在成细胞分化和融合过程中利用活成像跟踪核

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

骨骼肌分化是一个高度动态的过程, 它特别依赖于核定位。在这里, 我们描述了一种方法, 以跟踪核运动的活细胞成像在成肌细胞分化和肌管形成, 并执行核动力学的定量表征, 从自动跟踪提取信息。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Careccia, G., Colombo, F., Tirone, M., Agresti, A., Bianchi, M. E., Zambrano, S., Vénéreau, E. Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion. J. Vis. Exp. (146), e58888, doi:10.3791/58888 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

细胞内的核定位对于发育和再生过程中的多个细胞过程非常重要。核定位最有趣的例子发生在骨骼肌分化过程中。肌纤维 (肌纤维) 是由肌肉干细胞 (卫星细胞) 融合而成的多核细胞, 这些细胞经历增殖和分化。肌纤维内的正确核定位是正确的肌肉再生和功能所必需的。评估成肌细胞分化和肌纤维形成的常见程序依赖于免疫荧光分析的固定细胞, 这阻碍了随着时间的推移对核运动和细胞行为的研究。在这里, 我们描述了一种方法来分析成肌细胞分化和肌纤维形成的活细胞成像。我们提供了一个自动核跟踪软件, 以获得在分化和融合过程中核动力学和成肌细胞行为 (即轨迹) 的高通量定量表征。

Introduction

骨骼肌是人体最大的组织, 总数占人体质量的 35%-40% 1.卫星细胞是肌肉干细胞, 解剖上的特征是它们的位置 (并列于质膜, 在肌肉纤维的基层下), 从而导致成肌细胞 (成肌祖细胞) 的增殖, 最终区分并集成到现有的肌纤维和/或熔断器中, 形成新的肌纤维2,3,4。他们的发现和生物学研究的进展使人们对肌肉发育和再生有了重要的了解。

分离成肌细胞并将其分化为肌支管的协议早在多年前就已开发出来, 目前仍被广泛用于研究骨骼肌分化5, 6,7.然而, 这些方法大多代表了依赖于固定细胞分析的静态过程, 因此, 不允许科学家充分探索高度动态的过程, 如成肌细胞融合和肌纤维成熟。最突出的例子是核定位, 这是严格管制, 与原子核最初在肌纤维的中心, 然后, 位于周围的肌纤维成熟 8,9。实时成像是获得对这种特殊现象的进一步洞察的最适当的技术。

在这里, 我们描述了一种方法, 使科学家能够记录成肌细胞分化和肌管形成的延时显微镜, 并从自动跟踪成肌细胞核进行定量分析。该方法为分化和融合过程中的核动力学和成肌细胞行为提供了高通量的定量表征。该方案分为四个不同的部分, 即 (1) 从小鼠后肢收集肌肉, (2) 分离由机械和酶消化组成的原代成肌细胞, (3) 成肌细胞增殖和分化; (4)活体成像, 以跟踪成肌细胞分化前16小时内的细胞核。

在下面的过程中, 肌细胞从 H2B-gfp 小鼠中分离出来, 并用多西环素1μgml 进行治疗, 以诱导 H2B-gfp 表达, 如前面所述的 10。或者, 可以从其他在细胞核中表达荧光蛋白的转基因小鼠中分离成肌细胞, 也可以转染从野生小鼠体内分离出的细胞, 以表达细胞核中的荧光蛋白, 如 Pimentel 等人所述。9个

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

所有涉及动物主题的程序都得到了圣拉斐尔机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 小鼠后肢肌肉的解剖

  1. 通过高压灭菌灭菌推子和剪刀 (直的和弯曲的)。
  2. 在开始实验之前, 准备和过滤所有介质 (阻滞介质、消化介质、增殖介质和差异介质) (见材料表)。
  3. 将5毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 放入35毫米培养皿中, 用于肌肉采集。
  4. 用颈椎脱位或使用 co2 对小鼠进行牺牲 , 并用乙醇对皮肤进行消毒。用剪刀和推子将后肢和上肢的皮肤移开, 以方便肌肉的隔离。
    注: 肌肉可以从新生或成年小鼠中分离。与成年小鼠相比, 新生儿小鼠的卫星细胞数量有所增加。然而, 可以从一只成年老鼠中分离的卫星细胞总数足以进行下面描述的实验。
  5. 分离胫骨、单侧、伸肌长长 (EDL)、胃尾肌、四头肌和三头肌, 并将它们放入含有 PBS 的 Petri 培养皿中。把盘子放在冰上。用消毒剪刀和推子小心去除肌腱和脂肪。

2. 原生成肌细胞的分离

注: 细胞培养的所有程序都是在无菌条件下进行的。

  1. 从 PBS 中取出肌肉。通过使用无菌弯曲的剪刀切割和切碎肌肉, 直到获得均匀的质量。把肌肉块放入一个50毫升管。
  2. 在水浴中, 将消化培养基加入10毫升到肌肉块中, 在37°c 孵育 30分钟 (250分钟-1), 以酶质消化肌肉。
  3. 加入10毫升的杜尔贝科改良鹰培养基 (DMEM), 其中含有10% 的胎牛血清 (FBS)、1% 的谷氨酰胺、1% 的青霉素/链霉素和1% 的庆大霉素 (阻断培养基), 以阻止消化。
  4. 以 40 x g离心 5分钟, 并在50毫升管中收集上清液。把球团保存在冰上。
    注: 离心后, 上清液含有一些卫星细胞、血细胞、内皮细胞和成纤维细胞, 而颗粒含有未消化的肌肉和结缔组织碎片。为了增加分离细胞的数量, 颗粒必须经过额外的消化步骤, 如下所述。
  5. 以 650 x g 离心上清液 5分钟, 将上清液丢弃, 并在含有 10% FBS 的 Dmem 1 毫升中重新悬浮颗粒。把重新悬浮的颗粒放在冰上。
  6. 对步骤2.4 中获得的其余颗粒重复步骤 2.2-2.5 2倍, 并将随后重新悬浮的颗粒添加到保存在冰上的第一个重新悬浮的颗粒中。
  7. 通过70μm 的过滤器, 然后通过40μm 的过滤器, 将重新悬浮的颗粒通过。加入15毫升的 DMEM 与10% 的 FBS, 离心机在 650 x5分钟。
  8. 在3毫升的红细胞裂解缓冲液中重新移植细胞颗粒, 以耗尽红细胞。在室温下孵化5分钟。加入40毫升的 PBS 以停止红细胞的裂解, 离心剂在 650 x g处冷却 5分钟, 取出上清液, 用10% 的 fbs 在 DMEM 的5毫升中重新悬浮颗粒。
  9. 作为预涂步骤, 将细胞在20毫升的增殖介质中, 在150毫米无涂层培养皿中。在细胞培养孵化器 (37°c, 5% CO2) 孵育1小时后, 收集培养基。
    注: 将连接在板上的成纤维细胞被丢弃, 而卫星细胞仍处于悬浮状态。
  10. 重复步骤 2.9 3x, 并在最后一个预置步骤中, 收集悬浮中包含卫星单元的介质。
  11. 离心机, 650 x 克 , 5分钟。
  12. 当细胞离心时, 用胶原蛋白 (0.1 m 醋酸中0.1% 溶液的10毫升) 覆盖两个150毫米 Petri 培养皿。要做到这一点, 把胶原蛋白放在盘子里, 孵育 5分钟, 然后取出。让盘子干燥30分钟。
  13. 丢弃第2.11 步中获得的上清液, 并在40毫升的增殖介质 (材料表) 中重新悬浮细胞颗粒。将细胞贴在两个胶原蛋白包覆的150毫米 Petri 培养皿上 (每盘20毫升), 并将细胞保留在细胞培养孵化器 (37°c, 5% co 2 , 5% o2)中的增殖培养基中 2-3天, 用1μgml 的多西环素诱导 h2b gfp 表达。
    注: 此步骤允许成肌细胞的增殖获得更多的细胞进行进一步的检测。细胞密度保持在很低的水平, 以避免成肌细胞自发分化为肌张力图。

