Meso-Scale Particle Image Velocimetry studier av neurovaskulära flödar In Vitro

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi förenklade metoder för fabricera transparent neurovaskulära fantomer och karaktärisera flödet däri. Vi lyfter fram flera viktiga parametrar och visa deras förhållande till fältet noggrannhet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Particle image velocimetry (PIV) används i en mängd olika områden, på grund av möjlighet det ger för exakt visualisera och kvantifiera flöden över ett flertal spatiotemporal olika. Dess genomförande kräver dock normalt att utnyttja dyra och specialiserade instrumentation, som begränsar dess bredare verktyg. Dessutom, inom området bioteknik, in vitro- flöde visualisering studier finns också ofta ytterligare begränsas av de höga kostnaderna för kommersiellt odlade vävnad fantomer som recapitulate önskad anatomiska strukturer, särskilt för dem som span tem regimen (dvs, submillimeter till millimeter längdskalor). Häri, presenterar vi en förenklad experimentella protokoll som utvecklats för att hantera dessa begränsningar, de viktigaste inslagen som inkluderar 1) en relativt billig metod för att fabricera tem vävnad fantomer med hjälp av 3D-utskrifter och silikon gjutning, och 2) en öppen källkod bild analys och bearbetning ram som minskar efterfrågan på instrumenteringen för mäta tem flöden (dvs, hastigheter upp till tiotals millimeter/sekund). Kollektivt, sänker detta inträdeshindret för nonexperts, genom att utnyttja resurser redan till förfogande för många bioengineering forskare. Vi demonstratethe tillämpligheten av detta protokoll inom ramen för neurovaskulära flöde karakterisering; men förväntas det vara relevanta för ett bredare spektrum av tem applikationer i bioteknik och bortom.

Introduction

PIV används ofta i experimentell strömningsmekanik för flöde visualisering och kvantitativa undersökningar av flytande rörelse som varierar i längd skala från atmosfäriska till blodcirkulationens flöden1,2,3. Detaljerna i dess genomförande kan variera så mycket som dess tillämpningar, är en aspekt som är gemensamma för nästan alla PIV studier användningen av video avbildning av tracer partiklar seedade inom arbetsvätskan, följt av en parvisa analys av på varandra följande bild ramar att extrahera den önskade flödesegenskaper. Detta görs normalt genom första delas varje bildram i mindre regioner kallas förhör windows. Till följd av slumpmässiga positioner av spridda partiklarna innehåller varje förhör fönstret en unik distribution av pixel stödnivåer. Om andelen fönster storlek och data förvärv väljer lämpligt, kan cross-korrelation av intensitet signalera i varje fönster användas att uppskatta den genomsnittliga förskjutningen inom regionen. Slutligen, med tanke på att förstoringen och bildfrekvens är kända experimentella parametrar, en momentan hastighet vektorfält kan lätt beräknas.

En stor fördel med PIV över enpunkts-mätteknik är dess förmåga att mappa vektorfält över en två - eller tredimensionella domän. Hemodynamiska tillämpningar, i synnerhet, har gynnats av denna kapacitet, eftersom det gör en grundlig utredning av lokala flöden som är känd för att spela en betydande roll i vaskulär sjukdom eller remodeling (t.ex., åderförkalkning, angiogenes) 4 , 5 , 6. Detta har också varit sant för utvärdering av neurovaskulära flöden och interaktioner därav med transluminal (t.ex., flöde fördelare, stent, intrasaccular spolar), sedan de relevanta längd-skalorna i sådana tillämpningar kan sträcker sig över ofta en eller flera tiopotenser (t.ex., från mikrometer millimetern), och enheten geometri och placering kan väsentligt påverka den lokala strömningslära7.

De flesta grupper bedriver PIV-baserade hemodynamiska studier har förlitat sig på experimentella uppställningar som efterliknar nära några av de tidigaste undersökningarna av stent inflytande på vaskulär flöde7,8. Vanligtvis, dessa inkluderar en) pulsade lasrar och höghastighets kameror, att fånga hög hastighet flöden; (b) synkroniserare, att förhindra aliasing mellan puls frekvens av laser och kameran förvärv bildfrekvensen; (c) cylindriska optik, att bilda ett ljus blad och, således, minimera bakgrund fluorescensen från tracer partiklar över och under förhör planet; (d) för kommersiella nyckelfärdiga system, proprietär programvarupaket, att utföra cross-korrelation analyser. Men medan vissa program kräver den prestanda eller mångsidighet kollektivt ges av dessa komponenter, många andra inte. Dessutom de höga kostnaderna för kommersiellt odlade vävnad fantomer som recapitulate önskad vaskulära strukturer kan också bevisa att begränsa för många in vitro- studier, särskilt fantomer med har för det överbryggar den tem-regimen (> 500 USD / Phantom). Häri, redovisar vi utvecklingen av ett förenklat protokoll för att genomföra PIV för in vitro- visualisering av neurovaskulära flöden, som vanligtvis ligger både rumsligt och temporally inom tem regimen (dvslängdskalor sträcker sig från submillimeter millimeter och hastigheter upp till tiotals millimeter/sekund). Protokollet syftar till att utnyttja resurser redan till förfogande för många bioengineering forskare, sålunda sänkanden inträdeshindret för nonexperts.

Det första elementet i detta protokoll innebär användning av en investering gjutning teknik att aktivera in-house tillverkning av transparent, Polydimetylsiloxan (PDMS)-baserat vävnad fantomer från 3-D-tryckt uppoffrande formar. Genom att utnyttja den ökande tillgången till 3D-skrivare under de senaste åren, särskilt de i delade/multi-användare faciliteter (t.ex., institutionella faciliteter eller offentlig makerspaces), denna metod minskar kostnaderna betydligt (t ex, < 100 USD/phantom i fall presenteras här), och möjliggöra en snabb vändning för tillverkning av ett brett utbud av mönster och geometrier. I det nuvarande protokollet, en smält nedfall modellering system används med akrylnitril-butadien-styren (ABS) som byggmaterial och den tryckta delen fungerar som en uppoffrande mögel för efterföljande phantom gjutning. Vår erfarenhet har visat att ABS är lämpade för sådan användning eftersom den är löslig i vanliga lösningsmedel (t.ex., aceton), och den har tillräcklig hållfasthet och styvhet att upprätthålla mögel integritet efter avlägsnande av stöd materialet (t.ex., till förhindra deformation eller fraktur av diminutiva mögel funktioner). I det nuvarande protokollet säkerställs mögel integritet ytterligare med hjälp av tryckta solidmodeller, även om detta sker på bekostnad av ökad upplösning tid. Användningen av ihåliga modeller kan också vara möjligt i vissa fall, att förbättra solvent tillgång och därmed minska upplösning tid. Dock försiktig bör man överväga om att detta kan ha på mögel integritet. Slutligen, medan phantoms fabricerade häri är baserade på idealiserade representationer av neurovaskulära strukturer genereras med hjälp av en vanliga programpaket för datorstödd konstruktion (CAD), protokollet förväntas vara mottagliga för tillverkning av mer komplexa , patientspecifika geometrier samt (t.ex. via användning av modellfiler som genereras av omvandlingen av kliniska imaging data till den. STL filformat som används av de flesta 3D-skrivare). Ytterligare information om phantom tillverkningsprocessen finns i avsnitt 2 i protokollet.

Det andra elementet i protokollet innebär användning av en öppen källkod plug-in för ImageJ att genomföra den cross-korrelation analyser9. Detta är kopplat till genomförandet av ett system för enkla statistiska tröskelvärde (dvsintensitet tak)10 att förbättra bilden signalen före cross-korrelation, liksom ett valideringsschema postcorrelation vector, de normaliserade Median test (NMT), att eliminera falska vektorer genom en jämförelse av varje till dess närmaste grannar11. Kollektivt, tillåter detta imaging att utföras med hjälp av utrustning som vanligtvis hittas i många bioengineering laboratorier, vilket eliminerar behovet av förvärvet av många av de kostsamma komponenterna i typiska PIV system (t.ex., det Pulsade laser, Synchronizer, cylindriska optik och proprietär programvara). Ytterligare information om de video samling, bildbehandling och analys av data finns i avsnitt 5 och 6 i protokollet.

Figur 1 illustrerar PIV set-up används i detta protokoll, som förlitar sig på fluorescens Mikroskop utrustat med en höghastighetskamera för imaging, samt en extern, kontinuerlig vitt ljus källa (dvs, metallhalogen lampa) för genom mål volymetriska belysning. En variabel hastighet kugghjulspump används för att införa recirkulerande flödet av en transparent håna blod lösning genom neurovaskulära vävnad phantoms. Lösningen består av en 60: 40 blandning av avjoniserat vatten (DI) och glycerol, som är en vanlig ersättning för blod i hemodynamiska studier12,13,14, tack vare en) dess liknande densitet och viskositet (dvs. 1.080 kg/m3 och 3,5 cP vs 1 050 kg/m3 och 3-5 cP för blod)15,16; (b) dess öppenhet i det synliga området; (c) dess liknande brytningsindex som PDMS (1,38 vs. 1,42 för PDMS)17,18,19,20, vilket minimerar optisk förvrängning; (d) den lätthet med vilken icke-newtonska beteende kan införas, om det behövs, via tillägg av xanthane21. Slutligen används fluorescerande polystyren pärlor som tracer partiklar (10,3 µm i diameter, 480 nm/501 nm excitation/utsläpp). Medan neutralt buoyant pärlor önskas, kan sourcing tracer partiklar med optimal vätska mekaniska egenskaper (t.ex., densitet, storlek, sammansättning) och utsläpp våglängd vara utmanande. Pärlorna används häri är exempelvis något mindre tät än glycerol lösningen (1 050 kg/m3 vs 1.080 kg/m3). Dock de hydrodynamiska effekterna, därav, är försumbar, eftersom varaktigheten av en typisk experiment är betydligt kortare än den tidsskala som förknippas med flytkraft effekter (dvs, 5 min och 20 min, respektive). Vidare finns information om håna blod lösning formulering och in vitro- cirkulationssystemet set-up i avsnitten 3 och 4 i protokollet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ABS-baserade uppoffrande mögel tillverkning

  1. Designa en inverterad modell av önskad vävnad phantom med hjälp av CAD-program.
  2. Skriv ut den modell som använder en 3D-skrivare med ABS som byggmaterial.

2. PDMS-baserade vaskulär Phantom Fabrication

  1. Blanda
    1. Blanda PDMS prepolymer bas och härdare i förhållandet 10:1 (viktprocent). en 66 g blandning ger tillräckligt material för tillverkning av fantomer med volymer upp till 50 cm3.
    2. Lägg blandningen i vakuum exsickator för 60 min att degas och minimera bubbla entrapment. Använda cyklisk trycksättning/råoljor för att underlätta bubbla brista.
  2. Gjutning
    1. Montera den tryckta ABS mögel på en glasskiva med gjutning spackel för att försegla gränssnittet.
    2. Häll försiktigt PDMS blandningen i formen samtidigt försöker minimera bubbla entrapment. Kvardröjande bubblor kan vara spruckna manuellt med hjälp av en nål.
    3. Bota cast Fantomen i rumstemperatur (25 ° C) under minst 24 h.
      Obs: Vid högre temperaturer, kan denna process vara accelererad22.
  3. Demolding
    1. Lös ABS genom att dränka Fantomen i aceton och sonicating för minst 15 min, använder krafter upp till 70 W.
      FÖRSIKTIGHET: Aceton har ett högt ångtryck vid rumstemperatur och en låg flampunkt. Därför arbeta alltid under dragskåp och bort från potentiella antändningskällor. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (t.ex., skyddsglasögon eller ansikte sköld, labbrock, aceton-resistenta handskar).
    2. Skölj phantom med isopropylalkohol och, sedan, DI vatten för att avlägsna rester av lösningsmedel.
      Obs: PDMS sväller vid exponering för aceton; men avtar svullnaden när Fantomen sköljs och torkas tillräckligt23.
  4. Bekräftelse av phantom trohet med hjälp av optisk mikroskopi
    1. Med ett optiskt mikroskop med en bifogad kamera och bild ta till fånga mjukvaran, fånga en bild av en kritisk funktion inom Fantomen i en förstoring som maximerar funktionen inom synfältet.
    2. En avbildning av en lämplig kalibrering riktmedel vid samma förstoring.
    3. Fyll på båda bilderna i ImageJ genom att dra dem till i verktygsfältet.
    4. Klicka på bilden för kalibrering riktmedel för att aktivera den och sedan Välj linjeverktyget . Med hjälp av musen, dra en linje längs en funktion av en känd sträcka och välj Analyze > Ange skala från menyn ImageJ.
      Obs: I fönstret Ange skala fältet märkt avståndet i pixlar bör vara fylls med längden på den ritade linjen i enheter av pixlar.
    5. Ange längden på funktionen i fältet märkt Kända avståndoch dess enhet i fältet Enhet av längden. Markera rutan som heter Global gälla denna kalibreringsfaktorn för alla öppna bilder.
    6. Göra bilden av phantom kritiska funktionen aktiv och Använd linjeverktyget för att rita en linje längs en funktion av intresse. Från ImageJ menyn, Välj Analyze > åtgärd (eller tryck på Ctrl + M) att mäta längden av linjen.
    7. Jämför det förväntade värdet mot värdet i kolumnen markerade längd i resultatfönstret för att bekräfta phantom trohet.

3. håna blod lösning formulering

  1. Blanda DI vatten och glycerol i en 60: 40 förhållandet (i volym).
    Obs: En 100 mL volym räcker för cirkulationssystemet i vitro beskrivs häri.
  2. Tillsätt 1 mL 2,5% w/v fluorescerande polystyren pärla lösning (dvs, tracer partiklar) till mock blod lösningen.
  3. Homogenisera blandningen på en magnetisk uppståndelse tallrik vid 400 rpm i 10 min.

4. in Vitro cirkulationssystemet Set-up

  1. Pump set-up
    1. Använd ett tråd strippa verktyg för att skära av DC-slutet kontakten från strömkällan AC-till-DC adapter.
    2. Band beläggning av strömmen och marken kablar och koppla dem till ingången input spänningsregulatorn puls bredd modulation (PWM).
    3. Anslut ström och slipade ledningarna från pumpens DC-motor till en utgång för PWM spänningsregulatorn.
      Obs: PWMS sju-segment display utgångar intermittensen (0% - 100%) används för att uppnå en variabel spänning till DC-motor.
  2. Pump kalibrering
    1. Förbereda 200 mL håna blod lösning (se avsnitt 3).
    2. Placera slangen från pumpens intag till bägaren hålla håna blod lösningen.
    3. Placera slangen från pumpen uttaget till en tom bägare.
    4. Välj en önskad arbetspunkt cykel set (0% - 100%). Tryck knappen och starta en timer.
    5. Stoppa timern när pumpen har överförts hela volymen av mock blod lösning. Använd denna tid för att beräkna det volymetriska flöde som.
    6. Upprepa steg 4.2.1 - 4.2.5 för minst fem olika duty cycle börvärden att fastställa en minsta kvadratmetoden regressionskurvan.
      Obs: Minst tre replikera punkter per börvärdet för skyldighet cykel rekommenderas. Detta förhållande kan användas för att korrelera det önskad flödet till krävs PWM intermittensen.

5. video samling

  1. Bild kalibrering
    1. Bestämma förhållandet kalibrering för video bildtagning (se avsnitt 2).
  2. Apparater set-up
    1. Placera PDMS Fantomen på scenen av fluorescens Mikroskop.
    2. Anslut Fantomen till kugghjulspump och införa håna blod lösningen.
      Obs: Alternativt prefill modellen med etanol att underlätta fullständig vätning; sedan spola och fyll den med mock blod lösningen. Detta kan vara särskilt fördelaktigt för modeller med mindre fartyg eller blinda funktioner.
    3. Ange den pump motor controller för önskad flödet baserat på pumpen kalibreringskurvan.
    4. Kör pumpen för 1-5 min innan experimentet att säkerställa steady-state-förhållanden.
    5. Slå på den externa lampan att lysa upp synfältet. Välj ett lämpligt filter baserat på excitation våglängd av fluorescerande pärlor.
    6. Justera imaging fokalplanet till det fartyget midplane.
      Obs: Detta kan uppnås genom att använda en brännvidd som maximerar avbildad fartyget tvärsnitt (t.ex.när du använder fantomer med cirkulär fartyget tvärsnitt); och/eller indexering bort av en fantom funktion som utformats för att underlätta identifieringen av fartyg efter halva planet.
  3. Videoinspelning
    1. Välj parametrarna videoinspelning att optimera det signal-brus-förhållandet (SNR). Viktiga parametrar inkluderar exponeringstid, bildfrekvens, och vinna.
      Obs: I detta protokoll använder vi en bildhastighet av 2 000 fps och en vinst på 1.0. Dessa parametrar kan dock variera beroende på programmet (se diskussionsavsnittet för ytterligare detaljer).
    2. Samla in videon och spara den i AVI-format.
  4. Phantom sanering
    1. Om pärla-sticker observeras efter ett experiment, Sonikera Fantomen i en vattenlösning rengöringslösning som använder krafter upp till 70 W.

6. bild bearbetning och analys av Data

  1. Bildförbehandling
    1. Dra den sparade AVI-filen till fönstret ImageJ att importera den. Markera rutan märkt konvertera till gråskala.
    2. Från ImageJ menyn, Välj Analyze > generera Histogram (eller tryck Ctrl + H) att generera ett histogram över bilden pixel stödnivåer. Ta del av medelvärde och standardavvikelse för obearbetade bilden.
      Obs: Vid höga bildhastigheter, det är inte ovanligt för distribution att bli skeva tungt mot noll (dvs, ingen signal).
    3. Från ImageJ menyn, Välj Bild > Justera > ljusstyrka och kontrast (eller tryck på Skift + Ctrl + H) att tillämpa ett filter för ljusstyrka/kontrast.
    4. Tryck på Set -knappen för att definiera gränserna som bilden på menyn ljusstyrka och kontrast . Minsta värdet vara medelvärdet plus en standardavvikelse, och det högsta värdet att vara den högsta stödnivån bilden (både baserat på statistik som erhölls i steg 6.1.2).
      Obs: Detta vanligtvis eliminerar alla utom topp 10% av stödnivåerna som pixel. Antalet standardavvikelser kan varieras beroende på önskad fördelningen av stödnivåerna som pixel. Ett anpassat makroskript för att utföra intensiteten tak drift föreskrivs i de Kompletterande material.
    5. Från ImageJ menyn, Välj Process > buller > Despeckle att minska antalet mättade pixlar.
      Obs: Denna operation är nödvändiga på grund av ökad potential för pixel mättnad som uppstår under optimering av ljusstyrka och kontrast, som kan producera falska vektorer under efterföljande cross-korrelation.
    6. Från ImageJ menyn, Välj Process > Filter > Gaussian Blur med en radie på 1,5 att minska artefakter från tillfälliga avlägsnande av belysta pixlar i ett 3 x 3 kvarter av föregående despeckling drift.
    7. Klicka på verktyget Polygon och klicka sedan på bilden för att beskriva regionen av intresse (ROI).
    8. Från ImageJ menyn, Välj Redigera > Rensa utanför ta bort sensorbrus på platser där ingen signal väntat (t.ex., områden utanför fartyget vägg gränsen), som kan minska den totala SNR.
  2. PIV beräkning
    Obs: Denna del av protokollet sysselsätter en tredje part PIV plug-in för ImageJ, som förlitar sig på Gaussisk peak-tillbehöret att möjliggöra en uppskattning av förskjutning med sub-pixel noggrannhet.
    1. Från ImageJ menyn, Välj Plugins > makron > Kör... och navigera till det sparade makrot tilläggskod 2. ijjm till cross-korrelat successiva bild par.
      Obs: Makrot fortsätter så här. (1) en cross-korrelation på fältet intensitet inom på varandra följande bilder utförs först för att fastställa den lokala förskjutningen av advected tracer partiklar (dvs., det första bilden par består av första och andra bilder, det andra paret bild består av andra och tredje bilder osv). (2) en två-stegs multipass utvärdering utförs sedan med inledande och avslutande förhör fönsterstorlekar av 256 x 256 pixlar och 128 x 128 pixlar, respektive. Slutligen, 3) makrot utför en temporal genomsnittet för att ytterligare minska uppkomsten av falska vektorer.
  3. Normaliserade median test (NMT)
    1. Från ImageJ menyn, Välj Plugins > makron > Kör... och navigera till det sparade makrot tilläggskod 3. ijjm att validera den hastighet fält via normaliserade median testet.
      Obs: Makrot fortsätter så här. 1) varje vektor i en momentan vektorfält jämförs först med sina åtta närmaste grannar att beräkna medianvärdet. (2) matrisen av kvarstående fel beräknas då som skillnaden mellan varje angränsande vektor och beräknade medianvärdet. 3) skillnaden mellan vektorn under utredning och angränsande vektor medianvärdet är sedan normaliseras av medianvärdet för residualerna. (4) Detta jämförs sedan med ett tröskelvärde (normalt, 0.2 pixlar), som kan varieras beroende på förhand kunskap om buller under bild förvärv. Slutligen, 5) en temporal genomsnittet av alla validerade momentana vektorfält utförs för att producera en sammansatt fält, eftersom detta har visat sig öka den vektor fält kvalitet24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 illustrerar PDMS vävnad phantom tillverkningsprocessen. Phantoms utformad häri är avsedda för studiet av flödet i idealized wide-necked, saccular, intrakraniella aneurysm, samt proximala förgrenade perforator artärer. Viktigt ytterligare design funktioner inkluderar 1) en gemensam reservoar som alla fartyg rinna in, för att säkerställa skuldfria vätska avstigning från phantom - annars, droplet bildandet kan uppstå på mindre fartyg verksamhetsställen; (2) en bubbelfälla, att underlätta bubbla borttagning; (3) en yttre skalmur, att säkerställa parallellismen av fartyget med horisontalplanet, samt en exakt definition av den slutliga phantom platta höjd, längd och bredd; (4) användning av en 21 G injektionsnål shank (820 µm i nominella ytterdiameter) för gjutning av perforator artären, på grund av vår skrivarens oförmåga att definiera sådana funktioner med tillräcklig trohet. Trogen återgivning av alla designfunktioner observeras i hela.

Representativa resultat av en PIV-baserade flöde karakterisering utförs med hjälp av det nuvarande protokollet presenteras i figur 3 och figur 4. Dessa studier utfördes med phantom inlopp flödesområde 100 mL/min, förvärv datahastigheter på 2 000 fps, och en temporal genomsnitt över spännvidder 0,05 s. figur 3 visar representativa bild ramar inom perforator artären, före och efter intensitet tak, samt motsvarande yta tomter av 8-bit pixel intensitetsvärden. Båda visar att intensiteten tak ökar markant topp definitionen ovan buller golvet (dvs.ökar SNR), som är avgörande för att säkerställa noggrannhet när du utför efterföljande cross-korrelation. Figur 4 visar effekterna av intensitet tak och NMT operationer på fältet velocity vektor. Markant förbättring i fältet enhetlighet observeras, vilket ytterligare betonar vikten av att maximera SNR för att minimera data dropout.

Figure 1
Figur 1 : Particle image velocimetry set-up. Tillit till en öppen källkod bildanalys och en före/postprocessing ram minskar efterfrågan på instrumenteringen för mäta tem flöden, vilket eliminerar behovet av många av de kostsamma komponenterna i typiska PIV system (t.ex., pulsade laser, synchronizer, cylindriska optik eller proprietär programvara). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : PDMS-baserade vävnad phantom tillverkningsprocessen. Bilderna illustrerar (en) en CAD-modell av neurovaskulära phantom mögel, (b) tryckta ABS mögel efter avlägsnande av stöd materialet, (c), gjutning och härdning av PDMS inom ABS mögel, (d) partiell upplösning av ABS mögel material och (e), den ifyllda PDMS phantom, med den infällda visar de slutliga dimensionerna av kritiska funktioner, liksom regionen av intresse (ROI) i perforator artären där PIV mätningarna gjordes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Effekt av intensiteten tak drift på bilden SNR. Dessa paneler Visa representativ bild ramar och den motsvarande pixeln intensitet ytan tomter inom perforator artären, (en och b) innan (c och d) efter applicering intensiteten tak drift. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Effekter av intensitet tak och NMT operationer på velocity vektor fält. Dessa paneler illustrera den representativa momentana hastighet vektorfält inom perforator artären härrör från (en) obearbetade bilddata, (b) intensitet-utjämnade data, och (c) intensitet-utjämnade data + NMT postprocessing . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Effekt av förhör fönster dimensionering på korrelation kvalitet. Optimala fönstret dimensionering uppstår när värdet för korrelationskoefficienten noll-normaliserade maximeras och standardavvikelsen är minimerat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet beskrivs häri skisserar en förenklad metod för att utföra PIV studier för att visualisera neurovaskulära flödar på fysiologiskt relevanta dimensioner och flödet villkorar in vitro. Så tjänar det till att komplettera protokoll som rapporterats av andra som har också fokus på att förenkla kvantifiering av vektorfält, men inom mycket olika sammanhang som kräver övervägande av långt större längd skalar25 eller lägre flöde priser26,27 (t.ex., atmosfäriska eller blodcirkulationens flöden), och således med en tillit till system som är oförenliga med det aktuella programmet.

De viktigaste övervägandena för ett framgångsrikt genomförande av PIV lie i minimizationen av flöde fält artefakter och maximering av bildkvalitet. Flera steg i vävnad phantom tillverkningsprocessen är kritiska till båda dessa kriterier. Till exempel är grundlig avgasning avgörande eftersom luft fångas upp inom PDMS under blandning kan leda till bubbla bildandet inom den slutliga phantom, som kan påverka både funktionen trohet och optisk klarhet. Dessutom, minimering av ytjämnhet av ABS mögel är önskvärd, eftersom PDMS gjutprocessen troget återger även de mest minuten brister (t.ex., bygga linjer, surface porer, repor), vilket resulterar i ytjämnhet i den slutliga phantom som kan minska optisk klarhet och öka risken för bead ackumulering. Även protokollet beskrivs häri har visat tillräckligt för det aktuella programmet, det finns många rapporter i litteraturen av medel för att minska sådan råhet, som bör det finnas något behov (t.ex., aceton vapor smoothing28 eller optimering av lager tjocklek och en del orientering med avseende på byggnaden riktning)29.

Parametern valet för videoinspelning är också avgörande att säkerställa ett HiFi-vektorfält. En optimal SNR uppnås vanligtvis på den högsta uppnåeliga bildhastighet som fortfarande tillåter tillräcklig pärla exponering (den maximal bildhastighet begränsas av minsta exponeringstiden). Vinst kan användas för att förstärka signalen, men detta ökar också sensor buller. Om den högsta hastigheten kan beräknas från andra flödesparametrar (t.ex., inlopp volymflöde), kan sedan en nedre gräns på krävs bildfrekvensen uppskattas med hjälp av följande förhållande30.

Equation 1(1)

Här fprovtagning är den kamera förvärv frekvensen (Hz), vmax är den högsta beräknade hastigheten (mm/s), ckalibrering är kalibrering konstant (pixel/mm) och hförhör fönster är storleken på fönstret förhör (pixlar). Dock kan mer optimala värden bestämmas med hjälp av så kallade korrelation kvalitet skattningsmetoder, såsom noll-normaliserade korrelationskoefficienten11. Den här tekniken är genomsnitten av kompletterande signaler från varje ram par först subtraheras och sedan normaliseras av standardavvikelsen för deras stödnivåer11. Om en förskjutning av den ursprungliga signalen finns, så att alla toppar och dalar matcha, kommer att tid-skiftat värdet av denna signal vara lika med ett. Omvänt, om det finns ingen förskjutning som kan justera dessa signaler, värdet kommer vara noll. Denna information ingår i ImageJ PIV utdata för varje vektor, och det kan ritas som en egen fält att kontrollera om det finns rumsliga effekter bidrar till dålig korrelation (t.ex., ojämn belysning). Korrelationskoefficienten kan också vara genomsnitt över ett fält som en övergripande uppskattning av dess kvalitet. Denna kvantitet kan slutligen också plottas mot varierande frame rates eller förhör fönsterstorlekar att bestämma en optimal. Figur 5 illustrerar resultaten från en sådan analys med en Monte Carlo-synthesized partikel fältet med förskjutningar överensstämmer med våra experimentellt uppmätta flöden (en typisk teknik för att karaktärisera korrelation kvalitet11 ). Resultaten visar att andelen förhör fönster storlek och ram bör väljas så att en partikel fältet är fördrivna av ≤ 20% av förhör fönstrets storlek per ram par att maximera korrelationskoefficienten samtidigt minimera dess variabilitet.

Även om protokollet beskrivs häri har visat tillräcklig för att tillgodose behoven hos det aktuella programmet, är det viktigt att erkänna dess begränsningar. Till exempel medan kontrast förbättring via intensitet tak erbjuder användarvänlighet genomförandet, kan transformationer av hela fördelningen av pixel stödnivåer förbättra SNR ytterligare31. På samma sätt även om korrelation-baserad spårning är väl etablerat och ger tillräcklig upplösning för att tillförlitligt uppskatta första ordningens flödesegenskaper relevanta för hemodynamik (t.ex., intra-aneurysmatisk velocity), kan andra tekniker erbjuda en högre spatial upplösning (t.ex., hybrid PIV/PTV, minsta-kvadratmetoden matchande)32,33 och därmed större precision när man överväger egenskaper som är mer känsliga för velocity fältet upplösning (t.ex. , vägg skjuvspänning, i-plane vorticity). Likaså medan NMT ger en möjlighet för att förbättra hastighet vektor fältet efter cross-korrelation, är det viktigt att betona att detta är bara en av många vektor validering tekniker som kan vara används24,34, alla med sina egna unika fördelar och nackdelar som kan göra användningen mer lämpade för applikationer utöver dem som beskrivs här. Slutligen, medan den experimentella set-up som beskrivs här försöker efterlikna fysiologiskt relevanta flöden och längd skalor för neurovasculature, det tillåter för närvarande inte analysen av pulserande flöden. Detta har inte varit en begränsning för det aktuella programmet, sedan utbud av Västerås siffrorna i mycket av neurovasculature tenderar att vara ≤ 1 (dvs.det finns en minimal tilläggseffekterna vid flera hjärt cykler)35, som tyder på att steady-state-förhållandena är tillräckliga för att sammanfatta diskret tidpunkter längs hjärt vågformen där flödet är jämförbara. Dock för tillämpningar där antalet Västerås är större (t.ex., vaskulatur närmare till hjärtat), vi ser framför oss en potential för att införa infusionsprotokoll med hjälp av en Arduino, som kunde användas för att skicka pumpen en tidsvarierande PWM spänning vågform som kan härma en hjärtats flöde profil36,37,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att deklarera.

Acknowledgements

Författarna erkänner delvis stöd för detta projekt som tillhandahålls av Collaborative utsäde bidrag från Office of Research och ekonomisk utveckling på UC Riverside.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211, (1), 55-76 (1997).
  2. Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9, (17), 2551 (2009).
  3. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
  4. Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73, (11), 1983-1992 (2009).
  5. Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23, (11), (2013).
  6. Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104, (4), 448-454 (2001).
  7. Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25, (3), 460-469 (1997).
  8. Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
  9. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  10. Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42, (2), 225-240 (2007).
  11. Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. Springer. New York, NY. (2007).
  12. Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74, (3), 321-334 (2014).
  13. Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30, (6), 768-777 (2002).
  14. Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37, (7), 1310-1321 (2009).
  15. Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19, (1), 117-122 (1964).
  16. Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370, (1), 25-29 (1977).
  17. Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26, (3), 329-332 (1934).
  18. Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
  19. Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9, (12), 113762 (2014).
  20. Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134, (8), 084505 (2012).
  21. Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46, (6), 841-848 (2018).
  22. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, (3), 035017 (2014).
  23. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75, (23), 6544-6554 (2003).
  24. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122, (2), 285 (2000).
  25. Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. (2006).
  26. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27, (5), 414-419 (1999).
  27. Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10, (2), 153-167 (2008).
  28. Kuo, C. -C., Mao, R. -C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31, (8), 1113-1118 (2016).
  29. Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12, (1), 014105 (2018).
  30. Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79, (1), 51-60 (2000).
  31. Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39, (32), 5978-5990 (2000).
  32. Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22, (3), 199-211 (1997).
  33. Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14, (3), 175-187 (1985).
  34. Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8, (12), 1493-1501 (1997).
  35. Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191, (1), 63-78 (1998).
  36. Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
  37. Tsai, W., Savaş, Ö Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (2), 197-201 (2010).
  38. Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23, (8), 1346-1351 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics