Meso-escala Particle Image Velocimetry estudos de Neurovascular flui em Vitro

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Bioengineering

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Summary

Aqui nós apresentamos métodos simplificados para fabricar fantasmas neurovascular transparente e caracterizando o fluxo nele. Destaca-se vários parâmetros importantes e demonstrar sua relação com a precisão do campo.

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Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

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Abstract

Velocimetria por imagem (PIV) é usada em uma ampla variedade de campos, devido a oportunidade que prevê precisamente Visualizar e quantificar os fluxos através de uma grande gama de spatiotemporal. No entanto, sua implementação geralmente requer o uso de instrumentação caro e especializado, o que limita sua utilidade mais ampla. Além disso, dentro do campo da bioengenharia, em vitro estudos de visualização de fluxo também são frequentemente mais limitado pelo alto custo dos espectros de tecido comercialmente origem que recapitular desejadas estruturas anatômicas, particularmente para aqueles que abrangem o regime de mesoescala (ou seja, submillimeter para escalas de comprimento milímetro). Neste documento, apresentamos um protocolo experimental simplificado desenvolvido para lidar com essas limitações, os elementos-chave dos quais incluem 1) um método de custo relativamente baixo para a fabricação de mesoescala espectros de tecido usando impressão 3-d e carcaça do silicone e 2) uma quadro de análise e processamento de imagem de código-fonte aberto que reduz a demanda sobre a instrumentação para medir os fluxos de mesoescala (ou seja, velocidades de até dezenas de milímetros/segundo). Coletivamente, isso diminui a barreira de entrada para nonexperts, aproveitando recursos já à disposição de muitos pesquisadores de bioengenharia. Nós demonstratethe aplicabilidade do presente protocolo no âmbito da caracterização do fluxo neurovascular; no entanto, espera-se que seja relevante para uma ampla gama de aplicações de mesoescala em Bioengenharia e além.

Introduction

PIV é amplamente utilizado na mecânica de fluidos experimental para a visualização fluxo e investigações quantitativas de movimentos fluidos que variam em escala de comprimento de atmosférico a fluxos microcirculatory1,2,3. Enquanto os detalhes de sua implementação podem variar tão amplamente como suas aplicações, um aspecto comum a quase todos os estudos PIV é o uso da imagem de vídeo de partículas de traçador semeado dentro do fluido de trabalho, seguido por uma análise por pares de quadros de imagens consecutivas para extrair as características de fluxo desejada. Normalmente, isso é realizado pela primeira subdividindo cada quadro de imagem em regiões menores denominadas janelas de interrogatório. Como consequência as posições aleatórias das partículas dispersas, cada janela de interrogatório contém uma única distribuição de intensidades de pixel. Se a taxa de aquisição de dados e tamanho de janela é escolhida apropriadamente, correlação cruzada do sinal de intensidade em cada janela pode ser usada para estimar o deslocamento médio dentro dessa região. Finalmente, dado que a ampliação e a taxa de quadros são conhecidos parâmetros experimentais, um campo vetorial de velocidade instantânea pode ser facilmente calculado.

Uma grande vantagem do PIV sobre técnicas de medição de ponto único é a sua capacidade para mapear campos vetoriais em um domínio de duas ou três dimensões. Aplicações de hemodinâmicas, em particular, se beneficiaram com esse recurso, uma vez que permite uma investigação minuciosa dos fluxos locais, que são conhecidas por desempenhar um papel significativo na doença vascular ou remodelação (por exemplo, aterosclerose, angiogênese) 4 , 5 , 6. isto também foi verdade para a avaliação dos fluxos neurovascular, e suas interações com dispositivos endovasculares (por exemplo, desviadores de fluxo, stents, bobinas de intrasaccular), desde os comprimento-escalas relevantes em tais aplicações podem muitas vezes abrangem uma ou mais ordens de grandeza (por exemplo, do micrômetro em milímetro) e geometria do dispositivo e colocação pode significativamente impactar o local mecânica dos fluidos7.

A maioria dos grupos de estudos baseados em PIV hemodinâmica têm invocado experimentais set-ups que intimamente imitam algumas das primeiras investigações de stent influência no fluxo vascular7,8. Normalmente, estes incluem um) pulsado lasers e câmeras de alta velocidade, para capturar os fluxos de alta velocidade; b) sincronizadores, para evitar serrilhado entre a frequência de pulso do laser e a taxa de quadros de aquisição de câmera; c) óptica cilíndrica, para formar uma folha de luz e, assim, minimizar a fluorescência de fundo de partículas marcador acima e abaixo do plano do interrogatório; d) no caso de sistemas comerciais de turn-key, pacotes de software proprietário, para realizar as análises de correlação cruzada. No entanto, embora alguns aplicativos exigem o desempenho e/ou versatilidade oferecidas coletivamente por estes componentes, muitos outros não o faz. Além disso, o alto custo do tecido comercialmente origem fantasmas que recapitular desejadas estruturas vasculares também podem provar limitantes para muitos estudos em vitro , particularmente para fantasmas com apresenta essa ponte o regime de mesoescala (> 500 USD / fantasma). Neste documento, nós relatamos o desenvolvimento de um protocolo simplificado pela execução PIV para a visualização em vitro de fluxos neurovascular, que normalmente estão ambos espacialmente e temporalmente dentro do regime de mesoescala (i.e., escalas de comprimento variando de submillimeter milímetros, e velocidades de até dezenas de milímetros/segundo). O protocolo visa alavancar recursos já à disposição de muitos pesquisadores de bioengenharia, diminuindo assim a barreira de entrada para nonexperts.

O primeiro elemento do presente protocolo envolve o uso de uma técnica de fundição de investimento para permitir a fabricação in-house de transparente, polidimetilsiloxano (PDMS)-com base em espectros de tecido de 3-D-impresso moldes sacrificiais. Aproveitando a crescente disponibilidade de impressoras 3-d nos últimos anos, particularmente aqueles em compartilhado/multi-usuário instalações (por exemplo, instalações institucionais ou makerspaces pública), esta metodologia corta custos significativamente (p. ex., < 100 USD/fantasma no caso apresentado aqui), permitindo uma rápida reviravolta para a fabricação de uma ampla variedade de projetos e geometrias. No protocolo atual, um depoimento fundido, sistema de modelagem é usado com acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS) como o material de construção, e a parte impressa serve como um sacrifício molde para a fundição de fantasma subsequente. Nossa experiência tem mostrado que ABS é well-suited para tal uso, já que é solúvel em solventes comuns (por exemplo, acetona), e tem suficiente força e rigidez para manter a integridade do molde após a remoção do suporte material (por exemplo, para Evite a deformação ou fratura das características do molde diminutivo). No actual protocolo, integridade de molde é mais assegurada usando sólidos modelos impressos, embora isso vem à custa do tempo de dissolução de aumento. O uso de modelos ocos pode também ser possível em alguns casos, para melhorar o acesso de solvente e assim, reduzir o tempo de dissolução. No entanto, cuidadosa consideração deve ser dada ao efeito isto pode ter na integridade do molde. Finalmente, enquanto os phantoms fabricados neste documento são baseados em representações idealizadas de estruturas neurovasculares geradas usando um pacote de software de desenho assistido por computador (CAD) comum, o protocolo deverá ser favorável para a fabricação de mais complexo , geometrias específicas do paciente também (por exemplo, através do uso de arquivos de modelo gerado pela conversão de dados clínicos de imagem para o. Formato de arquivo STL usado pela maioria das impressoras 3-d). Para mais informações sobre o processo de fabricação fantasma são fornecidas na secção 2 do protocolo.

O segundo elemento do protocolo envolve o uso de um plug-in para ImageJ realizar as análises de correlação cruzada9abr-fonte. Este é acoplado com a implementação de um regime de limiarização estatística simples (ou seja, intensidade tampando)10 para melhorar o sinal de imagem antes da correlação cruzada, bem como um esquema de validação postcorrelation vector, o normalizado teste de mediana (NMT), para eliminar vetores espúrios, através de uma comparação de cada um de seus mais próximos vizinhos11. Coletivamente, isso permite que a imagem para ser realizado usando equipamentos comumente encontrado em muitos laboratórios de bioengenharia, eliminando assim a necessidade de aquisição de muitos dos componentes dos sistemas típicos de PIV (por exemplo, laser pulsado, caros sincronizador, óptica cilíndrica e software proprietário). Para mais informações sobre a coleção de vídeos, processamento de imagem e análise de dados são fornecidas nas seções 5 e 6 do protocolo.

A Figura 1 ilustra a afinação PIV, usada no presente protocolo, que depende de um microscópio de fluorescência, equipado com uma câmera de alta velocidade de imagem, bem como externo, fonte de luz branca contínua (ou seja, lâmpada de iodetos metálicos) para iluminação volumétrica através da objectiva. Uma bomba de engrenagem de velocidade variável é usada para impor o fluxo de recirculação de solução transparente sangue simulado através dos phantoms de tecido neurovascular. A solução é composta de uma mistura de 60: 40 de deionizada (DI) água e glicerol, que é um substituto comum para o sangue na hemodinâmica estuda12,13,14, devido a um) sua densidade e viscosidade (ou seja, semelhantes 1.080 kg/m3 e 3,5 cP vs 1.050 kg/m3 e 3-5 cP para o sangue)15,,16; b) sua transparência na faixa visível; c) o seu índice de refração similar como PDMS (1.38 vs 1,42 para PDMS)17,18,19,20, que minimiza a distorção óptica; d) a facilidade com que comportamento não-newtonianos pode ser introduzido, se necessário, através da adição de xanthane21. Finalmente, esferas de poliestireno fluorescentes são usadas como partículas traçador (10,3 µm de diâmetro; 480 nm/501 nm excitação/emissão). Enquanto neutra flutuantes grânulos são desejados, sourcing partículas traçador com óptimas propriedades mecânicas fluidas (por exemplo, densidade, tamanho, composição) e o comprimento de onda de emissão pode constituir um desafio. Por exemplo, os grânulos usados aqui são ligeiramente menos densos que a solução de glicerol (1.050 kg/m3 vs 1.080 kg/m3). No entanto, os efeitos hidrodinâmicos, dos mesmos, são negligenciáveis, dado que a duração de um experimento típico é muito menor do que a escala de tempo associada com efeitos de flutuabilidade (i.e., 5 min e 20 min, respectivamente). Mais detalhes sobre o sangue simulado solução formulação e in vitro sistema circulatório set-up são fornecidos nas seções 3 e 4 do protocolo.

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Protocol

1. fabricação do molde Sacrificial ABS-baseado

  1. Desenha um modelo inverso do fantasma tecido desejado utilizando software CAD.
  2. Imprima o modelo usando uma impressora 3-d com ABS como o material de construção.

2. com base em PDMS Vascular fabricação de fantasma

  1. Mistura
    1. Misture a base prepolymer PDMS e agente de cura em uma proporção de 10:1 (por peso); uma mistura de 66G fornece material suficiente para a fabricação de fantasmas com volumes de até 50 cm3.
    2. Coloque a mistura num exsicador de vácuo para 60 min para desgaseificar e minimizar o aprisionamento de bolha. Use pressurização/despressurização cíclica para facilitar a ruptura da bolha.
  2. Fundição
    1. Monte o molde impresso do ABS em um slide de vidro usando moldagem putty para selar a interface.
    2. Com cuidado, despeje a mistura PDMS no molde enquanto tenta minimizar uma armadilha de bolha. Bolhas persistentes podem ser rompidas manualmente usando uma agulha.
    3. Cure o fantasma de molde à temperatura ambiente (25 ° C) pelo menos 24 h.
      Nota: Em temperaturas mais altas, esse processo pode ser acelerado22.
  3. Desmoldagem
    1. Dissolver o ABS por submergir o fantasma em acetona e sonicating pelo menos 15 min, usando poderes até 70 w.
      Atenção: A acetona tem uma alta pressão de vapor à temperatura ambiente e um baixo ponto de fulgor. Por conseguinte, sempre trabalha sob uma coifa e longe de possíveis fontes de ignição. Use equipamento de proteção pessoal adequado (por exemplo, óculos de proteção ou cara de escudo, jaleco, luvas resistentes a acetona).
    2. Enxague cuidadosamente o fantasma com álcool isopropílico e, em seguida, DI água para remover os resíduos de solventes.
      Nota: PDMS incha após exposição à acetona; no entanto, o inchaço diminui uma vez que o fantasma é lavado e secado suficientemente23.
  4. Confirmação de fidelidade fantasma usando microscopia ótica
    1. Usando um microscópio óptico com uma câmera anexada e software de captura de imagem, capture uma imagem de um recurso crítico dentro o fantasma com uma ampliação que maximiza o recurso dentro do campo de visão.
    2. Capture uma imagem de uma retícula de calibração adequados a mesma ampliação.
    3. Carrega as duas imagens no ImageJ arrastando-os para a barra de ferramentas.
    4. Clique sobre a imagem do retículo de calibração para torná-la ativa e, em seguida, selecione a ferramenta de linha . Usando o mouse, desenhe uma linha ao longo de uma característica de uma distância conhecida e selecione análise > definir escala de no menu ImageJ.
      Nota: Na janela Definir escala , o campo identificado como a distância em pixels deve ser preenchido com o comprimento da linha desenhada em unidades de pixels.
    5. Digite o comprimento do recurso no campo rotulado Distância conhecidae sua unidade no campo rotulado Unidade de comprimento. Marque a caixa rotulada Global para aplicar este fator de calibração para todas as imagens abertas.
    6. Tornar a imagem do fantasma recurso crítico ativo e usar a ferramenta linha para desenhar uma linha ao longo de uma característica de interesse. No menu do ImageJ, selecione Analyze > medida (ou pressione Ctrl + M) para medir o comprimento da linha.
    7. Compare o valor esperado contra o valor na coluna marcada comprimento na janela de resultados para confirmar a fidelidade fantasma.

3. zombar de formulação de solução de sangue

  1. Misture DI água e glicerol na proporção de 60: 40 (em volume).
    Nota: Um volume de 100 mL é suficiente para o sistema circulatório em vitro descrito neste documento.
  2. Adicione 1 mL de solução de grânulo fluorescente de poliestireno de w/v 2.5% (ou seja, partículas de rastreamento) para a solução de sangue falso.
  3. Homogeneizar a mistura em uma placa de agitação magnética a 400 rpm por 10 minutos.

4. in Vitro confi guração do sistema circulatório

  1. Bomba de set-up
    1. Use uma ferramenta de stripper de fio para cortar o plug DC-fim da fonte de alimentação adaptador AC-DC.
    2. Descascar o revestimento do poder e fios de terra e conectá-los para o terminal de entrada do regulador de tensão de modulação (PWM) de largura de pulso.
    3. Ligue os fios de alimentação e terreno do motor da C.C. da bomba para o terminal de saída do regulador de tensão PWM.
      Nota: O display de sete segmentos do PWM saídas duty cycle (0% - 100%) usado para obter uma tensão variável no motor DC.
  2. Bomba de calibração
    1. Prepare 200 mL de solução de simulação de sangue (ver secção 3).
    2. Colocar tubo de aspiração da bomba para o béquer segurando a solução de sangue falso.
    3. Coloque o tubo de saída da bomba para um copo vazio.
    4. Selecione um ponto de ajuste do ciclo de dever desejado (0% - 100%). Carregue no botão e iniciar um timer.
    5. Para o timer uma vez que a bomba tenha transferido todo o volume de solução de sangue falso. Use este tempo para calcular a vazão volumétrica.
    6. Repita as etapas 4.2.1 - 4.2.5 pelo menos cinco diferentes dever ciclo conjunto pontos estabelecer uma curva de regressão de mínimos quadrados.
      Nota: É recomendado um mínimo de três pontos replicar por dever ciclo ponto de ajuste. Esta relação pode ser usada para correlacionar a taxa de fluxo desejada para o ciclo de dever PWM necessária.

5. vídeo Collection

  1. Calibração de imagem
    1. Determine a relação de calibração para a geração de imagens de vídeo (ver secção 2).
  2. Instalação de aparelhos
    1. Coloque o fantasma PDMS no palco do microscópio de fluorescência.
    2. Conectar o fantasma para a bomba de engrenagem e apresentar a solução de sangue falso.
      Nota: Opcionalmente, umectantes prefill o modelo com etanol para facilitar completo; em seguida, lave e preenchê-lo com a solução de sangue falso. Isto pode ser particularmente benéfico para os modelos com pequenas embarcações e/ou características de cegas.
    3. Defina o controlador do motor da bomba para a vazão desejada, com base na curva de calibração da bomba.
    4. Opere a bomba por 15 min antes do experimento para garantir condições de estado estacionário.
    5. Ligue a lâmpada externa para iluminar o campo de visão. Selecione um filtro apropriado com base no comprimento de onda de excitação dos grânulos fluorescentes.
    6. Ajuste o plano focal imagem do midplane de navio.
      Nota: Isto pode ser conseguido usando-se uma distância focal que maximiza a seção transversal de navio imagem (por exemplo, quando usando fantasmas com vaso circular seções transversais); e/ou indexação de um recurso fantasma projetado para facilitar a identificação do avião meio do navio.
  3. Gravação de vídeo
    1. Selecione os parâmetros de gravação de vídeo para otimizar a relação sinal-ruído (SNR). Parâmetros-chave incluem o tempo de exposição, taxa de quadros e ganham.
      Nota: No presente protocolo, usamos uma taxa de quadros de 2.000 fps e um ganho de 1.0. No entanto, esses parâmetros podem variar com base no aplicativo (consulte a seção de discussão para mais detalhes).
    2. Recolher o vídeo e salve-o no formato AVI.
  4. Limpar fantasma
    1. Se o grânulo-colagem é observado após um experimento, proceda à sonicação do fantasma em uma solução aquosa de detergente usando poderes até 70 w.

6. processamento e análise de dados de imagem

  1. Pré-processamento da imagem
    1. Arraste o arquivo AVI salvo para a janela do ImageJ para importá-lo. Marque a caixa marcada converter para escala de cinza.
    2. No menu do ImageJ , selecione Analyze > gerar histograma (ou pressione Ctrl + H) para gerar um histograma das intensidades de pixel da imagem. Tome nota da média e desvio-padrão para a imagem não processado.
      Nota: Em altas taxas de quadros, não é incomum para a distribuição a ser desviado pesadamente em direção a zero (ou seja, sem sinal).
    3. No menu do ImageJ , selecione imagem > ajustar > brilho e contraste (ou pressione Shift + Ctrl + H) para aplicar um filtro de brilho/contraste.
    4. No menu de brilho e contraste , pressione o botão Set para definir os limites da imagem. Defina o valor mínimo a ser o valor médio mais um desvio padrão e o valor máximo a ser a intensidade máxima da imagem (ambos baseados em estatísticas obtidas na etapa 6.1.2).
      Nota: Isto normalmente elimina todos, mas o top 10% das intensidades pixel. O número de desvios padrão pode variar dependendo da distribuição desejada das intensidades pixel. Um script de macro personalizado para executar a intensidade de operação de nivelamento é fornecido nos Materiais suplementares.
    5. No menu do ImageJ , selecione processo > ruído > Despeckle para reduzir o número de pixels saturados.
      Nota: Esta operação é exigiu o aumento potencial de saturação de pixel que surge durante a otimização do brilho e contraste, que pode produzir vetores espúrios durante posterior correlação cruzada.
    6. No menu do ImageJ , selecione processo > Filtros > Gaussian Blur com um raio de 1,5 para reduzir os artefatos decorrentes a remoção ocasional de pixels iluminadas em um 3x3 bairro pela obliquidade operação prévia.
    7. Clique na ferramenta polígono e, em seguida, clique na imagem para delinear a região de interesse (ROI).
    8. No menu do ImageJ , selecione Editar > clara fora remover o ruído do sensor em locais onde não há sinal é esperado (por exemplo, áreas além do limite da parede vaso), que pode diminuir o SNR global.
  2. Cálculo de PIV
    Nota: Esta parte do protocolo emprega um PIV de terceiros plug-in para ImageJ, que depende de gaussianas pico-encaixe para permitir uma estimativa de deslocamento com precisão subpixel.
    1. No menu do ImageJ , selecione Plugins > Macros > executar... e navegue até a macro salva código complementar 2. ijjm a correlação cruzada pares de imagem sucessivas.
      Nota: A macro procede da seguinte maneira. 1) uma correlação cruzada do campo intensidade dentro de imagens consecutivas primeiro é executada para determinar o deslocamento local de partículas traçador influienciada pela advecção (i.e., a primeira imagem par consiste as imagens primeiras e o segunda, o segundo par de imagem consiste a segunda e terceiros imagens, etc.). 2) uma avaliação de multipass duas etapas é então realizada com tamanhos de janela interrogatório inicial e final de 256 x 256 pixels e 128 x 128 pixels, respectivamente. Finalmente, 3) a macro executa uma média temporal para reduzir ainda mais a aparência de vetores espúrios.
  3. Teste de mediana normalizado (NMT)
    1. No menu do ImageJ , selecione Plugins > Macros > executar... e navegue até a macro salva código complementar 3. ijjm para validar a velocidade campos através do teste normalizado mediano.
      Nota: A macro procede da seguinte maneira. 1) cada vetor em um campo vetorial instantânea primeiro é comparado com seus vizinhos mais próximos oito para calcular o valor mediano. 2) a matriz de erros residuais é então calculada como a diferença entre cada vetor vizinha e a mediana calculada. 3) a diferença entre o vetor sob investigação e o valor mediano de vetor vizinhas então é normalizada pelos resíduos ao longo da rodovia. 4) isto é então comparado com um valor de limiar (normalmente, 0,2 pixels), que pode ser variado com base no conhecimento um priori de ruído durante a aquisição de imagem. Finalmente, 5) uma média temporal de todos os campos do vetor instantânea validado é executada para produzir um campo composto, como isto foi mostrado para aumentar o vetor campo qualidade24.

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Representative Results

A Figura 2 ilustra o processo de fabricação de fantasma de tecido PDMS. Os phantoms projetados neste documento destinam-se para o estudo do fluxo em aneurismas idealizados de pescoço largo, sacular, intracranianas, bem como artérias de perforator ramificação proximal. Design adicional importantes características incluem 1) um reservatório comum que todos os navios que desaguam, para garantir o egresso fluido livre do phantom - caso contrário, formação de gotículas pode ocorrer nas tomadas de embarcação menores; 2) um borbulhador, para facilitar a remoção da bolha; 3) cavidade parede exterior, para garantir o paralelismo da embarcação com o plano horizontal, bem como uma definição precisa do último fantasma laje altura, comprimento e largura; 4) a utilização de uma haste de agulha hipodérmica de 21 G (820 µm de diâmetro exterior nominal) para o molde da artéria perforator, devido à incapacidade da nossa impressora para definir tais características com fidelidade suficiente. Reprodução fiel de todas as características de design é observada em toda.

Resultados representativos de uma caracterização de fluxo PIV-based realizada utilizando o protocolo atual são apresentados na Figura 3 e Figura 4. Estes estudos foram realizados utilizando as taxas de fluxo de entrada fantasma de 100 mL/min, taxas de aquisição de dados de 2.000 fps, e com uma média temporal sobre vãos de 0,05 s. a Figura 3 mostra quadros de imagem representativa dentro da artéria perforator, antes e depois Capturando com intensidade, bem como parcelas de superfície correspondentes dos valores de intensidade de 8-bit pixel. Ambos demonstram que intensidade tampando aumenta significativamente a definição de pico acima do piso de ruído (ou seja, aumenta o SNR), que é fundamental para assegurar precisão ao realizar correlação cruzada posterior. A Figura 4 mostra os efeitos de operações de NMT no campo vetorial de velocidade e intensidade tampando. Observa-se melhora acentuada em uniformidade de campo, assim, ainda mais, ressaltando a importância de maximizar o SNR para minimizar a eliminação de dados.

Figure 1
Figura 1 : Afinação de Velocimetria particle image. Confiança sobre uma análise de imagem de código-fonte aberto e um quadro de pre/pós-processamento reduz a demanda sobre a instrumentação para medir os fluxos de mesoescala, eliminando assim a necessidade de muitos dos componentes de sistemas PIV típicos (por exemplo, pulsada caros laser, sincronizador, óptica cilíndrica e/ou software proprietário). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Processo de fabricação de fantasma de tecido com base em PDMS. As imagens ilustram (um) um modelo de CAD do neurovascular fantasma molde, (b) o ABS impresso do molde após a remoção do material de apoio, (c) a conversão e cura de PDMS dentro do molde ABS, (d) a dissolução parcial do ABS molde de material e (e), o fantasma, com o baixo-relevo mostrando as dimensões finais de recursos críticos, bem como a região de interesse (ROI) na artéria perforator onde as medições de PIV foram feitas de PDMS concluído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Efeito da intensidade tampando a operação na imagem SNR. Estes painéis mostram quadros de imagem representativa e o pixel correspondente intensidade terrenos superfície dentro do perforator artéria, (a e b) antes e (c e d) depois de aplicar a intensidade tampando a operação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Efeitos de operações de NMT na velocidade e intensidade tampando vector campos. Estes painéis ilustram o campo vetorial de velocidade instantânea representativa dentro da artéria perforator derivado (um) não transformados, dados de imagem, dados de intensidade-tampado (b) e (c) dados de intensidade-tampado + pós-processamento de NMT . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Efeito de dimensionamento de janela de interrogatório na qualidade correlação. Dimensionamento da janela ideal ocorre quando o valor do coeficiente de correlação zero-normalizado é maximizado e o desvio padrão é minimizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo descrito aqui contornos de um método simplificado para a realização de estudos PIV para visualizar neurovascular flui em dimensões fisiologicamente relevantes e de condições de fluxo em vitro. Ao fazê-lo, serve para complementar protocolos relatados por outras pessoas que também têm focado simplificando a quantificação de campos vetoriais, mas dentro de contextos muito diferentes que exigem que a consideração de muito maior comprimento escalas de25 ou menor fluxo taxas de26,27 (por exemplo, fluxos atmosféricos ou microcirculatory) e assim, com uma confiança sobre os esquemas que são incompatíveis com o aplicativo atual.

As considerações mais importantes para o sucesso da implementação de PIV mentem na minimização dos artefatos do campo de fluxo e a maximização da qualidade de imagem. Várias etapas no processo de fabricação do fantasma de tecido são fundamentais para ambos estes critérios. Por exemplo, desgaseificação completa é crucial, pois o ar arrastado dentro o PDMS durante a mistura pode levar à formação de bolhas dentro o phantom final, que pode afetar tanto a fidelidade de recurso e a claridade ótica. Além disso, minimização de rugosidade da superfície do molde ABS é desejada, desde que o processo de fundição de PDMS reproduz fielmente as mais minutos imperfeições (por exemplo, linhas de compilação, os poros superficiais, arranhões), resultando em aspereza de superfície em o fantasma final que pode diminuir a claridade ótica e aumentar o potencial de acumulação do grânulo. Enquanto o protocolo descrito neste documento provou suficiente para o aplicativo atual, há inúmeros relatos na literatura de meios de reduzir tal aspereza, caso haja alguma necessidade (por exemplo, vapor acetona suavização28 ou o otimização de orientação de espessura e parte de camada em relação a direção do edifício)29.

A seleção do parâmetro para captura de vídeo também é fundamental para garantir um campo vetorial de alta-fidelidade. Um SNR ideal normalmente é alcançado com a mais alta taxa de quadros realizáveis que ainda permite a exposição de grânulo suficientes (a taxa de quadros máxima sendo limitada pelo tempo mínimo de exposição). Ganho pode ser usado para amplificar o sinal, mas isso também aumenta o ruído do sensor. Se a velocidade máxima pode ser estimada a partir de outros parâmetros de fluxo (por exemplo, taxa de fluxo volumétrico de entrada), então um limite inferior sobre a taxa de quadro necessária pode ser calculado usando a seguinte relação30.

Equation 1(1)

Aqui, famostragem é a taxa de aquisição de câmera (Hz), máximo v é a velocidade máxima esperada (mm/s), ccalibração é a calibração constante (pixels/mm) e hjanela de interrogatório é o tamanho da janela do interrogatório (pixels). No entanto, valores mais ideais podem ser determinadas usando técnicas de estimativa de qualidade de chamada correlação, tais como o coeficiente de correlação zero-normalizado11. Nesta técnica, as médias dos sinais complementares de cada par de quadro são primeiro subtraídas e, então, normalizadas pelo desvio padrão de suas intensidades11. Se existe um deslocamento do sinal original, tal que todos os picos e vales de corresponder, o valor de tempo transferiu deste sinal será igual a um. Por outro lado, se não houver nenhum deslocamento que pode alinhar esses sinais, o valor será zero. Esta informação é incluída na saída do ImageJ PIV para cada vetor, e ele pode ser plotado como campo próprio para verificar se há efeitos espaciais, contribuindo para a pobre correlação (p. ex., iluminação desigual). O coeficiente de correlação pode também ser em média mais de um campo como uma estimativa global da sua qualidade. Finalmente, esta quantidade também pode ser plotada contra diferentes taxas de quadros ou tamanhos de janela de interrogatório para determinar uma ótima. A Figura 5 ilustra os resultados de tal análise usando um campo de partículas de Monte Carlo-sintetizados com deslocamentos consistentes com nossos fluxos medidos experimentalmente (uma técnica para caracterizar a correlação qualidade11 ). Os resultados mostram que o interrogatório janela tamanho e taxa de quadros deve ser escolhida de tal forma que um campo de partículas é deslocado por ≤ 20% do tamanho da janela de interrogatório por par de moldura para maximizar o coeficiente de correlação, minimizando sua variabilidade.

Apesar do protocolo descrito neste documento provou suficiente para satisfazer as necessidades do aplicativo atual, é importante reconhecer suas limitações. Por exemplo, enquanto o contraste realce através de intensidade tampando oferece facilidade de implementação, transformações da distribuição das intensidades de pixel inteira podem melhorar o SNR mais31. Da mesma forma, embora o rastreamento baseado em correlação está bem estabelecido e fornece resolução suficiente para estimar com fiabilidade as características de fluxo de primeira ordem relevantes para hemodinâmica (por exemplo, velocidade intra-aneurismático), outras técnicas podem oferecer uma maior resolução espacial (por exemplo, híbrido PIV/PTV, correspondência de quadrados mínimos)32,33 e, assim, maior precisão quando considerando as características que são mais sensíveis para a resolução do campo de velocidade (por exemplo, , tensão de cisalhamento da parede, vorticidade no plano). Da mesma forma, enquanto o NMT fornece um meio para melhorar o campo vetorial de velocidade após a correlação cruzada, é importante enfatizar que esta é apenas uma das muitas técnicas de validação de vetor que podem ser usado24,34, cada um com suas próprias únicas vantagens e desvantagens que podem fazer seu uso mais adequado para aplicações além daqueles descritos aqui. Por último, enquanto a montagem experimental descrita aqui procura imitar fisiologicamente relevantes de caudais e escalas de comprimento para a neurovasculatura, não atualmente permite a análise dos fluxos pulsátil. Isso não tem sido uma limitação para o aplicativo atual, desde que os números de faixa de Womersley em grande parte a neurovasculatura tendem a ser ≤ 1 (ou seja, há um efeito aditivo mínimo dos vários ciclos cardíacos)35, que sugere que condições de estado estacionário são suficientes para recapitular os pontos de tempo discreto junto a forma de onda cardíaca em que a taxa de fluxo é comparável. No entanto, para aplicações onde o número de Womersley é maior (por exemplo, vasculatura mais perto do coração), montamos um potencial para a introdução de pulsatility através do uso de um Arduino, que poderia ser usado para enviar a bomba uma tensão PWM variáveis no tempo forma de onda que permite a imitação de um fluxo cardíaco perfil36,37,38.

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Disclosures

Os autores não têm nada a declarar.

Acknowledgements

Os autores reconhecem suporte parcial para este projeto fornecido por uma concessão de semente colaborativo do escritório de pesquisa e desenvolvimento económico em UC Riverside.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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