Meso-escala partícula imagen Velocimetry estudios neurovasculares flujos In Vitro

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Bioengineering

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Summary

Aquí presentamos métodos simplificados para fabricación neurovascular transparentes fantasmas y caracterizar el flujo en el mismo. Destacar varios parámetros importantes y demostrar su relación con la precisión del campo.

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Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

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Abstract

Imagen de partícula velocimetry (PIV) se utiliza en una amplia variedad de campos, debido a la oportunidad que ofrece para precisamente visualizar y cuantificar los flujos a través de una amplia gama de spatiotemporal. Sin embargo, su ejecución requiere típicamente el uso de instrumentos costosos y especializados, que limita su utilidad más amplia. Por otra parte, dentro del campo de la bioingeniería, en vitro estudios de visualización de flujo son también a menudo más limitado por el alto costo de fantasmas comercialmente con tejido que recapitular estructuras anatómicas deseadas, particularmente para aquellos que abarcar el régimen de mesoescala (es decir, submilimétricas a escalas de longitud milímetro). Adjunto, presentamos un protocolo experimental simplificado desarrollado para hacer frente a estas limitaciones, los elementos clave que incluyen 1) un método de costo relativamente bajo para la fabricación de mesoescala fantasmas de tejido mediante impresión 3-d y bastidor de la silicona y 2) marco de análisis y procesamiento de imágenes de código abierto que reduce la demanda sobre la instrumentación para la medición de flujos de mesoescala (es decir, velocidades de hasta decenas de milímetros/segundo). Colectivamente, esto reduce la barrera de entrada para nonexperts, mediante el aprovechamiento de recursos ya a disposición de muchos investigadores de Bioingeniería. Demonstratethe aplicación de este protocolo en el contexto de la caracterización del flujo de neurovascular; sin embargo, se espera a ser relevantes para una amplia gama de aplicaciones de mesoescala en Bioingeniería y más allá.

Introduction

PIV es ampliamente utilizado en mecánica de fluidos experimental para visualización de flujo e Investigaciones cuantitativas de movimiento fluido que varía en la escala de longitud de atmosférico a flujo microcirculatorio1,2,3. Mientras que los específicos de su aplicación pueden variar tan ampliamente como sus aplicaciones, un aspecto común a casi todos los estudios PIV es el uso de imágenes de video de partículas trazadoras sembradas dentro del líquido de trabajo, seguido por un análisis de pares de fotogramas de la imagen consecutiva para extraer las características de flujo deseada. Por lo general, esto se logra por primer subdividiéndose cada fotograma de la imagen en regiones más pequeñas como windows interrogatorio. Como consecuencia de las posiciones al azar de las partículas dispersas, cada ventana de interrogatorio contiene una única distribución de intensidades de píxeles. Si la tasa de adquisición de datos y tamaño de ventana se elige apropiadamente, la correlación cruzada de la señal de intensidad en cada ventana se puede utilizar para estimar el desplazamiento promedio en esa región. Por último, dado que la ampliación y la velocidad de fotogramas se conocen parámetros experimentales, un campo del vector velocidad instantánea puede ser computado fácilmente.

Una ventaja importante de PIV sobre técnicas de medición de un solo punto es su capacidad para asignar campos del vector en un dominio de dos o tres dimensiones. Aplicaciones hemodinámicas, en particular, se han beneficiado de esta capacidad, ya que permite una investigación exhaustiva de corrientes locales, lo que se sabe que juega un papel importante en la enfermedad vascular o remodelación (p. ej., ateroesclerosis, angiogénesis) 4 , 5 , 6. esto ha sido cierto para la evaluación de los flujos de neurovascular, y las interacciones de éstos con los dispositivos endovasculares (p. ej., desviadores de flujo, stents, bobinas de intrasaccular), desde las escalas de la longitud relevantes en este tipo de aplicaciones pueden a menudo abarcan uno o más órdenes de magnitud (por ejemplo, del micrómetro al milímetro) y geometría del dispositivo y colocación puede afectar significativamente la mecánica de fluidos locales7.

Mayoría de los grupos realización de estudios hemodinámicos basados en la PIV ha confiado en configuraciones experimentales que mímico de cerca algunas de las primeras investigaciones de stent influencia sobre el flujo vascular7,8. Por lo general, se trata de un) pulsada láser y cámaras de alta velocidad, para captar flujos de alta velocidad; b) sincronizadores, para prevenir aliasing entre la frecuencia del pulso del láser y la velocidad de fotogramas de adquisición cámara; c) óptica cilíndrica, para formar una ficha técnica de iluminación y, así, minimizar la fluorescencia de fondo de partículas trazadoras por encima y por debajo del plano de interrogatorio; d) en el caso de sistemas comerciales llave en mano, paquetes de software propietario, para realizar los análisis de correlación cruzada. Sin embargo, mientras que algunas aplicaciones requieren el rendimiento y versatilidad que colectivamente estos componentes, muchos otros no. Además, el alto costo del tejido comercialmente con fantasmas que recapitulan estructuras vasculares deseadas también pueden resultar limitante para muchos estudios en vitro , particularmente para fantasmas con cuenta que puente el régimen de mesoescala (> 500 USD / fantasma). Adjunto, Divulgamos el desarrollo de un protocolo simplificado para la aplicación de PIV para la visualización en vitro de corrientes neurovascular, que típicamente se encuentran tanto espacial y temporalmente dentro del régimen de mesoescala (es decir, escalas de longitud que van de submilimétricas al milímetro y velocidades de hasta decenas de milímetros/segundo). El protocolo pretende aprovechar los recursos ya a disposición de muchos investigadores de bioingeniería, disminuyendo la barrera de entrada para nonexperts.

El primer elemento de este protocolo incluye el uso de una técnica de fundición de inversión para permitir la fabricación interna de transparente, polydimethylsiloxane (PDMS)-basado en fantasmas de tejido de 3-D-impreso moldes sacrificiales. Aprovechando la creciente disponibilidad de las impresoras 3D en los últimos años, particularmente aquellos en compartido y multiusuario instalaciones (p. ej., instalaciones institucionales o makerspaces pública), esta metodología reduce los costes significativamente (por ejemplo, < 100 USD/fantasma en el caso presentado aquí), al tiempo que permite un cambio rápido para la fabricación de una amplia variedad de diseños y geometrías. En el protocolo actual, una deposición fundida modelado de sistema se utiliza con acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) como el material de construcción, y la parte impresa sirve como un molde sacrificial para el posterior bastidor phantom. Nuestra experiencia ha demostrado que ABS es adecuado para tal uso ya que es soluble en los solventes comunes (por ejemplo, acetona), y tiene suficiente fuerza y rigidez para mantener la integridad del molde después de remover el material de apoyo (por ejemplo, a evitar la deformación o fractura de características diminuto molde). En el actual protocolo, integridad del moldes más se asegura mediante modelos impresos sólidos, aunque esto viene a expensas de tiempo de mayor disolución. El uso de modelos hueco también es posible en algunos casos, para mejorar el acceso de solvente y por lo tanto, reducir el tiempo de la disolución. Sin embargo, debe prestarse atención cuidadosa al efecto esto puede tener sobre la integridad del moldes. Finalmente, mientras los fantasmas fabricados en este documento se basan en representaciones idealizadas de las estructuras neurovasculares generadas usando un paquete de software de diseño asistido por ordenador (CAD) común, el protocolo se espera que sea favorable a la fabricación de más complejos , específico para cada paciente geometrías así (p. ej., mediante el uso de archivos del modelo generado por la conversión de datos de imágenes clínicas a la. STL formato de archivo utilizado por la mayoría de las impresoras 3-d). Más detalles sobre el proceso de fabricación fantasma se proporcionan en el artículo 2 del protocolo.

El segundo elemento del protocolo implica el uso de un código abierto plug-in para ImageJ para llevar a cabo el análisis de correlación cruzada9. Esto junto con la implementación de un esquema simple umbral estadístico (es decir, intensidad límite)10 para mejorar la señal de imagen antes de la correlación cruzada, así como un esquema de validación de postcorrelation vector, el normalizado prueba de la mediana (NMT), para eliminar falsas vectores a través de una comparación de cada uno de sus más cercanos vecinos11. En conjunto, esto permite obtener imágenes para lograrse usando equipos comúnmente encontrados en muchos laboratorios de bioingeniería, así eliminando la necesidad de la adquisición de muchos de los costosos componentes de los sistemas PIV típicos (p. ej., láser pulsado, sincronizador, óptica cilíndrica y software propietario). Más detalles sobre la colección de vídeos, procesamiento de imágenes y análisis de datos se proporcionan en las secciones 5 y 6 del protocolo.

La figura 1 ilustra la configuración PIV usada en este protocolo, que se basa en un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad para la proyección de imagen, así como un externo, fuente de luz blanca continua (es decir, lámpara de halogenuro metálico) para iluminación volumétrica a través del objetivo. Una bomba de engranaje de velocidad variable se utiliza para imponer el flujo de recirculación de una solución de sangre falsa transparente a través de los fantasmas del tejido neurovascular. La solución se compone de una mezcla de 60: 40 de desionizada (DI) agua y glicerol, que es un sustituto común para sangre en hemodinámica estudia12,13,14, debido a una) su densidad y viscosidad (es decir, similar 1.080 kg/m3 y 3.5 cP vs 1.050 kg/m3 y 3-5 cP sangre)15,16; b) su transparencia en la gama visible; c) su índice de refracción similar como PDMS (1.38 vs 1,42 para PDMS)17,18,19,20, que minimiza la distorsión óptica; d) la facilidad con que puede introducirse los comportamiento no newtoniano, de ser necesario, mediante la adición de xanthane21. Por último, granos del poliestireno fluorescentes se utilizan como partículas Trazadoras (10,3 μm de diámetro; 480 nm/501 nm excitación/emisión). Mientras que se desean que los granos de flotabilidad neutra, puede resultar difícil abastecimiento partículas trazadoras con óptimas propiedades mecánicas fluidos (p. ej., densidad, tamaño, composición) y longitud de onda de emisión. Por ejemplo, los granos utilizados aquí son un poco menos densos que la solución de glicerol (1.050 kg/m3 vs 1.080 kg/m3). Sin embargo, los efectos hidrodinámicos, son insignificantes, dado que la duración de un experimento típico es mucho más corta que la escala de tiempo asociada con los efectos de la flotabilidad (es decir, 5 min y 20 min, respectivamente). Más detalles sobre el sistema circulatorio configuración formulación y en vitro de sangre falsa solución se proporcionan en las secciones 3 y 4 del protocolo.

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Protocol

1. fabricación del molde de sacrificio base de ABS

  1. Diseñar un modelo inverso del fantasma de tejido deseada utilizando el software de CAD.
  2. Imprimir el modelo mediante una impresora 3-d con ABS como el material de construcción.

2. a base de PDMS Vascular fabricación fantasma

  1. Mezcla
    1. Mezcle el prepolímero base PDMS y el agente endurecedor en una proporción 10:1 (por peso); una mezcla de 66 g proporciona suficiente material para la fabricación de fantasmas con volúmenes de hasta 50 cm3.
    2. Colocar la mezcla en un desecador de vacío durante 60 min a degas y reducir al mínimo la captura de burbujas. Uso cíclico presurización/despresurización para facilitar la ruptura de la burbuja.
  2. Fundición
    1. Montar el molde impreso de ABS en un portaobjetos de vidrio usando masilla de moldear para sellar la interfaz.
    2. Vierta con cuidado la mezcla PDMS en el molde intentando minimizar el atrapamiento de burbujas. Burbujas persistentes pueden ser roto manualmente utilizando una aguja.
    3. Curar el fantasma de colado a temperatura ambiente (25 ° C) durante al menos 24 h.
      Nota: En temperaturas más altas, este proceso puede ser acelerado22.
  3. Demolding
    1. Disolver el ABS sumergiendo el fantasma en acetona y sonicando durante al menos 15 min, con potencias hasta 70 w.
      PRECAUCIÓN: La acetona tiene una alta presión de vapor a temperatura ambiente y un bajo punto de inflamación. En consecuencia, siempre trabajar bajo una campana de humos y lejos de posibles fuentes de ignición. Use equipo de protección personal adecuado (p. ej., gafas o cara escudo, capa del laboratorio, guantes resistentes a la acetona).
    2. Enjuague bien el fantasma con alcohol isopropílico y, luego, DI agua para eliminar residuos de solvente.
      Nota: PDMS se hincha con la exposición a la acetona; sin embargo, la hinchazón disminuye una vez que el fantasma se haya enjuagado y secado suficientemente23.
  4. Confirmación de la fidelidad fantasma mediante microscopía óptica
    1. Utilizando un microscopio óptico con una cámara adjunta y software de captura de imagen, captura una imagen de una función crítica en el fantasma con un aumento que maximiza la función dentro del campo de visión.
    2. Capturar una imagen de una retícula de calibración apropiado en el mismo aumento.
    3. Cargar ambas imágenes en ImageJ arrastrándolas en la barra de herramientas.
    4. Haga clic en la imagen de la retícula de calibración para que sea activa y, a continuación, seleccione la herramienta línea . Utilizando el ratón, dibuje una línea a lo largo de una función de una distancia conocida y seleccione Analyze > Set escala en el menú de ImageJ.
      Nota: En la ventana Ajustar escala , el campo etiquetado distancia en píxeles debe ser previamente cumplimentado con la longitud de la línea dibujada en unidades de píxeles.
    5. Introduzca la longitud de la característica en el campo marcado Distancia conociday su unidad en el campo etiquetado como Unidad de longitud. Marque la casilla llamada Global para aplicar este factor de calibración para todas las imágenes abiertas.
    6. Que la imagen de la función crítica fantasma activa y utilice la herramienta línea para dibujar una línea a lo largo de una característica de interés. En el menú de ImageJ, seleccione Analyze > medida (o presione Ctrl + M) para medir la longitud de la línea.
    7. Comparar el valor esperado contra el valor en la columna de marcado longitud en la ventana resultados para confirmar la fidelidad de fantasma.

3. falsa sangre solución formulación

  1. La mezcla DI agua y glicerol en una proporción de 60: 40 (por volumen).
    Nota: Un volumen de 100 mL es suficiente para en vitro circulatorio descrito.
  2. Añadir 1 mL de solución de grano de poliestireno fluorescente 2.5% w/v (es decir, las partículas trazadoras) a la solución de sangre falsa.
  3. Homogeneizar la mezcla en una placa de agitación magnética a 400 rpm por 10 minutos.

4. in Vitro confi guración del sistema circulatorio

  1. Instalación de la bomba
    1. Utilice una herramienta de stripper de alambre para cortar el tapón del extremo del DC de la fuente de alimentación adaptador AC-DC.
    2. Tira de la capa de la energía y los cables de tierra y conectarlos al terminal de entrada del regulador de voltaje de modulación (PWM) de ancho de pulso.
    3. Conecte los cables de corriente y tierra de motor de la C.C. de la bomba a la terminal de salida del PWM del regulador de voltaje.
      Nota: El display de siete segmentos de PWM salidas el ciclo de trabajo (0% - 100%) se utiliza para lograr un voltaje variable al motor DC.
  2. Calibración de la bomba
    1. Preparar 200 mL de solución de sangre falsa (ver sección 3).
    2. Coloque el tubo de la entrada de la bomba en el vaso con la solución de sangre falsa.
    3. Coloque el tubo de la salida de la bomba, un vaso de precipitación vacío.
    4. Seleccione un punto de ajuste de ciclo de servicio deseado (0% - 100%). Presione el botón de encendido e iniciar un temporizador.
    5. Detener el temporizador una vez que la bomba ha transferido todo el volumen de la solución de sangre falsa. Utilice este tiempo para calcular la tasa de flujo volumétrico.
    6. Repita los pasos 4.2.1 - 4.2.5 para por lo menos cinco diferentes deber ciclo puntos establecer una curva de regresión de mínimos cuadrados.
      Nota: Se recomienda un mínimo de tres puntos repetidos por deber ciclo set-point. Esta relación puede utilizarse para correlacionar la velocidad de flujo deseada para el ciclo de trabajo PWM requiere.

5. video colección

  1. Calibración de imagen
    1. Determinar la relación de calibración para la proyección de imagen de vídeo (véase sección 2).
  2. Instalación de aparatos
    1. Coloque el fantasma PDMS en la etapa del microscopio de fluorescencia.
    2. Conectarse el fantasma de la bomba de engranaje e introducir la solución de sangre falsa.
      Nota: Opcionalmente, prellenado el modelo con etanol para facilitar la completa adherencia de soldadura; Luego, lavar y llenar con la solución de sangre falsa. Esto puede ser especialmente beneficioso para los modelos con pequeñas embarcaciones o características ocultas.
    3. Ajuste el regulador del motor de la bomba para el caudal deseado, basado en la curva de calibración de la bomba.
    4. Funcionar la bomba durante 1-5 min antes del experimento para garantizar unas condiciones de estado estacionario.
    5. Encender la lámpara exterior para iluminar el campo de visión. Seleccione un filtro apropiado basado en la longitud de onda de excitación de los granos fluorescentes.
    6. Ajustar el plano focal imagen de la placa del recipiente.
      Nota: Esto puede lograrse usando una distancia focal que maximiza la sección reflejada del buque (por ejemplo, cuando utilice fantasmas con recipiente circular cortes transversales); o indexación de una fantasma característica diseñada para facilitar la identificación del plano medio vaso.
  3. Grabación de vídeo
    1. Seleccione los parámetros de grabación de vídeo para optimizar la relación señal a ruido (SNR). Parámetros clave incluyen el tiempo de exposición, velocidad de fotogramas y ganan.
      Nota: En este protocolo, utilizamos una velocidad de 2.000 fps y una ganancia de 1.0. Sin embargo, estos parámetros pueden variar según la aplicación (consulte la sección de discusión para más detalles).
    2. Recoger el vídeo y guardarlo en formato AVI.
  4. Limpiar el fantasma
    1. Si se observa el grano-que se pega después de un experimento, someter a ultrasonidos el fantasma en una solución acuosa de detergente usando poderes hasta 70 w.

6. tratamiento y análisis de datos de imágenes

  1. Procesamiento previo de imágenes
    1. Arrastre el archivo AVI hasta la ventana de ImageJ para importarlo. Seleccione la casilla marcada convertir a escala de grises.
    2. En el menú de ImageJ , seleccione analizar > histograma generar (o presione Ctrl + H) para generar un histograma de intensidades de píxeles de imagen. Tome nota de la media y la desviación estándar de la imagen sin procesar.
      Nota: En las tasas de marco alto, no es inusual para la distribución a ser sesgado fuertemente hacia cero (es decir, no hay señal).
    3. En el menú de ImageJ , seleccione imagen > ajustar > brillo y contraste (o presione Mayús + Ctrl + H) para aplicar un filtro de brillo/contraste.
    4. En el menú de brillo y contraste , pulse el botón Set para definir los límites de la imagen. Establezca el valor mínimo que el valor medio más una desviación estándar y el valor máximo que la intensidad máxima de la imagen (ambos basados en estadísticas obtenidas en el paso 6.1.2).
      Nota: Normalmente esto elimina todo menos el 10% de las intensidades de los píxeles. El número de desviaciones estándar puede variar dependiendo de la distribución deseada de las intensidades de los píxeles. Una secuencia de comandos de macro personalizado para llevar a cabo la intensidad límite de operación se proporciona en los Materiales complementarios.
    5. En el menú de ImageJ , seleccione proceso > ruido > refinar para reducir el número de pixeles saturados.
      Nota: Esta operación es requerida por el mayor potencial para la saturación de píxeles que se presenta durante la optimización del brillo y contraste, que puede producir vectores espúreos durante subsecuente correlación cruzada.
    6. En el menú de ImageJ , seleccione proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano con un radio de 1.5 para reducir artefactos derivados de la extracción ocasional de píxeles iluminados en una vecindad de 3 x 3 por la previa operación de eliminación de manchas.
    7. Haga clic en la herramienta polígono y, a continuación, pulse en la imagen para describir la región de interés (ROI).
    8. En el menú de ImageJ , seleccione Editar > claro fuera quitar ruido del sensor en lugares donde no hay señal esperado (p. ej., áreas más allá del límite de la pared de vasos), que pueden reducir el SNR total.
  2. Cálculo de PIV
    Nota: Esta parte del protocolo emplea a un PIV de terceros plug-in para el ImageJ, que se basa en el ajuste de pico gaussiano para permitir una estimación del desplazamiento con una precisión de subpíxeles.
    1. En el menú de ImageJ , seleccione Plugins > Macros > ejecutar... y vaya a la macro guardada código suplementario 2 ijjm a cross-correlación pares de imágenes sucesivas.
      Nota: La macro procede como sigue. 1) una correlación cruzada del campo de intensidad en imágenes consecutivas en primer lugar se realiza para determinar el desplazamiento local de partículas trazadoras advectado(es decir, la primera imagen par consiste en las imágenes primeras y segunda, el segundo par de imagen consiste en la segunda y terceros imágenes, etc.). 2) dos etapas muchas pasadas se realiza una evaluación luego con tamaños de ventana de interrogación inicial y final de 256 x 256 pixeles y 128 x 128 píxeles, respectivamente. Por último, 3) la macro realiza una media temporal para reducir la aparición de vectores espúreos.
  3. Prueba media normalizada (NMT)
    1. En el menú de ImageJ , seleccione Plugins > Macros > ejecutar... y vaya a la macro guardada código suplementario 3 ijjm para validar los campos de velocidad mediante la prueba mediana normalizada.
      Nota: La macro procede como sigue. 1) cada vector en un campo del vector instantáneo es comparado primero con sus ocho vecinos más cercanos para calcular el valor medio. 2) la matriz de errores residuales se calcula entonces como la diferencia entre cada vector vecina y la mediana calculada. 3) la diferencia entre el vector bajo investigación y el valor mediano de vector vecinos luego se normaliza por la mediana de los residuos. 4) esto se compara con un valor de umbral (típicamente, 0,2 píxeles), que puede variar en base a priori conocimiento de ruido durante la adquisición de la imagen. Por último, 5) un promedio temporal de todos los campos de vectores instantáneos validado se realiza para producir un campo compuesto, como esto se ha demostrado para aumentar el vector campo calidad24.

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Representative Results

La figura 2 ilustra el proceso de fabricación fantasma de tejido PDMS. Los fantasmas de la diseñada en este documento están diseñados para el estudio del flujo en idealizado aneurysms ancho-necked, saculares, intracraneales, así como arterias perforantes ramas proximales. Diseño adicional importante incluye 1) un depósito común que vierten todos los buques, para asegurarse de salida flúida del fantasma - no, formación de gota puede ocurrir en las salidas de buques más pequeños; 2) una trampa de la burbuja, para facilitar la extracción de burbuja; 3) una pared exterior de la cavidad, para garantizar el paralelismo de la embarcación con el plano horizontal, así como una definición precisa de la altura de la losa final de fantasma, longitud y anchura; 4) el uso de una caña de aguja hipodérmica 21 G (820 μm en diámetro externo nominal) para el moldeado de la arteria perforante, debido a la incapacidad de la impresora para definir características tales con suficiente fidelidad. Fiel reproducción de todas las características de diseño se observa todo.

Resultados representativos de una caracterización basada en un PIV flujo realizada utilizando el protocolo actual se presentan en la figura 3 y figura 4. Estos estudios se realizaron mediante caudales de entrada fantasma de 100 mL/min, velocidades de adquisición de datos de 2.000 fps, y un promedio temporal sobre palmos de 0.05 s. figura 3 muestra marcos de imagen representativa dentro de la arteria perforante, antes y después limitación de intensidad, así como parcelas de superficie correspondientes de los valores de la intensidad de píxel de 8 bits. Ambos demuestran que intensidad capsular aumenta significativamente la definición de pico por encima del piso de ruido (es decir, aumentos de la SNR), que es fundamental para garantizar la exactitud al realizar la correlación cruzada posterior. La figura 4 muestra los efectos de la intensidad límite y las operaciones de NMT en el campo del vector velocidad. Notable mejora en la uniformidad de campo se observa, así seguir subrayando la importancia de maximizar la SNR para minimizar la salida de datos.

Figure 1
Figura 1 : Configuración de velocimetría de imagen de partícula. Confianza en un análisis de imágenes de código abierto y un marco de pre/postproceso reduce la demanda sobre la instrumentación para la medición de flujos de mesoescala, eliminando así la necesidad de muchos de los costosos componentes típicos sistemas PIV (por ejemplo, pulsada de láser, sincronizador, óptica cilíndrica o software privativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Proceso de fabricación fantasma basada en PDMS tejido. Las imágenes muestran (a) un modelo CAD neurovascular fantasma del molde de, (b) el ABS impreso del molde después de remover el material de apoyo, (c) el bastidor y curado de PDMS dentro del molde ABS, (d) disolución parcial de los ABS moldes de material y (e) el PDMS terminado fantasma, con el recuadro que muestra las dimensiones finales de las características críticas, así como la región de interés (ROI) en la arteria perforante donde se realizaron las medidas de PIV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Efecto de la intensidad límite de operación en la imagen SNR. Estos paneles muestran marcos de imagen representativa y el píxel correspondiente parcelas superficie intensidad dentro del perforador de la arteria, (a y b) antes y (c y d) después de aplicar la intensidad límite de operación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Efectos de la intensidad límite y las operaciones de NMT en velocidad vector campos. Estos paneles muestran el campo del vector velocidad instantánea representativa dentro de la arteria perforante derivado de (un) sin procesar datos de imagen, (b) los datos de intensidad en su cumbre y (c) datos de intensidad tope + postproceso de NMT . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Efecto del tamaño de ventana de interrogación sobre la calidad de la correlación. Tamaño de ventana óptimo se produce cuando se maximiza el valor del coeficiente de correlación normalizado a cero y la desviación estándar se reduce al mínimo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo descrito aquí describe un método simplificado para realizar estudios PIV para visualizar neurovascular fluye en dimensiones relevantes fisiológicamente y flujo condiciones in vitro. De esta manera, sirve para complementar los protocolos registrados por otros que también se han centrado en la simplificación de la cuantificación de campos del vector, pero dentro de contextos muy diferentes que requieren que la consideración de la mucho mayor longitud de escalas de25 o menor flujo tasas de26,27 (p. ej., flujos atmosféricos o microcirculación) y así, con una dependencia de esquemas que son incompatibles con la aplicación actual.

Las consideraciones más importantes para la exitosa implementación de PIV se encuentran en la minimización de los artefactos de campo de flujo y la maximización de la calidad de imagen. Varios pasos en el proceso de fabricación fantasma de tejido son críticos para ambos de estos criterios. Por ejemplo, desgasificación completa es fundamental ya que el aire ocluido en el PDMS durante la mezcla puede conducir a la formación de burbujas en el fantasma final, que puede afectar negativamente la fidelidad característica y claridad óptica. Además, se desea minimización de rugosidad de la superficie del molde ABS, ya que el proceso de fundición de PDMS reproduce fielmente incluso las más diminutas imperfecciones (por ejemplo, líneas de construcción, poros superficiales, rasguños), lo que resulta en la rugosidad de la superficie en el fantasma final que puede disminuir la claridad óptica y aumentar el potencial para la acumulación de grano. Mientras que el protocolo descrito en este documento ha demostrado ser suficiente para la aplicación actual, hay numerosos reportes en la literatura de los medios de reducir tal aspereza, debe haber alguna necesidad (por ejemplo, el vapor de acetona alisar el28 o el optimización de la capa de espesor y parte la orientación con respecto a la dirección del edificio)29.

La selección de parámetro para la captura de vídeo también es crítica para asegurar un campo del vector de alta fidelidad. Un SNR óptimo se logra normalmente en el marco alcanzable más alta que todavía permita suficiente exposición del grano (la velocidad de fotogramas máxima está limitada por el tiempo de exposición mínimo). Ganancia puede utilizarse para amplificar la señal, pero esto también aumenta el ruido del sensor. Si la velocidad máxima puede estimarse desde otros parámetros de flujo (p. ej., tasa de flujo volumétrico de entrada), entonces un límite inferior en la velocidad de fotogramas requiere puede estimarse mediante la siguiente relación30.

Equation 1(1)

Aquí, fmuestreo es la frecuencia de adquisición de cámara (Hz), vmax es la máxima velocidad prevista (mm/s), ccalibración es la calibración constante (píxeles/mm) y hventana de interrogación es el tamaño de la ventana de interrogatorio (píxeles). Sin embargo, más valores óptimos pueden ser determinados mediante las técnicas de estimación de la calidad de llamada correlación, tales como el coeficiente de correlación cero normalizada11. En esta técnica, los promedios de las señales complementarias de cada par de marco se restan primero y, luego, normalizados por la desviación estándar de sus intensidades11. Si existe un desplazamiento de la señal original, que coincida con todos los picos y valles, el valor diferido de esta señal será igual a uno. Por el contrario, si no hay ningún desplazamiento que puede alinear estas señales, el valor será cero. Esta información se incluye en la salida de ImageJ PIV para cada vector, y puede representarse gráficamente como campo propio para verificar si hay efectos espaciales que contribuyen a la pobre correlación (p. ej., iluminación desigual). El coeficiente de correlación también puede ser promediado sobre un campo como una estimación general de su calidad. Finalmente, esta cantidad también puede ser trazada contra diversos tipos de marco o tamaños de ventana de interrogatorio para determinar una óptima. Figura 5 muestra los resultados de ese análisis utilizando un campo de partículas sintetizadas de Monte Carlo con desplazamientos constantes con nuestros flujos medidos experimentalmente (una técnica típica para la caracterización de correlación calidad11 ). Los resultados muestran que el interrogatorio ventana tamaño y velocidad de fotogramas debe elegirse de tal forma que un campo de partículas es desplazado por ≤ 20% del tamaño de la ventana de interrogación por par de marco para maximizar el coeficiente de correlación, reduciendo su variabilidad.

Aunque el protocolo descrito en este documento ha demostrado suficiente para satisfacer las necesidades de la aplicación actual, es importante reconocer sus limitaciones. Por ejemplo, mientras que el contraste mejora a través de intensidad límite ofrece facilidad de aplicación, transformaciones de toda la distribución de intensidades de píxeles pueden mejorar la SNR más31. De manera similar, aunque basado en la correlación de seguimiento está bien establecido y ofrece suficiente resolución para estimar confiablemente las características del flujo de primer orden correspondientes a hemodinámica (p. ej., velocidad intra aneurismático), otras técnicas pueden ofrecen una mayor resolución espacial (por ejemplo, híbridos PIV/PTV, coincidencia de mínimos cuadrados)32,33 y, por tanto, una mayor precisión al considerar las características que son más sensibles a la resolución del campo de velocidad (p. ej. , tensión de esquileo de la pared, en el plano de Vorticidad). Además, mientras que el NMT proporciona un medio para mejorar el campo de vector de velocidad después de la correlación cruzada, es importante destacar que ésta es sólo una de muchas técnicas de validación de vector que pueden ser usado24,34, cada uno con sus ventajas únicas y desventajas que pueden hacer su uso más adecuado para aplicaciones más allá de las descritas aquí. Por último, mientras que el montaje experimental que se describe aquí intenta imitar fisiológicamente relevantes de caudal y longitud de escalas para la neurovasculatura, no actualmente permite el análisis de flujo pulsátil. Esto no ha sido una limitación para la aplicación actual, ya que los números de la gama de Womersley en gran parte de la vasculatura neurológica tienden a ser ≤ 1 (es decir, hay un mínimo efecto aditivo de múltiples ciclos cardiacos)35, que sugiere que condiciones de estado estacionario son suficientes para recapitular momentos discretos a lo largo de la onda cardiaca en la que el caudal es comparable. Sin embargo, para aplicaciones donde el número de Womersley es más grande (e.g., vasculatura más cercano al corazón), visualizamos un potencial para la introducción de pulsatilidad a través de un Arduino, que se podrían utilizar para enviar la bomba un voltaje PWM varían con el tiempo forma de onda que permite la mímica de un perfil de flujo cardiaco36,37,38.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que declarar.

Acknowledgements

Los autores reconocen el apoyo parcial para este proyecto proveído por una beca semilla de colaboración de la oficina de investigación y desarrollo económico en UC Riverside.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

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References

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