3. 成肌细胞增殖和分化检测

注: 当成肌细胞密度较高时, 一些细胞会启动伸长率, 然后, 有必要分裂细胞。一般来说, 在不影响细胞表型的情况下, 可以2x–3x 分裂细胞。

  1. 丢弃介质, 用5毫升的 PBS 清洗细胞, 加入2毫升的胰蛋白酶 (1x), 在37°c 的细胞孵化器中孵育板 5分钟, 在显微镜下检查, 当圆形细胞分离时, 加入5毫升 DMEM 和 10% FBS 以灭活胰蛋白酶。数一数单元格的数量 (通常可以获得大约 1 x10 6 细胞/鼠标)。
    注: 用胰蛋白酶孵化5分钟通常足以分离增殖的成肌细胞。
  2. 将细胞进行下面描述的检测之一。
    1. 增殖分析
      1. 在胶原蛋白涂层的12孔板中的增殖培养基中的1万千井中板出 50, 000 细胞, 并在细胞培养孵化器 (37°c, 5% CO 2) 中孵育镀层细胞。在24小时、48小时或72小时修复和计数单元格。
        注: 介质每48小时更换一次, 以避免营养耗尽。
    2. 分化分析
      1. 涂布12孔板, 含350μl 的分化介质, 含基底膜基质 (1: 100)。在37°c 下将板材加氢 30分钟, 并取出介质。
      2. 板 200, 000 细胞在分化介质中的基质包衣板。在细胞培养孵化器 (37°c, 5% CO2, 5% o2) 中孵育细胞, 直到它们粘附在板上 (2小时一般足以使细胞粘附并开始分化)。
      3. 为了评估分化, 如前面所述, 对肌球蛋白重链和细胞核进行染色。或者, 执行现场成像分析, 如下所述。

4. 成肌细胞分化和核跟踪的实时成像

  1. 对于活细胞成像, 将在3.2.2 部分获得并在12孔板中镀的细胞置于共聚焦显微镜下, 配备了孵育系统, 使细胞保持在 5°c co 2 的 37°C.
  2. 使用20x 干目标 (0.7 NA) 获得数百个细胞的视野, 足以监测肌纤维的形成。H2B-GFP 细胞可以用低强度488纳米氩激光成像。
    注: 开放针孔可确保图像深度 (~ 10μm) 包含电池厚度, 以便在整个实验过程中保持单元格的焦点。使用共聚焦显微镜是有利的, 因为它提高了图像的信噪比, 虽然也可以使用广域显微镜。肌纤维的形成可以通过传输通道进行监测。
  3. 每隔 6分钟, 每16-bit 获取16位和 1, 024 x 1, 024 像素的图像。对于每个获取的位置, 生成一个多帧. tif 文件 (请参阅"补充文件" 中的示例)。
    注: 在本协议中, 使用了与显微镜 (材料表) 有关的商业软件;使用适当的软件在使用其他显微镜时实现相同的目标。
  4. 下载作为. zip补充文件提供的软件。
    注: 例程是必须在 MATLAB 中运行的脚本。该软件是对已发布的软件12的改编, 该软件经过优化, 用于跟踪肌管形成过程中的原子核。该软件分为两部分: 第一部分通过分割每个帧中的原子核来识别原子核, 而第二部分则生成原子核运动的 "轨迹" (轨迹)。补充文件中提供了完整的核分割和跟踪代码以及入门的分步指南。
  5. 提取 zip 文件, 并将其保存在所需的路径上的个人计算机 (PC) 正在使用。在已安装必要软件的电脑上执行以下所有段落。请注意,. zip 文件由三个文件夹组成, 如下所述。
    注:分段例程包含要为分割运行的函数。相反, 跟踪例程包含跟踪所需的功能。示例分段跟踪提供了熟悉系统的基本脚本和文件。用于分割和跟踪原子核的软件在 MATLAB、R2015 a 或更高版本中正常运行。
  6. 要从. tif 文件中分割原子核, 请命名该文件, 例如, namfile. tif.
    1. 打开"细分跟踪示例"文件夹, 然后单击"段式"。这将打开 MATLAB 中的命令窗口。
    2. 检查左侧的"当前文件夹"窗口, 以查看"分段跟踪示例" 文件夹中的所有元素。双击 "剂量分割".
      注: 有关必须在脚本中进行的修改的详细信息, 可在 stepbystepp. txt 文件中找到。必须修改脚本, 以便变量文件名输入是 filenameinput . tif, 文件夹输入是包含. tif 文件的文件夹.
    3. 运行脚本 (通过单击绿色的"运行"按钮)。分割的结果将保存为文件. mat(seg美格菲. mat), 而细胞核的分割可以在输出图中可视化。
      注: 如果需要, 可以修改脚本中描述的分割参数。可以使用脚本"检查分段" (请参阅 stepbystepp. txt 文件) 检查分割的质量。在此基础上, 如果分割质量较差 (只检测到几个原子核), 请调整分割的参数, 清楚地显示在do察门蒂m 脚本中, 并重复该过程。
  7. 要生成轨道 (即每个原子核的轨迹在时间), 使用在分割中获得的核位置, 运行脚本generatacks m 在同一个工作文件夹中。请务必添加正确的分段文件作为输入, 获得之前 (有关详细信息, 请参阅 stepbystepp. txt 文件)。
    注: 作为输出, 用户将获得一个文件trackednamefile.mat, 其中包含一个用于 x 坐标的矩阵和另一个用于生成轨道的 y 坐标的矩阵。
  8. 使用checkackingn 评估轨道的质量。使用最后一段的输出图, 帮助及时可视化每个原子核位置。在左侧检查是否有绿色十字架, 表示每个分段的细胞核。若要选择一个特定的原子核, 请使用较低的滚动条。请注意, 所选细胞核将以红色环绕, 而在右侧, 可以及时跟踪所选单元的轨迹 (通过使用上滚动条)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

