Explotando en la proyección de imagen a los núcleos de la pista durante la fusión y diferenciación de mioblastos

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Biology

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Summary

Diferenciación del músculo esquelético es un proceso altamente dinámico, que particularmente se basa en posición nuclear. Aquí, describimos un método para seguir los movimientos de los núcleos de proyección de imagen de vivo de la célula durante la diferenciación y myotube formación de mioblastos y se realiza una caracterización cuantitativa de la dinámica de los núcleos de extracción de información de seguimiento automático.

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Careccia, G., Colombo, F., Tirone, M., Agresti, A., Bianchi, M. E., Zambrano, S., Vénéreau, E. Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion. J. Vis. Exp. (146), e58888, doi:10.3791/58888 (2019).

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Abstract

Posicionamiento nuclear dentro de las células es importante para múltiples procesos celulares en el desarrollo y regeneración. El ejemplo más fascinante del posicionamiento nuclear ocurre durante la diferenciación del músculo esquelético. Las fibras musculares (myofibers) está formadas por la fusión de células precursoras de músculo (mioblastos) derivadas de células madre de músculo (células satélite) que experimentan la proliferación y diferenciación de células multinucleadas. Correcta posición nuclear en myofibers es necesaria para la regeneración muscular adecuada y la función. El procedimiento común para evaluar la formación de la diferenciación y del myofiber mioblastos se basa en las células fijas analizadas por inmunofluorescencia, que impide el estudio del comportamiento de movimiento y de la célula nuclear con el tiempo. Aquí, describimos un método para el análisis de diferenciación y myofiber formación de mioblastos por proyección de imagen de células vivas. Ofrecemos un software para el seguimiento automatizado nuclear obtener una caracterización cuantitativa de alto rendimiento de nuclear dinámica y comportamiento de mioblastos (es decir, la trayectoria) durante la diferenciación y la fusión.

Introduction

Músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo humano, por un total de 35% - 40% de la masa del cuerpo1. Las células satélite son células madre de músculo, caracterizadas anatómicamente por su posición (yuxtapuesto a la membrana plasmática, por debajo de la lámina basal de las fibras musculares), que dan lugar a la proliferación de mioblastos (células progenitoras miogénica), que eventualmente diferenciar e integrar en myofibers existentes o fusible forma nuevo myofibers2,3,4. Su descubrimiento y los avances en el estudio de su biología ha llevado a importantes conocimientos en desarrollo muscular y la regeneración.

Protocolos para aislar y diferenciar mioblastos a miotubos han sido desarrollados hace muchos años y siguen siendo ampliamente utilizados para el estudio de diferenciación de músculo esquelético5,6,7. Sin embargo, la mayoría de estos métodos representan procedimientos estáticos que se basan en el análisis de las células fijas y, en consecuencia, no permiten a los científicos explorar procesos altamente dinámicos, como la fusión de mioblastos y maduración del myofiber. El ejemplo más llamativo es nuclear, que es estrictamente regulado, con los núcleos inicialmente en el centro de la myofiber y, luego, situado en la periferia después myofiber maduración8,9. En proyección de imagen es la técnica más adecuada para obtener mayor información sobre un fenómeno tan peculiar.

Aquí, describimos un método que permite a los científicos realizar diferenciación y myotube formación de mioblastos por microscopia Time-lapse y realizar análisis cuantitativos de seguimiento automático de núcleos mioblastos. Este método proporciona una caracterización cuantitativa de alto rendimiento de comportamiento dinámica y mioblastos nuclear durante la diferenciación y la fusión. El protocolo se divide en cuatro partes diferentes, a saber: (1) la colección de músculos de los miembros posteriores de los ratones, (2) el aislamiento de mioblastos primario que consiste en la digestión mecánica y enzimática, la proliferación de mioblastos (3) y la diferenciación y (4) en vivo imagen de seguimiento de núcleos dentro de las 16 h de la diferenciación de mioblastos.

En el procedimiento siguiente, mioblastos aislados de ratones H2B-GFP y tratados con 1 μg/mL de doxiciclina para inducir la expresión de GFP H2B, como se describió anteriormente10. Alternativamente, es posible aislar los mioblastos de otros ratones transgénicos que expresan una proteína fluorescente en el núcleo o transfectar las células aisladas de ratones de tipo salvaje para expresar una proteína fluorescente en el núcleo, como se describe por Pimentel et al. 9.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales sujetos fueron aprobados por el San Raffaele institucional Animal cuidado y uso.

1. disección de los músculos del miembro posterior del ratón

  1. Esterilice en autoclave pinzas y tijeras (rectas y curvas).
  2. Preparar y filtro (0,22 μm) todos los medios de comunicación (bloqueo medio, medio de digestión, medio de la proliferación y diferenciando medio) antes de empezar el experimento (véase Tabla de materiales).
  3. Colocar 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri para la colección de músculo de 35 mm.
  4. Sacrificar el ratón mediante dislocación cervical o mediante el uso de CO2 y esteriliza la piel con etanol. Retirar la piel de los miembros posteriores y los miembros superiores mediante el uso de tijeras y pinzas, para facilitar el aislamiento de los músculos.
    Nota: Los músculos pueden ser aislados de ratones adultos o neonatales. Ratones neonatales tienen un mayor número de células satélite en comparación con ratones adultos. Sin embargo, el número total de las células satélite que puede ser aislado de un ratón adulto solo es suficiente para realizar el experimento que se describe a continuación.
  5. Aislar tibialis, sóleo, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemio, cuádriceps y tríceps y ponerlos en el plato de Petri con PBS. Deja el plato en el hielo. Retire con cuidado los tendones y la grasa con tijeras esterilizadas y pinzas.

2. aislamiento de mioblastos primarios

Nota: Todos los procedimientos para el cultivo celular se realizan en condiciones estériles.

  1. Quitar los músculos del PBS. Corte y pique los músculos mediante el uso de tijeras curvas estériles, hasta obtener una masa uniforme. Poner los trozos de músculo en un tubo de 50 mL.
  2. Añadir 10 mL del medio de digestión a los trozos de músculo e incubar a 37 ° C durante 30 min con agitación fuerte (250 min-1) en un baño de agua, digestión enzimático de los músculos.
  3. Añadir 10 mL de Dulbecco modificado medio del águila (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS), 1% glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina y gentamicina 1% (medio bloqueo) para detener la digestión.
  4. Centrifugue a 40 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante en un tubo de 50 mL. Guardar el sedimento en el hielo.
    Nota: Después de la centrifugación, el sobrenadante contiene algunas células satélite, las células sanguíneas, células endoteliales y fibroblastos, mientras que el sedimento contiene pedazos de músculo sin digerir y tejido conectivo. Para aumentar el número de células aisladas, los pellets deben someterse a medidas adicionales de digestión como se describe a continuación.
  5. Centrifugar el sobrenadante a 650 x g por 5 min, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de DMEM con 10% FBS. Mantenga resuspendido en el hielo.
  6. Repita los pasos 2.2-2.5 x 2 para el resto del precipitado obtenido en el paso 2.4 y añadir los pellets posteriormente resuspendidos a primera resuspendido conservado en hielo.
  7. Pasar los pellets resuspendidos a través de un filtro μm 70 y luego a través de un filtro μm 40. Añadir 15 mL de DMEM con 10% FBS y centrifugar a 650 x g durante 5 minutos.
  8. Resuspender el precipitado de células en 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos a agotar los glóbulos rojos. Incubar por 5 min a temperatura ambiente. Añadir 40 mL de PBS para detener la lisis de los glóbulos rojos y centrifugar a 650 x g durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL de DMEM con 10% FBS.
  9. Como paso preplating, placa las células en 20 mL de medio de proliferación en caja Petri 150 mm sin recubrir. Después de 1 h de incubación en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2), recoge el medio.
    Nota: Fibroblastos, fijación a la placa, son entonces desechados, mientras que las células satélite permanecen en suspensión.
  10. Repita el paso 2,9 3 x y, en el último paso preplating, recoge el medio que contiene las células satélite en suspensión.
  11. Centrifugar a 650 x g durante 5 minutos.
  12. Mientras que las células son la centrifugación, la capa dos platos de Petri de 150 mm con colágeno (10 mL de una solución al 0.1% en ácido acético de 0,1 M). Para ello, poner el colágeno en la placa, incube durante 5 minutos y retírela. Deje la placa secar durante 30 minutos.
  13. Deseche el sobrenadante obtenido en el paso 2.11 y resuspender el precipitado de células en 40 mL de medio de proliferación (Tabla de materiales). Las células en dos platos de Petri recubiertas de colágeno 150 mm (20 mL por caja) de la placa y mantener las células en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) en medio de la proliferación de 2 – 3 días con 1 μg/mL de doxiciclina para inducir la expresión de GFP H2B.
    Nota: Este paso permite la proliferación de mioblastos para obtener un número mayor de células para otros ensayos. Densidad celular se mantiene muy baja para evitar una diferenciación espontánea de mioblastos a miotubos.

3. ensayos de proliferación y diferenciación de mioblastos

Nota: Cuando mioblastos la densidad es alta, algunas células inician la elongación, y entonces, es necesario dividir las células. En general, es posible dividir las células 2 x-3 x sin afectar a su fenotipo.

  1. Descartar el medio, lavan las células con 5 mL de PBS, añadir 2 mL de tripsina (1 x), incubar la placa a 37 ° C en un incubador celular 5 minutos comprobar al microscopio y cuando separar células redondas, añadir 5 mL de DMEM con 10% FBS para inactivar la tripsina. Contar el número de células (generalmente es posible obtener aproximadamente 1 x 106 células/ratón).
    Nota: Incubación con tripsina para 5 minutos suele ser suficiente para separar la proliferación de mioblastos.
  2. Someter las células a uno de los ensayos que se describen a continuación.
    1. Ensayo de proliferación
      1. 50.000 células/pozo en 1 mL o bien medio de proliferación en una placa de 12 pozos recubiertas de colágeno de la placa e incubar las células plateadas en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2). Fijar y contar las células en 24, 48 o 72 h.
        Nota: El medio es reemplazado cada 48 h para evitar el agotamiento de nutrientes.
    2. Ensayo de diferenciación
      1. Cubrir una placa de 12 pozos con 350 μl de la matriz de la membrana del sótano que contiene medio diferenciación (1: 100). Incubar la placa a 37 ° C durante 30 minutos y quitarlo del medio.
      2. Placa de 200.000 células/pozo en el medio de diferenciación en la placa revestida de matriz. Incubar las células en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) hasta que se adhieren a la placa (2 h suelen ser suficiente para que las células se adhieren y diferenciación).
      3. Para evaluar la diferenciación, realizar tinción de cadena pesada de miosina y núcleos como se describió anteriormente11. Como alternativa, realizar análisis de imágenes en vivo como se describe a continuación.

4. imágenes en vivo de la diferenciación de mioblastos y seguimiento nuclear

  1. Para celular directo imágenes, poner las células, obtenidas en la sección 3.2.2 y plateado en una placa de 12 pozos, microscopio confocal, equipada con un sistema de incubación para mantener las células a 37 ° C en 5% CO2.
  2. Utilice un objetivo seco de 20 x (0,7 NA) para obtener campos de vista con cientos de células, lo suficiente para controlar la formación del myofiber. Células de H2B-GFP pueden ser reflejadas con un láser de argón de baja intensidad de 488 nm.
    Nota: Un agujero de alfiler abierto asegura que la profundidad de la imagen (~ 10 μm) contiene el grueso de la célula de modo que las células se mantienen en foco durante todo el experimento. Utilizando un microscopio confocal es ventajoso ya que mejora la relación señal a ruido de las imágenes, aunque también se podría utilizar microscopía de amplio campo. Formación del Myofiber puede controlarse a través del canal de transmisión.
  3. Adquisición de imágenes de 16 bits y 1.024 x 1.024 píxeles por fotograma cada 6 minutos durante 16 horas. Para cada posición adquirida, generar un archivo multiframe.tif (ver ejemplo en los Archivos complementarios).
    Nota: En el presente Protocolo, software comercial asociado con el microscopio (Tabla de materiales) se ha utilizado; Utilice el software apropiado para lograr el mismo objetivo al usar otros microscopios.
  4. Descargar el software suministrado como un.zip archivo complementario.
    Nota: Las rutinas son scripts que deben ejecutarse en MATLAB. El software es una adaptación de un software publicado12 optimizado para el seguimiento de los núcleos durante la formación de myotube. Este software está dividido en dos partes: la primera de ellas identifica los núcleos de cada marco por segmentación, mientras que el segundo genera "pistas" (trayectorias) del movimiento de los núcleos. El código completo de segmentación nuclear y seguimiento y una guía paso a paso para empezar se encuentran en los Archivos complementarios.
  5. Extraiga el archivo zip y guardarlo en una ruta deseada en el ordenador personal (PC) en uso. Llevar a cabo todo el debajo de pasos en un PC con el software necesario instalado. Tenga en cuenta que el archivo .zip se compone de tres carpetas mencionadas anteriormente.
    Nota: Las rutinas de segmentación contiene las funciones a ejecutar para la segmentación. Seguimiento de rutinas, en cambio, contiene las funciones necesarias para el seguimiento. Ejemplo de segmentación de seguimiento proporciona los scripts básicos y archivos para familiarizarse con el sistema. El software utilizado para la segmentación y seguimiento de los núcleos funciona correctamente en MATLAB, R2015a o versiones posteriores.
  6. Para segmentar los núcleos desde el archivo .tif, nombre del archivo, por ejemplo, NameFile.tif.
    1. Abra la carpeta Ejemplo segmentación seguimiento y haga clic en DoSegmentation.m. Se abrirá la ventana de comandos de MATLAB.
    2. Compruebe la ventana de la Carpeta actual a la izquierda para ver todos los elementos en la carpeta de Ejemplo de segmentación de seguimiento . Haga doble clic en DoSegmentation.m.
      Nota: Puede encontrarse información detallada sobre las modificaciones que deben hacerse en la secuencia de comandos en el archivo StepbyStep.txt. Es obligatorio modificar el script para que la variable filenameinput es NameFile.tif y folderinput es la carpeta donde se encuentra el archivo .tif.
    3. Ejecutar el script (haciendo clic en el verde botón Ejecutar ). El resultado de la segmentación se guardará como un file.mat (SegmentedNameFile.mat), mientras que la segmentación de los núcleos se puede visualizar en la figura de la salida.
      Nota: Los parámetros para la segmentación, que se describe en la escritura, pueden ser modificados si es necesario. La calidad de la segmentación puede ser comprobada utilizando el script CheckSegmentation.m (véase el archivo de StepbyStep.txt). Basados en esto, si la calidad de la segmentación es pobre (sólo de unos pocos núcleos detectados), ajustar los parámetros de la segmentación, claramente indicado en el script de DoSegmentation.m y repita el procedimiento.
  7. Para generar las pistas (es decir, las trayectorias de cada uno de los núcleos en el tiempo), usando las posiciones nucleares obtenidos en la segmentación, ejecute el script GenerateTracks.m en la misma carpeta de trabajo. Asegúrese de agregar el archivo correcto de segmentación como entrada, obtenidos antes (véase el archivo StepbyStep.txt para más información).
    Nota: Como resultado, el usuario obtendrá un archivo TrackedNameFile.mat, con una matriz para las coordenadas x y otra matriz para las coordenadas y de las pistas generadas.
  8. Evaluar la calidad de las pistas usando CheckTracking.m (consulte el archivo StepbyStep.txt para más información). Utilice la figura de la salida de este último pasaje para visualizar cada posición de los núcleos en el tiempo. Echale un vistazo a la izquierda para cruces verdes que indican cada núcleo segmentado. Para seleccionar un núcleo específico, utilice la barra de desplazamiento inferior. Tenga en cuenta que el núcleo seleccionado será un círculo en rojo, mientras que a la derecha, la trayectoria de la celda seleccionada puede seguirse en el tiempo (mediante el uso de la barra de desplazamiento superior).

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Representative Results

Para seguir automáticamente movimiento nuclear durante la diferenciación de mioblastos en proyección de imagen de vivo, los núcleos deben preferentemente fluorescente etiquetarse. Es importante tener en cuenta que utilizando moléculas intercalantes de ADN no es factible porque estas moléculas interfieren con la proliferación y diferenciación de mioblastos primarios13. Por ejemplo, proliferación y diferenciación han sido analizados en primaria mioblastos cultivados con o sin Hoechst (figura 1). Es evidente que proliferación (figura 1A, B) y diferenciación (figura 1, panel central) son fuertemente deterioradas en mioblastos cultivados con Hoechst 33342. Por el contrario, mioblastos aislados de ratones H2B-GFP y cultivadas con doxiciclina tienen núcleos con fluorescencia verde y distinguen de manera similar a mioblastos aislados de ratones de tipo salvaje (figura 1, izquierda y derecha en los paneles, respectivamente).

Imágenes de células vivas con mioblastos primarios expresando la proteína GFP H2B permite el seguimiento de núcleos durante la diferenciación (figura 2 y 1 de Video suplementaria). Combina imágenes de la transmisión y canales de la GFP en el inicial (figura 2A) y tiempo final de puntos (figura 2B) durante la diferenciación de mioblastos H2B-GFP permiten a los científicos identificar miotubos y, en consecuencia, los núcleos que terminan integrar en un myotube (por ejemplo, el núcleo en el círculo azul) o núcleos que se fusionan no en un myotube (por ejemplo, el núcleo en el círculo rojo).

Para extraer información sobre los movimientos de los núcleos de la célula de los datos de imágenes de células vivas, es posible utilizar el software suministrado para realizar un seguimiento de las trayectorias de los núcleos. El software utiliza la imagen del canal de H2B-GFP (los núcleos; Figura 3A) para crear una máscara y segmentar los núcleos en cada fotograma. Por segmentación nuclear en un marco, un umbral "conservador" es seleccionado usando el método de Otsu en la imagen después de Gaussian filtro14. A continuación, los objetos son más o menos segmentado; para obtener una segmentación más fina, cada objeto se enmascara con un umbral basado en el promedio en su cuadro delimitador. Una transformación de la cuenca se utiliza para separar objetos (figura 3B). En nuestras manos, una transformación de la cuenca ha sido incapaz de separar la mayoría de núcleos cercanos (figura 3B, * recuadro). Por lo tanto, utilizó el área para seleccionar los objetos más grandes de la imagen y aplicar una nueva transformación de la cuenca (figura 3B, ** recuadro), que es capaz de separar adicional cerca de los núcleos. Con este enfoque, la mayoría de los núcleos se identifica en la imagen (figura 3).

Para el seguimiento de los núcleos, mejoramos las rutinas mediante la incorporación de las rutinas de seguimiento publicadas por el Tinevez15. En Resumen, el algoritmo de seguimiento enlaces de núcleos detectados en fotogramas consecutivos con el objetivo de minimizar la suma de las distancias entre la posición de cada núcleo en un marco y la posición del núcleo mismo en la siguiente, mediante el "algoritmo Húngaro" para tal minimización de16. El paso se repite para unir núcleos desvinculados que son hasta un cierto número máximo de fotogramas lejos. También se establece un umbral para la distancia máxima entre la posición de un objeto en un marco y otro. Los datos aquí presentados, un número máximo de cinco fotogramas y una distancia máxima de 20 píxeles por paso dan un gran número de pistas correctas (figura 3D). Lo importante, podemos utilizar estas rutinas para comprobar la calidad del seguimiento. También es posible utilizar este script para buscar las celdas que tienen un comportamiento determinado, por ejemplo formando (o no) un myofiber y posteriormente analizar las características dinámicas del conjunto de las células de interés.

El software aplicado genera las pistas con las coordenadas x e y-para cada celda de marco n, Equation 1 , por cientos de células (figura 3D). Podemos utilizar dicha información para extraer información sobre movimiento de núcleos. Por ejemplo, el desplazamiento total entre el marco inicial (n = 0) y el marco final N se define como sigue.

Desplazamiento de una trayectoria = || Equation 2 ||

Aquí, "|| · ||" está parado para la norma del vector (Figura 4A).

La velocidad de cada núcleo en el marco de la n es la siguiente.
Equation 3

Entonces, podemos definir la longitud de una trayectoria para una célula dada como sigue.

Longitud de la trayectoria =Equation 4

Como un ejemplo de cómo estos simples parámetros ya pueden dar información relevante, calcula la longitud de las trayectorias de los núcleos de mioblastos incubadas con o sin Hoechst. Parece que la longitud total de las trayectorias es ligeramente más alta de células teñidas con Hoechst, aunque la diferencia no es significativa (Figura 4B). Sin embargo, cuando calcula el desplazamiento total durante un lapso de tiempo, observamos que el desplazamiento total de células teñidas con Hoechst era significativamente más pequeño que el de las células sin manchas (figura 4). Esto indica que el movimiento de células tiene una direccionalidad más baja. Para reforzar esta hipótesis, cuantificamos la direccionalidad del movimiento de una célula al computar el ángulo de la velocidad en cada fotograma (Figura 4A).

Equation 5

También cuantificamos la variación del ángulo entre los fotogramas.

Equation 6

La variación del ángulo total a lo largo de una trayectoria se puede definir entonces como sigue.

Total variación de ángulo =Equation 7

Como se predijo, la variación del ángulo total de las células sin manchas es significativamente menor en comparación con células teñidas con Hoechst (figura 4). Por lo tanto, esta medida simple de direccionalidad, Obtenido de un cálculo sencillo indica que los mioblastos teñidos con Hoechst son menos propensos a mantener la dirección de su desplazamiento, lo que refleja su capacidad en la formación de miotubos (figura 1).

En pocas palabras, vivo de la célula de datos como se describe aquí ofrecen un vínculo cuantitativo entre la dinámica nuclear y la capacidad de miotubos de forma y pueden utilizarse como entrada para una caracterización cuantitativa de alto rendimiento de la dinámica nuclear y mioblastos comportamiento durante la diferenciación y la fusión.

Figure 1
Figura 1: la incubación con Hoechst interfiere con la proliferación y diferenciación de mioblastos. (A) imágenes representativas de mioblastos primarios teñidos con Hoechst después de 24 h en medio de proliferación (panel izquierdo) o cultivadas por 24 h en medio de la proliferación con Hoechst (panel derecho) y (B) la cuantificación relativa. Los datos son la media ± SEM, y se evaluó la significación estadística del estudiante t-pruebas. P < 0.05. (C) imágenes representativas de primaria tipo salvaje de mioblastos cultivados durante 24 h en el distinción de medio sin (panel izquierdo) o Hoechst (panel central) y H2B-GFP mioblastos cultivados durante 24 h en el distinción de medio (panel derecho) y se tiñen con Hoechst (azul) y un anticuerpo de cadena pesada de la miosina (MyHC; rojo). Las barras de escala = 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: vivir la proyección de imagen de H2B-GFP mioblastos durante la diferenciación. Imágenes combinadas de transmisión y GFP canales en (A) inicial (t = 0 h) y (B) tiempo final (t = 16 h) durante la diferenciación de mioblastos H2B-GFP (objetivo 20 x). Algunos ejemplos de miotubos se destacan con flechas negras en el panel B. Las barras de escala = 50 μm. (C) ampliada con las zonas de los paneles A y B en el que es posible identificar un único núcleo que termina por integrar en un myotube (en azul) o no (en rojo) en t = 0 h, t = 8 h y t < / C12 > = 16 h. Las barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: segmentación de mioblastos H2B-GFP seguimiento durante diferenciación. (A) ejemplo de un marco de lapsos que muestra los núcleos de células aproximadamente 400. (B) ejemplo de enmascaramiento de los núcleos y segmentación. Objetos brillantes están segmentados usando un umbral local y global, y una transformación de la cuenca se aplica para separar cerca de núcleos. Núcleos cercanos podrían ser difíciles segmento (* recuadro), por lo que se realiza una segunda segmentación con enfoque de cuenca en objetos de grandes áreas a un mayor número de núcleos del segmento (** recuadro). (C) detectar posiciones nucleares (cruces rojas), que son posteriormente utilizan en el algoritmo de seguimiento. (D) las pistas mediante el algoritmo de seguimiento que minimiza la suma de las distancias entre la posición de cada objeto en dos fotogramas consecutivos. Un valor máximo posible de tal distancia para cada objeto se presenta como una entrada que permite a los científicos unir núcleos separados por más de un fotograma. Las barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: análisis cuantitativo de la dinámica de los núcleos de descubrir la capacidad deteriorada de mioblastos se incubaron con Hoechst para mantener la direccionalidad celular. (A) Descripción de las mediciones de parámetros. Es posible definir la velocidad de un núcleo teniendo en cuenta la posición en dos fotogramas consecutivos. El ángulo de la trayectoria y la variación de ángulo pueden entonces fácilmente calcularse de las posiciones como se indica en el esquema. (B) distribución de la longitud de trayectoria, desplazamiento total (C) y (D) variación del ángulo de trayectorias de mioblastos incubadas sin Hoechst (línea verde) o con Hoechst (línea azul). Las dos distribuciones no son significativamente diferentes, mientras que el desplazamiento total es significativamente mayor, y la variación del ángulo es menor de células sin manchas (test de Kolmogorov-Smirnov unilateral, *p < 0.05 y **p < 0.005). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 Video complementario: vive la proyección de imagen de H2B-GFP mioblastos durante la diferenciación. Proyección de imagen de H2B-GFP mioblastos cultivados en el medio de distinción de la inicial (t = 0 h) a puntos del tiempo final (t = 16 h) mediante la transmisión y canales GFP (objetivo 20 x). Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Las fibras musculares (myofibers) son células multinucleadas que se forman por la fusión de las células musculares precursores (mioblastos) derivada de células madre de músculo (células satélite) que experimentan la proliferación y diferenciación2,3, 4. Para evaluar la diferenciación de mioblastos, el procedimiento común consiste en el cultivo de mioblastos en diferenciar el medio y la fijación de las células en diferentes puntos temporales para realizar la inmunofluorescencia que manchaba de MyHC, un marcador de la diferenciación y la coloración de núcleos con intercalantes de ADN las moléculas (por ejemplo, Hoechst)5. Este método es útil para evaluar la diferenciación de mioblastos mediante la medición de distintos parámetros, como el índice de diferenciación (número de MyHC-positive células/la célula número total) o el índice de fusión (número de miotubos con al menos dos núcleos/celular número total) . Sin embargo, la fusión de mioblastos y myotube formación son procesos altamente dinámicos que dependen de la motilidad de los núcleos8. De hecho, posicionamiento nuclear en myofibers es requerido para la regeneración muscular adecuada y función17. La movilidad de mioblastos y de sus núcleos podría llegar a ser un parámetro crítico para evaluar la diferenciación de mioblastos y descubrir nuevos defectos en los trastornos musculares. Por lo tanto, es esencial para el desarrollo de nuevos procedimientos para estudiar el comportamiento celular y movimiento nuclear durante myofiber formación y diferenciación de mioblastos.

Aquí, describimos un método que permite a los científicos seguir mioblastos diferenciación y myotube la formación de imágenes de células vivas y para realizar análisis cuantitativos de seguimiento automático de los núcleos. La ventaja de este método es la posibilidad de seguir durante la diferenciación de núcleos fluorescentes de mioblastos aislados de ratones H2B-GFP, sin de la transfección de la célula o la coloración adicional. Los ratones de H2B-GFP son disponibles en el mercado y, en consecuencia, fácilmente accesible. Alternativamente, es posible aislar los mioblastos de otros ratones transgénicos que expresan una proteína fluorescente en el núcleo o transfectar las células aisladas de ratones de tipo salvaje para expresar una proteína fluorescente en el núcleo, como describió anteriormente9 . Estas opciones además amplían las posibilidades de aplicación del método aquí presentado.

El actual protocolo se basa en el cultivo de mioblastos primarios, y por lo tanto, una alta variabilidad puede observarse en los procedimientos experimentales, también debido a la posible presencia de células nonmyogenic después el aislamiento de músculos18 . Para superar esta limitación, es posible aislar mioblastos por célula clasificación como se describió anteriormente19. Otro punto crítico en el método descrito aquí es la dificultad para generar un perfecto seguimiento de núcleos cuando las células están cerca uno del otro, como durante la formación de myotube. Sin embargo, las rutinas de software aquí permiten a los científicos inspeccionar visualmente la calidad del seguimiento y, si es necesario, para seleccionar un subconjunto de las células de interés para un análisis posterior. Mejora del software podría ser necesario proporcionar una caracterización completa de la dinámica nuclear durante la formación del myofiber.

En conclusión, este método es útil para proporcionar la penetración cuantitativa en la dinámica de los núcleos durante la diferenciación de mioblastos comparando diversas condiciones, según nos informan con incubación de Hoechst. Este ejemplo ilustra la capacidad de extraer datos dinámicos significativos experimentos Time-lapse.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el AFM Telethon e.v. (#21545) y por el Ospedale San Raffaele (OSR) semilla a S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez desde el centro de análisis de imagen del Instituto Pasteur es reconocido por compartir públicamente sus rutinas MATLAB "Simple Tracker".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
chicken embryos extract Seralab CE-650-J
collagenase Sigma C9263-1G 125units/mg
collagen from calf skin Sigma C8919
dispase Gibco 17105-041 1.78 units/mg
doxyciclin Sigma D1515
DMEM Sigma D5671
fetal bovine serum Life technologies 10270106
gentamicin Sigma G1397
Horse serum Invitrogen 16050-098
Hoechst life technologies 33342
IMDM Sigma I3390
L-glutamine Sigma G7513
Matrigel Corning 356231
penicillin-streptomycin Sigma P0781
red blood cells lysis medium Biolegend 420301
Digestion medium
collagenase 40 mg
dispase 70 mg
PBS 20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum 10%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum 20%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum 2%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 1%
filtered 0.22um

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References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89, (1), 81-88 (2000).
  2. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224, (1), 7-16 (2010).
  3. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  4. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  5. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
  6. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
  7. Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
  8. Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. (2017).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
  10. Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27, (1), 84-90 (2009).
  11. Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215, (1), 303-318 (2018).
  12. Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
  13. Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581, (16), 3076-3080 (2007).
  14. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  15. Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
  16. Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. SIAM. (2009).
  17. Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6, (11), 1455-1475 (2014).
  18. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3, (2), (2014).
  19. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10, (10), 1612-1624 (2015).

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