Mesoskaligen Partikel Image Velocimetry Studien des neurovaskulären fließt In-vitro-

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Bioengineering

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Summary

Hier präsentieren wir vereinfachte Methoden für die Herstellung von transparenten neurovaskuläre Phantome und Charakterisierung des Fluss darin. Wir markieren Sie mehrere wichtige Parameter und ihre Beziehung zum Feld Genauigkeit zu demonstrieren.

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Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

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Abstract

Particle Image Velocimetry (PIV) dient in einer Vielzahl von Feldern, durch die Möglichkeit, die es für präzise Visualisierung und Quantifizierung fließt in einem großen raumzeitlichen Spektrum bietet. Ihre Umsetzung erfordert jedoch in der Regel die Verwendung von teuer und spezialisierte Instrumentierung, die seine breitere Dienstprogramm begrenzt. Darüber hinaus auf dem Gebiet der Biotechnologie, in-vitro- Flow Visualisierung Studien sind auch oft weitere begrenzt durch die hohen Kosten der kommerziell sourced Gewebe Phantome, die gewünschten anatomische Strukturen, vor allem für diejenigen zu rekapitulieren, die Das mesoskalige Regime (d.h. Submillimeter Millimeter Länge Skalen) erstrecken. Hier präsentieren wir Ihnen ein vereinfachte experimentelles Protokoll entwickelt, um diese Einschränkungen zu beheben, die Schlüsselelemente von denen umfassen (1) eine relativ kostengünstige Methode zur Herstellung von mesoskaligen Gewebe Phantome mit 3D-Druck und Silikon gießen, und (2) eine OpenSource-Bild Analyse und Verarbeitung Rahmen, der die Nachfrage nach Instrumenten zur Messung der mesoskaligen fließt reduziert (d.h., Geschwindigkeiten bis zu zehn Millimeter/Sekunde). Kollektiv, senkt dies die Einstiegsschwelle für unverständliche, durch die Nutzung von Ressourcen bereits zur Verfügung stehen viele Bioengineering Forscher. Wir Demonstratethe Anwendbarkeit dieses Protokolls im Rahmen des neurovaskulären Fluss Charakterisierung; Allerdings wird es voraussichtlich für ein breiteres Anwendungsspektrum mesoskalige in Bioingenieurwesen und darüber hinaus relevant sein.

Introduction

PIV ist weit verbreitet in Experimentelle Strömungsmechanik für Visualisierung und quantitative Untersuchungen der fließenden Bewegung, die in Längenskala von atmosphärischen mikrozirkulatorischen fließt1,2,3variieren. Während die Besonderheiten ihrer Umsetzung so weit wie ihre Anwendungen variieren können, ist ein Aspekt für fast alle PIV Studien die Verwendung von video-Bildgebung der Tracer Partikel innerhalb des Arbeitsfluids, gefolgt von einer paarweisen Analyse der aufeinander folgenden Bildrahmen ausgesät gewünschten Fließeigenschaften zu extrahieren. In der Regel erfolgt dies durch erste Unterteilung jeder Bildrahmen in kleinere Regionen Verhör Windows bezeichnet. Als Folge der zufälligen Positionen der dispergierten Partikel enthält jedes Verhör-Fenster eine eindeutige Verteilung der Pixelintensität. Wenn die Fenster-Dateigröße und Datenrate Erwerb passend gewählt sind, kann Kreuzkorrelation des Signals Intensität in jedem Fenster verwendet werden, um die durchschnittliche Verschiebung innerhalb der Region zu schätzen. Schließlich, angesichts der Tatsache, dass die Vergrößerung und die Frame-Rate experimentellen Parameter bekannt sind, kann eine momentane Geschwindigkeit Vektor auffangen leicht berechnet werden.

Ein großer Vorteil der PIV über Einzelpunkt-Messverfahren ist seine Fähigkeit Vektorfelder auf einer zwei- oder dreidimensionalen Domäne zuordnen. Hämodynamische Anwendungen profitierten vor allem von diese Funktion, denn es eine gründliche Untersuchung der lokalen Strömungen, die bekannt sind ermöglicht, spielen eine wichtige Rolle bei Gefäßerkrankungen oder Umbau (z.B., Atherosklerose, Angiogenese) 4 , 5 , 6. Dies wurde auch für die Bewertung der neurovaskulären fließt wahr, und deren Wechselwirkungen mit Endovaskuläre Prothesen (z.B., Flow Diverter, Stents, intrasaccular Spulen), da die relevanten Längenskalen in solchen Anwendungen können häufig umfassen eine oder mehrere Größenordnungen (z.B.von Mikrometer auf Millimeter) und Gerät Geometrie und Platzierung kann die lokale Strömungsmechanik7erheblich beeinträchtigen.

Die meisten Gruppen PIV-basierte hämodynamischen Untersuchungen Vertrauen auf Versuchsanordnungen, die einige der frühesten Untersuchungen des Stents Einfluss auf vaskuläre Flow7,8eng imitieren. Diese gehören in der Regel eine) gepulste Laser und High-Speed-Kameras erfassen hoher Geschwindigkeit fließt; (b) Synchronizer, Aliasing zwischen die Pulsfrequenz des Lasers und die Framerate der Kamera Übernahme zu verhindern; (c) zylindrische Optik, bilden einen leichten Bogen und so minimieren die Hintergrundfluoreszenz vom Tracer Partikel oberhalb und unterhalb der Ebene der Vernehmung; (d) bei der kommerziellen schlüsselfertige Systeme, proprietäre Software-Pakete, die Kreuzkorrelation Analysen durchzuführen. Aber, während einige Anwendungen erfordern die Leistung und/oder die Vielseitigkeit, die gemeinsam von diesen Komponenten gewährt, nicht viele andere. Darüber hinaus die hohe Kosten der kommerziell sourced Gewebe Phantome, die gewünschte vaskuläre Strukturen rekapitulieren können auch beweisen Begrenzung für viele in-vitro- Studien, insbesondere für die Phantome mit verfügt über die Brücke des mesoskaligen Regimes (> 500 USD / Phantom). Hier berichten wir über die Entwicklung eines vereinfachten Protokolls zur Umsetzung PIV für in-vitro- Visualisierung der neurovaskulären Ströme, die in der Regel sowohl räumlich liegen und zeitlich innerhalb des mesoskaligen Regimes (d.h.Längenskalen bis hin von Submillimeter Millimeter und Geschwindigkeiten bis zu zehn Millimeter/Sekunde). Das Protokoll soll Ressourcen bereits zur Verfügung stehen viele Bioengineering Forscher, wodurch die Einstiegsschwelle für unverständliche nutzen.

Das erste Element dieses Protokolls beinhaltet die Verwendung von einer Investition Gießtechnik, die hauseigene Herstellung von transparenten, Polydimethylsiloxan (PDMS) ermöglichen-basierte Gewebe Phantome aus 3-D-gedruckt Opfer Formen. Durch die Nutzung der zunehmenden Verfügbarkeit von 3-d-Drucker in den letzten Jahren, insbesondere in geteilt/multi-user Einrichtungen (z.B., institutionelle Einrichtungen oder öffentliche Makerspaces), diese Methode senkt die Kosten erheblich (z. B.< 100 USD/Phantom im hier vorgestellten Fall), und ermöglicht eine schnelle Trendwende für die Herstellung einer Vielzahl von Designs und Geometrien. In das aktuelle Protokoll ein fused Deposition Modellierung dient als Baustoff mit Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) und der gedruckten Teil dient als Opfer Form für das spätere phantom Casting. Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass ABS eignet sich gut für einen solchen Einsatz, denn es löslich in gebräuchlichen Lösungsmitteln (z.B. Aceton ist), und es hat ausreichende Festigkeit und Steifigkeit zu Schimmel Integrität nach dem Entfernen des Trägermaterials (z.B., zu verhindern, dass die Verformung oder Bruch der Diminutiv Formelemente). Das aktuelle Protokoll ist Schimmel Integrität weiter gewährleistet mit gedruckten Volumenmodelle, obwohl dies auf Kosten der erhöhten Auflösungszeit kommt. Die Verwendung von hohlen Modellen kann auch in einigen Fällen, solvent Zugang zu verbessern und somit die Auflösungszeit möglich sein. Jedoch kann sorgfältige Beachtung geschenkt werden sollte, die Wirkung dies auf Schimmel Integrität haben. Schließlich, während die Phantoms hierin fabriziert auf idealisierte Darstellungen der neurovaskulären Strukturen erzeugt, mit einer gemeinsamen Computer aided Design (CAD) Software basieren, das Protokoll soll offen für die Herstellung von komplexen , Patienten-spezifischen Geometrien sowie (z.B. über die Verwendung von Modelldateien erzeugt durch die Umwandlung des klinischen Bilddaten, die. STL Datei-Format von den meisten 3-d-Druckern verwendet). Weitere Details zu den phantom Fertigungsprozess sind in Abschnitt 2 des Protokolls zur Verfügung gestellt.

Das zweite Element des Protokolls beinhaltet die Verwendung einer Open-Source-Plug-in für ImageJ die Kreuzkorrelation Analysen9durchzuführen. Dies ist in Verbindung mit der Umsetzung eines einfachen statistischen Schnittstellenüberwachung Systems (d.h.Intensität Deckelung)10 , das Bildsignal vor ein postcorrelation Vektor-Validierung-Schema, die normalisierte Kreuzkorrelation sowie zu verbessern Median-Test (NMT), unechte Vektoren durch einen Vergleich der einzelnen auf seine nächsten Nachbarn11zu beseitigen. Gemeinsam können bildgebende Geräte weit verbreitet in vielen Laboratorien der Biotechnik, wodurch die Notwendigkeit für den Erwerb von viele teuren Komponenten typisch PIV-Systeme (z.B., gepulste Laser ausgeführt werden sollen Synchronizer, zylindrische Optik und proprietäre Software). Weitere Details zur video-Sammlung, Bildverarbeitung und Analyse der Daten sind in den Abschnitten 5 und 6 des Protokolls zur Verfügung gestellt.

Abbildung 1 zeigt das PIV-Setup verwendet in diesem Protokoll stützt sich auf ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Hochgeschwindigkeitskamera für imaging, sowie eine externe, kontinuierliche Weißlichtquelle (d.h., Metalldampflampen) ausgestattet für volumetrische Beleuchtung durch Ziel. Eine variabler Drehzahl Zahnradpumpe wird verwendet, um den umlaufenden Fluss einer transparenten mock Blut-Lösung durch die neurovaskuläre Gewebe Phantome zu verhängen. Die Lösung besteht aus einer 60: 40 Mischung von entionisiertem Wasser (DI) und Glycerin, die gemeinsame Ersatz für Blut im hämodynamischen12,13,14, durch Studien eine) ähnliche Dichte und Viskosität (d.h., 1.080 kg/m3 und 3,5 cP vs. 1.050 kg/m3 und 3-5 cP für Blut)15,16; (b) seine Transparenz im sichtbaren Bereich; (c) seine ähnlichen Brechungsindex wie PDMS (1,38 vs. 1.42 für PDMS)17,18,19,20, die optischen Verzerrungen minimiert; (d) die Leichtigkeit, mit der nicht-newtonsches Verhalten kann, eingeführt werden, wenn nötig, über die Zugabe von Xanthane21. Schließlich sind fluoreszierende Polystyrol-Kügelchen als Tracer Partikel (10,3 µm im Durchmesser; 480 nm/501 nm Anregung/Emission) verwendet. Während neutral Auftrieb Perlen gewünscht werden, kann Beschaffung Tracer Partikel mit optimale mechanische Eigenschaften (z.B.Dichte, Größe, Zusammensetzung) und Emissionswellenlänge herausfordernde beweisen. Die hierin verwendeten Perlen sind beispielsweise etwas weniger dicht als die Glycerin-Lösung (1.050 kg/m3 vs. 1.080 kg/m3). Die hydrodynamische Effekte, davon sind jedoch vernachlässigbar, angesichts der Tatsache, dass die Dauer der ein typisches Experiment viel kürzer als die Zeitskala mit Auftrieb Wirkungen verbunden ist (d.h., 5 min und 20 min, beziehungsweise). Weiter sind Einzelheiten über die mock Blut Lösung Formulierung und in-vitro- Herz-Kreislauf-System Set-up in den Abschnitten 3 und 4 des Protokolls zur Verfügung gestellt.

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Protocol

1. ABS-basierte Opfer Schimmel Fertigung

  1. Entwurf eine inverse Modellierung des gewünschten Gewebe Phantom mit CAD-Software.
  2. Drucken Sie das Modell mit einem 3-d-Drucker mit ABS als Baumaterial.

2. PDMS-basierte vaskulären Phantom Fertigung

  1. Mischen
    1. Mischen Sie die PDMS prepolymer Basis und Härtemittel im Verhältnis 10:1 (nach Gewicht); eine 66 g Mischung bietet genügend Material für die Herstellung von Phantomen mit einem Volumen bis zu 50 cm3.
    2. Legen Sie die Mischung in ein Vakuum Exsikkator für 60 min. zu entgasen und minimieren die Blase Einklemmung. Verwenden Sie zyklische Druckbeaufschlagung/Druckentlastung, um Ruptur der Blase zu erleichtern.
  2. Casting
    1. Montieren Sie die gedruckte Form des ABS auf einem Objektträger mit Molding Putty um die Oberfläche zu versiegeln.
    2. Gießen Sie vorsichtig PDMS-Mischung in die Form bei dem Versuch, Blase Einklemmung zu minimieren. Anhaltende Bläschen können manuell mit Hilfe einer Nadel gebrochen werden.
    3. Die Darsteller Phantom bei Raumtemperatur (25 ° C) mindestens 24 Stunden aushärten.
      Hinweis: Bei höheren Temperaturen, kann dieser Prozess beschleunigten22sein.
  3. Entformung
    1. Auflösen der ABS durch Eintauchen der Phantom in Aceton und beschallen für mindestens 15 Minuten, mit Leistungen bis zu 70 w.
      Achtung: Aceton hat einen hohen Dampfdruck bei Raumtemperatur und einer niedrigen Flammpunkt. Deshalb arbeiten Sie immer unter einer Abzugshaube und von potentiellen Zündquellen. Geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (z. B.Brille oder Gesicht Schild, Laborkittel, Aceton-resistente Handschuhe) zu tragen.
    2. Spülen Sie das Phantom mit Isopropyl-Alkohol und dann, VE-Wasser, Lösungsmittel-Rückstände zu entfernen.
      Hinweis: PDMS quillt bei Kontakt mit Aceton; jedoch nachlässt die Schwellung, sobald das Phantom gespült wird und ausreichend23 getrocknet.
  4. Bestätigung der phantom Treue mit optischen Mikroskopie
    1. Mit einem optischen Mikroskop mit einer angeschlossenen Kamera und Bild-Capture-Software, Erstellen eines Abbildes der eine wichtige Funktion innerhalb der Phantom unter einer Vergrößerung, die die Funktion innerhalb des Gesichtsfeldes maximiert.
    2. Erstellen eines Abbildes der eine entsprechende Kalibrierung Fadenkreuz mit der gleichen Vergrößerung.
    3. Laden Sie beide Bilder in ImageJ, indem Sie sie in die Symbolleisteziehen.
    4. Klicken Sie auf die Kalibrierung Absehens Bild um es zu aktivieren und wählen Sie dann das Werkzeug Linie . Mit der Maus ziehen Sie eine Linie entlang eines Features von einen bekannten Abstand und wählen Sie analysieren > Set Maßstab aus dem ImageJ-Menü.
      Hinweis: Im Fenster Set Maßstab sollte das Feld Abstand in Pixel mit der Länge der gezeichneten Linie in der Einheit Pixel aufgefüllt werden.
    5. Geben Sie die Länge des Features im Feld mit der Bezeichnung Bekannt Distanzund seiner Einheit auf dem Feld Der Längeneinheit. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen mit der Bezeichnung Global um alle geöffneten Bilder dieser Kalibrierfaktor zuweisen.
    6. Das Bild der phantom kritische Funktion zu aktivieren und verwenden Sie das Linien -Werkzeug zum Zeichnen einer Linie entlang eines Features von Interesse. Klicken Sie im Menü ImageJ analysieren > Maßnahme (oder drücken Sie Strg + M), die Länge der Linie zu messen.
    7. Vergleichen Sie den erwarteten Wert mit dem Wert in der Spalte Länge im Ergebnisfenster phantom Treue zu bestätigen.

3. Blut-Lösungs-Formulierung zu verspotten.

  1. Mischen Sie Wasser und Glycerin im Verhältnis 60: 40 DI (nach Volumen).
    Hinweis: Ein Volumen von 100 mL ist ausreichend für die in-vitro- Herz-Kreislauf-System beschriebenen.
  2. Die mock Blut-Lösung 1 mL 2,5 % w/V fluoreszierende Polystyrol Bead Lösung (d.h. Tracer Partikel) hinzufügen.
  3. Die Mischung auf einem magnetischen rühren Teller bei 400 u/min, 10 min zu homogenisieren.

4. in-vitro- Herz-Kreislauf-System-Setup

  1. Pump Set-up
    1. Verwenden Sie eine Stripperin Werkzeug Draht von der Stromquelle AC / DC-Adapter DC-Endstopfen abzuschneiden.
    2. Streifen Sie die Beschichtung ausschalten und Boden Sie Kabel und schließen Sie sie an die Eingangsklemme des Spannungsreglers Puls breite Modulation (PWM).
    3. Die Spannungs- und Drähte aus der Pumpe DC-Motor an den Ausgang des Spannungsreglers PWM anschließen.
      Hinweis: Die PWM-sieben-Segment-Anzeige gibt das Tastverhältnis (0 % - 100 %) verwendet, um eine Variable Spannung des DC-Motors zu erreichen.
  2. Kalibrierung der Pumpe
    1. Bereiten Sie 200 mL mock Blut-Lösung (siehe Abschnitt 3).
    2. Setzen Sie Schläuche von den Pumpeneinlass auf den Becher halten die mock Blut-Lösung.
    3. Schlauch vom Pumpenausgang auf einen leeren Becher zu platzieren.
    4. Wählen Sie einen gewünschte Pflicht-Zyklus-Sollwert (0 % - 100 %). Drücken Sie auf die Schaltfläche und einen Timer gestartet.
    5. Stoppen Sie die Zeitmessung, sobald die Pumpe das gesamte Volumen der Lösung mock Blut übertragen hat. Nutzen Sie diese Zeit, um den Volumenstrom zu berechnen.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 - 4.2.5 für mindestens fünf verschiedene Pflicht Zyklus Sollwerte, eine kleinste-Quadrate-Regression-Kurve zu etablieren.
      Hinweis: Ein Minimum von drei replizieren Punkten pro Zyklus Set Betriebspunkt wird empfohlen. Diese Beziehung kann verwendet werden, um die gewünschte Durchflussgeschwindigkeit, das erforderliche PWM-Tastverhältnis zu korrelieren.

5. video-Sammlung

  1. Bild-Kalibrierung
    1. Bestimmen Sie die Kalibrierung-Verhältnis für das video Imaging (siehe Abschnitt 2).
  2. Apparat-Set-up
    1. Platzieren Sie das PDMS-Phantom auf der Bühne von dem Fluoreszenzmikroskop.
    2. Verbinden Sie das Phantom mit der Zahnradpumpe und führen Sie mock Blut-Lösung ein.
      Hinweis: Optional vorkonfigurieren das Modell mit Ethanol zur Erleichterung der vollständigen Benetzung; dann spülen Sie und füllen Sie es mit der mock Blut-Lösung. Dies kann besonders vorteilhaft für Modelle mit kleineren Schiffen und/oder blind Features sein.
    3. Legen Sie die Pumpe motor-Controller für die gewünschte Durchflussgeschwindigkeit, basierend auf der Pumpenkennlinie Kalibrierung.
    4. Führen Sie die Pumpe für 1-5 min vor dem Experiment Steady-State-Bedingungen sicherzustellen.
    5. Schalten Sie die Lampe, das Sichtfeld zu beleuchten. Wählen Sie einen entsprechenden Filter basierend auf die Erregung Wellenlänge der fluoreszierenden Perlen.
    6. Anpassen der bildgebenden Brennebene auf der Mittelebene des Schiffes.
      Hinweis: Dies kann durch die Verwendung einer Brennweite, die den abgebildeten Schiff Querschnitt maximiert erreicht werden (z.B.bei kreisförmigen Schiff Phantome mit Querschnitten); und/oder Indizierung von einem phantom-Funktion entwickelt, um die Identifizierung der Mittelebene des Schiffes zu erleichtern.
  3. Video-Aufzeichnung
    1. Wählen Sie die video-Aufnahme-Parameter, das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) zu optimieren. Schlüsselparameter sind Belichtungszeit, Frame-Rate, und gewinnen.
      Hinweis: In diesem Protokoll verwenden wir eine Bildrate von 2.000 fps und einem Plus von 1,0. Diese Parameter können jedoch anhand der Anwendung variieren (siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Details).
    2. Das Video zu sammeln und im AVI-Format speichern.
  4. Phantom Aufräumarbeiten
    1. Perle-kleben nach einem Experiment festgestellt, beschallen Sie das Phantom in eine wässrige Lösung mit Leistungen bis zu 70 w.

6. Bild-Verarbeitung und Datenanalyse

  1. Bildvorverarbeitung
    1. Ziehen Sie die AVI-Datei auf ImageJ-Fenster um es zu importieren. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen markiert, in Graustufen umwandeln.
    2. Klicken Sie im Menü ImageJ analysieren > generieren Histogramm (oder drücken Sie Strg + H), ein Histogramm des Bildes Pixelintensität zu generieren. Beachten Sie den Mittelwert und Standardabweichung für das unbearbeitete Bild.
      Hinweis: Bei hohen Frameraten, es ist nicht ungewöhnlich für die Verteilung an stark verzerrt werden, gegen Null (d.h. kein Signal).
    3. Klicken Sie im Menü ImageJ Bild > anpassen > Helligkeit und Kontrast (oder drücken Sie Umschalt + Strg + H) einen Helligkeit/Kontrast-Filter anwenden.
    4. Helligkeit und Kontrast im Menü drücken Sie die Taste Set , um die Bild-Grenzen zu definieren. Den minimalen Wert sein, den Mittelwert und eine Standardabweichung und der maximale Wert der maximalen Intensität des Bildes sein (beide basierend auf Statistiken, die in Schritt 6.1.2 erhaltenen) festgelegt.
      Hinweis: Dadurch wird in der Regel alle, aber die oberen 10 % der die Pixelintensität. Die Anzahl der Standardabweichungen kann abhängig von der gewünschten Verteilung der Pixelintensität variiert werden. Ein benutzerdefiniertes Makroskript für die Durchführung der Intensität Deckelung Betrieb ist in den Ergänzenden Materialienzur Verfügung gestellt.
    5. Klicken Sie im Menü ImageJ Prozess > Lärm > Filter die Anzahl der gesättigten Pixel reduzieren.
      Hinweis: Dieser Vorgang ist durch das höhere Potenzial für Pixel Sättigung erforderlich, die entsteht, bei der Optimierung von Helligkeit und Kontrast, die unechte Vektoren während nachfolgende Kreuzkorrelation produzieren kann.
    6. Klicken Sie im Menü ImageJ Prozess > Filter > Gaußscher Weichzeichner mit einem Radius von 1,5, Artefakte aus der gelegentlichen entfernen von beleuchteten Pixel in ein 3 x 3-Nachbarschaft durch die vorherige Feldgrenzen Betrieb zu reduzieren.
    7. Klicken Sie auf das Polygon -Werkzeug und klicken Sie auf das Bild die Region of Interest (ROI) zu skizzieren.
    8. Klicken Sie im Menü ImageJ Bearbeiten > klar außerhalb entfernbar Sensorrauschen an Orten wo kein Signal ist erwartet (z. B.Bereiche jenseits der Schiff-Wand-Grenze), die kann die gesamte SNR zu verringern.
  2. PIV-Berechnung
    Hinweis: Dieser Teil des Protokolls beschäftigt eine Drittanbieter-PIV-Plug-in für ImageJ, die stützt sich bei der "glockenförmig" Peak-Befestigung ermöglicht eine Abschätzung der Verschiebung mit Subpixel-Genauigkeit.
    1. Klicken Sie im Menü ImageJ Plugins > Makros > ausführen... und navigieren Sie zur gespeicherten Makros zusätzlicher Code 2. Ijjm , Kreuz-aufeinander folgende Bildpaare korrelieren.
      Hinweis: Das Makro geht wie folgt vor. (1) eine Kreuzkorrelation des Feldes Intensität in aufeinander folgenden Bildern wird zuerst durchgeführt, um bestimmen die lokale Verschiebung des advected Tracer Teilchen (d. h., das erste Bild, das Paar der ersten und zweiten Bilder, das zweite Bildpaar besteht besteht aus der zweiten und dritten Bilder, etc.). (2) eine zweistufige multipass Auswertung erfolgt dann mit Anfangs- und Endwert Verhör Fenstergrößen von 256 x 256 Pixel und 128 x 128 Pixel, beziehungsweise. Zu guter Letzt 3) das Makro führt einen zeitlichen Durchschnitt um das Aussehen der unechten Vektoren weiter zu verringern.
  3. Normalisierte Median-Test (NMT)
    1. Klicken Sie im Menü ImageJ Plugins > Makros > ausführen... und navigieren Sie zu der gespeicherte Makro zusätzlicher Code 3. Ijjm zur Validierung der Geschwindigkeit Felder über die normalisierten Median-Test.
      Hinweis: Das Makro geht wie folgt vor. (1) jeder Vektor in einer momentanen Vektorfeld ist zunächst im Vergleich zu seinen acht nächsten Nachbarn, den Mittelwert zu berechnen. (2) die Anordnung der verbleibende Fehler wird als der Unterschied zwischen den jeweils benachbarten Vektor und der berechneten Median berechnet. (3) der Unterschied zwischen dem Vektor untersucht und der Medianwert der benachbarten Vektor wird dann durch den Median der Residuen normalisiert. (4) Dies wird dann verglichen mit einem Schwellenwert (in der Regel 0,2 Pixel), die basierend auf a priori Kenntnis der Lärm während der Bildaufnahme variiert werden kann. Zu guter Letzt 5) ein zeitlicher Durchschnitt alle validierten momentane Vektorfelder wird durchgeführt, um ein zusammengesetztes Feld erzeugen, wie dies gezeigt worden, um den Vektor Feld Qualität24erhöhen.

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Representative Results

Abbildung 2 veranschaulicht die PDMS Gewebe phantom Fertigungsprozess. Die Phantome entwickelt hierin sind für die Untersuchung der Strömung im idealisierten Wide-necked, saccular, intrakranielle Aneurysmen sowie proximalen Verzweigung Perforator Arterien bestimmt. Wichtige weitere Design Merkmale 1) eine gemeinsame Reservoir, das alle Schiffe in, zu entwässern, um unbelastet Flüssigkeit austritt aus der Phantom - andernfalls sicherzustellen Tropfenbildung auftreten in den kleineren Schiffes Outlets; (2) eine Falle, Blase, um Blase entfernen zu erleichtern; (3) ein Hohlraum Außenwand, um Parallelität des Schiffes mit der horizontalen Ebene, sowie eine genaue Definition der letzte phantom Plattehöhe, Länge und Breite zu gewährleisten; (4) die Verwendung von einem 21 G Injektionsnadel Schaft (820 µm im äußeren Nenndurchmesser) für das Gießen der Perforator Arterie, wegen des Druckers Unfähigkeit, diese Features mit ausreichender Genauigkeit zu definieren. Originalgetreue Nachbildung der alle Konstruktionsmerkmale wird im gesamten beobachtet.

Repräsentative Ergebnisse der PIV-basierte Fluss Charakterisierung durchgeführt, über das aktuelle Protokoll sind in Abbildung 3 und Abbildung 4. Diese Studien wurden durchgeführt mit phantom Einlass Flussraten von 100 mL/min, Erwerb Datenraten von 2.000 fps und repräsentatives Bild Frames innerhalb der Perforator Arterie, eine zeitliche Mittelung über Spannweiten von 0,05 S. Abbildung 3 zeigt, vor und nach Begrenzung der Intensität sowie entsprechende Oberfläche Grundstücke die 8-Bit-Pixel-Intensitätswerte. Beide zeigen, dass Intensität Deckelung die Peak-Definition über das Grundrauschen (d.h., erhöht die SNR), ist entscheidend erhöht für die Genauigkeit beim anschließenden Kreuzkorrelation durchführen. Abbildung 4 zeigt die Auswirkungen der Intensität capping und NMT Operationen auf das Geschwindigkeitsfeld Vektor. Deutliche Verbesserung im Bereich Einheitlichkeit wird beobachtet und weiter unterstreicht damit die Bedeutung der SNR zur Minimierung von Daten ausfallende zu maximieren.

Figure 1
Abbildung 1 : Particle Image Velocimetry Set-up. Vertrauen auf eine Open-Source-Bildanalyse und einen vor-/Nachbereitung Rahmen reduziert die Nachfrage nach Instrumenten zur Messung der mesoskaligen fließt, wodurch die Notwendigkeit für viele der teuren Komponenten typischen PIV-Systeme (z. B.gepulst Laser, Synchronizer, zylindrische Optik und/oder proprietäre Software). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : PDMS-basierte Gewebe phantom Fertigungsprozess. Die Bilder veranschaulichen (ein) ein CAD-Modell der neurovaskulären phantom Form, (b) die gedruckten ABS Schimmel nach dem Entfernen des Trägermaterials, (c) das Casting und Aushärtung des PDMS innerhalb der ABS-Form, (d) teilweise Auflösung der ABS Form, Material und (e) die fertige PDMS phantom mit der Inset zeigt die Endabmessungen kritische Funktionen, sowie die Region von Interesse (ROI) in der Perforator Arterie, wo die PIV-Messungen durchgeführt wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Wirkung der Intensität Deckelung Betrieb auf das Bild, SNR. Diese Tafeln zeigen repräsentative Bildrahmen und den entsprechenden Pixel Intensität Oberfläche Grundstücke innerhalb der Perforator Arterie, (a und b) vor und (c und d) nach der Anwendung der Intensität Deckelung Betrieb. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Auswirkungen der Intensität capping und NMT Operationen auf Geschwindigkeit Vektor-Felder. Diese Platten illustrieren das Vektorfeld repräsentative momentane Geschwindigkeit innerhalb der Perforator Arterie abgeleitet (ein) unbearbeitet Bilddaten, (b) Intensität begrenzt Daten, und (c) Intensität begrenzt Daten + NMT Nachbearbeitung . Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Wirkung der Vernehmung Fenstergröße auf Korrelation Qualität. Optimale Fenstergröße tritt auf, wenn der Wert der Korrelationskoeffizient Null normiert maximiert wird und die Standardabweichung wird minimiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Das Protokoll beschriebenen Umrisse ein vereinfachtes Verfahren für die Durchführung von PIV Studien um neurovaskuläre visualisieren an physiologisch relevanten Dimensionen und Fluss Bedingungen in Vitromündet. Auf diese Weise dient es Ergänzung Protokolle von anderen berichtet, die auch konzentriert haben, über die Vereinfachung der Quantifizierung der Vektorfelder, sondern in sehr verschiedenen Kontexten, die erfordern, dass die Berücksichtigung der weit größeren Länge25 oder niedriger Durchfluss Waagen 26,27 (z.B. atmosphärische oder mikrozirkulatorischen fließt), Preise und somit, eine Berufung auf Regelungen, die mit der aktuellen Anwendung nicht kompatibel sind.

Die wichtigsten Überlegungen für die erfolgreiche Umsetzung des PIV liegen in der Minimierung der Fluss Feld Artefakte und die Maximierung der Bildqualität. Es sind mehrere Schritte in der Gewebe-phantom-Fertigung für beide Kriterien von entscheidender Bedeutung. Beispielsweise ist die gründliche Entgasung entscheidend, denn Luft mitgerissen innerhalb der PDMS während des Mischvorgangs zu Blasenbildung innerhalb der letzte Phantom führen kann die Funktion Treue und optische Klarheit beeinträchtigen können. Minimierung der Oberflächenrauhigkeit der ABS-Form ist darüber hinaus gewünscht, da PDMS-Gießverfahren originalgetreu reproduziert selbst das kleinste Mängel (z.B., Build Linien, Oberfläche Poren, Kratzer), wodurch sich die Rauheit der Oberfläche in das letzte Phantom, das optischen Klarheit zu verringern und erhöhen das Potenzial für die Wulst Akkumulation. Während das Protokoll beschriebenen für die aktuelle Anwendung ausreichend nachgewiesen hat, es gibt zahlreiche Berichte in der Literatur der Mittel zur Verringerung solcher Rauheit, sollte es nötig sein (z.B., Aceton Dampf Glätten28 oder die Optimierung der Schicht Dicke und Teil-Orientierung in Bezug auf die Gebäude)29.

Die Parameterauswahl für video-Capture ist auch wichtig, ein High-Fidelity-Vektorfeld sicherzustellen. Eine optimale SNR wird in der Regel mit der höchste erreichbare Framerate erreicht, die noch genügend Wulst Exposition (die maximale Bildrate wird begrenzt durch die minimale Belichtungszeit) ermöglicht. Gewinn kann verwendet werden, um das Signal zu verstärken, aber auch Sensorrauschen erhöht. Wenn die maximale Geschwindigkeit von anderen Strömungsparameter (z.B. Einlass Volumenstrom) geschätzt werden kann, kann eine untere Schranke auf den gewünschten Frame-Rate unter Verwendung der folgenden Beziehung30geschätzt werden.

Equation 1(1)

Hier fProbenahme ist die Kamera Erfassungsrate (Hz), Vmax ist die maximale erwartete Geschwindigkeit (mm/s), C-Kalibrierung ist die Kalibrierung konstant (Pixel/mm) und hVerhör Fenster ist die Größe des Fensters Verhör (Pixel). Jedoch können mit sogenannten Korrelation Qualität Schätzung Techniken, wie z. B. der Korrelationskoeffizient Null normiert11mehr optimale Werte ermittelt werden. Bei dieser Technik sind die Durchschnittswerte der ergänzenden Signale von jedem Frame paar zuerst abgezogen und dann durch die Standardabweichung der ihre Intensitäten11normiert. Wenn eine Verschiebung des Originalsignals vorhanden ist, so dass alle Höhen und tiefen übereinstimmen, wird die zeitversetzte Wert dieses Signals gleich eins sein. Im Gegensatz dazu gibt es keine Verschiebung, die diese Signale ausrichten kann, wird der Wert Null sein. Diese Informationen sind in der ImageJ PIV-Ausgabe für jeden Vektor enthalten, und es als eigenes Feld zu prüfen, ob gibt es räumliche Effekte zur schlechten Korrelation geplottet werden kann (z.B., ungleichmäßige Beleuchtung). Der Korrelationskoeffizient kann auch über ein Feld als eine allgemeine Schätzung seiner Qualität gemittelt werden. Diese Menge kann schließlich auch gegen unterschiedliche Frame-Raten oder Verhör Fenstergrößen zu bestimmen, eine optimale geplottet werden. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse von solch eine Analyse mit einem Monte-Carlo-synthetisiert Partikel-Feld mit Verschiebungen Einklang mit unserer experimentell gemessenen Ströme (eine typische Technik zur Charakterisierung von Korrelation Qualität11 ). Die Ergebnisse zeigen, dass die Abfrage-Fenster Größe und Frame-Rate gewählt werden sollte, so dass ein Teilchen-Feld von ≤ 20 % der Vernehmung Fenstergröße pro Frame paar der Korrelationskoeffizient zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung ihrer Variabilität verdrängt wird.

Obwohl das Protokoll beschriebenen für die Bedürfnisse der aktuellen Anwendung ausreichend bewiesen hat, ist es wichtig, seine Grenzen zu erkennen. Zum Beispiel, während Kontrast Verbesserung über Intensität Deckelung einfache Implementierung bietet, können Transformationen der gesamten Verteilung der Pixelintensität SNR weitere31verbessern. Ebenso können obwohl Korrelation-basierten Tracking gut etabliert ist und ausreichende Lösung bietet für zuverlässig schätzen erster Ordnung Fließverhalten auf Hämodynamik (z.B. Intra-aneurysmal Geschwindigkeit), andere Techniken bieten eine höhere räumliche Auflösung (z.B.Hybrid PIV/PTV, kleinste-Quadrate-matching)32,33 und damit höhere Genauigkeit bei Eigenschaften, die mehr empfindlich auf die Geschwindigkeit Feld Auflösung (z.B. , Wand-Schubspannung, Vorticity in der Ebene). Ebenso während der NMT ein Mittel zur Verbesserung der Geschwindigkeit Vektor auffangen nach Kreuzkorrelation bietet, ist es wichtig zu betonen, dass dies nur eine von vielen Vektor Validations-Techniken, die verwendeten24,34, jeweils mit Ihre eigene einzigartige Vorteile und Nachteile, die ihre Nutzung besser geeignet für Anwendungen über den hier beschriebenen machen können. Zu guter Letzt während der hier beschriebenen Versuchsaufbau physiologisch relevanten Durchflussmengen zu imitieren soll und Länge für die Neurovasculature Skalen, erlaubt nicht gerade die Analyse der pulsierende Ströme es. War dies keine Beschränkung für die aktuelle Anwendung, da die Palette von Womersley Zahlen in einem Großteil der Neurovasculature tendenziell ≤ 1 (d. h., es gibt eine minimale additive Wirkung von mehreren Herzzyklen)35, was darauf, dass hindeutet Steady-State-Bedingungen sind ausreichend zu diskreten Zeitpunkten entlang der kardialen Wellenform rekapitulieren, in dem der Durchfluss vergleichbar ist. Allerdings könnte für Anwendungen, bei denen die Womersley Zahl größer (z. B.Gefäßsystem näher zum Herzen), wir stellen uns ein Potenzial für die Einführung von Pulsatilität durch den Einsatz von einem Arduino, die verwendet werden, um der Pumpe eine zeitlich veränderliche PWM-Spannung schicken Wellenform, die es ermöglicht, die imitiert eine kardiale Flow Profil36,37,38.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Acknowledgements

Die Autoren erkennen teilweise Unterstützung für dieses Projekt zur Verfügung gestellt durch einen kooperativen Samen Zuschuss aus dem Office of Research und ökonomische Entwicklung an der UC Riverside.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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