要在活体成像中自动跟踪成肌细胞分化过程中的核运动, 核应优先进行荧光标记。需要注意的是, 使用 dna 插层分子是不可行的, 因为这些分子干扰原代成肌细胞13的增殖和分化。例如, 在有或没有 Hoechst 培养的原代成肌细胞中进行了增殖和分化分析 (图 1)。很明显, 在使用 Hoechst 33342 培养的成肌细胞中, 增殖 (1Cb) 和分化 (图 1c, 中面板) 受到严重损害。相反, 从 H2B-gfp 小鼠中分离出并使用多西环素培养的成肌细胞具有绿色荧光的细胞核, 其区别类似于从野生小鼠中分离出的成肌细胞 (分别为图 1C、右、左板)。

活细胞成像与原代成肌细胞表达 H2B-gfp 蛋白允许在分化过程中跟踪细胞核 (图 2补充视频 1)。在 H2B-gfp 成肌细胞分化过程中, 最初 (图 2a) 和最后时间点 (图 2A) 的传输和 gfp 通道的融合图像使科学家能够识别肌管, 从而识别最终形成的核整合成肌管 (例如, 蓝色圆圈中的细胞核) 或不融合成肌管的细胞核 (例如, 红色圆圈中的细胞核)。

为了从活细胞成像数据中提取有关核子细胞运动的信息, 可以使用所提供的软件来跟踪核子的轨迹。该软件使用来自 H2B-gfp 通道 (原子核) 的图像;图 3 a)创建一个掩码, 并分割每个帧中的原子核。对于帧中的核分割, 在高斯滤波14后, 利用大津的方法在图像选择一个 "保守" 阈值。接下来, 对象大致分段;为了获得更精细的分割, 每个对象再次被屏蔽使用的阈值基于其边界框中的平均值。然后使用分水岭变换分隔附近的对象 (图 3b)。在我们手中, 一个分水岭变换一直无法分离附近的大多数核 (图 3B, * 插入)。因此, 我们使用该区域来选择图像中较大的对象, 并应用新的分水岭变换 (图 3b, * * 插入), 它能够分离附近的其他原子核。通过这种方法, 大多数原子核都被识别在图像中 (图 3C)。

为了跟踪原子核, 我们通过整合 Tinevez15发布的跟踪例程来改进例程。简而言之, 跟踪算法将连续帧检测到的原子核连接起来, 目的是最大限度地减少帧中每个原子核的位置与下一个帧中相同原子核的位置之间的距离之和, 对此类使用 "匈牙利算法"。最小化16。重复这一步骤是为了连接未连接的原子核, 这些原子核最多可以达到一定的最大帧数。还建立了对象在框架中的位置与下一个对象之间的最大距离的阈值。对于此处提供的数据, 每步最多5帧和最大距离为20像素, 可提供大量正确的轨道 (图 3d)。重要的是, 我们可以使用这些例程来检查跟踪的质量。也可以使用此脚本查找具有给定行为的单元格, 例如形成 (或不形成) 肌纤维, 然后分析感兴趣的单元集的动态特征。

应用的软件为数百个单元 Equation 1 (图 3d) 生成具有帧 n 中每个单元格的 x 和 y 坐标的轨道。我们可以利用这些信息来提取有关核子运动的信息。例如, 初始帧 (n = 0) 和最终帧n之间的总位移定义如下。

轨迹的位移 =Equation 2 ||

在这里, "···" 代表向量的范数 (图 4a)。

N帧中每个原子核的速度如下。
Equation 3

然后, 我们可以定义给定单元格的轨迹长度, 如下所示。

轨迹长度 =Equation 4

作为这些简单参数如何能够提供相关信息的一个例子, 我们计算了与 Hoechst 或不具有 Hoechst 的成肌细胞的核轨迹长度。对于被 Hoechst 染色的细胞来说, 轨迹的总长度似乎稍高一些, 尽管差异不大 (图 4b)。然而, 当我们计算时间间隔内的总位移时, 我们观察到, 用 Hoechst 染色的细胞的总位移明显小于未染色细胞的总位移 (图 4C)。这表明染色细胞的运动具有较低的方向性。为了进一步加强这一假设, 我们通过计算每个帧中的速度角度来量化细胞运动的方向性 (图 4 a)。

Equation 5

我们还量化了帧之间角度的变化。

Equation 6

然后, 沿轨迹的总角度变化可以定义如下。

总角度变化 =Equation 7

正如预测的那样, 未染色细胞的总角度变化明显小于使用 Hoechst 染色的细胞 (图 4d)。因此, 从简单的计算中获得的这一简单的方向性测量方法表明, 染红 Hoechst 的成肌细胞不太容易保持其位移的方向, 这反映了它们的形成能力受损(图 1)。

简而言之, 如下所述, 生成的活细胞成像数据提供了核动力学与形成肌管的能力之间的定量联系, 可作为核动力学和肌细胞的高通量定量表征的输入分化和融合过程中的行为。

Figure 1
图 1: 与 Hoechst 的孵化会干扰成肌细胞的增殖和分化.(A) 在增殖培养基 (左面板) 中染色 Hoechst 后的原代成肌区的代表性图像 (左面板) 或在增殖介质中培养24小时的原代成肌细胞图像 (右面板), 以及 (b) 相对量化。数据为平均± SEM, 并通过学生 t 检验对统计意义进行了评估。*P < 0.05。(C) 原始野生型成肌细胞的代表性图像, 在没有 (左面板) 或与 hoechst (中间面板) 的分化培养基中培养 24小时, 在鉴别培养基 (右面板) 中培养24小时的 h2b-gfp 成肌细胞, 并染色与 Hoechst (蓝色) 和抗肌球蛋白重链抗体 (MyHC; 红色)。刻度条 = 500μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 2
图 2: H2B-gfp 成肌细胞在分化过程中的实时成像.在 H2B-gfp 成肌细胞 (20x目标) 分化过程中, 在 (a) 初始 (t = 0 h) 和 (b) 最后时间点 (t = 16H) 处合并传输和 gfp 通道的合并图像。肌管的一些例子在面板b中用黑色箭头突出显示。刻度柱 = 50μm. (c) 面板 a 和b中的放大虚线区域, 在这些区域中, 可以识别出一个单一的原子核, 最终在t = 0 小时、 t = 8 h 和t = 16小时。刻度条 = 50 微米. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 3
图 3: H2B-gfp 成肌细胞在分化过程中的分割.(A) 显示大约400个细胞的细胞核的时间框架的例子。(B) 原子核掩蔽和分割的例子。明亮的物体使用全局阈值和局部阈值进行分割, 并将分水岭变换应用于分离附近的原子核。附近的原子核可能很难分割 (* 插入), 因此在大面积的对象中进行第二次基于水的分割, 以分割更多的原子核 (* * 插入)。(C) 检测到的核位置 (红色十字架), 这些位置后来在跟踪算法中使用。(D) 使用跟踪算法生成的跟踪, 该跟踪算法最大限度地减少每个对象在两个连续帧中的位置之间的距离总和。每个物体的最大可能距离值作为输入提供, 使科学家能够将由多个帧分隔的原子核连接起来。刻度条 = 50 微米. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 4
图 4: 对细胞核动力学的定量分析揭示了与 Hoechst 孵育的成肌细胞的受损能力, 以保持细胞的方向性.(A) 参数测量说明。通过考虑两个连续帧中的位置, 可以定义原子核的速度。然后可以很容易地从方案中指示的位置计算弹道角度和角度变化。(B) 无 hoechst (绿线) 或与 hoechst (蓝线) 孵育的成肌细胞的轨迹长度、(c) 总位移和 (d) 轨迹角度的变化的分布。这两种分布无显著性差异, 总位移明显较高, 未染色细胞的角度变化明显较低 (片面的 Kokomoorov-smirnos 试验, *p < 0.05 和 * *p< 0.005)。请点击这里查看此图的较大版本.

补充视频 1: H2B-gfp 成肌细胞在分化过程中的实时成像.利用传输和 GFP 通道 (20x 目标) 将培养基从初始 (t = 0 h) 分化为最终时间点 (t = 16H) 的 h2b-gfp 成肌细胞成像。请点击此处下载此文件.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

肌肉纤维 (肌纤维) 是由肌肉干细胞 (卫星细胞) 的融合而形成的多核细胞, 这些细胞经历了 2,3的增殖和分化, 4. 我的工作是什么?为了评估成肌细胞的分化, 常见的程序包括培养成肌细胞在分化培养基和固定细胞在不同的时间点进行免疫荧光染色肌红器, 一个分化的标记, 和染色带 dna 插层分子 (例如, Hoechst)细胞核5。该方法可通过测量不同的参数来评价成肌细胞分化, 如分化指数 (myoblast 阳性细胞/总细胞数) 或融合指数 (至少有两个细胞核/总细胞数的肌小管数).然而, 成肌细胞融合和肌管形成是高度动态的过程, 依赖于原子核8的运动。事实上, 肌纤维内的核定位是适当的肌肉再生和功能17所必需的。成肌细胞及其细胞核的流动性可能是评估成肌细胞分化和发现肌肉疾病新缺陷的关键参数。因此, 有必要制定新的程序来研究成肌细胞分化和肌纤维形成过程中的细胞行为和核运动。

在这里, 我们描述了一种方法, 使科学家能够跟踪成肌细胞分化和肌管形成的活细胞成像, 并从核的自动跟踪进行定量分析。这种方法的优点是可以在从 H2B-transfection 小鼠身上分离的成肌细胞荧光核分化过程中跟踪, 而无需任何细胞转染或额外染色。H2B-GFP 小鼠在商业上是可买的, 因此很容易获得。或者, 也可以从其他在细胞核中表达荧光蛋白的转基因小鼠中分离成肌细胞, 也可以转染从野生小鼠体内分离出的细胞, 以表达细胞核中的荧光蛋白, 如前面所述.这些不同的选项进一步扩展了此处介绍的方法的潜在应用。

目前的协议依赖于原代成肌细胞的培养, 因此, 在以下实验过程中可能会观察到很高的变异性, 这也是由于与肌肉分离后可能存在非成肌细胞18.为了克服这一限制, 可以通过细胞分类来分离成肌细胞, 如前面所述的 19。这里描述的方法的另一个关键点是, 当细胞彼此接近时, 例如在肌管形成过程中, 很难产生对原子核的完美跟踪。然而, 这里讨论的软件例程允许科学家直观地检查跟踪的质量, 并在必要时选择感兴趣的细胞子集进行后续分析。可能需要进一步改进该软件, 以提供肌纤维形成过程中的核动力学完整特征。

总之, 这种方法是有用的, 通过比较不同的条件, 在成肌细胞分化过程中的核动力学的定量洞察, 正如我们所报告的 Hoechst 孵化。这个例子说明了从延时实验中提取有意义的动态数据的能力。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了 AFM-Telethon 至 e. v. (#21545) 和 Osedale San Raffaele (OSR) 对 s. z. 的种子赠款 (ZAMBRA5X1000) 的支持。巴斯德研究所图像分析中心的 Jean-yf·蒂涅克斯博士因公开分享他的 "简单跟踪者" MATLAB 例程而受到认可。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
chicken embryos extract Seralab CE-650-J
collagenase Sigma C9263-1G 125units/mg
collagen from calf skin Sigma C8919
dispase Gibco 17105-041 1.78 units/mg
doxyciclin Sigma D1515
DMEM Sigma D5671
fetal bovine serum Life technologies 10270106
gentamicin Sigma G1397
Horse serum Invitrogen 16050-098
Hoechst life technologies 33342
IMDM Sigma I3390
L-glutamine Sigma G7513
Matrigel Corning 356231
penicillin-streptomycin Sigma P0781
red blood cells lysis medium Biolegend 420301
Digestion medium
collagenase 40 mg
dispase 70 mg
PBS 20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum 10%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum 20%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum 2%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 1%
filtered 0.22um

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89, (1), 81-88 (2000).
  2. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224, (1), 7-16 (2010).
  3. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  4. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  5. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
  6. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
  7. Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
  8. Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. (2017).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
  10. Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27, (1), 84-90 (2009).
  11. Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215, (1), 303-318 (2018).
  12. Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
  13. Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581, (16), 3076-3080 (2007).
  14. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  15. Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
  16. Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. SIAM. (2009).
  17. Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6, (11), 1455-1475 (2014).
  18. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3, (2), (2014).
  19. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10, (10), 1612-1624 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics