분해 활동에 대 한 화면에 Fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과: 코로나 바이러스에 대 한 응용 프로그램 스파이크 단백질 활성화

* These authors contributed equally
Biochemistry

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Summary

우리는 바이러스 성 퓨전 펩 티 드의 분열 사이트를 대표 하는 펩 티 드에 프로 테아의 분해 활동의 신속한 심사를 허용 하는 fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과 제시. 이 방법은 효소 활동에 대 한 테스트 하려면 단백질 시퀀스 내에서 다른 아미노산 주제에 사용할 수 있습니다.

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Jaimes, J. A., Millet, J. K., Goldstein, M. E., Whittaker, G. R., Straus, M. R. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (143), e58892, doi:10.3791/58892 (2019).

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Abstract

Coronaviruses 또는 인플루엔자 바이러스 엔벌로프된 바이러스 주인 세포를 감염 시킬 수 있도록 그들의 융해 단백질의 분해 절단이 필요 합니다. 종종 바이러스 세포 및 조직 차 있는 굴곡 운동 전시 하 고 특정 셀 또는 조직 프로 테아 제에 적응. 또한,이 바이러스는 분열에 영향을 미칠 수 있습니다 하 고 따라서 새로운 호스트에 적응에 기여할 수 있는 복제 하는 동안 돌연변이 또는 그들의 게놈으로 삽입 발생할 수 있습니다. 여기, 우리는 바이러스 성 융해 단백질의 분열 사이트를 흉내 낸 펩 티 드의 신속한 심사를 허용 하는 fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과 제시. 기술은 매우 유연 하 고 많은 다른 기판에 단일 효소의 분해 활동을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 또한, 그것은 수 있으며 또한 여러 프로 테아 제 활동의 하나 또는 그 이상의 펩 티 드 기질에. 이 연구에서 우리는 코로나 스파이크 단백질의 분열 사이트 모티프를 흉내 낸 펩 티 드를 사용 합니다. 우리 인간의 테스트 하 고 낙 타 파생 중동 호흡기 증후군 coronaviruses 분열 사이트에서 단일 및 이중 대체 furin의 동작을 변경할 수 있습니다 및 분열 효율을 극적으로 변경 (메 CoV). 우리 또한 다른 serotypes 및 긴장에서 고양이 코로나 스파이크 단백질의 furin 분열 활동 테스트를 함께 생물 정보학의이 방법을 사용. 이 펩 티 드 기반 방법은 더 적은 노동-그리고 시간 바이러스, 분해 활동의 분석에 사용 하는 기존의 방법 보다 집중 하 고 하루 이내 결과 얻을 수 있습니다.

Introduction

호스트 세포 막을 가진 바이러스 성 퓨전 엔벌로프된 바이러스의 수명 주기에서 중요 한 단계 이며 입국 셀 및 바이러스의 복제를 용이 하 게. 일반적으로, 바이러스는 특수 단백질 (단백질)을 호스트 세포 막에 수용 체에 바인딩하고 트리거 바이러스 세포 막 융합1을 있습니다. 바이러스 성 융해 단백질은 세 가지 주요 클래스 (난-3)1로 편성 되었다. 현재 인플루엔자 바이러스 (조류에서 오랜 zoonotic 출현 대표) 등 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (메-CoV) 공중 보건에 대 한 주요 관심사는 바이러스의 숫자 (대표는 최근 동물 매개 낙 타에서 출현), 소위 활용 종류 I 융해 단백질, 호스트 프로 테아 제, 그들의 fusogenic 활동2를 발휘 하 여 분해 처리를 요구 하는. 마찬가지로, 고양이 코로나 바이러스 (FCoV), 야생 및 국내 고양이 대 한 주요 질병 위협을 나타내는 클래스를 또한 소유 나 융해 단백질. 내가 바이러스 성 융해 단백질 uncleaved 전조로 합성 일반적으로 그리고 일반적으로 수용 체 바인딩 및 트리거링 퓨전 이벤트 각각에 대 한 책임은 두 개의 도메인으로 구성 클래스. 날짜 하려면, 인플루엔자 조류 (HA) 최고 융해 단백질을 이해 하 고 호스트 셀 항목 및 퓨전3에서 기계적 역할을 설명 하는 다 수의 연구 이다. 이 경우에 분열 융해 단백질의 특정 시퀀스 또는 분열 사이트 하, 시간과 pH 의존 구조적 변화, 바이러스 융해 펩 티 드1,2의 노출에 결과 함께에서 발생합니다.

융해 펩 티 드 및 그것의 이전 효소 인식 순서는 pathogenicity 및 바이러스의 호스트 적응에 대 한 중요 하다. 효소 인식 순서로 변경 바이러스와 호스트4에 대 한 잠재적으로 극적인 결과를 크게 분열을 변경할 수 있습니다. 한 손으로, 그것은 분열을 파기 하 고 따라서 바이러스의 라이프 사이클을 제거. 하지만 다른 한편으로, 돌연변이 수 주어진된 효소의 기질 특이성을 증가 하거나 융해 단백질을 쪼개 다에 "새" 프로 테아 제. 그 후,이 세포 및 조직 차 있는 굴곡 운동, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 하위5,6관찰로 확장할 수도 있습니다. 일반적으로 낮은 pathogenicity 조류 인플루엔자 (LPAI) 바이러스 그리고 가장 인간 인플루엔자 바이러스 때문에 그들을 활성화 하는 프로 테아의 제한 된 지역화 위장 또는 호흡 기관에 수감 된다. 일반적으로, 이러한 HA 단백질의 융해 펩 티 드 4-아미노 산 시퀀스 1-2 연속 비 기본적인 아미노산, 구성 된 트립 신 처럼 떠들고 프로 테아 제는 트립 신, matriptase 또는 TMPRSS27, 에 의해 인식 되는 앞 8. 바이러스 삽입 또는 polybasic 사이트에 분열 사이트를 변경 하는 돌연변이 획득 때 furin에 HA를 활성화 하 고 잠재적으로 훨씬 더 심한 전신 감염6,9를 발생할 수 있습니다. 이 바이러스를 높은 pathogenicity 조류 인플루엔자 (HPAI), H5N1 긴장에 의해 대표 라고 합니다.

인플루엔자 HA, 달리 메 CoV 등 많은 coronaviruses가 있다 그들의 스파이크 단백질 내의 두 가지 분열 사이트. S1/S2 사이트 s 2 라는 두 번째 분열 사이트 C 터미널 퓨전 도메인 (S2)에서 N 맨끝 수용 체 바인딩 도메인 (S1) 분리 ', 퓨전 펩 티 드10에 근접에서 S1/S2 위치의 하류. S1/S2 S2 다음에 사이트는 순차적으로 죽 습을 제안 했다 '. 대부분의 독감 바이러스 변종, 메 CoV S 단백질 S1/S2 및 S2 하 달리 ' 사이트는 furin 같은 proprotein convertase (PC) 가족의 프로 테아 제에 의해 인식 될 수 있다. 이 가족의 구성원 모티브 R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2쌍된 기본 잔류물에서 쪼개 다. 일반적으로, 분열 위치의 아미노산 상류 라고를 P1, P2, P3, 등등. P1으로 지정 된다 분열 사이트와 아미노산 하류에서 계산 ', P2', P3', . 11. FCoV 긴장 하거나 단일 또는 듀얼 분열 사이트를 가질 수 있습니다. 메-CoV, 같은 일부 FCoV 긴장 또한 두 분열 사이트 보유 (S1/S2 및 S2') 그들의 S 단백질. 그러나,이 특성은 이다 serotype 독점 나 FCoVs (clade A). 반면, serotype II (clade B) 그룹의 구성원만 사이트가 있는 단일 분열 (S2')2,12. 여러 프로 테아 제 다니엘 FCoV 분열 사이트, furin, cathepsin, 트립 신 같은 프로 테아 제 등을 제안 했습니다. 그것은 장 FCoV (일컬어 고양이 장 코로나 또는 FECV)의 S 단백질 S1/S2 사이트에 furin 및이 사이트에서 돌연변이 의해 죽 습 있을 것입니다 제안 되었습니다 (S2에서 뿐만 ') 프로 테아 제 요구 사항에 변화를 리드. 이러한 변이 차 있는 굴곡 운동 및 조직의 될 바이러스와 대 식 세포-트로픽 (일컬어 고양이 전염 성 복 막 염 바이러스 또는 FIPV)13이러한 바이러스의 pathogenicity와 연결 되었습니다.

바이러스는 자연스럽 게 각 복제 주기 동안 그들의 유전자에 돌연변이 소개 하 고 자주 새로운 하위 및 인플루엔자, 메 CoV와 FCoV의 긴장은 설명된14,,1516. 신흥 바이러스의 공중 보건 위협 평가를 급속 한 평가의 일부로, 그것은 분열 사이트 및 프로 테아 제 활성화 하는 이러한 바이러스의 범위에 어떻게 영향을 미치는 변화를 조사 하는 중요 한. 여기, 우리 메 CoV S 단백질의 분열 사이트 변화 기질 특이성 주어진된 효소의와 다니엘을 자신의 능력에 대 한 다양 한 프로 테아 제를 빠르게 화면에 미치는 영향에 매우 빠른 평가 허용 하는 펩타이드 기반 분석 결과 설명을 지정 또는 여러 시퀀스4. 실험의 두 번째 세트에서 우리는 다른 FCoV serotypes 및 긴장 furin 분열 활동을 결정 하는 기술을 사용.

이 분석 결과에서 사용 하는 펩 티 드 형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 쌍, N-말단에서 N-2, 4-dinitrophenyl (DNP)에 C-7-methoxycoumarin-4-yl 틸 (MCA) 수정 됩니다. 분석 결과, 동안 MCA 흥분 이며 쌍은 서로 게 가까운 근처에 DNP에 의해 침묵 이다 빛 에너지를 방출 한다. 그러나 분열이 발생 하는 경우, DNP는 더 이상 방출 끄다 수 없습니다 하 고 형광 플레이트 판독기에서 읽을 수 있습니다. 형광의 변화 실험 펩 티 드 분열 속도 확인 하 고는 프로 테아 제 특정 펩 티 드 (일컬어 Vmax)17앞 속도 계산 하는 동안 측정 된다.

펩 티 드를 디자인 하려면 각각 융해 단백질의 유전자 해야 합니다가 되어 시퀀스 및/또는 데이터베이스에서 사용할 수 있는. 그러나, 방법은 덜 노동 강렬 하 고 일반적으로 포유류 세포 분열 분석 하에 그것을 표현 하 식 벡터에 융합 단백질 유전자의 클로닝을 요구 하는 기존의 방법 보다 비용이 많이 드는입니다. 시작부터 끝까지, 여기에 제시 된 펩 티 드 분석 1 일 최대한 빨리 펩 티 드와 프로 테아 제를 사용할 수 있습니다 수행할 수 있습니다 하는 동안 몇 일 몇 주까지 걸릴 수 있습니다이. 분석 결과의 설치 샘플 수에 따라 5와 30 분 정도 걸립니다 그리고 형광 플레이트 리더에서 런타임 1 h. 분석 데이터의 샘플 크기에 따라 다시 2 시간까지 걸릴 수 있습니다.

여기, 우리는 분석 결과 제시 하는 두 가지 다른 예를 선택 했다. 첫 번째 예제에서 우리는 인간과 낙 파생 메-CoV, 그들은 종 방 벽을 교차 하는 경우에, 인간에서 활성화 되 고의 낙 타-파생 된 긴장의 잠재력을 평가 하의 furin 중재 분열 비교 데이터 제시. 두 번째 예제에서 우리는 S1/S2 및 S2 furin 중재 분열을 결정 하 fluorogenic 펩 티 드 분석 결과 사용 ' 사이트 또는 S2' 두 사이트 serotype 어 두 serotype II FCoV 긴장, 각각. 이러한 실험 trypsin 분열 긍정적인 제어로 사용 했습니다.

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Protocol

1. 디자인 하 고 준비 하는 펩 티 드

  1. NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)와 같은 공용 데이터베이스 또는 바이러스 병원 체 데이터베이스 (https://www.viprbrc.org)에서 융해 단백질의 시퀀스를 취득 합니다. 앞에 융합 펩타이드 효소 인식 사이트를 선택 하 고 2-3 아미노산 업스트림과 다운스트림이 시퀀스를 포함.
  2. 펩 티 드를 주문할 경우 N-말단에서 N-2, 4-dinitrophenyl (DNP)에 C-그들을 무서 워 쌍 7-methoxycoumarin-4-yl 틸 (MCA)와 함께 수정 합니다.
    참고: 여러 공급 업체는 이러한 수정을 제공합니다. 가격과 배달 시간 선택의 공급 업체에 따라 달라 집니다. 그러나, 대체 수정 존재 감도 다와 파장 면에서 플레이트 리더의 필요.
  3. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 제조업체 권장 사항에 따라 펩 티 드를 resuspend. 예를 들어 1 m m의 최종 농도에 70% 에탄올에 펩 티 드 resuspend.
  4. 선택적으로 포함 하는 펩타이드와 용 매 쥡니다 목욕으로 펩 티 드 pipetting으로 아주 잘 resuspend 하지 않는 경우 resuspended 완전히은 때까지 튜브를 추가 합니다.
  5. Aliquot 빛 감쇄 또는 저항 펩 티 드 튜브 표백에서 펩 티 드를 보호 하기 위해 합니다. Aliquot 크기 여러 동결/동결 해제 사이클 (예를 들어, 100 µ L)를 피하기 위해 작은 유지 합니다. -20 ° c.에 aliquots 저장

2. 형광 플레이트 리더 준비

  1. 플레이트 리더를 켜고 자체 테스트 완료 될 때까지 기다립니다.
  2. 연결된 된 컴퓨터에 운영 소프트웨어 열고 플레이트 리더와 연결 되어 있는지 확인 합니다.
  3. 온도 설정을 열고 30 ° C (또는 protease에 대 한 최적의 성능을 위해 필요한 온도)로 설정 합니다.
  4. 제어 클릭 | 계장 설치 실험 설정.
  5. 운동 선택 합니다.
  6. 형광을 선택 합니다.
  7. 입력 여기 및 방출 파장: 330 nm 및 390 nm 각각.
  8. Unselect 자동 컷-오프입니다.
  9. 중간, 보통 감도 선택 합니다.
  10. 분석 결과 대 한 1 h의 런타임을 선택 하 고 선택 한 측정 모든 60 s.
  11. 첫 번째 측정 및 3 전에 혼합 세트 5 s s 각 측정 하기 전에
  12. 웰 스를 읽고 분석 결과 시작을 선택 합니다.

3. 분석 결과 준비

  1. 각 성분에 대 한 적절 한 수량을 계산 하 고 그것을 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. Furin, 만들 버퍼 100 mM HEPES, 1mm CaCl2, 1 m m 2-mercaptoethanol, 5%의 구성 된 트라이 톤 X-100. 트립 신, 버퍼링 표준 인산 염 (PBS)를 사용 합니다.
    참고: 볼륨 10 mL 이하로 충분 한 있습니다. 분석 결과에서 사용 하는 protease(s) 따라 버퍼가 다릅니다.
  2. 얼음에 버퍼를 진정.
  3. 얇은 금속판 밑 지원 냉각 및 안정성을 가진 얼음에 분석 결과 접시를 놓습니다. 솔리드 블랙 플랫 바닥 폴리스 티 렌 96 잘 접시와 치료 비에 사용 합니다.
    참고: 검은 접시를 사용 하 여 인접 한 우물에서 형광 "누출"을 방지 하기 위해 필수적 이다.
  4. 이전 간행물 또는 실험 데이터에 따라 각 반응에 대 한 추가 protease의 적절 한 금액을 계산 합니다. Furin, 0.5 µ L에 해당 하는 반응 당 1 단위를 사용 합니다. 트립 신, 160 nM TPCK trypsin의 0.5 µ L을 사용 합니다.
  5. 샘플 당 샘플 당 100 µ L의 총 볼륨 분석 결과 당 3 기술 복제를 준비 합니다.
    참고: 그것은 실험적으로 평가 일반 조명 조건 하에서 실시 되는 pipetting 또는 빛을 흐리게 그것는 차이 확인 하지 않습니다 그. 그러나,는 펩 티 드 해야 하지 수 노출 빛에 시간의 연장된 기간에 대 한.
  6. 각 우물에 적절 한 양의 분석 결과 버퍼 (94.5 µ L 단계 3.1 아래 설명 된 대로) 플라스틱.
  7. 각 잘 하는 프로 테아 제를 추가 합니다. 둘 다, furin 및 TPCK 트립 신에 대 한 샘플 당 0.5 µ L을 사용 합니다. 6 우물 (3 우물 빈 컨트롤에 대 한)과 펩타이드 컨트롤 3 웰 스, 하려면 각각 효소 대신 0.5 µ L 버퍼를 추가 합니다.
  8. 빈 컨트롤을 제외 하 고 각 우물에 50 µ M의 최종 농도에 펩 티 드를 추가 합니다. 이 경우에, 플라스틱 5 µ L 펩 티 드 1.3 단계에서 설명한 대로 준비. 펩 티 드 대신 빈 제어 버퍼의 5 µ L를 추가 합니다.
    참고: 여러 농도의 펩 티 드 효소 포화 했다 되도록 설명된 효소 농도 처음 테스트 했다.
  9. 형광 판 리더에 접시를 삽입 하 고 시작을 클릭 합니다.

4. 데이터 분석

  1. 실험 파일을 저장 합니다.
  2. 수출 에 클릭 하 고으로.txt 파일을 내보냅니다.
  3. 스프레드시트에.txt 파일을 가져옵니다.
  4. 샘플 당 각 기술 복제 (보충 그림 1) x 축에 시간에 대 한 y 축에 상대 형광 단위 (RFU) 플롯 그래프를 만듭니다.
  5. 그래프는 선형 범위와 형광 증가의 시작에 가장 가까운은 하는 데이터 범위를 선택 합니다.
  6. 두 번째 그래프에서 선택한 데이터를 플롯 하 고 선형 추세선을 추가 합니다.
  7. 추세선 옵션 차트에 디스플레이 방정식에서 선택 합니다. 방정식은 Vmax 표시 됩니다.
  8. 3 기술에서 각 샘플에 대 한 평균 Vmax 복제를 계산 합니다.
  9. 3 생물 복제를 두 번 더 실험을 반복 합니다.
  10. 표준 편차 3 독립적인 생물에서 데이터 복제를 계산 합니다.

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Representative Results

우리는 s 2를 대표 하는 펩 티 드를 사용 하는이 연구의 첫 번째 부분에서 ' 세 가지 메 CoV S 단백질의 분열 사이트: 원형 EMC/2012 인간의 스트레인 (은행 AFS88936.1)와 선택 2에서 낙 타 파생 메-CoVs, NRCE-HKU205 (은행 AHL18090.1)와 Mor215 (은행 AVN89324.1) 긴장, 이집트와 모로코, 각각 (표 1)16,18에 격리.

EMC/2012 스트레인, HKU205 s 2에 비해 ' 분열 사이트는 P2 및 p 1에 두 개의 돌연변이 ' 잠재적으로 furin에 의해 그것의 인식에 영향을 줄 수 있고 분열 효율 (표 1)를 변경 하는 위치. 또한, 우리 경우 조사에 관심이 있었고 각 개별 돌연변이 HKU205 스트레인에 발견 furin 분열에 미치는 영향. 우리가, 그러므로, 개별 대체 EMC/2012 펩 티 드 순서에 소개 되었다 2 개의 펩 티 드 포함 (EMC/2012 무타-S s 2 '와 EMC/2012 mutS-난 S2') (표 1). Furin는 6.3 ± 1.2의 Vmax와 함께 효율적으로 EMC/2012 펩 티 드를 쪼개 다 수 RFU/분, 우리는 s 2를 사용 하는 경우 거의 아무 분열을 감지 하는 동안 ' HKU205 긴장의 펩 티 드 (Vmax 0.5 ± 0.1 RFU/분) (그림 1a). EMC/2012 무타-S s 2를 조사할 때 ' 펩 티 드, 우리 발견 분열 강하게 감소 되었다 야생 타입 시퀀스에 비해 (Vmax 3.6 ± 1 RFU/min). 때 거의 아무 분열 EMC/2012 mutS 테스트-난 S2' 펩 티 드 (Vmax 1.1 ± 0.9 RFU/분) (그림 1a).

최근, 서 부 아프리카에서 메 CoV 격리는 메 CoV phylogenetically 다릅니다에서 있다 아라비아 반도16보고 되었다. 최근 설명된 격리 중 하나는 운반 S2 P4 위치에 아르기닌 대신 신 Mor213 스트레인 ' 사이트 (표 1), 하 수와 잠재적으로 furin에 의해 그것의 인식에 영향 분열 효율 변경. 우리의 펩 티 드 분석 결과 보였다 Mor213 S2의 최소한의 분열은 단지 ' EMC/2012 사이트 (그림 1b)에 비해 사이트. Mor213 펩 티 드에 대 한 브이 맥스 1.0 ± 0.1입니다.

이 연구의 두 번째 부분, 동일한 펩타이드 분석 결과 FCoV S 단백질 분열 사이트의 분열 furin 중재를 평가 하기 위해 사용 했습니다. 우리가 사용 하는 펩 티 드의 2 개의 FCoV serotype S1/S2 분열 사이트를 흉내 낸 나 바이러스: FECV I와-4 (휘 태 커 연구소)에서 및 FIPV 검은색 (은행 AB088223.1). 또한 사용 하는 s 2를 흉내 낸 펩 티 드 ' 두 FCoV serotype II로 서 이러한 바이러스의 사이트: FECV II 1683 (은행 AFH58021.1) 및 FIPV II 1146 (은행 AAY32596.1) 긴장 (표 1). 일반적으로, furin 분열 기본 잔류물 (아르기닌과 리) 분열 사이트의 P1 및 p 4 위치에 있는 경우 발생 합니다. P1, p 4와 p 1에 돌연변이 ' 위치 제안 furin cleavability, 따라서 단백질의 효소 요구 사항 변경 방해 하 고. (표 1)입니다. Furin 절단 원형 S1/S2 펩 티 드 FECV I와-4 S1/S2에 대 한 관찰 되었다 (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/min) 하지만 돌연변이 S1/S2 펩타이드 FIPV에에서 나 블랙 S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1.29 RFU/분) (그림 2A). 마찬가지로, furin 원형 S2 쪼개 다 수 있었습니다 ' 펩 티 드 FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0.97 RFU/min), 돌연변이 S2 하지 하지만 ' 펩 티 드와 4 FECV I s 2 ' (Vmax 0.26 ± 0.11 RFU/min), FIPV 나 블랙 S2' (Vmax 0.30 ± 0.14 RFU/분) 및 FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0.11 RFU / 분) (그림 2B). 우리 펩 티 드 분열에 대 한 긍정적인 컨트롤로 트립 신을 사용 하 고 우리 모두는 펩 티 드 사용 (추가 그림 2)에서 트립 신 분열 관찰.

Table 1

표 1입니다. 펩 티 드 아미노산 사용 하 고 해당 시퀀스. 분석에 사용 된 펩 티 드 (7-methoxycoumarin-4-yl) 틸/2, 4-dinitrophenyl (MCA/DNP) 무서 워 쌍 포함. P4 및 p 1 분열 위치 사이트 아르기닌 (R) 잔류물, furin에 의해 인정 되는 대담한에 있다. 빨간색에서 잔류물 참조 시퀀스에 비해 돌연변이에 해당 합니다.

Figure 1
그림 1 . 인간과 낙 파생 메 CoV s 2의 분해 절단 Furin 중재 ' 사이트 fluorogenic 펩 티 드. A. Furin 분열 분석 결과 인간의 메-CoV EMC/2012 s 2의 ' 사이트 및 낙 타 파생 된 변형 HKU205 (이중 돌연변이), EMC/2012의 단일 돌연변이 변종 함께 (무타-S 및 mutS-나). B. Furin 분열 분석 결과 인간의 메-CoV EMC/2012 s 2의 ' 사이트 및 낙 타 파생 긴장 Mor213. 패널에 대 한 A B, 펩 티 드와 재조합 furin incubated 했다 고 형광 분해 처리 때문에 증가 fluorometer를 사용 하 여 측정 했다. 분석 결과 3 개의 독립적인 실험에서 브이 맥스의 평균을 나타내는 triplicates에서 수행한 (n = 3). 오차 막대 표시 sd. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . FCoV S1/S2 및 S2 분해 분열 Furin 중재 ' fluorogenic 펩 티 드 사이트. A. Furin 분열 분석 결과 FECV I와-4와 FIPV 나 블랙 S1/S2 사이트. 펩 티 드와 재조합 furin incubated 했다. B. Furin FECV I와-4, FIPV 나 검정, FECV II 1683 FIPV II 1146 S2의 분열 분석 결과 ' 사이트. 형광 분해 처리 때문에 증가 fluorometer를 사용 하 여 측정 했다. 분석 결과 3 개의 독립적인 실험에서 브이 맥스의 평균을 나타내는 triplicates에서 수행한 (n = 3). 오차 막대 표시 sd. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 1그림 2에 사용 되는 보충 표 1: Vmax 값. Vmax 값에서 계산 된 그래프 및 프로토콜 섹션 4에서에서 설명한 대로 추가 그림 1 에서 볼 수 있듯이. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 플레이트 리더 소프트웨어에서 파생 된 원시 데이터의 그림. 측정 하 여 Vmax 사용 된 시간 그래프에 형광의 증가. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 2: FCoV S1/S2 및 S2 분해 분열 Trypsin 중재 ' fluorogenic 펩 티 드 사이트. 트립 신 분열 분석 결과 FECV I와-4와 FIPV 나 블랙 S1/S2 사이트 및 FECV I와-4, FIPV 나 검정, FECV II 1683 FIPV II 1146 S2의 ' 사이트. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

선물이 여기 fluorogenic 펩 티 드 분석 결과 프로 테아 제에 의해 그들의 분해 분열에 대 한 단백질 시퀀스의 빠른 심사에 대 한 수 있습니다. 우리의 첫 번째 예제에서 우리는 다른 분열이 분석이 결과 대 한 응용 프로그램을 설명 하기 위해 메 CoV 스파이크 (S) 단백질의 사이트 주제를 선택 했다. 몇몇 바이러스 나 퓨전 메 CoV, SARS CoV (중증 급성 호흡기 증후군), 인플루엔자 등 단백질은 공중 보건에 대 한 중요 한 관심사 및 새로운 하위는 끊임없이 진화 하는 그는 교차 하는 종 가능성이 클래스는 둘러싸 인간1,,1516에 그들의 자연적인 호스트에서 장벽. 바이러스를 분리 하 고 실험실에서 배양 항상 가능한 않을 수 있습니다 또는 모든 연구 시설에서 제공 되지 않는 특별 한 실험실을 요구 한다. 따라서, 일반 실험실 조건 하에서 실시 될 수 있는 새로운 바이러스의 잠재적인 공중 보건 위협 평가 하는 방법에 대 한 필요가 있다. 인간을 대상으로 하는 바이러스 뿐만 아니라 FCoV 같은 일부 동물 바이러스 또한 소유 같은 종류 I 융해 단백질, 그러므로, 그들의 인간 대조 물 보다는 유사한 특성을 공유. 이러한 바이러스를 격리 그들을 공부 하는 혁신적인 도구를 사용 하 여 필요한 만들기 도전 될 수 있습니다.

위에서 언급 한 바이러스의 수명 주기에서 중요 한 단계는 호스트 셀 항목 및 퓨전 호스트 프로 테아 제1,2로 각각 융해 단백질의 분해 처리 하 여 중재입니다. 바이러스 성 수명 주기의이 부분을 조사 하는 표준 방법 이다 포유류 식 벡터에 융합 단백질 유전자를 복제, 포유류 세포 단백질 발현에 대 한 허용, 품 어 또는 공동 관심, 격리의 효소와 transfect transfect는 단백질 및 서쪽 오 점 분석을 수행. 이 방법은 몇 가지 제한 사항이 제공: 복제, DNA 또는 RNA, 사용할 수 있는 경우는 유전자를 합성에 대 한 비용에 대 한 바이러스 성 DNA/RNA의 융해 단백질의 분열 제품, 그리고 그것을 검출 하는 항 체의 최대 걸릴 수 있습니다 몇 가지 주 전체 연구 수행 될 때 까지입니다. 그것은 심지어 더 많은 시간이 걸리는, 돈과 노동 경우 사이트 지시 된 mutagenesis 필요 하기 때문에 분열 사이트에 몇 가지 돌연변이 조사 하는 연구의 관심은 집중 된다. 여기 설명 fluorogenic 펩 티 드 분석 결과 이러한 한계는 없습니다. 펩 티 드의 공개적으로 사용 가능한 시퀀스에 따라 디자인 될 수 있다, 다양 한 연구의 이러한 종류에 대 한 관련 된 재조합 프로 테아 제를 제공 하는 여러 공급 업체와 분석 등 분석 결과 내에서 수행할 수 있는 단일 하루입니다.

우리의 예제에서 우리는 s 2의 furin 중재 분열 검사 ' 메 CoV S 단백질의 효소 인식 사이트 인간과 이집트와 모로코에서 낙 타에서 파생 된. 낙 타와 인간의 EMC/2012 HKU205 S2' 일반적인 RXXR furin 분열 모티브를 포함 하는 사이트. 그러나, 점수 알고리즘 HKU205 S2 PiTou 2.0 쪼개 짐에 따라 ' 사이트 하지 우리는 furin에 의해 실험적으로 확인 된19죽 습 될 전망 이다. 이유 왜 HKU5 S2'에 의해 처리 되지 않습니다 furin 때문일 수는 P1에 이소류신 ' 위치. 우리는 EMC/2012 S2에 개별 돌연변이 전달 하는 2 개의 펩 티 드를 시험 하는 때 ' 순서, 우리 확인 수 있었다는 P1에 이소류신 ' 감소 분열 귀착되 었 다 떠들고 대체에 알라닌 반면 크게 분열 되어있는. Mor213 S2' 사이트 furin 분열 모티브를 포함 하지 않습니다 그리고 그것은 거의 아무 분열을 감지 하는 놀라운 일이 아니었다. 우리는 또한 어떻게 furin 앞 S1/S2 및 S2 시험 ' FCoV S 단백질의 효소 인식 사이트. 우리 모두 FECV 펩 티 드의 furin 분열을 관찰할 수 있었다 (FECV I와-4 S1/S2 및 FECV II 1683 S2'), FIPV 바이러스에서 돌연변이 순서 furin에 의해 죽 습 하지 했다.

EMC/2012 s 2의 furin 중재 분열을 비교할 때 ' 펩 티 드 (그림 1A) FECV I와-4 S1/2 펩 티 드 (그림 2A)와 함께, 우리는 브이 맥스에서 대략 26-fold 차이 발견. 이 두 시퀀스 (표 1)에서 furin 분열 모티브에 의해 설명 될 수 있다. Furin 분열에 대 한 최소 요구는 RXXR 모티브, RXRR 순서는 훨씬 더 유리한2입니다. 따라서, EMC/2012 S2' 펩 티 드, RSAR 모티브가 RSRR furin 분열 사이트 (표 1)를 포함 하는 FECV I와-4 S1/2 펩 티 드에 비해 더 적은으로 죽 습.

그러나, 분석 결과의 한 가지 주요 한계는 펩 티 드에는 그들은 일반적으로에 포함 된 단백질의 3 차 구조를 반영 하지 않습니다. 전체 길이 융해 단백질의 분열 융해 펩 티 드를 제공 하 고 트리거 호스트 셀 항목1. 우리는 펩 티 드 더 많거나 적은 선형 가정 하는 동안 융해 단백질의 3 차 구조에 의해 효소와 퓨전 단백질 사이 상호 작용 또한 영향을 수도 있습니다. 따라서, 분열 펩 티 드 분석 결과에서 발견 인공 수 있으며 vivo에서 상황을 반영 하지 않을 수 있습니다. 이 인플루엔자 H3N2 하 하위의 분열에 대 한 matriptase에 의해 보고 되었다. 여러 그룹의 H3N2 하 분열 펩 티 드 분석 실험에서 matriptase 설명, 하는 동안 그것은 또한 fusogenic HA 단백질4,20, 전체 길이 H3N2 하 단백질 및 세포 배양에서 matriptase의 부 화 발생 하지 않았다 표시 했다 21. 분해 분열의 생물학으로 중요 한 규정의 단백질 구조 수준에는 보여 주는 다른 예제 들이 있다.입니다. 그것은 퓨전 단백질 때때로 일련의 융합에 따라 분열 사이트 노출 수를 미리 퓨전 이벤트 필요 설명 하고있다. Semliki 숲 바이러스 융해 단백질, 예를 들어 prefusion 이벤트의 융해 단백질을 노출 하 고 분해 활성화22사용할 수 중 구조 재배열을 요구 한다. 따라서, fluorogenic 펩 티 드 분석 결과에서 얻은 결과 셀 퓨전 분석 실험 또는 유사한 실험에 의해 확인 될 필요가 있다. 그러나, 펩 티 드 분석 결과 아직도 여러 효소/펩 티 드 조합 및 분열을 표시 하지 않는 조합은 매우 가능성이 같은 결과는 vivo에서전시 이후 노동 및 후속 실험의 시간을 줄이기 위해 빠른 심사를 허용 한다.

분석 결과의 두 번째 주요 한계는 프로 테아 제를 염려 한다. 지금까지 그것은 수용 성 프로 테아 제 하지만 하지 막 횡단 프로 테아 제를 테스트 수 있습니다. 실험의 의도 따라이 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어, 인플루엔자는 다양 한 세포 막8에 위치한 막 횡단 프로 테아 제에 의해 활성화 됩니다. 어느 정도 녹는 분해 활성 도메인을 사용 하 여이 문제를 피할 수 있지만 결과 주의로 해석 하 고 기존의 방법으로 확인 합니다. Matriptase 그리고 그것의 활동으로 H3N2 하 beforementioned 예제를 참조 합니다. Vivo에서 matriptase은 세포 막에 있지만 상업적으로 이용 가능한 효소는 수용 성 촉매 도메인. 융합 단백질에 관하여 설명 했 듯이, 그것은 가능한 그것은 또한 절단과 테스트 단일 도메인만 초래할 수 있다는 오판을 전장 단백질 기질 상호 작용 길이 효소 필요 합니다 수 있습니다.

이 방법론은 furin에 의해 특정 아미노산 시퀀스의 분열을 공부 효율적으로 보이고 있다. 그러나, 기술은 범위의 모든 사용 가능한 프로 테아 제 (, cathepsins, proprotein convertase), 응용 프로그램 화면 펩타이드 후보 효소 분열에 대 한 유용한 방법을 만들고. 또한, 그것은 보였다이 분석 결과 또한 protease 억제제의 효능을 테스트 하는 데 사용 수 및 따라서 빨리 하 고 쉽게 화면 단백질 억제제23도구를 제공 합니다.

여기에 설명 된 fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과 아미노산 속성 및 순서에 따라 결정 된 효소에 의해 펩 티 드 분열 예측 알고리즘, 득점 bioinformatic 분열에 추가 나타냅니다. 이 두 기술은 함께 전통 서양 기술을 blotting 효소 분열 시험관을 공부 하는 효율적인 방법으로 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

R21 AI111085 부여 연구 자금 메 프로젝트가이 원고에 제시 되었다 NIH에 의해 제공 해 왔습니다. 고양이 코로나 연구 모리스 동물 재단, Winn 고양이 기초와 코넬 고양이 보건 센터에서 연구 보조금에 의해 지원 되었다. 우리 또한 말리 크 거기 그것이 공개적으로 액세스할 수 전에 Mor213 시퀀스를 제공 하기 위한 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptides Biomatik N/A
Furin NEB P8077S
Trypsin, TPCK-treated Sigma-Aldrich 4352157-1KT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Triton-X100 Sigma-Aldrich X100
PBS Corning 21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices XPS
SoftMax Pro 6.5.1  Molecular Devices N/A
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) Costar 3915
Light damping tubes Watson Lab 131-915BL or 131-915BR
Microsoft Excel Microsoft N/A
Prism 7 GraphPad N/A

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References

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