blodstrøm, som glatt muskel og begrenset fleksibilitet i en eksperimentell tidsplan, som denne modellen er optimalt testet innenfor 4 h intakt vaskulær segmentet isolasjon fra dyret.

Fra en tidligere video protokoll forfattet av Socha og Segal12 og eksperimentelle bruer i midlertidige6,15,16, viser vi herved isolering av fersk endotelet fra bakre hjerne arterier og samtidig måling av endothelial [Ca2 +]jeg og Vm med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis. I tillegg innebærer dette eksperimentet kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter i fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Vi valgte den bakre arterien cerebri, som det gir isolert endotelet med den strukturelle integriteten (celler koblet gjennom gapet veikryss) og tilstrekkelig størrelse (bredde ≥50 µm, lengde ≥300 µm) mottakelig for intra- og intercellulære signalering langs og blant endotelceller. I tillegg studier av gnager bakre hjerne arterien er vesentlig representert i litteratur og omfatter undersøkelse av grunnleggende endothelial signalnettverk mekanismer, vaskulære utvikling/aldring og patologi20, 21 , 22. eksperimentelle programmet forventes å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjon (og dysfunksjon) og vil dermed gi betydelige fremskritt i forståelsen av blod flyte gjennom aldring og utvikling av nevrodegenerative sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Før du gjennomfører følgende eksperimenter, sikre at alle dyr omsorg bruker og protokoller er godkjent av dyr institusjon og bruke Committee (IACUC) og utføres i samsvar med National Research Council's "Guide og bruk av Forsøksdyr" (8th utgave, 2011) og ANKOMME retningslinjene. IACUC av Loma Linda universitetet har godkjent alle protokoller som brukes for dette manuskriptet for mannlige og kvinnelige C57BL/6 mus (alder rekkevidde: 3 til 30 mo).

1. utstyr og materialer

Merk: Detaljer om materialer som kreves for protokollen kan finnes i Tabell av materialer, reagenser, og manualer eller nettsteder tilknyttet de respektive leverandørene.

  1. Flow Chamber
    1. Fest en superfusion kammer med glass dekkglassvæske bunn i en anodisert aluminium plattform. Sikre plattformen med kammer i en kompakt aluminium scene.
    2. Angi en micromanipulator i hver ende av plattformen på aluminium scenen for å holde den feste pipette.
      Merk: Som et praktisk alternativ, kan du bruke overførbar scenen apparatet med en flyt kammer enhet for å lette overgangen fra isolering av endothelial røret til resultatene for eksperimentene.
  2. Mikroskop
    1. Bruk stereomicroscopes (5 x 50 x forstørrelse utvalg) utstyrt med fiber optisk lyskilder for makro - og mikro-disseksjon prosedyrer.
    2. For utarbeidelse av endothelial rør, bruk en invertert mikroskop fase kontrast og differensielle forstyrrelser kontrast (DIC) kompatibel mål (10 x, 20 x og 40 x) og en aluminium scenen.
    3. For å isolere endothelial rør fra delvis fordøyde blodkar, plassere en microsyringe pumpe kontroller tilstøtende til endotelial tube forberedelse apparatet.
    4. For eksperimentelle apparater, bruk en invertert mikroskop utstyrt med standard mål (4 x og 10 x) i tillegg til fluorescerende mål (20 x og 40 x, numerisk blenderåpning 0,75) og en manuell aluminium scene på en vibrasjon isolasjon tabell.
  3. Intracellulær opptaksutstyr
    1. For å registrere Vm av endotelceller i isolerte endothelial rør, koble electrometer til den kompatible headstage. Eventuelt kan du koble en funksjonsgenerator eller stimulator til electrometer for eksperimenter som krever gjeldende injeksjon.
    2. Koble den forsterker utganger et data oppkjøpet system, hørbar planlagte skjermer og et oscilloskop. Sikre referanse elektroden (Ag/AgCl pellets) nær avkjørselen flyt kammer under eksperimenter.
    3. Bruke en fotometriske system med integrerte komponenter av fluorescens system grensesnitt, høy intensitet arc lampe og makt levere, hyperswitch, photomultiplier tube (eller avdrag), og å måle [Ca2 +]jeg i endotelceller.
    4. Bruke en temperatur kontroller utstyrt med en innebygd ovn å øke og opprettholde en fysiologisk temperatur (37 ° C) gjennom hele eksperimentet.
    5. Bruke en seks-reservoaret plattform koblet til ventilstiller med en innebygd flyt kontroll ventil for å kontrollere levering av respektive løsninger til endotelial røret sikret i kammeret.
  4. Mikropipetter og skarpe elektroder
    Merk: For å produsere Pipetter for føden og mekanisk stabilisering av isolerte endothelial rør, bruke en elektronisk avtrekker for trekke Pipetter og en mikro-smie for å bryte og brann polering.
    1. Separate adventitia og glatt muskel endothelial røret fra delvis fordøyde arteriell segmentet, forberede føden Pipetter (hver med en intern tuppens diameter på 80-120 µm) som hensiktsmessig, bruker Borosilikatglass kapillær rør, og brann polsk spissen.
    2. For å sikre endothelial røret mot bunnen av superfusion kammeret, bruke feste Pipetter med en avstumpet, sfærisk slutt (varme-polert, OD på 100-150 µm; forberedt fra tynne vegger Borosilikatglass rør).
    3. For å registrere Vm en endothelial celle, forberede skarpe elektroder med en tips motstand ~ 150 + 30 MΩ fra kapillær BILLEDRØR bruker en elektronisk avtrekker.

2. forberedelse av løsninger og medisiner

  1. Fysiologisk saltløsning (PSS)
    1. For et eksperiment med narkotika forberedelser, forberede minst 1 L PSS bruker: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic syre (HEPES) og 10 mM glukose.
    2. For å forberede de nødvendige løsningene disseksjon, forberede isolering av arteria cerebri, og forberedelse av endothelial tube, PSS mangler CaCl2 (null Ca2 + PSS).
    3. Forberede alle løsninger i ultrapure deionisert H2O, justere pH 7,4, sperre gjennom et filter (0.22 µm porestørrelse) og sikre at osmolality løsninger er mellom 290 og 300 mOsm.
      Merk: Løsninger kan lagres på 4 ° C i ca to uker.
  2. 10% bovin Serum Albumin (BSA)
    1. For å forberede 10% BSA, oppløses 1 g lyofiliserte pulveret i et beaker av 10 mL null Ca2 + PSS.
    2. Dekk begeret med parafin film og la i flere timer skjedde med langsom omrøring for BSA å oppløse.
    3. Filtrere den endelige løsningen bruker en 10 mL sprøyte pluss filtere 0.22 µm og gjøre 1 mL dele lagres på 20 ° C.
  3. Disseksjon løsning
    1. For å forberede 50 mL av disseksjon løsning, legge til 500 µL av BSA (10%) 49,5 mL null Ca2 + PSS.
    2. Umiddelbart etter forberedelse, overføre disseksjon løsningen i en Petriskål for arteriell disseksjon.
  4. Dissosiasjon løsning
    1. For å forberede 50 mL av dissosiasjon løsning, legge 5 µL av CaCl2 (1 M) og 500 µL av BSA (10%) til 49,5 mL av null Ca2 + PSS. Tillate løsningen å sitte ved romtemperatur (RT).
  5. Enzymer
    1. For delvis fordøyelsen av arteriell segmentene, forberede 1 mL av fordøyelsen løsning med 0.31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL collagenase (Type H blanding) og 0,13 mg/mL elastase.
      Merk: Enzym aktiviteter kan variere; men for våre vellykkede protokoller, kommersielt levert enzym aktiviteter har blitt brukt som følger: papain ≥10 enheter/mg; collagenase ≥1 enheter/mg, for N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala eller FALGPA substrat omsetning; og elastase ≥ 5 enheter/mg.
  6. Utarbeidelse av Fura-2 og farmakologiske agenter
    1. Klargjør lager konsentrasjon (1 mM) av Fura-2 AM fargestoff i DMSO. Forberede en arbeider konsentrasjon (10 µM) ved å legge til 5 µL av lager 495 µL av PSS for lasting.
    2. Forberede ≥50 mL arbeider konsentrasjoner av farmakologiske agenter (f.eks ATP) i PSS etter behov.
  7. Gjennomføre løsning
    1. Forberede en gjennomføre løsning, 2 M KCl, oppløsning KCl i deionisert H2O (7.455 g KCl i 50 mL H2O).
    2. Filtrere løsningen gjennom en 0.22 µm sprøyte før tilbakefylling skarpe elektrodene.
  8. Propidium Iodide (0,1%)
    1. Oppløse 10 mg lyofilisert propidium iodide i 10 mL av 2 M KCl.
    2. Bland godt og lagre på RT.

3. disseksjon og isolering av arteria cerebri

Merk: Alle disseksjon prosedyrer krever prøven forstørrelse (opptil 50 x) via stereomicroscopes og belysning av fiber optisk lyskilder. Bruke skjerpet disseksjon instrumenter for å utføre disseksjon prosedyrer for isolering av hjernen og arterier. Microdissection verktøy å isolere og ren arteriene inkluderer skjerpet tynn tang og Vannas stil disseksjon saks (3 til 9.5 mm blader).

  1. Isolering av musen hjernen
    1. Bedøve en C57BL/6 mus (3-30 måneder gamle, mann eller kvinne) via innånding av isoflurane (3% i 2-3 min), så halshugge dyret umiddelbart etter fullført induksjon av anestesi. Plasser hodet i en Petriskål (diameter 10 cm, dybde 1,5 cm) som inneholder kalde (4 ° C) null Ca2 + PSS under en stereomicroscope.
    2. Ser gjennom mikroskop, fjerne hud og hår over skallen og fjerne overdreven blod med kalde null Ca2 + PSS. Gjør et snitt bruke bare tipsene standard disseksjon saks (f.eks 24 mm blad), med nakkeknølen og strekker seg opp gjennom nasal Ben av skallen.
    3. Åpne skallen nøye langs snittet med grov-tipped tang og separat bindevev isolere hjernen med en intakt sirkel Willis.
      Merk: Alternativt kan Littauer bein-skjæring tang brukes til å åpne skallen og utsette hjernen.
    4. Forsiktig vaske isolert hjernen med kalde null Ca2 + PSS i et beaker å fjerne blod. Plass hjernen ventrale siden vendt opp i et kammer som inneholder kald disseksjon løsning for isolering av cerebral arteriene (figur 1A).
  2. Isolasjon av Cerebral arterier
    Merk: Den bakre arterien cerebri har blitt valgt som representant cerebrovascular endothelial studie modell for denne protokollen.
    1. Sikre isolert hjernen kald disseksjon løsning ved hjelp av rustfritt stål pinner (diameter 0.2 mm, lengde ~ 11-12 mm) settes inn i en kull-tilført silisium polymer belegg nederst (dybde ≥50 cm) et glass Petriskål.
    2. For å opprettholde en kald temperatur av PSS i disseksjon, bruk en disseksjon kammer avkjølt av kuldemedium kontinuerlig sykling en 1:1 vann-ethylene glycol blanding. Alternativt kan disseksjon utføres på fersk is.
    3. Kirurgisk isolere bakre hjerne arteriene (~0.3 0,5 cm segmenter, ingen aksielle spenning) fra den bakre kommunikasjon og basilar arterier microdissection instrumenter Vannas stil saks og skjerpet tynn tang (figur 1B ). Bruke rustfritt stål pinner (diameter 0,1 mm, lengde ~ 13 – 14 mm) å sikre både isolert bakre hjerne arterier i disseksjon løsningen i Petriskål (figur 1 c).
    4. Ren isolert bakre hjerne arteriene nøye ved å fjerne bindevev bruker skjerpet tynn tang (figur 1 d). Skjær intakt arterier i segmenter (lengde 1-2 mm) for enzymatisk fordøyelse (figur 1 d, innfelt).

4. forberedelse av Endothelial rør og Superfusion

Merk: Endothelial røret er utarbeidet som beskrevet tidligere12, med modifikasjoner for arteria cerebri6.

  1. Forberede føden apparatet bruker et mikroskop utstyrt med mål (10 x, 20 x og 40 x), et kamera og en aluminium scenen holde et kammer og micromanipulators. Sikre en microsyringe med en pumpe kontroller ved siden av scenen og prøven (figur 2A).
  2. Fullstendig etterfylle en føden Pipetter med mineralolje og sikre den over mikro sprøyten stempelet. Deretter bruker micro-sprøyten med pumpe kontrolleren, trekke dissosiasjon løsning i Pipetter (~ 130 nl) over mineralolje samtidig sikre fravær av luftbobler i pipette.
  3. Plass intakt arteriell segmenter i 1 mL av dissosiasjon løsning i 10 mL glassrør (figur 2B), som inneholder 0.31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL collagenase og 0,13 mg/mL elastase. Ruge på 34 ° C i 10-12 minutter for delvis fordøyelsen.
  4. Etter fordøyelsen, erstatte enzym løsningen med ~ 5 mL frisk dissosiasjon. Bruke en 1 mL pipette, overføre ett segment i et kammer som inneholder dissosiasjon løsningen på RT.
  5. Plasser Pipetter i dissosiasjon løsningen i kammeret og plasser den nær ene enden av fordøyd fartøyet. Angi en hastighet innen 2 til 5 nL/s på pumpen kontrolleren for mild føden (figur 2C, senket).
  6. Mens du ser gjennom 100 x 200 x forstørrelse, ta ut og kaste ut arteriell segmentet for å distansere glatte muskelcellene mens en endothelial rør. Om nødvendig, nøye bruke tynn tang skille dissosiert adventitia og interne elastisk lamina fra endothelial røret. Kontroller at alle glatte muskelcellene er atskilt, og at bare endotelceller forblir som en intakt "rør" (figur 2C).
  7. Benytter micromanipulators, sikre hver ende av endothelial røret på glass cover slip av superfusion kammeret bruker Borosilikatglass låsing Pipetter (figur 2D).
  8. Vaske-out dissosiert adventitia og glatt muskelceller fra kammeret og erstatt dissosiasjon løsningen med 2 mM CaCl2 PSS. Overføre den mobile plattformen med sikret endothelial røret på mikroskopet på superfusion og eksperimentelle rigg.
  9. Bruke 6 ren 50 mL-reservoarene (figur 3A) for kontinuerlig levering av PSS og respektive narkotika under eksperimentet, etter behov. Bruk innebygd flyt kontrollventilen manuelt angi infusjonshastigheten gjennom som samsvarer med laminær strømning samtidig som flyt feed til vakuum sugekraft. Levere PSS til chamber (figur 3B) for superfusion av endothelial rør for ≥ 5 min før innspillingen bakgrunnsdata og fargestoff lasting.

5. fargestoff belastning, vaske-Out og temperaturinnstillinger

  1. Slå på alle komponenter av fotometri system for å måle [Ca2 +]jeg. Bruk mikroskopet på eksperimentell riggen (Figur 3 c) å vise endothelial røret på 400 x forstørrelse, og fokus på celler i vinduet fotometriske bruker fotometri system programvare suite.
  2. Måle diameteren på endothelial røret og registrere bakgrunn autofluorescence verdier i samsvar med 510 nm utslipp under alternative eksitasjon på 340 og 380 nm (≥10 Hz).
  3. For å måle [Ca2 +]jeg svar, laste endothelial røret med Fura-2 er farge (10 µM siste konsentrasjon) på RT og tillate ~ 30 – 40 min i fravær av lys.
  4. Starte superfusion av endothelial røret med fersk PSS for ~ 30 – 40 min å vaske ut overflødig fargestoff og tillate intracellulær Fura-2 er å de forestre. Under vaske-out perioden, heve temperaturen gradvis fra RT 37 ° c temperatur kontrolleren (figur 3A) med en innebygd ovn, og opprettholde på 37 ° C hele eksperimentet.
    Merk: Den anbefalte trinnvise overgangen mellom RT 37 ° c innebærer tre trinn (f.eks 5 ° C) med ≥5 min balanse tid på hvert trinn.

6. samtidig måling av [Ca2 +]jeg og Vm

  1. Slå på alle annet utstyr og electrometer-programvarepakke for å måle Vm (se Figur 3, Figur 4). Justere oppkjøpet hastighet tilsvarende (≥10 Hz).
  2. Trekke en skarp elektrode og etterfylle med 2 M KCl. For studier av intercellulære kopling via fargestoff overføring, etterfylle microelectrodes med 0,1% propidium iodide oppløst i 2 M KCl.
  3. Sikre elektroden over en sølv wire belagt med klor i pipette innehaveren knyttet til en electrometer hodet scenen sikret med en micromanipulator. Bruk micromanipulator å kort plasser tuppen av elektroden i den flytende PSS i kammeret mens du ser gjennom 4 x målet.
  4. Angi hvile Vm til 0 som samsvarer med jordet bad potensielle. Plasser tuppen av elektroden bare over en celle av endothelial røret. Eventuelt kan du bruke hørbar planlagte skjermer knyttet til electrometers knytte lyd pitch potensielle innspillinger.
  5. Øke forstørrelsen til 400 x bruker 40 x målet og reposisjonere spissen av elektroden etter behov. Justere vinduet fotometriske programmvre fotometri for å fokusere på ~ 50 til 80 endotelceller.
  6. Forsiktig plassere elektroden i én av cellene av endothelial røret ved hjelp av micromanipulator og vente ≥2 min for den hvile Vm å stabilisere. Tilsvarende inn en andre elektrode i en annen celle (avstand ≥100 µm) fra den første cellen impaled med første elektroden.
  7. Når hviler Vm er stabilt på sin forventede verdier (30 til-40 mV)6, slår på avdrag på fluorescens grensesnittet i fravær av lys og begynner oppkjøpet av intracellulær [Ca2 +]jeg av spennende Fura-2 vekselvis (10 Hz) på 340 og 380 nm mens samle fluorescens utslipp på 510 nm.
    Merk: Teste intercellulære elektriske koplingen, gjeldende (± 0.5-3 nA, ~ 20 s puls varighet) kan leveres via en electrometer som "Område 1", og endringer av Vm kan registreres med en annen electrometer som "område 2" (avstand ≥100 µm).
  8. Når samtidige målinger av Vm og [Ca2 +]jeg er etablert, at ~ 5 minutter for superfusion av endothelial rør med PSS frekvensen konstant laminær strømning før bruk av narkotika.
  9. Bruke stoffet (f.eks ATP) utarbeidet i PSS til superfusion kammeret med konstant flyt. Etter ~ 3 minutter (eller en tidsperiode passer for the kinetics av stoffet) tilbake vask med PSS til Vm og F340/F380 forholdet til deres opprinnelige forhold. Merk respektive opptak timelig synkronisert over programvarepakkene fotometer og electrometer under hver overgang av løsninger.
  10. Når eksperimentet er gjort, trekke elektrode fra cellen med micromanipulator og merke Vm ~ 0 mV som refereres av bad elektroden. Stoppe respektive innspillinger av Vm og [Ca2 +]jeg og lagre postene på filen for dataanalyse.

7. visualisering av celle-til-celle kopling

  1. For å visualisere celle til celle kobling via propidium iodide, bruke en 40 x eller 60 x fluorescerende målet med en relativt høy numeriske blenderåpning (f.eks 0,95) og rhodamine filteret satt med SSD belysning, en høy oppløsning kamera (eksempelvis 16- megapiksler), og en tenkelig programvarepakke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skjematisk demonstrasjon av protokollen beskrevet ovenfor er vist i vedlagte tallene. En hjerne isolert fra en ung voksen mann C57BL/6N mus (5 måneder) vises i figur 1A. Bakre hjerne arterier er forsiktig isolere fra sirkel av Willis, fjernet uten bindevev, og kutt i segmenter (figur 1B-D). Fra delvis fordøyde arteriell segmenter, er intakt endothelial røret produsert og sikret på glass cover slip med feste pipetter. Mild mekanisk strekk brukes med to feste Pipetter omtrent lineær i vivo lengde uten fartøyet tortuosity. Dette er videre avklart i manuskriptet (figur 2A-D). Endothelial rør isolert fra bakre hjerne arterier er ~ 90-100 µm i bredde og ≥300 µm i lengde. Røret er lastet med Fura-2 er etterfulgt av vask ut med PSS. Samtidig måling av [Ca2 +]jeg og Vm i endothelial røret er utført av Ca2 + fotometri samt skarpe elektrode elektrofysiologi (eksperimentell riggen vist i Figur 3 og Figur 4).

Funksjonell vurdering av endothelial røret utføres ved å bruke en klassisk endotelial GPCR Agonistiske som ATP i flyt kammeret under fysiologiske forhold. Som vist i figur 5, [Ca2 +]jeg og Vm registreres samtidig svar på ATP (100 µM). En betydelig hyperpolarization av Vm (≥5 mV) oppstår samtidig med en intracellulær [Ca2 +]jeg økning, som indikerer at en økning i [Ca2 +]jeg aktiverer SKCa/IKCa kanaler og dermed tillater K+ middelklasseinnbyggere over plasma membranen å produsere EDH. Bevis for intercellulære kobling ved hjelp av aktuelt sprøytebruk (± 0,5 til 3 nA, ~ 20 s pulser) finnes i våre nylig publisert arbeid (referanse6, figur 1). Merk at propidium iodide har en masse ~ 668 Da referanse til andre messengers kjent for passerer gjennom gapet veikryss som inositol trisphosphate (IP3~ 420 Da), syklisk adenosin monofosfat (cAMP, ~ 329 Da).

Figure 1
Figur 1 : Isolering av arteria cerebri fra hjernen. (A) hjerne isolert med intakt arteriene (hvite pil viser den bakre arterien cerebri) i dessection løsning. (B) Magnified visning av bakre arteria cerebri (hvit pil, ~ 3 x vs. Panel A). (C) isolert bakre hjerne arteriene sikret med rustfritt stål pins i prøven parabolen. (D) bakre hjerne arterier etter fjerning av bindevev. Innfelt viser kuttet segmenter av arterier; Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Forberedelse av cerebral endothelial. (A) utstyret brukes til triturating de delvis fordøyd arteriell segmentene: en = micromanipulator, b = kammer for å forberede tube, c = aluminium scenen, d = microsyringe, e = mikroskop, f = microsyringe pumpe kontrolleren. (B) Arterial segmenter (hvite piler) i løsning for enzymatisk fordøyelsen. (C) Endothelial rør utarbeidet av føden; en = føden pipette, b = intakt endothelial rør. Innfelt viser føden prosessen å fjerne adventitia og glatt muskelceller. Skala bar = 100 µm. (D) en intakt endothelial rør sikret på glass cover slip med feste pipette; en = låsing pipette, b = intakt endothelial tube med diameter på ~ 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : For superfusion og samtidige [Ca2 +] jeg og V m målinger. (A) utstyr for superfusion av endothelial rør og temperaturkontroll, en = høy intensitet ARC lampe strømforsyning, b = fluorescens systemgrensesnitt, c = temperatur kontroller, d = seks-reservoarene av superfusion system, e = fiberoptisk lys kilder, f = ventilstiller, g = hyperswitch [Ca2 +]jeg fotometri system. (B) Superfusion kammeret apparater; en og b = headstages, c = bakken elektrode, d = innebygd ovn, e = superfusion rør, f = vakuum inntaks, g = superfusion kammer, h = aluminium scenen holder kammeret. (C) eksperimentelle plattform på en vibrasjon isolasjon tabell. en = celle innramming adapter med kameraet, b = mikroskop lys, c = mikroskop, d = aluminium scenen, e = micromanipulator headstage kontroll, f = vibrasjon isolasjon tabell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Utstyr for electrophysiology og datainnspilling. en = oscilloskop, b = funksjonsgenerator, c = hørbar planlagte skjerm, d = 50/60 Hz støyfilter, e og f = electrometers, g = data oppkjøpet systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Samtidig [Ca2 +] jeg og V m recordings. (A) differensial forstyrrelser kontrast bilde (400 x) av en mus cerebral arteriell endothelial tube justert for eksperiment i fotometriske vindu med en 40 x målsetting. En skarp elektrode plasseres i en celle som vist på toppen av bildet (hvit pil). (B) rå spor for samtidig måling av F340/F380 forhold (øverst) og Vm (nederst) svar på ATP (100 µM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I lys av nyere utviklingen6,15,16,17viser vi nå metoden for å isolere musen cerebral arteriell endotelet i forberedelse til samtidig måling av [Ca2 +] jeg og Vm underliggende EDH konsekvent for ~ 2 h på 37 ° C. Selv om teknisk vanskelig, kan vi måle celle-til-celle kopling også (se referanse6figur 1). På denne måten kan vi måle diskret og gjennomført signalisering hendelser samtidig. For en redegjørelse for de generelle utfordringer isolering musen arteriell endotelet se referanser11,12. Vi vektlegger avgjørende skritt for å isolere musen cerebral arteriene, våre bestemt måling av endothelial [Ca2 +]jeg og Vm, forslag til feilsøking og betraktninger om alternative metoder i lys av eksperimentell styrker/svakheter nedenfor.

Den bakre arterien cerebri krever forsiktig isolasjon fra sirkel av Willis og bindevev uten skade glatt muskel og endotelceller. Kirurgiske verktøy (tang og saks) bør være egnet for musen mikrosirkulasjonen disseksjon prosedyrer mens opprettholdt med rene, skarpe kanter. Forhold til Skjelettmuskel12, redusert vi tidsperioden for enzymatisk inkubering av to tredjedeler og konsentrasjonen av papain collagenase og dithioerythritol med halv samtidig bruk av en empirisk optimalisert konsentrasjonen av elastase. For konsistent suksess i isolere cerebral arteriell endothelial rør, er det viktig å bestille enzymer i grupper (2 til 4 flasker) fra et svært anerkjente leverandør med konsekvent fremgangsmåter i samsvar med frekvens og holdbarhet. Selv med potensial for variasjon i enzym aktivitet fra en rekke enzym til neste, er det foreslått at enzymet konsentrasjoner opprettholdes mens optimalisere tiden fordøyelsen innen 10 til 12 min. Det er verdt å merke seg at verken kjønn eller alder på dyret (3 til 30 måneder) har vært en betydelig barriere til utarbeidelse av isolerte endotelet fra cerebral arteries i vår erfaring. Det anbefales derfor at sammensetningen av enzymet cocktail og tid enzym fordøyelsen forblir den samme i studier på alder og kjønn.

Som understreket, kreves forsiktig under mild føden og isolering av endotelet fra adventitia og spindel-formet glatt muskelceller for å unngå skade på endotelceller12. For føden trinn fungerer tyktflytende mineralolje som en hydraulisk medium mellom stempelet av mikro- og den vandige PSS for å trekke eller løse ut fartøyet segmenter badet i PSS. Det bør bemerkes at hvis fartøyet segmentet kontakter mineralolje, dette trinnet må gjentas en ren føden pipette med sekvensiell oppfylling av mineralolje og PSS. Før et eksperiment anbefales det at en ca lineær i vivo lengde gjenopprettes til endotelial røret i grad mulig, der enkeltceller anta en "flat", langsgående morfologi (f.eks, diameter ~ 5 µm, lengde ~ 100 µm; tykkelse ~0.5 µm)8. Imidlertid aksial spenning bør ikke brukes i den grad hvor cellene på kantene av prøven trekke unna respektive feste Pipetter og dermed kompromitterende mekanisk stabilitet for pålitelig mobilnettet mål under den eksperiment.

Den fotometriske [Ca2 +]jeg måle brukes i denne teknikken er egnet for kontinuerlig måling av endothelial [Ca2 +]jeg bruker ratiometric Fura-2 fargestoff. Enkelte protokoller kan vanligvis siste ≥10 min uten betydelige photobleaching. Videre bruker vi vanligvis denne tilnærmingen for å måle [Ca2 +]jeg fordi det er mottakelig for rettidig pauser i datainnsamling og hyppige bevegelser av mikroskopet mål for å sikre skarpe elektroder for Vm målinger. Merk at dette er en fotometriske tilnærming som kun fanger opp globale, gjennomsnitt [Ca2 +]jeg blant flere celler. Generelt for [Ca2 +]jeg målinger anbefaler vi fotometri for første karakterisering av endothelial celle Svar å farmakologiske agenter (f.eks, gang løpet av toppen og platå) samtidig sikre planer om å gå til quantitate microdomain signalisering hendelser ved hjelp av standard multiphoton eller AC confocal mikroskopi12,23.

Skarp elektrode elektrofysiologi tilnærmingen er mottakelig for integrert Vm opptak i fysiologiske flercellet preparater. Måling av intracellulær Vm er langt den mest teknisk utfordrende med mange avgjørende skritt som kan lette eller utslette suksess av målinger. Først eksperimentator trenger for å bestemme optimale programmet forholdene i en glass avtrekker for konsekvent produksjon skarpe elektroder med en tips motstand ~ 150 + 30 MΩ. Bruker en filament varme rampen test lese som referanse, anbefales det at eksperimentator bestemmer parametere empirisk, særlig i forbindelse med variasjon i innstillingen "varme" samtidig maksimere tiden av trekk. Neste, mekanisk stabilitet av micromanipulators, headstages, pipette holdere og prøven er helt avgjørende. Bortsett fra tydelig nødvendigheten for en vibrasjon isolasjon tabell må av eksperimentator sikre at alle beslag er sikre og at scenen området rundt og under manipulators er ren. Ideelt sett ytre støy bør reduseres i den grad at oppløsningen til skarpe elektrode innspillinger ligger 1 mV. I vår erfaring er den vanligste kilden støy sølv wire sikret i pipette holderen som er i behov av en tilstrekkelig flammehemmende belegg eller erstatning helt. Hvis vanlige 50/60 Hz støy, "hum stanse" teknologi kan brukes og leveres som standard med en moderne electrometer. Hvis støy vises helt uhåndterlig, kontrollere om det finnes en lekkasje i bad eller overflyt der PSS vil komme i kontakt med motstander for temperaturkontroll. Hvis komplikasjoner fortsatt med å skaffe en stabil Vm signal, sjekke integriteten til elektriske ledninger og t-kontakter.

Helt, hvis etablere en skarp elektrode innspilling er vellykket, er det ofte på grunn av en upassende elektrode, mekanisk ustabil eller dårlig mobilnettet helse. Eksperimentator bør eventuelt også vurdere en konfigurasjon av oppdateringen-klemme teknikken på individuelle, elektrisk montert celler hvor informasjon om hele cellen strømninger og enkelt ion kanal opptak kan skaffes. Selv om overfor generelle utfordringene med å bruke en fluorescerende farge (for eksempel, heterogene intracellulær lasting, bleking, kalibrering bruker ionophores, beskjedne oppdagelsen oppløsning), fargestoffer spenning-sensitive som Di-8-ANEPPS er også kommersielt tilgjengelig.

Vår forståelse av endotelet i blodet flyt regulering til og gjennom hjernen er avgjørende med et raskt aldring befolkningen og økende forekomsten av kronisk hjerte og nevrodegenerative sykdommer. Dermed gir vi en metode for å isolere intakt endotelet fra en viktig arteria cerebri, som kan tilpasses til andre vaskulære strukturer i hjernen. I tillegg viser vi en nyttig metode for samtidige målinger av underliggende [Ca2 +]jeg og Vm. Til slutt kan bruker dobbel intracellulær elektroder, celle-til-celle kopling gjennom gapet veikryss også vurderes. Med nøye planlagt farmakologiske og/eller genetisk intervensjoner omfatter gjeldende protokollen rimelig og kvantitativt studiet av cerebral endothelial funksjon i sin opprinnelige form. Vår forventning er at forskere vil bygge og tilpasse denne informasjonen for å fremme vaskulær biologi og nevrovitenskap generelt. Spesielt ville det være tilfredsstillende å se vanlig eksperimentelle kjemper involvert med elektriske målinger minimert helt. Selv om denne protokollen ikke er et frittstående sett av teknikker på noen måte, den kan brukes som en komplementær tilnærming til å bestemme nøyaktig hvor endothelial Biofysiske determinanter oversette til endringer i vascular motstand og hvordan de finjustere regulering av blodstrøm i forhold til vilkårene representant for helse vs. sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Charles Hewitt for utmerket kundestøtte ved opprettelse av utstyr og rekvisita som trengs for gjeldende protokollene. Vi takker Dr. Sean M. Wilson og Christopher G. Wilson, fra LLUB senter for Perinatal biologi, for å gi oss med en ekstra invertert mikroskop og electrometer, henholdsvis. Denne forskningen har blitt støttet av National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) og Loma Linda University School of Medicine nye fakultetet oppstart midler. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3, (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78, (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202, (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219, (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6, (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285, (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24, (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15, (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9, (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593, (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72, (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595, (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293, (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297, (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3, (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170, (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, (8), 757-770 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics