Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

* These authors contributed equally
Biochemistry

GE Global Research must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Biz peptidler viral füzyon peptidler bölünme sitenin temsil eden proteaz proteolitik aktivite hızlı bir tarama sağlayan bir fluorogenic peptid bölünme tahlil mevcut. Bu yöntem aynı zamanda bir protein sıra içinde diğer amino asit motif üzerinde proteaz aktivitesi için test etmek için kullanılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jaimes, J. A., Millet, J. K., Goldstein, M. E., Whittaker, G. R., Straus, M. R. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (143), e58892, doi:10.3791/58892 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Coronaviruses veya grip virüsü gibi saran virüs ana hücre enfekte edebilmek için kendi füzyon proteinin proteolitik bölünme gerektirir. Genellikle virüsler hücre ve doku tropism sergi ve belirli hücre veya doku proteaz için uyarlanmış. Ayrıca, bu virüsler mutasyon veya eklemeler içine onların genom bölünme etkileyebilir ve böylece yeni bir ana bilgisayara uyarlamalar katkıda bulunabilir çoğaltma sırasında ortaya çıkarabilir. Burada, viral füzyon proteinlerin bölünme sitesini taklit peptidler hızlı bir tarama sağlayan bir fluorogenic peptid bölünme tahlil mevcut. Bu teknik çok esnek ve birçok farklı yüzeyler üzerinde tek bir proteaz proteolitik aktivite araştırmak için kullanılan ve buna ek olarak, ayrıca bir veya daha fazla peptid yüzeyler üzerinde birden fazla proteaz aktivitesinin incelenmesi sağlar. Bu çalışmada, Biz bölünme sitesi motifleri coronavirus spike protein taklit peptidler kullanılır. İnsan test ettik ve deve Ortadoğu solunum Sendromu coronaviruses (MERS-CoV) tek ve Çift Kişilik oyuncu değişikliği bölünme sitedeki furin etkinliği değiştirmek ve bölünme verimliliği önemli ölçüde değiştirmek göstermek için türetilmiş. Ayrıca bu yöntem Biyoinformatik ile birlikte test furin bölünme etkinliği farklı serotipleri ve suşların kedi coronavirus spike proteinlerin için kullanılır. Bu peptid tabanlı yöntem daha az emek ve zaman geleneksel yöntemlerle virüslere karşı proteolitik aktivite analizi için kullanılan daha yoğun ve sonuçları tek bir gün içinde elde edilebilir.

Introduction

Konak hücre zarı ile viral fusion saran virüs yaşam döngüsü içinde çok önemli bir adımdır ve çoğaltma virüs ve hücre içine girişi kolaylaştırır. Tipik olarak, virüs özel bir protein (veya proteinler) üzerinde ana hücre membran reseptörleri bağlar ve virüs-hücre membran fusion1tetikler sahip. Viral füzyon protein üç ana sınıfları (ı-III)1grupladığınızda. Şu anda grip virüsü (temsil eden bir uzun süredir olabilmekte ortaya çıkması kuşlar) ve Orta Doğu Solunum Sendromu-coronavirus (MERS-CoV) gibi halk sağlığı için önemli bir endişe virüs sayısı (bir son temsil eden olabilmekte ortaya çıkması deve--dan), sözde kullanmak sınıf ı proteolitik işlemi kendi fusogenic etkinlik2uygulamak için ana bilgisayar proteaz tarafından istemeniz füzyon protein. Benzer şekilde, bir büyük hastalık tehdit yerli ve vahşi kediler için temsil eden, kedi coronavirus (FCoV), ayrıca bir sınıf sahip ben füzyon protein. Sınıf ı viral füzyon proteinler genellikle bir uncleaved habercisi sentezlenmiş ve genellikle bağlama ve füzyon olay tetikleme sırasıyla reseptör için sorumlu iki etki alanı oluşur. Bugüne kadar en iyi füzyon protein anlaşılır ve çok sayıda çalışma ana hücre giriş ve füzyon3mekanik rolü tarif var grip hemagglutinin (HA) olduğunu. Bu durumda bölünme füzyon proteinin bir özel sıra veya bölünme sitesinden HA içinde ve pH bağımlı konformasyon değişiklikleri, viral füzyon peptid1,2pozlama sonuçları ile birlikte ortaya çıkar.

Füzyon peptid ve onun önceki proteaz tanıma sıra patojenitesi ve virüs ana bilgisayar adaptasyon için önemlidir. Değişiklikleri proteaz tanıma sırasındaki bölünme virüs ve ana bilgisayar4için potansiyel olarak dramatik sonuçları ile önemli ölçüde değiştirebilir. Bir taraftan, bu bölünme iptal etmek ve böylece virüs yaşam döngüsü ortadan kaldırmak. Ama öte yandan, bir mutasyon belirli bir proteaz substrat özgüllüğü artırmak ve füzyon protein ayırmak "yeni" bir proteaz izin. Daha sonra bu gözlemlediği gibi Örneğin, grip virüsü alt türlerinden5,6hücre ve doku tropism genişletebilirsiniz. Patojenitesi kuş gribi (LPAI) virüsler genellikle düşük ve en insan grip virüsleri gastrointestinal veya solunum sistemi için onları harekete geçirmek proteaz sınırlı lokalizasyonu nedeniyle sınırlı bulunmaktadır. Genellikle, bu tür HA proteinlerin füzyon peptid tripsin benzeri serin proteaz tripsin, matriptase veya TMPRSS27, gibi tarafından tanınan ardışık olmayan bir temel amino asitler 1-2, oluşan bir dört-amino asit dizisi tarafından öncesinde 8. virüs insersiyonlara veya bölünme sitenin polybasic bir siteye değiştirmek mutasyonlar dakötüye furin HA etkinleştirmek için ve potansiyel bir çok daha ağır sistemik enfeksiyon6,9neden için sağlar. Bu virüsler H5N1 suşları tarafından harles yüksek patojenitesi kuş gribi virüsü (HPAI) olarak adlandırılır.

Grip HA aksine, iki ayrı bölünme site içinde onların spike protein MERS-CoV gibi pek çok coronaviruses var. S1/S2 sitesi N-terminal reseptör bağlayıcı etki (S1) (S2), C-terminal füzyon etki alanından S2 olarak adlandırılan ikinci bir bölünme siteyle ayıran ', S1/S2 sitesinde fusion peptid10yakınlık aşağı. Siteleri ardışık olarak S1 S2/S2 tarafından takip, i ciddi ki önerildi '. Aksine çoğu grip virüs suşları, MERS-CoV S protein/S2 S1 ve S2 HA' siteleri proteaz furin gibi proprotein konvertaz (PC) aile tarafından tanınan. Bu motifi R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2ile eşleştirilmiş temel kalıntıları, ayırmak. Genel olarak, akıntıya karşı bölünme sitesinin amino asitler için adlandırılır P1, P2, P3, vb. bölünme site ve amino asitler aşağı sayma P1 belirlenmiş ', P2', P3', vs. 11. FCoV suşları de tek bir ya da bir çift göğüs arası site yok. MERS-CoV gibi bazı FCoV suşlarının aynı zamanda sahip iki bölünme site (S1/S2 ve S2') onların S protein. Ancak, bu özelliği özel bir serotip ben FCoVs (a clade) olduğunu. Buna ek olarak, serotip II (clade B) gruplandırma üyeleri yalnızca bir tek bölünme site var (S2')2,12. Birkaç proteaz furin, tripsin benzeri proteaz ve cathepsin gibi FCoV bölünme siteleri ayırmak önerdi. Enterik FCoV (olarak da bilinen kedi enterik coronavirus veya FECV) S protein furin S1/S2 sitesindeki ve mutasyonlar bu sitedeki i ciddi muhtemeldir önerilmiştir (S2 gibi yanı sıra ') proteaz gereksinimleri değişikliklere yol açar. Bu mutasyonlar tropism ve sistemik olmak için virüs ve makrofaj-tropic (olarak da bilinen kedigil bulaşıcı peritonitis virüs ya da FIPV)13izin vererek bu virüslerin patojenitesi değişiklikler ile ilişkili bulunmuştur.

Virüs doğal mutasyonlar onların genleri içine her çoğaltma döngüsü sırasında tanıtmak. ve sık sık yeni alt türlerini ve grip, MERS-CoV ve FCoV açıklanan14,15,16. Halk Sağlığı tehdit ortaya çıkan virüs değerlendirmek için hızlı bir değerlendirme bir parçası olarak, bölünme sitesi ve nasıl bu virüsler aktive proteaz aralığını etkiler değişiklikleri öğrenmek için önemlidir. Burada, biz nasıl etkileyeceğini bölünme site değişiklikleri MERS-CoV S protein substrat özgüllüğü belirli bir proteaz ve hızlı bir şekilde ayırmak yeteneklerini için çeşitli proteaz ekran için çok hızlı bir değerlendirme sağlar peptid tabanlı bir tahlil tarif bir verilen veya birden çok dizileri4. Deneyler ikinci kümesi içinde farklı FCoV serotipi ve suşların üzerinde furin bölünme etkinliğini belirlemek için teknik kullanılır.

Bu tahlil kullanılan peptidler floresans rezonans enerji transferi (FRET) çift, N-terminus ve N-2,4-dinitrophenyl (DNP) C-terminus, 7-methoxycoumarin-4-yl asetil (MCA) ile değiştirilir. Tahlil sırasında MCA heyecanlı ve birbirlerine yakın çevrede bulunan çift olduğu sürece DNP tarafından giderdikten ışık enerji yayar. Bölünme ortaya çıkarsa, ancak, DNP emisyon artık gidermek mümkün değildir ve floresan plaka okuyucu tarafından okunabilir. Floresans değişimler peptit bölünme oranı belirlemek ve hangi belirli peptit (olarak da bilinen Vmax)17proteaz cleaves hız hesaplamak için deneme sırasında ölçülür.

Peptidler tasarlamak için ilgili füzyon proteinin gen gerekir sıralı ve/veya bir veritabanında kullanılabilir. Ancak, daha az emek-yoğun ve genellikle bölünme çözümlenecek memeli hücrelerinde ifade etmek için ifade vektörel çizimler içine füzyon protein Gen klonlama gerektiren geleneksel yöntemlere göre pahalı bir yöntemdir. Burada sunulan peptid deneyleri 1 peptidler ve proteaz mevcuttur en kısa zamanda gün içinde yapılabilir sonuna kadar başından beri bu kadar birkaç hafta birkaç gün sürebilir. Tahlil Kur örnek sayısına bağlı olarak 5 ve 30 dk arasında ve çalışma zamanı floresans plaka okuyucu içinde 1 h veri analizi en fazla 2 saat örnek boyutuna bağlı olarak daha sürebilir.

Burada, iki farklı örnek tahlil sunmak için seçtik. İlk örnekte, biz insan ve deve kaynaklı MERS-tür bariyer geçersen insanlarda aktive ediliyor, deve kaynaklı suşları potansiyelini değerlendirmek için CoV, furin aracılı bölünme karşılaştırır veri mevcut. İkinci örnekte, biz/S2 S1 ve S2 furin aracılı bölünme belirlemek için bir fluorogenic peptid tahlil kullanılan ' siteleri veya S2' iki sitenin serotype ben ve iki serotip II FCoV suşları, anılan sıraya göre. Bu deneyler için tripsin bölünme bir pozitif kontrol kullanılan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tasarlama ve peptidler hazırlanıyor

  1. Füzyon proteini NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) gibi kamuya açık bir veritabanı veya virüs patojen veritabanı (https://www.viprbrc.org) dan ilgi sıralaması elde etmek. Füzyon peptid önceki proteaz tanıma site seçin ve 2-3 amino asitler upstream ve downstream bu sırası içerir.
  2. Peptidler sipariş verirken, N-terminus ve N-2,4-dinitrophenyl (DNP) C-terminus adlı FRET çift 7-methoxycoumarin-4-yl asetil (MCA) değiştirebilirsiniz.
    Not: Bazı tedarikçiler bu değişiklikleri sağlar. Fiyat ve teslim süresi bağlı seçim tedarikçisi. Ancak, alternatif değişiklikler hangi duyarlılık içinde değişir ve plaka okuyucu açısından dalga boylarında ayarlamalar gerektiren bulunmaktadır.
  3. Peptid üreticilerin önerilerine göre hafifçe yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Örneğin, peptidler 1 mM son konsantrasyonu % 70 etanol içinde resuspend.
  4. İsteğe bağlı olarak, peptid çok iyi pipetting tarafından resuspend değil eğer tamamen resuspended kadar bir sonication banyoya peptid ve çözücü içeren tüp ekleyin.
  5. Aliquot peptid ağartma üzerinden korumak için hafif gölgeleme ağı içine veya dayanıklı peptid tüpleri. Aliquot boyutları birden çok donma/çözülme döngüsü (Örneğin, 100 µL) önlemek için küçük tutun. Aliquots-20 ° C'de depolayın

2. floresans plaka okuyucu hazırlanması

  1. Plaka Okuyucu açın ve otomatik test tamamlanana kadar bekleyin.
  2. Ekli bilgisayarda işletim yazılımı açın ve plaka okuyucu ile bağlı olduğundan emin olun.
  3. Sıcaklık ayarı açın ve 30 ° C (veya en iyi performans için proteaz için gerekli sıcaklık) için ayarlayın.
  4. ' I tıklatın denetimde | Araç kurulum deneme oluşturmak için.
  5. Kinetik seçin.
  6. Floresans seçin.
  7. Uyarma ve emisyon dalga boylarında girin: 330 nm ve 390 nm anılan sıraya göre.
  8. Otomatik kesme seçimini kaldırır.
  9. Orta, normal duyarlılık seçin.
  10. 1 h tahlil için bir çalışma zamanı seçtiyseniz ve bir ölçü her 60 s.
  11. İlk ölçüm ve 3 önce karıştırma set 5 s s her ölçü önce
  12. Kuyu okumak ve tahlil başlatmak için seçin.

3. tahlil hazırlanması

  1. Tahlil arabellek her madde için uygun miktarlarını hesaplamak ve ekleme hazırlamak. 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol, %5 oluşan arabellek furin için yapmak Triton X-100. Tripsin için standart fosfat tamponlu tuz (PBS) çözüm kullanın.
    Not: Birimleri 10 mL veya daha az yeterli. Assay olarak kullanılan protease(s) arabellek göre değişir.
  2. Buz üzerinde arabellek chill.
  3. Buz ince metal bir plaka altında destek soğutma ve kararlılık ile tahlil tabak yerleştirin. Sağlam bir düz dipli polistren 96-şey plakalı siyah ve sigara tedavi kullanımı.
    Not: Bitişik kuyulardan floresan "kaçağı" önlemek için siyah plaka kullanmak için gereklidir.
  4. Proteaz önceki yayınları veya deneysel verileri temel alan her reaksiyon için eklemek için uygun miktarını hesaplamak. Furin için 0.5 µL için karşılık gelen tepki başına 1 adet kullanın. Tripsin için 160 nM TPCK tripsin 0.5 µL kullanın.
  5. Örnek 100 µL örnek başına toplam hacmi tahlil başına 3 Teknik çoğaltır hazırlayın.
    Not: Pipetting normal ışık koşulları altında yürütülen ışık soluk ya da bir fark yaratmak değil deneysel olarak değerlendirilmiştir. Ancak, peptidler ışık için uzun bir süre için maruz değil.
  6. Tahlil arabellek (adım 3.1 altında açıklandığı gibi 94,5 µL) uygun miktarda her kuyuya pipette.
  7. Proteaz her şey için ekleyin. Hem, furin ve TPCK tripsin, örnek başına 0.5 µL kullanın. 6 wells (3 kuyular için boş bir denetim) ve peptid denetimi için 3 kuyu için 0.5 µL arabellek ilgili proteaz yerine ekleyin.
  8. Peptid 50 µM boş denetim dışında her şey için son bir konsantrasyon ekleyin. Bu durumda, adım 1.3 altında açıklandığı gibi hazırlanan 5 µL peptid pipet. 5 µL arabelleği peptid yerine boş denetimine ekleyin.
    Not: Birçok peptid konsantrasyonları başlangıçta enzimler doymuş emin olmak için açıklanan enzim konsantrasyonları ile test edildi.
  9. Plaka floresans plaka okuyucuya yerleştirin ve Başlat'ı tıklatın.

4. veri analizi

  1. Deneme dosyayı kaydedin.
  2. Dışa Aktar ' ı tıklatın ve dosyayı .txt verin.
  3. .Txt dosyasının bir elektronik tabloya almak.
  4. Örnek başına teknik her çoğaltma için y ekseni (Tamamlayıcı Şekil 1) zamana karşı komplo göreli floresan birimleri (RFU) bir grafik oluşturun.
  5. Grafik doğrusal bir aralığı ve floresan artış başlangıcı en yakın nerede veri aralığını seçin.
  6. İkinci grafikte seçili verileri çizmek ve doğrusal bir eğilim çizgisi ekleyebilirsiniz.
  7. Eğilim çizgisi seçenekleri grafik üzerinde denklemi görüntüleseçin. Denklemi Vmax gösterir.
  8. 3 teknik her örnek için Ortalama Vmax çoğaltır hesaplayın.
  9. 3 biyolojik çoğaltır elde etmek için iki kez daha denemeyi tekrarlamak.
  10. Çoğaltır 3 bağımsız biyolojik gelen verileri temel alarak standart sapmayı hesaplar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmanın ilk bölümünde biz S2 temsil peptidler kullanılan ' bölünme site üç ayrı MERS-CoV S proteinlerin: prototip EMC/2012 insan zorlanma (Genbank AFS88936.1) ve iki seçili deve-elde MERS-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) ve Mor215 (Genbank AVN89324.1) suşlar, Mısır ve Fas, sırasıyla (Tablo 1)16,18izole.

EMC/2012 gerginliği, HKU205 S2 karşılaştırıldığında ' bölünme have iki mutasyonların P1 ve P2' potansiyel olarak kendi tanıma furin tarafından etkileyen ve bölünme verimliliği (Tablo 1) alter pozisyonlar. Buna ek olarak, biz eğer araştırmaya baktılar ve her bireysel mutasyon HKU205 zorlanma bulundu furin bölünme etkilemesi. Biz, bu nedenle, iki peptidler nerede bireysel oyuncu değişikliği EMC/2012 peptit dizisi tanıtıldı dahil (EMC/2012 mutA-S S2' ve EMC/2012 mutS-ben S2') (Tablo 1). Furin EMC/2012 peptid verimli bir Vmax 6.3 ± 1.2 ile ayırmak mümkün RFU/dak S2 kullanırken neredeyse hiçbir bölünme tespit ederken,' peptid HKU205 baskı (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/dak) (Şekil 1a). EMC/2012 mutA-S S2 soruşturma zaman ' peptid, bulduk bölünme şiddetle düşürüldü vahşi tipi kol ile karşılaştırıldığında (Vmax 3.6 ± 1 RFU/dak). EMC/2012 mutS test ederken neredeyse hiçbir bölünme oldu-ben S2' peptid (Vmax 1,1 ± 0.9 RFU/dak) (Şekil 1a).

Son zamanlarda, Batı Afrika'dan MERS-CoV yalıtır filogenetik MERS-CoV farklı Arap Yarımadası'nda16' bulunan rapor edilmiştir. Son zamanlarda açıklanan yalıtır biridir bir lösin bir arginin S2 P4 pozisyonda yerine taşır Mor213 gerginliği,' site (Tablo 1) ve potansiyel olarak kendi tanıma furin tarafından etkisi ve bölünme verimliliği alter. Bizim peptid tahlil sadece Mor213 S2 en az bölünme olduğunu gösterdi ' site ile karşılaştırıldığında EMC/2012 sitesi (Şekil 1b). Mor213 peptid Vmax 1.0 ± 0,1 olduğunu.

Bu çalışmanın ikinci adıma, furin aracılı bölünme FCoV S protein bölünme siteleri değerlendirmek için aynı peptid tahlil kullanılan. Biz iki FCoV serotip S1/S2 bölünme sitenin taklit peptidler kullanılan ben virüs: FECV ı ve-4 (Whittaker laboratuarından) ve FIPV ben siyah (Genbank AB088223.1). Biz de S2 taklit peptidler kullanılır ' site bu virüsler, hem de iki FCoV serotip II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) ve FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) suşlar (Tablo 1). Temel kalıntıları (arginin ve lizin) bölünme sitesi P1 ve P4 pozisyonlar mevcut olduğunda genellikle, furin bölünme ortaya çıkar. Mutasyonlar P1, P4 ve P1' pozisyonları bu nedenle protein proteaz gereksinimlerini değiştirme furin cleavability ile müdahale için önerilir. (Tablo 1). Furin bölünme prototip S1/S2 peptid FECV ı-4 ve S1/S2 için gözlenen (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/dak) değil, mutasyona uğramış S1/S2 peptid FIPV ben siyah S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1.29 RFU/dak) (Şekil 2A). Benzer şekilde, furin prototip S2 ayırmak başardı ' peptid FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0,97 RFU/dak), ama değil mutasyona uğramış S2' peptidler FECV ı-4 ve S2' (Vmax 0,26 ± 0,11 RFU/dak), FIPV ben siyah S2' (Vmax 0.30 ± 0,14 RFU/dak) ve FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0,11 RFU / dk) (Şekil 2B). Peptid bölünme için olumlu bir denetim olarak tripsin kullandık ve kullanılan tüm peptidler (Tamamlayıcı Şekil 2) tripsin bölünme görülmektedir.

Table 1

Tablo 1. Peptidler kullanılan ve karşılık gelen amino asit dizileri. Deneyleri içinde kullanılan peptidler (7-methoxycoumarin-4-yl) asetil/2,4-dinitrophenyl (MCA/DNP) perde çifti içerir. Hangi furin tarafından tanınan, P4 ve P1 bölünme konumlandırılmış sitesi arginin (R) artıkları, kalın bulunmaktadır. Kırmızı kalıntılarında başvuru serileri göre mutasyonlar karşılık gelir.

Figure 1
Resim 1 . İnsan ve deve kaynaklı MERS-CoV S2, proteolitik bölünme furin aracılı ' siteleri fluorogenic peptidler. A. Furin bölünme tahlil insan MERS-CoV EMC/2012 S2' site ve deve kaynaklı zorlanma HKU205 (Çift Kişilik mutant), EMC/2012 tek mutant türevleri ile birlikte (mutA-S ve mutS-ben). B. Furin bölünme tahlil insan MERS-CoV EMC/2012 S2' site ve deve elde edilen gerilim Mor213. Paneller için A ve B, peptidler rekombinant furin ile inkübe ve floresan proteolitik işleme nedeniyle artış bir yer kullanılarak ölçüldü. Deneyleri Vmax ortalamalar üç bağımsız deneylerden temsil eden sonuçları ile triplicates içinde gerçekleştirilmiştir (n = 3). Hata Çubuklarõn SD Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Proteolitik bölünme furin aracılı FCoV S1/S2 ve S2' siteleri fluorogenic peptidler. A. Furin bölünme tahlil FIPV ve FECV ı-4 ve ben siyah S1/S2 siteleri. Peptidler rekombinant furin ile inkübe. B. Furin bölünme tahlil FECV I ve-4, ben siyah, FIPV FECV II 1683 ve FIPV II 1146 S2' siteleri. Floresans proteolitik işleme nedeniyle artış bir yer kullanılarak ölçüldü. Deneyleri Vmax ortalamalar üç bağımsız deneylerden temsil eden sonuçları ile triplicates içinde gerçekleştirilmiştir (n = 3). Hata Çubuklarõn SD Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Ek tablo 1: Resim 1 ve Şekil 2için kullanılan Vmax değerleri. Değerleri üzerinden hesaplanan Vmax tamamlayıcı Şekil 1 ' de gösterildiği gibi ve Bölüm 4 iletişim kuralında tanımlandığı gibi grafikler. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 1: ham veri gösterimi plaka okuyucu yazılımdan türetilen. Floresans Vmax belirlenmesi için kullanılan zaman grafikler üzerinde artırılır. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 2: proteolitik bölünme tripsin aracılı FCoV S1/S2 ve S2' siteleri fluorogenic peptidler. Tripsin bölünme tahlil FIPV ve FECV ı-4 ve ben siyah S1/S2 siteleri ve FECV I ve-4, ben siyah, FIPV FECV II 1683 ve FIPV II 1146 S2' siteleri. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada proteaz tarafından onların proteolitik bölünme protein dizileri hızlı bir tarama için izin veren bir fluorogenic peptid tahlil mevcut. İlk örneğimizde sitesi motifler bu tahlil için bir uygulama göstermek için MERS-CoV spike (S) protein farklı bölünme seçtik. Birkaç ben proteinler MERS-CoV, SARS-CoV (şiddetli akut solunum Sendromu) ve grip gibi halk sağlığı için önemli kaygıları ve yeni alt türlerinden sürekli gelişmekte olan füzyon türler geçmeye bir potansiyele sahip sınıf sahip virüs zarflı engelleri onların doğal ana bilgisayarlara göre insanlar1,15,16. Belgili tanımlık virüs izole edip onları laboratuarda yetiştirilmesi her zaman mümkün olmayabilir veya her araştırma tesisinde kullanılabilir değil özel laboratuvarlar gerektirir. Bu nedenle, yöntemleri düzenli laboratuvar koşullarında yapılan gelişmekte olan virüslerin olası Halk Sağlığı tehdit değerlendirmek için bir ihtiyaç vardır. FCoV gibi hayvan bazı virüsler de aynı sahip insanlar hedefleme virüsler ek olarak, sınıf ı insan meslektaşlarına benzer özelliklere füzyon protein, bu nedenle,. Bu virüs izole da onları çalışmaya yenilikçi araçları kullanmak gerekli olduğunun bir meydan okuma olabilir.

Yukarıda belirtilen virüs yaşam döngüsü içinde önemli bir adımı konak hücre girişini ve füzyon tarafından ilgili füzyon proteinin proteolitik işleme ana bilgisayar proteaz1,2tarafından aracılı var. Bu bölümü viral ömrünün araştırmak için standart bir yol olduğunu füzyon protein gen bir memeli ifade vektör clone, protein ifade için izin, kuluçkaya veya faiz, ayrı tutulan proteaz ile ortak transfect memeli hücreleri transfect için protein ve western blot analizi gerçekleştirin. Bu yöntem ile bazı sınırlamaları geliyor: viral DNA/RNA klonlama, DNA veya RNA kullanılabilirse, gen sentezleme maliyetleri için kullanılabilirliğini füzyon protein ve onun göğüs arası ürün (ler) ve bunu tespit etmek için bir antikor kullanılabilirliğini alabilir birkaç Tüm çalışma gerçekleştirilene kadar hafta. Hatta daha fazla zaman alan, para ve emek yoğun çalışmanın ilgi sitesi-yönetmen mutagenesis gerektirdiğinden çeşitli mutasyonlar bölünme sitedeki araştırmak için ise olur. Biz burada tarif fluorogenic peptid tahlil bu sınırlamalar yoktur. Peptidler ilgi bağlı halk için elde edilebilir dizileri olarak tasarlanabilir, orada bu tür çalışmalar için uygundur rekombinant proteaz geniş bir sunar birçok tedarikçiler ve analizi de dahil olmak üzere tahlil içinde gerçekleştirilen bir tek gün.

Bizim örneğimizde, biz furin aracılı bölünme S2, muayene ' proteaz tanıma sitesi MERS-CoV S protein elde edilen insan ve Mısır ve Fas deve. İnsan EMC/2012 ve deve HKU205 S2' siteleri içerir bir tipik RXXR furin bölünme motif. Ancak, algoritma HKU205 S2 Puanlama PiTou 2.0 bölünme göre ' site değil furin tarafından hangi biz deneysel olarak teyit edilen19i ciddi için tahmin. Neden neden HKU5 S2' tarafından işlenmez furin P1 isoleucine nedeniyle olabilir ' konum. Ne zaman biz test bireysel mutasyonlar EMC/2012 S2 yapılan iki peptidler ' dizisi, biz başardık onaylamak P1 isoleucine' alanin serin ikamesi için azaltılmış bölünme sonuçlandı, ancak bölünme büyük ölçüde abrogates. Mor213 S2' site bir furin bölünme motif içermez ve neredeyse hiçbir bölünme algılamak için şaşırtıcı değildi. Biz de nasıl furin/S2 S1 ve S2 cleaves muayene ' proteaz tanıma siteleri FCoV S protein. Biz her iki FECV peptidler furin bölünme gözlemlemek mümkün (FECV ı-4 ve S1/S2 ve FECV II 1683 S2'), mutasyona uğramış dizileri FIPV virüslerden değil-i ciddi furin tarafından iken.

EMC/2012 S2, furin aracılı bölünme karşılaştırırken ' peptid (Şekil 1A) FECV ı-4 ve S1/2 peptidler (Şekil 2A) ile Vmax yaklaşık bir 26-fold fark olduğunu bulduk. Bu her iki dizileri (Tablo 1) furin bölünme motifi tarafından açıklanabilir. Furin bölünme için en düşük gereksinimi RXXR motifi olsa da, daha uygun2RXRR dizisidir. Bu nedenle, EMC/2012 S2' RSAR desene sahiptir, peptid, RSRR furin bölünme sitesi (Tablo 1) içeren FECV ı-4 ve S1/2 peptid kıyasla daha az özgüllük ile i ciddi.

Ancak, bir büyük tahlil peptidler onlar genellikle katıştırılır proteinin üçüncül yapı yansıtmıyor kısıtlamasıdır. Bölünme tam uzunlukta füzyon proteinin füzyon peptid ortaya çıkaran ve Tetikleyiciler hücre giriş1ev sahibi. Biz peptidler daha fazla veya daha az doğrusal kabul ederken proteaz ve füzyon protein arasındaki etkileşimi de füzyon proteinin üçüncül yapı tarafından etkilenme ihtimali. Bu nedenle, peptid assay olarak algılanan bölünme yapay olabilir ve in vivo durumu yansıtmıyor olabilir. Bu grip H3N2 HA alt bölünme için matriptase tarafından bildirildi. Çeşitli gruplar tarafından matriptase peptid deneyleri içinde bölünme, H3N2 HA tarif ederken, aynı zamanda kuluçka tam uzunlukta H3N2 HA protein ve matriptase hücre kültüründe bir fusogenic HA protein4,20sonuçlanmamıştır gösterildi, 21. Biyolojik açıdan önemli düzenleme proteolitik bölünme, protein uyum düzeyini gösteriyor ki diğer örnekleri vardır. Füzyon protein bazen bölünme siteleri fusion üzerine ortaya çıkarmak için önceden füzyon olayların bir dizi gerekir tarif edilmiştir. Semliki orman virüs füzyon protein, örneğin, birçok onun füzyon protein ortaya çıkarmak ve proteolitik harekete geçirmek22kullanılabilmesi için prefusion olay sırasında yapısal düzenlemeler gerektirir. Bu nedenle, bir fluorogenic peptid tahlil elde edilen sonuçlar hücre füzyon deneyleri veya benzer deneyler tarafından doğrulanması gerekir. Ancak, peptid tahlil hala birkaç proteaz/peptid kombinasyonları ve bölünme gösterme kombinasyonları aynı sonuç vivo içindesergilemek çok olasılığı olduğundan emek ve zaman deneyleri takip azaltmak için hızlı bir tarama sağlar.

Testin ikinci büyük sınırlama proteaz ilgilendiriyor. Defa bu sadece çözünür proteaz ama değil transmembran proteaz test etmek mümkündür. Denemenin amacı bağlı olarak, bu bir sorun olabilir. Örneğin, grip HAs transmembran proteaz hücre zarlarında8' de yer alan bir dizi tarafından etkinleştirilir. Belli bir ölçüde bu sorunu çözünür proteolitik active etki alanları kullanarak atlatılabilmişlerdir, ama sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır ve geleneksel yöntemleri ile doğrulanması. Matriptase ve onun aktivite doğru H3N2 HA beforementioned örnek başvurmak istediğiniz. Vivo matriptase hücre zarı bulunur ama piyasada bulunan enzim için çözünür katalitik adıdır. Füzyon protein ile ilgili olarak açıklandığı gibi o da bölünme ve sadece tek etki alanları test yanlış pozitif neden olabilir elde etmek için tam uzunlukta protein substrat etkileşimli olarak tam uzunlukta proteaz istemek mümkün olabilir.

Bu metodoloji furin tarafından belirli amino asit dizileri bölünme çalışmaya verimli olmasını göstermiştir. Ancak, teknik kapsamlarını uygulamaları (Örneğin, cathepsins, proprotein konvertaz), kullanılabilir herhangi bir proteaz için daha yararlı bir yöntem ekran peptid proteaz bölünme adayları için yapım. Ayrıca, bu tahlil proteaz inhibitörleri etkinliğini test etmek için de kullanılabilir ve bu nedenle, hızlı ve kolay aracı için ekran protein inhibitörleri23sağlar gösterilmiştir.

Burada açıklanan fluorogenic peptid bölünme tahlil hangi amino asit özellikleri ve sıra dayalı kararlı bir proteaz tarafından peptid bölünme öngörür algoritmaları, Puanlama bioinformatic bölünme bir ek temsil eder. Gelenek teknikleri kurutma Batı ile birlikte bu iki teknik proteaz bölünme içinde vitroçalışma için verimli bir yöntem kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

Bu el yazması sunulan MERS proje NIH tarafından sağlanan için araştırma fonu R21 AI111085 verin. Kedi coronavirus çalışma araştırma hibe Morris hayvan Foundation, Winn kedi Vakfı ve Cornell Feline Sağlık Merkezi tarafından desteklenmiştir. Biz de Malik Peiris Mor213 sıra ile kamuya önce bize verdiğiniz için teşekkür ederiz istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptides Biomatik N/A
Furin NEB P8077S
Trypsin, TPCK-treated Sigma-Aldrich 4352157-1KT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Triton-X100 Sigma-Aldrich X100
PBS Corning 21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices XPS
SoftMax Pro 6.5.1  Molecular Devices N/A
96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) Costar 3915
Light damping tubes Watson Lab 131-915BL or 131-915BR
Microsoft Excel Microsoft N/A
Prism 7 GraphPad N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Virology. 479-480, 498-507 (2015).
  2. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. (2014).
  3. Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4, (7), 1144-1168 (2012).
  4. Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12, (3), e0174827 (2017).
  5. Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (2), 324-328 (1988).
  6. Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90, (1), 400-411 (2016).
  7. Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258, (1), 1-20 (1999).
  8. Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69, (2), 87-100 (2013).
  9. Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68, (9), 6074-6078 (1994).
  10. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (14), 5871-5876 (2009).
  11. Polgar, L. General Aspects of Proteases. Mechanisms of Protease Action. 43-76 (1989).
  12. Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3, (1), 1-8 (2018).
  13. Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19, (7), 1066-1073 (2013).
  14. Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R. Viral Mutation Rates. Journal of Virology. 84, (19), 9733-9748 (2010).
  15. Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3, (1), 172-185 (2015).
  16. Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1-6 (2018).
  17. Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58, (6), 1080-1083 (1986).
  18. Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5, (12), e126-e129 (2016).
  19. Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
  20. Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86, (19), 10579-10586 (2012).
  21. Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30, (878), 4237-4251 (2013).
  22. Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278, (9), 7189-7198 (2003).
  23. Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450, (2), 1070-1075 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics