Intra-Omental Islet Transplantatie met behulp van h-Omental Matrix Islet vulling (hOMING)

Bioengineering
 

Summary

Hier presenteren we een protocol voor in vivo validatie van hydrogel gebaseerde celtherapie, geïllustreerd door het voorbeeld van islet transplantatie. h-Omental Matrix Islet vullen (hOMING) implantatie kunt implantatie van een cel-hydrogel mengsel tussen de omental lagen, in de buurt van bloedvaten, engraftment in een juiste metabole omgeving te maximaliseren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schaschkow, A., Mura, C., Pinget, M., Bouzakri, K., Maillard, E. Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING). J. Vis. Exp. (145), e58898, doi:10.3791/58898 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Regeneratieve geneeskunde op basis van celtherapie vertegenwoordigt een nieuwe hoop voor het genezen van de ziekte. Huidige hinderpalen betrekking hebben op juiste in vivo validatie van de efficiëntie van de therapie. Voor overdracht aan de ontvangende instantie moeten cellen vaak worden gecombineerd met biomaterialen, vooral hydrogels. Validatie van de werkzaamheid van een dergelijke prothese vereist echter de juiste omgeving, de juiste hydrogel, en de juiste geadresseerde website. De majus misschien wel zo'n site. Op basis van het voorbeeld van islet transplantatie, ontwikkeld we de hOMING (h-Omental Matrix Islet vulling)-techniek, die uit de injectie van de prothese binnen het weefsel, tussen de omental lagen bestaat, islet implantatie en overleving te verbeteren. Om dit te bereiken, moeten de eilandjes worden ingebed in een hydrogel met een viscositeit waarmee de injectie met behulp van een atraumatische naald. Spuiten worden geladen met een combinatie van hydrogel en eilandjes. Meerdere injecties worden uitgevoerd binnen het omental weefsel op verschillende toegangspunten, en de afzetting van het eilandje/hydrogel mengsel gebeurt langs een lijn. We testten de haalbaarheid van deze innovatieve aanpak met dextran kralen. De kralen zijn goed verspreid over de omental weefsel, in nabijheid van bloedvaten. Om te testen van de werkzaamheid van de prothese, wij getransplanteerde eilandjes in diabetische ratten en het uitvoeren van een metabole follow-up meer dan twee maanden. De getransplanteerde eilandjes tentoongesteld van een hoge mate van re vascularisatie rond en binnen de eilandjes en omgekeerd diabetes. De hOMING techniek kan worden toegepast voor andere soorten hydrogel of cel therapie, voor cellen met hoge metabole activiteit.

Introduction

Celtherapie is een hot topic, aangezien het is gericht op het genezen van ziekten op basis van de regeneratieve geneeskunde. Biologische materiaal-bijgewoonde celtherapieën zijn steeds bestudeerd in de afgelopen jaren, vooral omdat cel implantatie vaak een drager voor de overdracht van de cellen van de cultuur-schotel naar de ontvanger vereist. Biomaterial steigers zijn potentieel waardevolle cel dragers die voldoen aan meerdere rollen1. Een bevoegde drager moet beschermen cellen tegen mechanische belasting en bieden gunstige groei-omstandigheden, zoals essentiële groeifactoren, metabolische afvalstoffen uitscheiding, uitwisseling van voedende stoffen en zuurstof2.

Onder de verschillende soorten biomaterialen gebruikt in celtherapie, hebben hydrogels veel voordelen. Ze zijn gemakkelijk te hanteren, en vergemakkelijken van de diffusie zuurstof3, biocompatibel, biologisch afbreekbaar. Huidige technologie kunnen bovendien het gebruik van hydrogels te helpen cellen overleven en engraft met, bijvoorbeeld, suppletie met groeifactoren of de extra-cellulaire matrix eiwitten4.

Hydrogel vervoerders met stamcellen kunnen worden geïnjecteerd als behandelingen, bijvoorbeeld bot regeneratie5 en zenuwstelsel ziekte6. De inplanting van metabolisch actieve cellen nodig is. Terwijl in vitro validatie van de aanpak mogelijk is, instrumenten en technieken voor in vivo validatie moeten nog worden verfijnd.

Cel en hydrogel transplantatie kan gemakkelijk worden uitgevoerd door subcutane injectie wanneer biocompatibiliteit testen worden uitgevoerd. Dit subcutane lokalisatie is echter niet optimaal, hoofdzakelijk op het gebied van de veneuze drainage7als geënte cellen zijn bedoeld voor het regelen van systemische factoren door hun metabole actie. Daarom zijn er geen huidige tools om snel, veilig en efficiënt de gunstige effecten van een hydrogel. Op basis van het voorbeeld van islet transplantatie, die vereist dat hormonen worden vrijgelaten in de bloedbaan van de prothese in reactie op de niveaus van de glucose van het bloed, ontwikkeld wij een nieuwe methode voor cel/hydrogel implantatie in vivo.

De eerste stap was om te identificeren een acceptor transplantatie site, die een hydrogel met cellen kan aanvaarden. De majus biedt een grote ruimte voor implantatie, is zeer plastic en zijn dichte vascularisatie in combinatie met het intraperitoneaal instelling is interessant voor de studie van cellen met hoge metabole activiteit8. Vervolgens moesten we stellen een chirurgische techniek waardoor de overdracht van de cellen en de hydrogel in de majus. Geïnspireerd door de lipofilling gebruikt in plastische chirurgie9, ontwikkelden we de h-Omental Matrix Islet vullen (hOMING) aanpak. Eilandjes ingebed in hydrogel worden geïnjecteerd in de omental weefsel. De techniek ook gericht op het bieden van maximale engraftment door gebruik te maken van meerdere afzettingen van de cel en hydrogel mengsel in de omental weefsel, waar het grote aantal bloedvaten ook graft oxygenatie verbetert.

In de huidige studie beschrijven we een eenvoudige en innovatieve techniek voor islet implantatie tussen omental bladen, binnen het dichtst bij de bloedvaten vetweefsel. Dit bestaat uit micro-invasieve ingreep, die kan worden voltooid onder laparoscopie, met de injectie van eilandjes die zijn vervat in een hydrogel naar het vetweefsel. Deze techniek is gemakkelijk van toepassing op alle hydrogel en cel combinaties die worden getest moeten een in een metabolisch functionele omgeving.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health, met nummer van de vergunning: AL/60/67/02/13.

1. de ontvangende voorbereiding

  1. Chemisch induceren diabetes in ontvangende ratten.
    1. Injecteren van 75 mg/kg streptozotocin (STZ, in steriele 0,1 M citraat buffer, pH 4) intraperitoneally tot en met10van de ratten.
      Opmerking: Voor de transplantatie studies, werden er 6 weken oude Lewis stam ratten, met een gewicht van 150-190 g gebruikt.
    2. Controleer de status van de diabetes door dagelijkse bloed glucose metingen gedurende de eerste vier dagen. Injecteren van langwerkende insuline 6 U/dag subcutaan als ratten glycemia over 2 g/L vertonen te voorkomen diabetes complicaties en gewichtsverlies, tot insuline pellet implantatie.
    3. Ratten in de cohort opnemen wanneer twee maatregelen van staart veneuze bloedglucose > 4-5 g/L voor 2 opeenvolgende dagen, en C-peptide is < 200 pM. Meten van glycemia met behulp van een glucometer en C-peptidemia door een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
    4. Implantaat insuline pellets onder de huid (zie 1.2).
      Opmerking: Chronische insuline therapie kunt betere glycemia regelgeving en vermijdt diabetische complicaties (die verergeren oxidatieve stress op de site van transplantatie)11. Bovendien bespaart de therapie de diabetische staat samen met een normale groeicurve (zonder gebruikelijke gewichtsverlies waargenomen in een diabetische dier). Dit kan resulteren in een grotere omental vet pad, die ideaal is voor het uitvoeren van de transplantatie.
  2. Implantatie van insuline pellets
    1. Anesthetize van de rat met behulp van gas-anesthesie (3% Isofluraan in 500 mL/min O2) en plaats de rat in de vatbaar positie.
    2. Controleer de status van de verdoving door te controleren op de afwezigheid van reflex (poot knijpen). Reinig de nek met behulp van Povidon jodium, en scheren van het gebied met behulp van een scheermesje. Povidon jodium opnieuw toepassen en laat het staan voor 3 min.
    3. Plaats 1.5 insuline pellets (3 Units (U) / 200 g rat) in een 1:5 verdunde Povidon jodiumoplossing voor het steriliseren van de pellets. Doorboren de huid van de nek met behulp van een 16 G trocar en plaats de pellet met behulp van de ingerichte gids en pistolen. Ophalen van de gids en stilet en steek van één aanspreekpunt. Gebruik Povidon jodium te reinigen van de steek.
      Opmerking: Geen post chirurgische pijnbeheersing was noodzakelijk omdat de interventie vergelijkbaar met een enkele onderhuidse (SC) injectie was.
    4. Laat de rat herstellen van anesthesie en ervoor te zorgen dat ratten toegang tot voedsel hebben te voorkomen van hypoglykemie.
    5. De efficiëntie van pellet meten door het meten van de daling van de glycaemie na implantatie.
    6. Controleer de pellet-efficiëntie door monitoring van glycemia niveau elke week gedurende 1 maand.
    7. Opnemen van ratten in de cohort wanneer een maatregel van staart veneuze bloed C peptide niveau wordt gehandhaafd onder 200 pM 1 maand na insuline pellet implantatie.
      Opmerking: C-peptide niveaus controle is verplicht om te evalueren van de dieren op basislijn voor transplantatie en om te bevestigen hun diabetische staat. Lage C-peptide regeneratie altijd optreedt tijdens de follow-up. De laagste C-peptidemia is kenmerkend voor de laagste regeneratie.

2. hOMING: Intra-omental Matrix Islet vullen

  1. Eilandje-matrix mengsel voorbereiding.
    1. Bereiden de viskeuze islet drager in een laminaire flow-kap. Los alginaat poeder in steriele PBS met een concentratie van 1,5%. Het steriliseren van de voorbereiding door passage door een 0,22 µm filter. Bereiden 400 µL per ontvanger.
      Opmerking: Elke vorm van hydrogel met een viscositeit geschikt voor injectie via een naald 21 G kan worden gebruikt.
    2. Isoleren islet van gezonde Lewis ratten (200-250 g) als eerder beschreven12.
    3. Tellen aantal van de eilandje in islet equivalenten (IEQ) (een IEQ is aangemerkt als gelijkwaardig aan een alvleesklier eilandje met een diameter van 150 µm)13.
    4. Bereiden in een laminaire flow-kap, aliquots 7660-islet equivalent (IEQ) in een 1,5 mL-buis.
    5. Wassen eilandjes aliquots met 500 µL van CMRL (Connaught medische onderzoekslaboratoria) medium gratis foetale runderserum.
    6. Pellet eilandjes door middel van centrifugeren (2 min bij 500 x g - en 4 ° C). Verwijder het supernatant.
    7. Voeg 150 µL van alginaat hydrogel vervoerder over de eilandjes, meng zorgvuldig door pipetteren op en neer en plaats van de mix op ijs.
    8. Bereiden een atraumatische 21 G naald en een spuit van 1 mL zonder dood volume door het laden van 150 µL van lege alginaat in de spuit.
    9. Vul de injectiespuit met het mengsel van eilandjes en alginaat (150 µL, totaal volume 300 µL). Houd de spuit op het ijs.
  2. Chirurgische ingreep
    1. Steriliseren van chirurgische instrumenten met behulp van koude sterilisatie (2% Steranios voor 20 min).
    2. Anesthetize van de rat met behulp van Isofluraan anesthesie en plaats de rat in de vatbaar positie.
    3. Scheren het halsgebied met een scheermesje en het gebied met Povidon jodium te steriliseren. Laat de jodium staan gedurende 3 minuten.
    4. Maak een incisie met behulp van een scalpel en verwijderen van de 1.5 insuline pellets met pincet. Sluit de huid met behulp van één of twee één steek punten. Verwijder niet de rat van anesthesie.
      Opmerking: Na 1 maand kunnen de pellet brokkelige zoals sommige fibrotische weefsel laten als pellets teruglopen kunt; Gebruik schaar te ontleden correct het.
    5. Plaats de rat in de liggende positie. Scheren en steriliseren (met Povidon jodium) de peritoneale ruimte. Laat de jodium staan gedurende 3 minuten.
    6. Maak een laparotomie 1,5 cm net onder het borstbeen met behulp van een scalpel. NAT-steriel gaas plaats rond de ingesneden gedeelte.
    7. Identificeer de majus thats het vet pad gelokaliseerd naast maag. Gebruik pincet om zorgvuldig de majus vangen, trek hem voorzichtig uit de peritoneale Holte, en verspreid op het gaas.
      Opmerking: Het omental weefsel strekt zich uit van de milt aan de twaalfvingerige darm en hecht op het halverwege punt aan de maag. De normale majus van diabetische ratten ontvangen insuline therapie is ongeveer 2 cm² wanneer verspreid over het gaas.
    8. Hydrateren het omental weefsel goed met behulp van 2 mL steriele zoutoplossing voorverwarmde 37 ° C. Gebruik kleine gebogen pincet manipuleren van het weefsel te doordringen van de omental rand met de naald tussen de omental lagen. Plaats de naald volledig.
    9. Start de injectie van het eilandje preparaat langzaam en zorgvuldig verplaatsen de naald neerwaarts te injecteren de eilandjes op verschillende plaatsen (zoals lijnen). Vóór de intrekking van de naald, ervoor zorgen dat de hydrogel is gestopt met het afsluiten van de naald om te voorkomen dat het verlies van de verspreide eilandjes.
    10. Herhaal deze manipulatie desgewenst te injecteren van de gehele inhoud van de injectiespuit met behulp van verschillende toegangspunten voor het distribueren van de eilandjes in het omental weefsel.
      Opmerking: Bij ratten, zijn over het algemeen vier tot vijf injecties nodig.
    11. Controleer of eilandjes niet zijn gebundeld in de spuit op het eind van de injecties.
      Opmerking: Als sommige eilandjes nog steeds zichtbaar zijn zijn, is het mogelijk om in te trekken de naald van de spuit, vul de injectiespuit rechtstreeks met 100 µL lege hydrogel en sluit de naald. Een tweede ronde van injectie kan worden gedaan om de resterende eilandjes spoelen.
    12. Steriele zoutoplossing opnieuw gebruiken om te hydrateren het omental weefsel en de muur van de laparotomie. Pincet gebruiken ter vervanging van zorgvuldig majus in de buikholte.
    13. Injecteren 2 mL voorverwarmde steriele zoutoplossing in de buikholte te hydrateren van de rat.
    14. Sluit de muur van de spier met behulp van een continue draad hechtdraad. Steek vervolgens de cutane laag met één steek punt (punt-voor-punt).
    15. Injecteren meloxicam (1,5 mg/kg) subcutaan als pijnstiller voor 5 dagen één keer per dag.
    16. Plaats de rat in een kooi op een verwarming pad tot herstel van de verdoving. Herhaal de procedure voor alle geadresseerden ratten.
    17. Het meten van de bloedglucose na de transplantatie elke dag. Als glycemia > 2 g/L, 6 U van langwerkende insuline injecteren subcutaan eenmaal per dag.
    18. Beoordelen graft functie door glycemia en c-peptidemia toezicht gedurende 1 of 2 maanden.
      Opmerking: In geval van succesvolle transplantatie, glycemia binnen 2-5 dagen na de transplantatie moet stabiliseren en ratten in insuline kunnen afgenomen worden.

3. omental Graft explantatie

Opmerking: Deze procedure zal de bevestiging van goede graft functie toelaten. Na ophalen van een functionele graft, moeten ratten terugkeren naar een diabetische staat. Deze stap wordt uitgevoerd na 1 of 2 maanden van metabole follow-up.

  1. Anesthetize van de rat met gas-anesthesie en plaats deze in de liggende positie.
  2. Scheren van de peritoneale ruimte en met behulp van Povidon jodium gedurende 3 minuten steriliseren.
  3. Maak een laparotomie 1,5 cm net onder het borstbeen met behulp van een scalpel. Schakel NAT-steriel gaas rondom de ingesneden gebied.
  4. Identificeer de majus, dat naast de maag. Gebruik pincet zorgvuldig om het te verspreiden op het gaas.
  5. Gebruik schaar de majus accijnzen. Vanaf het deel dat op de staart van de pancreas (naast de milt voldoet). Als bloeden optreedt, gebruikt u droog steriel gaas om het te stoppen.
  6. Excisie langs het deel dat is aangesloten op de maag blijven en de majus op te halen.
    Opmerking: Op deze locatie, gastroepiploic slagaders (Figuur 1) kunnen leiden tot een grote hoeveelheid bloeden als ze per ongeluk zijn afgesneden. Slagader insnijdingen zijn onvermijdelijk voor het ophalen van de prothese, maar bloeden kan worden beheerd via pincet en gaas. Als een toevallige knippen gebeurt, stevig comprimeren met droog gaas en handhaven van de compressie voor minstens 1 min. Het bloeden moet stoppen. Als dat niet het geval is, gebruikt clips of een elektrische bistouri uitbranden van de schepen.

Figure 1
Figuur 1: verdeling van de Omental slagader. Voor majus graft explantatie, is het kritische gebied samengesteld uit gastroepiploic slagaders vertegenwoordigd in het blauw. Tijdens resectie van dit deel van het omental weefsel moet aandacht worden besteed aan de juiste gastroepiploic slagader sectie. Compressie, ligatuur of cauterisatie kan worden gebruikt om te beperken bloeden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Controleer of elke bloeden aanhoudt. Als dat niet het geval is, sluit de rat, injecteren van 2 mL voorverwarmde zoutoplossing en verwerken zoals eerder is beschreven.
     Transplanteren dieren terug naar een diabetische staat. Insuline-injectie (6 U/SC/dag) is dan verplicht om het welzijn van dieren te verzekeren.
  2. Euthanaseren de rat 10 tot 12 dagen na uitname met behulp van een overdosis van pentobarbital (182.2 mg/kg).

4. histologische analyse: Haematoxyline en eosine-kleuring

  1. Los van het opgehaalde omenta met 4% paraformaldehyde (PFA) en inbedden in paraffine.
  2. Secties 4 µm dik gesneden en haematoxyline en eosine vlek voor morfologische evaluatie van de transplantatie van toepassing.

5. statistische analyse

  1. Statistische significantie met behulp van statistische analysesoftware en herhaalde maatregelen variantieanalyse (ANOVA) met Tukey van eerlijke betekenis verschil test als een post hoc test te bepalen. Vertegenwoordigen van p -waarden als: *p < 0.05; p < 0,01; p < 0,001.

Representative Results

De hOMING methode toelaat het vermijden van intravasculaire implantatie en de opsluiting van de eilandjes in een orgaan. Een maximale periode van 8-10 min is vereist voor de gehele islet implantatie procedure, met inbegrip van anesthesie, die een tijdlijn vergelijkbaar met klassieke levertransplantatie.

Om te bestuderen hoe eilandjes zijn verdeeld binnen de omental weefsel, waren dextran kralen getransplanteerde de methode hOMING (Figuur 2). Een dag na implantatie, ratten werden opgeofferd en omental weefsels histologische p.a. werden opgehaald. De Haematoxyline en eosine-kleuring bleek een gelijkmatige verdeling van de kralen in het weefsel (Figuur 2rechtsonder). Heel vaak kralen waren dicht bij de bloedvaten en werden goed geïmplanteerde in het vetweefsel. Onmiddellijk na implantatie, treedt een ontstekingsreactie op rond de kralen, resulterend in weefsel omlegging nesten van de eilandjes in het weefsel.

Figure 2
Figuur 2: beschrijving van hOMING techniek en parel distributie via het omental weefsel één dag na implantatie. (A) afbeelding van de hOMING techniek. Na orgel blootstelling (A, links), werd de eilandje-hydrogel mix (hier vervangen door blauw gekleurde dextran kralen voor betere visualisatie) zorgvuldig geïnjecteerd in het weefsel met behulp van een atraumatische naald (A, midden). Kralen geïmplanteerd in het weefsel zijn zichtbaar (A, rechts). (B) de haematoxyline en eosine kleuring van majus transplanteren 1 dag na injectie van de kraal. Parels worden gevonden in het weefsel met een uniforme verdeling. Schaal bar = 100 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Voor het valideren van deze techniek, we isogene studies met behulp van Lewis ratten uitgevoerd (n = 8). Diabetische ratten ontvangen islet transplantatie (7660 islet equivalent, IEQ) per kg lichaamsgewicht rat met behulp van hOMING werden onderzocht voor glycemia en C-peptidemia voor twee maanden. Glycemia werd gecontroleerd door implantatie van insuline pellet (als waaruit blijkt dat de eerste daling in glycemia waargenomen in de figuur 3A). Graft functie werd benadrukt door glycemia van ongeveer 2 g/L en C-peptidemia > 500 uur. Voor transplantatie, ratten waren diabetische (glycaemie > 5 g/L en C-peptidemia < 200 pM). Na transplantatie en insuline pellet ophalen, glycemia onderhoud en normalisatie slechts 3 dagen na transplantatie hOMING werd waargenomen en bleef tot graft ophalen (p < 0,05 vergeleken met vooraf transplantatie niveaus). Na uitname van de omental, steeg de glycemia weer naar het niveau pre transplantatie, waaruit blijkt dat de functionaliteit van eilandjes die getransplanteerd werden door hOMING (figuur 3A). De C-peptidemia-patroon was precies het tegenovergestelde, met laag tot niet aantoonbaar niveaus vóór de prothese, gevolgd door een verhoging en onderhoud op dit hogere niveau in de loop van de studie (p < 0,05), en, na omental explantatie, een minder vooraf transplantatie niveaus (figuur 3B). Analyse van het transplanteren majus door histologie bleek zeer opnieuw gevacuoliseerd eilandjes, waarschijnlijk als gevolg van de nabijheid van bloedvaten (Figuur 3 c).

Figure 3
Figuur 3: twee maanden durende metabole follow-up van ratten hOMING en graft beoordeling ontvangen. (A) Glycemia meting en (B) C-peptide beoordeling na hOMING alginaat gebruiken als een eilandje drager (Tx: transplantatie en insuline pellet ophalen; Explantatie: Uitname van de majus). Transplantaties zijn functioneel, zoals blijkt uit het behoud van de normoglycemia na insuline pellet ophalen en toename van C-peptidemia na implantatie van het eilandje. Grijze gearceerde gebieden staan voor de minimale en maximale opgenomen waarden op elk tijdstip. (C) de haematoxyline en eosine kleuring van een omental afdeling na de islet transplantatie hOMING methode. Eilandjes zijn twee maanden na implantatie zonder een omringende fibrotische weefsel goed geïntegreerd in het weefsel. Schepen zijn gegroeid rond en binnen eilandjes, zoals aangegeven door de pijlen, en dus volledig terugzetten islet functie. Morfologie van de eilandjes lijkt ook goed bewaard gebleven. Schaal bars = 50 µm. (n = 8) (*p < 0.05; ** p < 0,01; *** p < 0.001 bepaald met behulp van herhaalde maatregelen variantieanalyse (ANOVA) met Tukey van eerlijke betekenis verschil test als een post hoc test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Sommige kritische stappen kunnen worden benadrukt in dit protocol. Eerst moeten de persoon uitvoeren de chirurgie en manipuleren van de weefsels de delicate met het vetweefsel, want het is kwetsbaar. Breken of beschadigen van de majus moet worden vermeden. Majus, is als een defensieve weefsel, verrijkt met macrofagen en andere leukocyten. Deze immuuncellen kunnen worden geactiveerd door buitensporige manipulatie en negatief van invloed kunnen zijn op de prothese. Ten tweede, graft (islet-hydrogel mengsel) laden is ook cruciaal. De persoon die u de procedure uitvoert dode volumes moet voorkomen en alles wat van het mengsel hydrogel-eilandje in de injectie-apparaat moet laden. Onmiddellijk na deze stap is een ander kritisch punt de injectie zelf. Injectie moet langzaam, voorzichtig en tactvol worden uitgevoerd. De spuit moet worden gespoeld door de lege hydrogel geladen in eerste instantie om op te halen van eventuele resterende eilandjes. Ten derde moet wordt dit zorgvuldig en in twee stappen. De gespierde plan eerst moet worden ingehecht verzorgen niet te suture de majus met de spier, en de huid moet afzonderlijk worden ingehecht. Met betrekking tot de explantatie procedure voor de omental prothese, moet bijzondere aandacht worden gehouden op het moment wanneer de slagaders vlakbij de maag (gastroepiploic slagaders) worden ingesneden. Het is belangrijk aandacht te besteden aan elke bloeduitstortingen die optreden en stoppen hen voordat het dier wordt als een hardnekkige bloedende leidt tot dier dood binnen enkele dagen.

Probleemoplossing kan het nodig zijn met betrekking tot het medium voor de uitvoering van de eilandjes; de keuze van hydrogel is aan de experimentator, zolang de hydrogel injecteerbare. Het gebruik van verschillende materialen kan resulteren in variabele graft functie (met of zonder suppletie, bijvoorbeeld). De hier beschreven methode is gebleken de efficiency voor inert mede transplanteren materiaal met een eilandje ratio van 7660 IEQ/kg.

De huidige methode kan worden beperkt door de grootte van de omental en de hydrogel eigenschappen. Als u wilt gebruiken een diabetische knaagdier model, is insuline therapie verplicht om voldoende praktijk gebied vóór eilandje. Diabetische knaagdieren verliezen veel gewicht en vet massa als gevolg van STZ veroorzaakte diabetes. Gezien het geringe gewicht van de dieren ingeschreven in deze studie, is enten in een nog kleinere ruimte niet mogelijk.

Behoud van de juiste glycemia beheer (voor transplantatie pellets en daarna gebruik van langwerkende insuline) is verplicht. Hier, wij hebben gekozen voor de instandhouding van de insuline-pellet tot de dag van transplantatie voor verschillende redenen. Ten eerste vermindert het behoud van een goede glycemische controle aanzienlijk oxidatieve stress veroorzaakt door diabetes in de ontvangende organen, die kunnen schadelijke voor islet graft11 en maakt voortzetting van intensieve behandeling met insuline en ontvanger voorbereiding waargenomen in de kliniek12. Ten tweede, we wilden beperken van het maximale aantal verdoving procedures voor de ratten. Met betrekking tot de uitvoering van de behandeling met insuline tijdens de metabole follow-up gebruik van langwerkende insuline, vermeden de regeling gebruikt massale complicaties als gevolg van glucotoxicity (die kan vernietigen enten) en voor de instandhouding van een "echte" glycemia waarde.

Als u wilt controleren graft-efficiëntie, is glycemia niet een relevante parameter in de eerste paar dagen als ratten ontvangt insuline therapie met behulp van pellets. Dit is de reden waarom de controle op het C-peptide niveau meerdere malen voorafgaande transplantatie is verplicht. Deze tijden opnemen aan het begin van de studie, dieren na STZ injectie, selecteren en vervolgens gewoon voorafgaand aan transplantatie, om ervoor te zorgen dat ratten diabetische blijven en dat regeneratie minimaal is.

Hydrogel eigenschappen zijn ook belangrijk. Vloeibare hydrogel zal lekken uit omental weefsel en niet zal zeer viskeuze hydrogel injecteerbare. Hydrogel viscositeit en injectiecapaciteit moet worden getest voordat u gebruikt, maar het lijkt essentieel om ook het materiaal rechtstreeks door evaluatie van eilandje of een andere cellen voortbestaan in vitro testen. Hier als eilandjes zeer gevoelig aan hypoxie en het gebruik van een zeer viskeuze vervoerder zijn kunnen invloed hebben op diffusie van zuurstof.

In termen van het belang van de hier beschreven met betrekking tot bestaande methoden methode, heeft deze intra-weefsel transplantatie-techniek voordelen in termen van reproduceerbaarheid. Het is ook atraumatische voor het weefsel en, vanwege de extra vasculaire ligging, vermijdt bloedingen en trombose risico's. Ook bij het overwegen van islet transplantatie, is onmiddellijke bloed-gemedieerde inflammatoire reactie vermeden14. Voorts staat hOMING transplanteren eilandjes in een niet-vitale orgaan, in tegenstelling tot transplantatie in de lever, die risico's op het gebied van hepatische functie15 levert.

Voor de productie van optimale prestaties, moet een hydrogel worden aangepast aan de cellen die zal dragen. Gebruik van groeifactoren of specifieke proteïnen kan hebben een positief effect op de getransplanteerde cellen16,17.

Tot slot kan deze techniek worden gebruikt voor in vivo validatie van een hydrogel op verschillende soorten cellen, met name wanneer een actieve metabole omgeving nodig is, wat eilandjes. Bovendien, kan deze chirurgische techniek geldt voor meerdere toepassingen en, in de toekomst snel overdraagbaar op de mens, zoals eenvoudig kan worden uitgevoerd met behulp van laparoscopie.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de regio Elzas, CQDM-BioArtMAtrix-Pôle Elzas Biovalley; 53/14/C1. De auteurs zijn dankbaar aan het team van Pr. Bruant-Rodier van de Hôpitaux Universitaires de Strasbourg voor het helpen ontwikkelen van dit innovatieve techniek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginate (PRONOVA UP LMV) Novamatrix 4200206 Hydrogel carrier
Atraumatic needle (Blunt) B.Braun 9180109
CMRL without FBS Gibco 11500576
C-peptide ELISA kit Mercodia 10-1172-01
Eosin Leica Microsystems 3801592E
Ethilon 4/0 Ethicon F2414 Surgical suture
Hematoxylin Leica Microsystems 3801562E
Insulin pellets Linshin INS-B14
Isofluorane Centravet ISO007
Lantus (Insulin-Glargin) Sanofi Adventis Lantus SoloStar Long acting insulin
Metacam Boehringer Ingelheim MET019 Anti-inflammatory drug
NaCl (for saline 0.9%) Sigma 10112640
Needle 26 G TERUMO 050101B
Oxygen Linde 2010152 For isoflurane use
Sodium pentobarbital Vetoquinol Dolethal For euthanasia
Steranios 2% Anios 11764046
Streptozotocin Santa-Cruz SC-200719A
Syringe – Injekt-F B.Braun 9166017V
Trocar & stylet (linshin) Linshin G12-SS For pellet insertion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bakhshandeh, B., et al. Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials. Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).
  2. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
  3. Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. Hydrogels in regenerative medicine. Adv Mater. 3307-3329 (2009).
  4. Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced healthcare materials. 2, 57-71 (2013).
  5. Bai, X., et al. Bioactive hydrogels for bone regeneration. Bioactive Materials. 3, 401-417 (2018).
  6. Allbright, K. O., et al. Delivery of adipose-derived stem cells in poloxamer hydrogel improves peripheral nerve regeneration. Muscle Nerve. (2018).
  7. Van Der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N. M., Cooper, D. K. C. The Choice of Anatomical Site for Islet Transplantation. Cell transplantation. 17, 1005-1014 (2008).
  8. Zweifach, B. W., Lipowsky, H. H. Quantitative studies of microcirculatory structure and function. III. Microvascular hemodynamics of cat mesentery and rabbit omentum. Circ Res. 41, 380-390 (1977).
  9. Bruant-Rodier, C., Dissaux, C., Baratte, A., Francois Fiquet, C., Bodin, F. The breast of the adolescent girl. Ann Chir Plast Esthet. 61, 629-639 (2016).
  10. Schaschkow, A., et al. Extra-Hepatic Islet Transplantation: Validation of the h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) Technique on a Rodent Model Using an Alginate Carrier. Cell transplantation. 27, 1289-1293 (2018).
  11. Schaschkow, A., et al. Impact of the Type of Continuous Insulin Administration on Metabolism in a Diabetic Rat Model. Journal of diabetes research. 2016, 8310516 (2016).
  12. Schaschkow, A., et al. Impact of an autologous oxygenating matrix culture system on rat islet transplantation outcome. Biomaterials. 52, 180-188 (2015).
  13. Kissler, H. J., et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an Islet Cell Resources study. Clinical transplantation. 24, 236-242 (2010).
  14. Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver microenvironment. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 30, 227-238 (2017).
  15. Leitao, C. B., et al. Liver fat accumulation after islet transplantation and graft survival. Cell transplantation. 23, 1221-1227 (2014).
  16. Narang, A. S., Mahato, R. I. Biological and biomaterial approaches for improved islet transplantation. Pharmacological reviews. 58, 194-243 (2006).
  17. Alvarado-Velez, M., Pai, S. B., Bellamkonda, R. V. Hydrogels as carriers for stem cell transplantation. IEEE Trans Biomed Eng. 61, 1474-1481 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics