Meso-גודל החלקיקים תמונה Velocimetry מחקרים של נוירו-וסקולריים זורם במבחנה

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מציגים שיטות מפושטת בדיית שקוף נוירו-וסקולריים פאנטום ואפיון הזרימה בו. עלינו להדגיש מספר פרמטרים חשובים, להדגים את הקשר שדה דיוק.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Velocimetry תמונה של חלקיקים (PIV) משמש במגוון רחב של תחומים, בגלל ההזדמנות שהיא מספקת בדיוק להמחיש וכימות זורם על פני טווח זמן-מרחבי גדול. עם זאת, יישומה בדרך כלל דורש השימוש במכשור מיוחד ויקר, אשר מגביל את השירות שלה רחב יותר. יתר על כן, בתוך השדה של בביו-הנדסה, במבחנה זרימה ויזואליזציה מחקרים הם לעתים קרובות גם נוסף מוגבל על-ידי העלות הגבוהה של רקמות מסחרית מתוצרת פאנטום זה מסכם את הדברים הרצויים מבנים אנטומיים, במיוחד עבור אלה אשר להקיף את המשטר mesoscale (כלומר, submillimeter כדי פיסיקליות מילימטר). במסמך זה, אנו מציגים את פרוטוקול נסיוני פשוטה שפותחה כדי לטפל מגבלות אלו, אשר המרכיבים העיקריים של כלול 1) שיטה יחסית נמוכים עבור בדיית mesoscale רקמות פאנטום באמצעות הדפסה תלת-ממדית, יציקת סיליקון, ו- 2) ניתוח פתוח תמונה ומסגרת עיבוד המפחיתה את דרישה המכשור למדידת זרמי mesoscale (כלומר, מהירויות עד עשרות מילימטרים/שניה). באופן קולקטיבי, שילוב זה מפחית את חסם כניסה עבור nonexperts, על-ידי מינוף המשאבים כבר לרשותם של חוקרים רבים בביו-הנדסה. אנחנו אחת הישימות של פרוטוקול זה בהקשר של נוירו-וסקולריים זרימה אפיון; עם זאת, הוא צפוי להיות רלוונטי מגוון רחב יותר של יישומים mesoscale בביו-הנדסה ומעבר.

Introduction

PIV הוא בשימוש נרחב ב מכניקת הזורמים ניסיוני הדמיית זרימה וחקירות כמותית של נוזלים משתנים בקנה מידה אורך מן האטמוספירה זורם microcirculatory1,2,3. בעוד הפרטים של יישומה יכול להשתנות באותו האופן כמו היישומים שלה, היבט אחד משותף כמעט כל הלימודים PIV הוא השימוש של הסרטונים הדמיה של חלקיקים מעקב נזרע בתוך הנוזל לעבוד, ואחריו ניתוח pair-wise של מסגרות תמונה רצופים כדי לחלץ את מאפייני הזרימה הרצויה. בדרך כלל, זו מושגת על ידי הראשון סוגייה משפטית כל מסגרת התמונה לאזורים קטנים יותר כינה החקירה windows. כתוצאה מכך העמדות אקראי של החלקיקים התפזרו, כל חלון החקירה מכיל בהתפלגות ייחודי של פיקסל עוצמות. אם קצב רכישת חלון וגודל נתוני נבחרו כראוי, קרוס-המתאם של האות בעוצמה בכל חלון ניתן להעריך העקירה הממוצע באזור הזה. בסופו של דבר, בהתחשב בכך רמת ההגדלה ואת קצב מסגרות ידועים פרמטרים ניסיוני, שדה וקטורי המהירות מיידי יכול להיות בקלות מחושב.

יתרון גדול של PIV על טכניקות מדידה נקודה אחת היא היכולת שלה מיפוי שדות וקטוריים על פני שני - או תלת ממדית תחום. יישומים והמודינמיקה, בפרט, שיפרו את מצבן של יכולת זו, שכן הוא מאפשר חקירה יסודית של תזרימי המקומי, אשר ידועים לשחק תפקיד משמעותי מחלת כלי דם או שיפוץ (למשל, טרשת עורקים, אנגיוגנזה) 4 , 5 , 6. זה גם היה נכון על ההערכה של נוירו-וסקולריים תזרימי, ויכול האינטראקציות שלו עם מכשירים endovascular (למשל, זרימה diverters, סטנטים, סלילי intrasaccular), מאז הרלוונטיות-פיסיקליות ביישומים כאלה לעיתים קרובות להקיף פעם אחת או יותר סדרי גודל (למשל, מ מיקרומטר כדי מילימטר), התקן גאומטריה, השמה יכולה להשפיע באופן משמעותי את מכניקת הזורמים מקומיים7.

רוב הקבוצות מבוססת-PIV מחקרים והמודינמיקה צריכים לסמוך על set-ups ניסיוניים המחקים חלק החקירות המוקדם של סטנט השפעה על זרימת הדם7,8מקרוב. בדרך כלל, אלה כוללים) פעמו לייזרים ומצלמות מהירות גבוהה, כדי ללכוד זורם במהירות גבוהה; b) המסנכרנים, כדי למנוע החלקה בין תדירות הדופק לייזר את קצב המסגרות של רכישת המצלמה; ג) אופטיקה גלילי, כדי ליצור גיליון אור, לפיכך, למזער את רקע זריחה של חלקיקים מעקב מעל ומתחת המטוס החקירה; ד) במקרה של מערכות מפתח הפעלה מסחריות, חבילות תוכנה קניינית, כדי לבצע את ניתוח קרוס-המתאם. עם זאת, בעוד חלק מהיישומים מחייבים את הביצועים ו/או רב-תכליתיות קולקטיבי המוענקת על ידי רכיבים אלה, ורבים אחרים עושים לא. יתר על כן, העלות הגבוהה של רקמות מסחרית מתוצרת פאנטום זה מסכם את הדברים הרצויים מבנים כלי הדם יכול להוכיח גם הגבלת למחקרים רבים במבחנה , במיוחד עבור מטוסי פאנטום עם כולל את הגשר הזה, המשטר mesoscale (> 500 USD / פנטום). במסמך זה, אנחנו מדווחים על התפתחות פרוטוקול פשוטה ליישום PIV עבור הפריט במבחנה החזותי של נוירו-וסקולריים תזרימי, אשר בדרך כלל שקר שניהם במרחב ובתוך חנותם המשטר mesoscale (קרי, פיסיקליות החל מ submillimeter מ מ, מהירויות עד עשרות מילימטרים/שניה). הפרוטוקול שואפת למנף את המשאבים כבר לרשותם של חוקרים רבים בביו-הנדסה, ובכך להקטין את חסם כניסה עבור nonexperts.

הרכיב הראשון של פרוטוקול זה כרוכה בשימוש שיטת הליהוק השקעות כדי לאפשר הזיוף שבאתר של שקוף, polydimethylsiloxane (PDMS)-מבוסס רקמות מטוסי פאנטום מטייסת מודפס ממד 3 תבניות ההקרבה. באמצעות מינוף הזמינות הגוברת של מדפסות תלת-ממדי בשנים האחרונות, במיוחד אלה במתקנים משותפים/מולטי-משתמש (למשל, מתקנים מוסדיים או makerspaces ציבורית), מתודולוגיה זו חותך בעלויות באופן משמעותי (למשל, < USD 100/פנטום בתיק המוצגים כאן), תוך מתן אפשרות של תגובה מהיר להרכבת מגוון רחב של עיצובים וגיאומטריה. בפרוטוקול הנוכחי, תצהיר מאוחה מידול מערכת עם styrene טבעי בוטאדיאן (ABS) משמש חומרי הבנייה, והוא החלק המודפס משמש תבנית ההקרבה לליהוק פנטום עוקבות. הנסיון מראה כי ABS הוא מתאים היטב עבור שימוש כזה מאז הוא מסיס ממיסים משותף (למשל, אצטון), וזה מספיק חוזק, קשיחות כדי לשמור על שלמות עובש לאחר הסרת החומר תמיכה (למשל, למנוע את דפורמציה או שבר של תכונות עובש זעיר). בפרוטוקול הנוכחי, עובש תקינות נוספות מובטחת באמצעות דגמים מודפסים מוצק, למרות שזה בא על חשבון זמן פירוק מוגבר. השימוש של מודלים חלול ייתכן גם במקרים מסוימים, כדי לשפר את הגישה הממס, ובכך גם להפחית זמן פירוק. עם זאת, זהיר להתחשב על אפקט זה ייתכן יושרה עובש. לבסוף, בעוד הרוחות מפוברק, והאירועים מתבססת על ייצוגים אידאלית של מבנים נוירו-וסקולריים שנוצר באמצעות חבילת תוכנה נפוצה של תכנון בעזרת מחשב (CAD), הפרוטוקול צפוי להיות מקובל הזיוף של מורכבות יותר , החולה הספציפי גיאומטריות כמו גם (למשל, באמצעות השימוש של מודל קבצים שנוצרו על-ידי ההמרה של נתונים קליניים הדמיה. STL תבנית קובץ בשימוש על ידי רוב מדפסות תלת-ממדי). פרטים נוספים על תהליך ייצור דמה ניתנים בסעיף 2 של הפרוטוקול.

הרכיב השני של הפרוטוקול כרוכה בשימוש פתוח התוספת עבור ImageJ לנהל את הצלב-המתאם ניתוחים9. זה זה משולב עם היישום של ערכת סף סטטיסטית פשוטה (קרי, עוצמת מיצוי)10 כדי לשפר את האות התמונה לפני הצלב-קורלציה, כמו גם ערכת אימות וקטור postcorrelation, מנורמל בדיקת חציון (nmt ב), כדי לחסל וקטורים כדין דרך השוואה של כל השכנים הקרובה שלה11. באופן קולקטיבי, הדבר מאפשר הדמיה להתבצע באמצעות ציוד מתמקמות במעבדות בביו-הנדסה רבים, ובכך מבטל את הצורך עבור רכישת רבים של רכיבי מערכות PIV טיפוסי (למשל, לייזר פעמו, יקר מסנכרן אופטיקה גלילי, תוכנה קניינית). פרטים נוספים על אוסף הווידאו, עיבוד תמונה, ניתוח נתונים ניתנים בסעיפים 5 ו- 6 של הפרוטוקול.

איור 1 מדגימה את הסידור PIV בשימוש פרוטוקול זה, אשר נשענת על מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד with a מצלמה במהירות גבוהה עבור הדמיה, כמו גם חיצוני, רציף מקור אור לבן (כלומר, מטאל-הליד) עבור תאורה הנפחי דרך המטרה. משאבה מהירות משתנה הציוד משמש להטיל את הזרימה recirculating של פתרון שקוף דם מדומה דרך הרוחות רקמות נוירו-וסקולריים. הפתרון מורכב תערובת מתקפל 60: 40 של יונים גליצרול, המהווה תחליף נפוץ עבור דם והמודינמיקה מחקרים12,13,14, בשל ומים (DI)) שלה צפיפות, צמיגות (כלומר, דומה 1,080 kg/m3 ו cP 3.5 לעומת 1,050 kg/m3 ו- 3-5 cP לדם)15,16; b) שקיפותו בטווח גלוי; ג) שלה דומה מקדם שבירה כמו PDMS (1.38 אינץ לעומת 1.42 עבור PDMS)17,18,19,20, אשר מצמצם את עיוות אופטי; ד) הקלות שבה שיוכל התנהגות לא-ניוטונים, במידת הצורך, באמצעות התוספת של xanthane21. לבסוף, חרוזי פוליסטירן פלורסנט משמשים חלקיקים מעקב (מיקרומטר 10.3 בקוטר; 480 ננומטר/501 nm עירור/פליטה). בעוד חרוזים נייטרליים קליל הם הרצויה, לחיזוי מעקב חלקיקים עם אופטימלית תכונות מכניות נוזלים (למשל, צפיפות, גודל, קומפוזיציה) ואת פליטת הגל יכול להוכיח מאתגר. לדוגמה, החרוזים הסעיפים הם מעט פחות צפוף מאשר הפתרון גליצרול (1,050 kg/m3 לעומת 1,080 kg/m3). עם זאת, ההשפעות hydrodynamic, ממנו הם זניחים, בהתחשב בכך משך ניסוי טיפוסי הוא קצר יותר ציר הזמן המשויכת ציפה אפקטים (כלומר, 5 דקות, 20 דקות, בהתאמה). עוד פרטים בנוגע דם מדומה פתרון ניסוח ו במבחנה מערכת הדם קביעת ניתנים בסעיפים 3 ו- 4 של הפרוטוקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור ABS המבוסס על תבנית ההקרבה

  1. עיצוב דגם ההופכי של הפאנטום הרקמה הרצויה באמצעות תוכנות CAD.
  2. הדפס את הדגם בעזרת מדפסת תלת-ממדי עם ABS כמו חומרי הבנייה.

2. PDMS המבוססת על ייצור דמה כלי דם

  1. ערבוב
    1. לערבב את הבסיס prepolymer PDMS ואת הסוכן ריפוי על יחס 10:1 (לפי משקל); תערובת 66 g מספק חומר מספיק עבור הזיוף של פאנטום עם אמצעי אחסון עד 50 ס מ3.
    2. מקם את התערובת desiccator ואקום במשך 60 דקות דגה ולצמצם את מלכודת בועות. השתמש לחץ ציקלי/לחצים כדי להקל על קרע בועה.
  2. הליהוק
    1. הר כייר ABS המודפס על משטח זכוכית באמצעות דבק פלסטיק כדי לאטום את הממשק.
    2. בזהירות שופכים את התערובת PDMS לתבנית בעת ניסיון למזער את מלכודת בועות. בועות משתרכים יכול להיות ידני נקרע באמצעות מחט.
    3. לרפא את הפאנטום יצוקה בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך לפחות 24 שעות.
      הערה: בטמפרטורות גבוהות יותר, תהליך זה יכול להיות מואצת22.
  3. Demolding
    1. להמיס את שרירי הבטן על ידי השוקע הפאנטום של אצטון sonicating למשך 15 דקות לפחות, באמצעות כוחות עד 70 W.
      התראה: אצטון יש לחץ אדים בטמפרטורת החדר, נקודת הבזק נמוכה. כתוצאה מכך, תמיד לעבוד תחת ברדס fume מן המקורות האפשריים. להצתה. ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (למשל, משקפי מגן או הפנים מגן, חלוק המעבדה, כפפות עמידים אצטון).
    2. שטפים היטב את הפאנטום עם אלכוהול איזופרופיל, אז די מים כדי להסיר שאריות ממס.
      הערה: PDMS מתנפח בתגובה לחשיפה אצטון; עם זאת, הנפיחות שוככת, ברגע הפאנטום שוטפים ומייבשים מספיק23.
  4. אישור של אמינות פנטום באמצעות מיקרוסקופ אופטי
    1. שימוש במיקרוסקופ אופטי עם המצלמה המצורפת, תוכנה ללכידת תמונות, תלכוד תמונה של תכונה קריטית בתוך הפאנטום תחת הגדלה שימקסם את התכונה בתוך שדה הראייה.
    2. ללכוד את התמונה של כיול המתאים reticle על ההגדלה אותו.
    3. לטעון גם תמונות לתוך ImageJ על-ידי גרירתם על הכלים.
    4. לחצו על התמונה reticle כיול כדי להפוך אותה לפעילה, ולאחר מכן, בחר בכלי קו . באמצעות העכבר, ציירו קו לאורך תכונה של מרחק ידוע ו בחר נתח > קנה מידה מוגדר ' מתפריט ' ImageJ.
      הערה: בחלון ' קבע קנה מידה ', השדה עם התווית מרחק בפיקסלים צריך ניתן לאכלס מראש עם האורך של קו שצויר ביחידות של פיקסלים.
    5. להזין את האורך של התכונה בשדה הנקרא מרחק ידועויחידת שלה בשדה הנקרא אורך של יחידה. סמן את התיבה עם התווית עולמי להחלת גורם כיול זה כל התמונות פתוח.
    6. להפוך את התמונה של התכונה קריטי הפאנטום פעיל, השתמש בכלי שורת כדי לצייר קו לאורך תכונה של עניין. מתפריט ' ImageJ ', בחר נתח > מדד (או הקש Ctrl + M) כדי למדוד את האורך של הקו.
    7. השווה את הערך צפוי נגד הערך בעמודה מסומן אורך בחלון תוצאות לאשר נאמנות פנטום.

3. ללעוג ניסוח פתרון דם

  1. מערבבים DI מים והגליצרול על יחס מתקפל 60: 40 (לפי נפח).
    הערה: אמצעי אחסון 100 מ ל זה מספיק עבור במבחנה מערכת הדם כפי שיתואר בהמשך.
  2. להוסיף 1 מ"ל של 2.5% פתרון של פלורסנט חרוז פוליסטירן w/v (קרי, מעקב חלקיקים) הפתרון דם מדומה.
  3. Homogenize את התערובת על צלחת מגנטית stir ב 400 סל ד למשך 10 דקות.

4. הגדרת מערכת הדם במבחנה

  1. משאבה הקמה
    1. להשתמש בכלי חשפנית תיל לנתק את התקע DC-end ממקור חשמל מתאם AC-זרם ישר.
    2. להפשיט את ציפוי לו את החשמל, קרקע חוטי ולהתחבר אותם הטרמינל קלט וסת המתח החשמלי אפנון (PWM) רוחב פולס.
    3. לחבר את חוטי חשמל ועפר מן מנוע DC של המשאבה הטרמינל פלט וסת המתח החשמלי PWM.
      הערה: הצג 7-קטע של PWM פלטי את המחזור (0% - 100%) המשמש להשגת מתח משתנה כדי מנוע DC.
  2. משאבה כיול
    1. להכין 200 מ של דם מדומה פתרון (ראו סעיף 3).
    2. מקום לצנרת מן הים משאבת כשהספל מחזיק את הפתרון דם מדומה.
    3. במקום אבובים מהשפך משאבת גביע ריק.
    4. בחר נקודה ערכת מחזור חובה הרצוי (0% - 100%). לחץ על הלחצן על ולהתחיל שעון עצר.
    5. לעצור את שעון העצר, ברגע המשאבה העבירה את כל נפח דם מדומה פתרון. תנצל את הזמן כדי לחשב את ספיקה.
    6. חזור על שלבים 4.2.1 - 4.2.5 נקודות לפחות חמישה חובה שונים מחזור סט להקים עיקול רגרסיה ריבועים.
      הערה: מומלץ מינימום של שלוש נקודות שכפל לכל מחזור החובה שנקבעה מראש. קשר זה יכול לשמש כדי להתאים את קצב הזרימה הרצויה מחזור חיים PWM הנדרש.

5. אוסף הווידאו

  1. כיול תמונה
    1. לקבוע את יחס כיול ההדמיה וידאו (ראה סעיף 2).
  2. הגדרת המנגנון.
    1. במקום הפאנטום PDMS על השלב של המיקרוסקופ זריחה.
    2. התחבר הפאנטום הילוך המשאבה, להציג את הפתרון דם מדומה.
      הערה: לחלופין, prefill המודל עם אתנול כדי להקל על מלא להרטיב; לאחר מכן, לשטוף ולמלא את זה עם הפתרון דם מדומה. זה עשוי להיות מועיל במיוחד עבור דגמים עם כלי שיט קטנים יותר ו/או תכונות עיוור...
    3. להגדיר את בקר מנוע המשאבה עבור קצב הזרימה הרצויה בהתבסס על עקומת כיול משאבות.
    4. להפעיל את המשאבה למשך 1-5 דקות לפני הניסוי כדי להבטיח תנאים מצב יציב.
    5. הפעל את המנורה חיצוני כדי להאיר את שדה הראיה. בחר מסנן המתאים בהתבסס על אורך הגל עירור של חרוזים פלורסנט.
    6. להתאים את המטוס מוקד הדמיה כדי midplane כלי השיט.
      הערה: זו יכולה להיות מושגת באמצעות אורך מוקד שימקסם את חתך הרוחב כלי הדמיה (למשל, בעת השימוש פאנטום עם כלי עגול חתכי רוחב); ו/או יצירת אינדקס מחוץ תכונה פנטום שנועדה להקל על הזיהוי של המשטח האמצעי כלי.
  3. הקלטת וידאו
    1. בחר את הפרמטרים הקלטת וידאו כדי למטב את יחס אות לרעש (SNR). פרמטרים מרכזיים כוללים את זמן החשיפה, קצב מסגרות, ולהשיג.
      הערה: ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים קצב 2,000 fps רווח של 1.0. עם זאת, פרמטרים אלה עשויות להשתנות בהתבסס על היישום (עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים).
    2. לאסוף את הווידאו ולשמור אותו בפורמט AVI.
  4. פנטום לנקות
    1. אם לאונרד-חרוז נצפית לאחר ניסוי, sonicate הפאנטום בתמיסה המימית דטרגנט באמצעות כוחות עד 70 W.

6. תמונה עיבוד וניתוח נתונים

  1. התמונה preprocessing
    1. גרור את הקובץ AVI השמור אל החלון ImageJ כדי לייבא אותו. בחר בתיבה המסומנת המר לגווני אפור.
    2. מתפריט ' ImageJ ', בחר נתח > ליצור היסטוגרמה (או הקש Ctrl + H) כדי ליצור היסטוגרמה של התמונה פיקסל עוצמות. שימו וסטיית עבור התמונה לא מעובד.
      הערה: במחירים מסגרת גבוהה, זה לא יוצא דופן עבור ההתפלגות להיות מוטה בכבדות לכיוון האפס (קרי, אין קליטה).
    3. מתפריט ' ImageJ ', בחר תמונה > התאם > בהירות וחדות (או הקש Shift + Ctrl + H) כדי להחיל מסנן בהירות/חדות.
    4. בתפריט הבהירות והניגודיות , לחץ על לחצן הגדר כדי להגדיר את גבולות התמונה. הגדר את הערך המינימלי להיות את הערך הממוצע בתוספת סטיית תקן אחת, הערך המרבי להיות העוצמה המקסימלית של התמונה (שניהם מבוסס על סטטיסטיקה שהושג בשלב 6.1.2).
      הערה: זה בדרך כלל מבטל הכל חוץ-10% העליונים של עוצמות פיקסל. מספר סטיות תקן יכול להיות מגוונים בהתאם להתפלגות הרצוי של עוצמות פיקסל. קובץ script מותאם אישית מאקרו לביצוע עוצמת מיצוי מבצע ניתנת תוספת חומרים.
    5. מתפריט ' ImageJ ', בחר תהליך > רעש > Despeckle כדי להפחית את מספר הפיקסלים רוויים.
      הערה: פעולה זו והמפותל מאת הפוטנציאל מוגברת פיקסל רוויה לאורך אופטימיזציה של הבהירות והחדות, אשר ניתן להפיק וקטורים כדין במהלך צלב עוקבות-המתאם.
    6. מתפריט ' ImageJ ', בחר תהליך > מסננים > Gaussian Blur עם רדיוס של 1.5 להפחית לכלוכים הנובעים הסרת פיקסלים מואר בשכונה 3 x 3 מפעם לפעם על ידי ראש המנזר despeckling מבצע.
    7. לחץ על הכלי מצולע ולאחר מכן, לחץ על התמונה כדי לחלק לרמות את האזור של הריבית (ROI).
    8. מתפריט ' ImageJ ', בחר עריכה > ברור בחוץ כדי להסיר חיישן רעש במקומות איפה אין אות צפוי (למשל, אזורים מגבולות קיר הספינה), אשר יכול להפחית את SNR הכללית.
  2. חישוב PIV
    הערה: חלק זה של הפרוטוקול מעסיקה PIV חיצוני של יישום plug-in עבור ImageJ, אשר נשענת על שיא-התאמה לפי עקומת גאוס כדי לאפשר הערכה של עקירה עם subpixel דיוק.
    1. מתפריט ' ImageJ ', בחר תוספים > פקודות מאקרו > הפעל. ונווט אל המאקרו שנשמרו קוד משלים 2 ijjm לתאם בין צמדי תמונות רצופות.
      הערה: המאקרו ממשיך כדלקמן. 1) צלב-מתאם של עוצמת השדה בתוך תמונות רצופות מתבצע קודם כדי לקבוע העקירה המקומי של חלקיקים מעקב advected (כלומר, התמונה הראשונה זוג מורכב התמונות הראשון והשני, הזוג השני תמונה מכיל השני והשלישי תמונות, וכו '). 2) הערכה מולטי שני שלבים ואז מתבצע באמצעות חקירה התחלתי וסופי מידות החלון של 256x256 פיקסלים, 128x128 פיקסלים, בהתאמה. לבסוף, 3) המאקרו מבצע ממוצע הטמפורלי כדי לצמצם עוד יותר את המראה של וקטורים כדין.
  3. מבחן מנורמל החציוני (nmt)
    1. מתפריט ' ImageJ ', בחר תוספים > פקודות מאקרו > הפעל. ונווט אל המאקרו שנשמרו קוד משלים 3 ijjm כדי לאמת את מהירות שדות באמצעות הבדיקה החציוני מנורמל.
      הערה: המאקרו ממשיך כדלקמן. 1) כל וקטור ב שדה וקטורי מיידי קודם לעומת שכנותיה הקרוב שמונה לחישוב הערך החציוני. 2) מערך של שגיאות שיורית לאחר מכן מחושב כהפרש בין כל וקטור שכנות החציון מחושב. 3) ההבדל בין הווקטור תחת חקירה הערך החציוני וקטור השכן ואז מנורמל מאת החציון של שנשאר משהו. 4) זה ואז לעומת ערך סף (בדרך כלל, 0.2 פיקסלים), אשר יכולים להיות מגוונים בהתבסס על ידע אפריורי של רעש במהלך רכישת התמונה. לבסוף, 5) ממוצע הטמפורלי של כל השדות המאומת וקטור מיידי מבוצעת כדי לייצר שדה ללא הפרדות צבע, כמו זה הוכח להגדיל את שדה וקטורי באיכות24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 מדגים את תהליך ייצור דמה רקמות PDMS. הפאנטום תוכנן בזאת מיועדים לחקר זרימה אידאלית מפרצות צוואר רחב, saccular, תוך גולגולתי, כמו גם צינתור העורקים מנקב מסעף. נושא נוסף חשוב כולל 1) מאגר משותף המתנקזים אל, כל כלי כדי להבטיח מכבידות נוזלים יציאה מן הרוח - אחרת, היווצרות droplet שעשויים להופיע שקעים כלי קטן יותר; 2) מלכודת בועות, כדי להקל על הסרת בועה; 3) חלל הקיר החיצוני, כדי להבטיח ההקבלה של כלי השיט במישור האופקי, כמו גם הגדרה מדויקת של לוח הסופית הפנטום גובה, אורך, רוחב; 4) השימוש של סכין תת-עוריות 21 G (820 מיקרומטר קוטרו החיצוני הנומינלית) עבור המכייר של העורק מנקב, בשל חוסר יכולת של המדפסת שלנו כדי להגדיר תכונות כגון עם נאמנות מספקת. רבייה נאמן של כל תכונות העיצוב הוא ציין בכל רחבי.

התוצאות נציג של אפיון זרם המבוססת על PIV שבוצעה באמצעות פרוטוקול הנוכחי מוצגים באיור 3 ו- 4 איור. מחקרים אלה בוצעו באמצעות כניסת פנטום שיעורי זרימה של 100 מ ל/דקה, שיעורי רכישת נתונים של 2,000 fps, ומראה טמפורלית בממוצע מעל משתרע של 0.05 ש איור 3 מסגרות תמונה ייצוגית בתוך העורק מנקב, לפני ואחרי מיצוי בעוצמה, כמו גם חלקות משטח התואם ערכי העוצמה של 8 סיביות פיקסל. שניהם מדגימים כי עוצמת מיצוי מגביר באופן משמעותי את ההגדרה שיא מעל רצפת הרעש (קרי, מגביר SNR), אשר חיוני להבטחת דיוק בעת ביצוע הצלב עוקבות-קורלציה. איור 4 מציג את ההשפעות של עוצמת מיצוי ופעולות nmt על המגרש וקטור מהירות. שיפור ניכר ב שדה אחידות הוא ציין, וכך נוסף המלמד את חשיבות למקסם את SNR כדי למזער את נתוני הנשירה.

Figure 1
איור 1 : חלקיק תמונה הגדרת velocimetry. הסתמכות על ניתוח פתוח תמונה ומסגרת טרום/postprocessing מפחית את דרישה המכשור למדידת זורם mesoscale, ובכך מבטל את הצורך עבור רבים של רכיבי מערכות PIV טיפוסי (למשל, פעמו יקר לייזר, מסנכרן, אופטיקה גלילי, ו/או תוכנה קניינית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תהליך ייצור דמה רקמות מבוסס PDMS. הדימויים ממחישים () דגם CAD של נוירו-וסקולריים פנטום כייר, (b) שרירי הבטן המודפס עובש לאחר הסרת החומר תמיכה, (ג) הליהוק וריפוי של PDMS בתוך כייר ABS, פירוק חלקי (d) ABS עובש החומריים (e) הפאנטום, עם שיבוץ מציג המידות הסופיות של תכונות קריטיות, כמו גם האזור של הריבית (ROI) בעורק מנקב שבו נעשו המדידות PIV הושלמה PDMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : השפעת עוצמת מיצוי מבצע על התמונה SNR. אלה מראות מסגרות תמונה ייצוגית, פיקסל התואם את עוצמת חלקות משטח בתוך מנקב עורק, ( b) לפני ו (c ו- d) לאחר החלת את עוצמת מיצוי מבצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : השפעות אינטנסיביות מיצוי ופעולות nmt על מהירות וקטור שדות. הלוחות הללו ממחישות את השדה וקטור מהירות מיידי נציג בתוך העורק מנקב נגזר () לא מעובדת נתוני תמונה, נתונים הכתיר בעוצמה (b), ו (ג) הכתיר בעוצמה נתונים + nmt ב postprocessing . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : ההשפעה של שינוי גודל חלון החקירה על איכות המתאם. שינוי גודל החלון האופטימלי מתרחשת כאשר הערך של מקדם המתאם מנורמל אפס מוגדל, סטיית התקן הוא ממוזער. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המפורטים להלן מתאר שיטה פשוטה לביצוע מחקרים PIV להמחיש נוירו-וסקולריים זורם המימדים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, תנאי זרימה בתוך חוץ גופית. בעשותו כן, הוא משמש כדי להשלים פרוטוקולים שדווחו על-ידי אחרים גם התמקדו פישוט כימות של שדות וקטוריים, אך בתוך בהקשרים שונים הדורשים שהשיקול של אורך גדול יותר קשקשים25 או זרימה נמוכה יותר שיעורי26,27 (למשל, זורם עם אווירה או microcirculatory), לפיכך, ועם מהסתמכות תוכניות שאינן תואמות היישום הנוכחי.

השיקולים החשובים ביותר עבור יישום מוצלח של PIV נעוץ צמצום של חפצים שדה הזרימה ומקסימום של איכות תמונה. מספר שלבים בתהליך ייצור דמה רקמות הם קריטיים כדי שני קריטריונים אלה. לדוגמה, degassing יסודי חיוני כיוון אוויר entrained בתוך PDMS במהלך ערבוב יכול להוביל היווצרות בועה בתוך הפאנטום האחרון, אשר עלולה להשפיע לרעה הן תכונה על אמינותה ועל בהירותה אופטי. בנוסף, וצמצום של חספוס פני שטח התבנית ABS היא הרצויה, מאז תהליך הליהוק PDMS מוליד בנאמנות פגמים אפילו הכי דקה (למשל, לבנות קווי, נקבוביות המשטח, שריטות), ובעקבותיה חספוס פני השטח ב הפנטום האחרון שיכול להקטין את בהירות אופטית ולהגביר את הפוטנציאל להצטברות חרוז. בעוד הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוכיח מספיק עבור היישום הנוכחי, ישנם דיווחים רבים בספרות של אמצעי הפחתת החספוס כזה, שיהיה צורך (למשל, אדי אצטון החלקת28 או אופטימיזציה של עובי השכבה וכיוון חלק ביחס לכיוון בניין)29.

הבחירה פרמטר עבור לכידת וידאו הוא גם להבטחת שדה וקטורי באיכות גבוהה. SNR האופטימלית מושגת בדרך כלל על שיעור הגבוה ביותר השגה מסגרת המאפשרת עדיין חרוז מספיק חשיפה (שער המסגרת המקסימלי מוגבלים בזמן חשיפה מינימלית). רווח יכול לשמש כדי להיקלט, אבל זה גם מגביר חיישן רעש. אם מהירות מקסימלית יכול להיות מוערך מן מפרמטרי הזרם אחרים (למשל, כניסת ספיקה), ואז מאוגד התחתונה על שער מסגרת נדרשת יכול להיות מוערך באמצעות יחס הבאות30.

Equation 1(1)

כאן, fהדגימה הוא קצב רכישת המצלמה (Hz) vמקסימום מהירות מקסימלית הצפוי (מ מ/s), cהכיול היא-ה קבוע (פיקסלים/מ מ), ואת כיולהחקירה חלון הוא הגודל של חלון החקירה (פיקסלים). עם זאת, יותר ערכים אופטימלית יכול להיקבע תוך שימוש בטכניקות הערכה איכות המתאם כביכול, כגון מנורמל אפס מקדם המתאם11. בטכניקה זו, הממוצעים של אותות משלימים כל זוג מסגרת ראשית המופחת, מנורמל, על ידי סטיית התקן של עוצמות שלהם11. אם קיימת תזוזה של האות המקורי, כך כל פסגות ועמקים תואמים, הערך בזמן עבר של האות הזה יהיה שווה לאחד. לעומת זאת, אם אין תזוזה זה יכול ליישר את האותות האלה, הערך יהיה אפס. מידע זה נכלל בפלט ImageJ PIV עבור כל וקטור, ואת זה ניתן להתוות כשדה משלו כדי לבדוק אם קיימים אפקטים מרחביים לתרום המתאם המסכן (למשל, תאורה לא אחידה). מקדם המתאם יכול גם להיות בממוצע שדה כהערכה הכוללת באיכות שלו. לבסוף, כמות זו ייתכן גם ניתן להתוות נגד קצב תמונות שונות או חקירה מידות החלון כדי לקבוע של אופטימום. איור 5 ממחיש את התוצאות של ניתוח כזה באמצעות שדה מונטה קרלו-מסונתז חלקיקים עם displacements בקנה אחד עם שלנו זורמת השפעול נמדד (טכניקה אופיינית עבור אפיון איכות המתאם11 ). התוצאות מציגות גודל חלון וקצב המסגרות החקירה צריכה להיבחר כך שדה חלקיק הוא שנעקרו על ידי ≤ 20% של גודל חלון חקירה לכל זוג מסגרת על מנת למקסם את מקדם המתאם תוך מזעור ההשתנות שלה.

אף על פי הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוכיח מספיקים כדי לענות על הצרכים של היישום הנוכחי, חשוב להכיר את מגבלותיו. לדוגמה, בעוד חדות שיפור דרך עוצמת מיצוי מציעה להקל על יישום, העתקות של חלוקת פיקסל עוצמות כולו עשוי לשפר SNR נוספת31. באופן דומה, למרות מעקב מבוססת קורלציה מבוססת היטב מספק רזולוציה מספיק אמינה להערכת מאפייני הזרימה מסדר ראשון רלוונטי ספיקת הדם (למשל, מהירות אינטרה-aneurysmal), טכניקות אחרות ייתכן מציעים רזולוציה מרחבית גבוהה יותר (למשל, היברידית PIV/זאת, התאמת הריבועים הפחותים)32,33 ו, לכן, דיוק רב יותר כאשר בוחנים מאפיינים רגישים יותר לרזולוציה שדה מהירות (למשל , קיר גזירה, ערבוליות בתוך המטוס). באופן דומה, בעוד nmt ב מספק אמצעי לשיפור מהירות וקטור השדה לאחר קרוס-קורלציה, זה חשוב להדגיש שזה רק אחד של טכניקות אימות רבים וקטור זה יכול להיות בשימוש24,34, כל אחד עם יתרונות ייחודיים וחסרונות משלהם שעשוי להפוך את השימוש בהם יותר מתאים ליישומי מעבר לאלה המתוארים כאן. לבסוף, בעוד הסידור ניסיוני המתוארים כאן שואף לחקות זרימה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית המחירים וקשקשים אורך עבור neurovasculature, זה אינו מתיר בשלב ניתוח תזרימי פועמת. לא מאז הגבלה עבור היישום הנוכחי, המספרים בטווח של Womersley עד כדי כך neurovasculature נוטה להיות ≤ 1 (כלומר, יש השפעה מוספים מינימלית של מספר מחזורי הלב)35, שמצביע על זה מצב יציב תנאים מספיקים לסכם זמן בדידים נקודות לאורך waveform הלב שבו קצב הזרימה משולה. עם זאת, עבור יישומים איפה המספר Womersley הוא גדול יותר (למשל, להערכת קרוב אל הלב), נוכל לדמות פוטנציאל שהצגת pulsatility באמצעות שימוש Arduino, אשר יכול לשמש כדי לשלוח המשאבה מתח PWM משתנה הזמן צורת גל המאפשרת את מחקה זרימת הלב פרופיל36,37,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש ריהצהל.

Acknowledgements

המחברים להכיר תמיכה חלקית עבור פרויקט זה מסופק על ידי מענק זרע שיתופי של Office של מחקר ופיתוח כלכלי ב UC Riverside.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211, (1), 55-76 (1997).
  2. Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9, (17), 2551 (2009).
  3. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
  4. Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73, (11), 1983-1992 (2009).
  5. Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23, (11), (2013).
  6. Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104, (4), 448-454 (2001).
  7. Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25, (3), 460-469 (1997).
  8. Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
  9. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  10. Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42, (2), 225-240 (2007).
  11. Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. Springer. New York, NY. (2007).
  12. Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74, (3), 321-334 (2014).
  13. Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30, (6), 768-777 (2002).
  14. Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37, (7), 1310-1321 (2009).
  15. Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19, (1), 117-122 (1964).
  16. Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370, (1), 25-29 (1977).
  17. Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26, (3), 329-332 (1934).
  18. Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
  19. Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9, (12), 113762 (2014).
  20. Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134, (8), 084505 (2012).
  21. Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46, (6), 841-848 (2018).
  22. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, (3), 035017 (2014).
  23. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75, (23), 6544-6554 (2003).
  24. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122, (2), 285 (2000).
  25. Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. (2006).
  26. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27, (5), 414-419 (1999).
  27. Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10, (2), 153-167 (2008).
  28. Kuo, C. -C., Mao, R. -C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31, (8), 1113-1118 (2016).
  29. Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12, (1), 014105 (2018).
  30. Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79, (1), 51-60 (2000).
  31. Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39, (32), 5978-5990 (2000).
  32. Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22, (3), 199-211 (1997).
  33. Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14, (3), 175-187 (1985).
  34. Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8, (12), 1493-1501 (1997).
  35. Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191, (1), 63-78 (1998).
  36. Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
  37. Tsai, W., Savaş, Ö Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (2), 197-201 (2010).
  38. Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23, (8), 1346-1351 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics