Functionele magnetische resonantie spectroscopie op 7 T in de Rat vat Cortex tijdens de Whisker activering

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Nadat u hebt gecontroleerd door bloed-zuurstof-niveau-afhankelijke functionele magnetische resonantie imaging (fMRI vet) thats het overeenkomstige vat Somatosensorische cortex gebied (genoemd S1BF) correct geactiveerd, de belangrijkste doel van deze studie is te kwantificeren lactaat inhoud schommelingen in de hersenen geactiveerd rat door gelokaliseerde proton magnetische resonantie spectroscopie (1H-mevrouw) bij 7 T.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blanc, J., Roumes, H., Mazuel, L., Massot, P., Raffard, G., Biran, M., Bouzier-Sore, A. K. Functional Magnetic Resonance Spectroscopy at 7 T in the Rat Barrel Cortex During Whisker Activation. J. Vis. Exp. (144), e58912, doi:10.3791/58912 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie biedt de mogelijkheid voor het meten van cerebrale metaboliet inhoud in vivo en noninvasively. Dankzij de technologische ontwikkelingen van het afgelopen decennium en de stijging van de magnetische veldsterkte is het nu mogelijk om goede resolutie spectra in vivo in de rat hersenen. Neuroenergetics (dat wil zeggen, de studie van het metabolisme van de hersenen) en, vooral, metabole interacties tussen de verschillende soorten cellen hebben steeds meer belangstelling in de afgelopen jaren aangetrokken. Onder deze metabole interacties, is het bestaan van een lactaat shuttle tussen neuronen en astrocyten nog besproken. Het is dus van groot belang voor het uitvoeren van functionele proton magnetische resonantie spectroscopie (1H-mevrouw) in het model van een rat van hersenen activering en monitor lactaat. Echter, de methyl lactaat piek overlapt lipide resonantie pieken en is moeilijk te kwantificeren. Het protocol hieronder beschreven staat metabole en lactaat schommelingen te worden gevolgd in een gebied van de hersenen geactiveerd. Cerebrale activering wordt verkregen door friemeltje stimulatie en 1H-mevrouw wordt uitgevoerd in de overeenkomstige cortex geactiveerd vat, wiens gebied wordt gedetecteerd met behulp van bloed-zuurstof-niveau-afhankelijke functionele magnetische resonantie beeldvorming (fMRI vet). Alle stappen worden volledig beschreven: de keuze van anesthetica, spoelen en sequenties, bereiken van efficiënte friemeltje stimulatie rechtstreeks in de magneet, en verwerking van gegevens.

Introduction

De hersenen bezit intrinsieke mechanismen waarmee de regulering van zijn grote substraat (d.w.z., glucose), zowel voor haar bijdrage en haar gebruik, afhankelijk van de variaties in plaatselijke cerebrale activiteit. Hoewel glucose de voornaamste energie-substraat voor de hersenen is, hebben experimenten uitgevoerd in de afgelopen jaren aangetoond dat lactaat, die wordt geproduceerd door de astrocyten, zou een substraat van de energie-efficiëntie voor de neuronen. Dit roept de hypothese van een lactaat shuttle tussen astrocyten en neuronen1. Bekend als ANLS, voor Astrocyt-neuron lactaat shuttle2, de theorie is nog steeds zeer besproken maar heeft geleid tot het voorstel dat glucose, in plaats van te gaan rechtstreeks in neuronen, kan het invoeren van de astrocyten, waar het wordt gemetaboliseerd in lactaat, een metaboliet die is , vervolgens overgebracht naar de neuronen, die het gebruiken als substraat van de energie-efficiëntie. Als dergelijke een shuttle in vivobestaat, zou hebben verscheidene belangrijke gevolgen, zowel voor het begrijpen van basistechnieken in functionele cerebrale beeldvorming (positron emissie tomografie [PET]) en voor het ontcijferen van de metabole wijzigingen waargenomen in de hersenen pathologieën.

Om te studeren van de stofwisseling van de hersenen en, vooral, metabole interacties tussen neuronen en astrocyten, vier voornaamste technieken beschikbaar zijn (niet met inbegrip van micro-/ nanosensors): autoradiografie, PET, twee-foton fluorescerende confocale microscopie, en MEVR. Autoradiografie was een van de eerste voorgestelde methoden en levert beelden van de regionale cumulatie van radioactieve 14C-2-deoxyglucose in plakjes van de hersenen, terwijl PET opbrengsten in vivo afbeeldingen van de regionale opname van radioactieve 18 F-deoxyglucose. Beiden hebben het nadeel van het gebruik van irradiative moleculen terwijl de productie van lage-ruimtelijke resolutiebeelden. Twee-foton microscopie cellulaire cijferreeks van fluorescerende sondes, maar lichtverstrooiing door weefsel beperkt de imaging diepte. Deze drie technieken hebben eerder is gebruikt om te neuroenergetics in knaagdieren studeren tijdens friemeltje stimulatie3,4,5,6. In vivo MRS heeft het dubbele voordeel dat noninvasive en nonradioactive, en elke hersenstructuur kan worden verkend. MRS kan bovendien worden uitgevoerd tijdens de neuronale activering, een techniek genaamd functionele MRS (fMRS), die zeer onlangs in knaagdieren7heeft ontwikkeld. Dus, een protocol bij het controleren van de stofwisseling van de hersenen tijdens de cerebrale activiteit door 1H-mevrouw in vivo en noninvasively wordt voorgesteld. De procedure is beschreven in volwassen gezonde ratten met hersenen activering verkregen door een lucht-bladerdeeg friemeltje stimulatie uitgevoerd direct in een 7 T magnetische resonantie (MR) imager maar kan worden aangepast in genetisch gemodificeerde dieren, alsmede in een pathologische aandoening .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de dier experimenten richtsnoeren van de Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 November 1986 (86/609/EEG). Het protocol ontmoette de ethische richtsnoeren van het Franse Ministerie van landbouw en bossen en is goedgekeurd door de plaatselijke ethische comités (Comité d 'éthique pour L' expérimentation Animale Bordeaux n ° 50112090-A).

Opmerking: Tijdens de metingen van de heer, een adequaat niveau van anesthesie en fysiologische monitoring (lichaamstemperatuur, ademhaling) zijn onmisbaar eisen.

1. dieren

  1. Gebruik mannelijke Wistar ratten wegen tussen de 350 en 450 g.
  2. Houd ze op een 12:12 h licht: donker cyclus en zorgen voor voedsel en water ad libitum.

2. anesthesie

  1. Voorbereiden van de apparatuur die nodig is voor de anesthesie (figuur 1A, B, Zie Tabel van materialen): een 5 mL-spuit met medetomidine in fysiologische zoutoplossing oplossing (240 µg/kg/h, met een snelheid van de perfusie van 20 µL/min), een 0,5 mL spuit met atipamezole (20 μL, in 0,5 mL zoutoplossing) en oog zalf.
    Opmerking: Houd alle apparatuur onder de afzuigkap, met uitzondering van de 5 mL spuit met medetomidine, die wordt geplaatst in de spuitpomp in de buurt van de magneet voor anesthesie tijdens heer acquisities.
  2. Plaats de rat in de zaal van de inductie, het starten van de narcose door het leveren van 4% Isofluraan en aanpassen van het debiet van de zuurstof aan 1,5 L/min.
  3. De diepte van de verdoving evalueren door het beoordelen van de terugtrekking van paw reflexen.
  4. Wanneer de rat niet op stimulatie reageert, neem het uit de doos van de verdoving, plaats het op de Bank met haar neus in het masker Isofluraan en onderhouden van verdoving door het leveren van 2,5% in zuurstof op 1,5 L/min.
  5. Zachtjes massage van de staart en plaats van de tourniquet (Figuur 1 c).
    Opmerking: De massage kan worden uitgevoerd in warm water, met een temperatuur tussen 38 en 42 ° C, tot het verkrijgen van betere vasodilatatie van de aderen.
  6. Plaats de perifere intraveneuze katheter (22 G), eerder EDTA, in de ader van de linker- of staart. Merk op dat een veneuze terugkeer wordt nageleefd (een druppel bloed is zichtbaar in het distale gedeelte van de naald) wanneer de katheter is correct ingevoegd (Figuur 1 d).
  7. Elke aanwezig in de katheter dode ruimte volume met behulp van de 2 mL spuit met fysiologische zoutoplossing oplossing en heparine luchtbellen blazen.
  8. Toepassing van het oog zalf en bereiden de spuit met atipamezole (17 µg/mL) om te ontwaken de rat aan het einde van het experiment.

3. rat plaatsing in magneet voor Whisker stimulatie

  1. Plaats een ademhaling-sensor op het bed magneet en breng de rat naar de magneet bed van de Bank. Plaats het in de vatbaar positie met haar neus in het Isofluraan masker, met de sensor van de ademhaling gelegen tussen de ribbenkast en het bed van de magneet.
    Opmerking: Alle apparatuur die de MRI-kamer binnenkomt moet MRI-safe.
  2. Verlagen van de Isofluraan (van 4% tot 1,5%-2%) tijdens de plaatsing van de rat en de narcose overschakelen naar medetomidine aan het einde van deze procedure. Zorg ervoor dat de juiste snorharen gratis zijn, hebben gesneden de rechterrand aan de voorzijde van de rat MRI bed vooraf om het verkeer van de snorharen.
  3. Houd de rat in positie met tape en haar ademhaling die tussen de 60 en 80 ademhalingen per minuut moet controleren.
  4. Het maken van een zeil dat oke snorharen in de papieren rompslomp (Figuur 2 overlapt). Aanpassing van de flexibele uitlaat-pijp van het systeem van de lucht-bladerdeeg langs de rat MRI bed zodat het deel verlaten van de buis loodrecht is en op ongeveer 1,5 cm van het zeil. Repareren met papieren rompslomp.

4. whisker stimulatie

  1. Verbinden met de inlaat van de flexibele pijp van een perslucht bron (1 bar) een solenoïde controle klep input en de pijp van de afvoer naar de solenoïde controle klep uitvoer (Figuur 3). Te zorgen dat de controle magneetventiel buiten de kamer van de magneet blijft.
  2. Steek het pulserende apparaat in de magneetklep en in de magneet met behulp van de transistor-transistor-logic (TTL)-poort. Configureren zodat de pulserende frequentie = 8 Hz, de pulserende tijd = 20 s, en de rust keer = 10 s.
    Opmerking: Deze parameters, gevisualiseerd op de kleine vloeibare kristallen (LCD) scherm, zijn instelbaar via de drie specifieke analogisch potentiometers. De elektronische pulserende inrichting, met behulp waarvan het paradigma, moet worden samengesteld uit kwalitatief hoogwaardige elektronische componenten om te voorkomen dat eventuele drift in tijdparameters (voor juiste postprocessing).

5. vet fMRI overname

  1. Plaats de rat hersenen zodat er in een verticale positie en gebruik van de oor-balken te handhaven. Plaatsen van de spoel matrix volume boven de rat's hoofd (figuur 4A) en repareren met behulp van tape. Controleer dat het zeil goed beweegt (anteroposterior beweging, geen rotatie en geen wrijving van zeil) wanneer het lucht-bladerdeeg-systeem is ingeschakeld op; vervolgens, om het uitte schakelen.
  2. Het bed en de spoel invoegen in het midden van de magneet. Controleer of het zeil nog steeds goed is zodra het bed binnen de magneet is als de lucht-bladerdeeg-systeem is op; vervolgens, om het uitte schakelen. Volledig overschakelen van Isofluraan naar medetomidine (perfusie tarief: 20 µL/min).
  3. Controleer dat de rat goed is gelegen met behulp van een reeks van lokalisatie (TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; gemiddelde = 1; herhaling = 1; segment = 1 mm; Afbeeldingsgrootte = 256 x 256; Beeldveld (FOV) = 50 x 50 mm; Scan tijd = 12 s 800 ms). Sleep de tab van de volgorde van de Localizer in de instructie naam en klik op Doorgaan.
  4. Sleep de tab van de volgorde van de T2_Star_FID_EPI in de naam van de instructie, centrum de FOV op het midden van de hersenen, en klik op de tab aanpassing platform de bewerkte scan-instructie. Opnemen van een B0 -kaart en ga naar een scan shim.
    Opmerking: Voor een B0 kaart, gebruikt u de volgende parameters: echo eerst = 1.65 ms; TR = 20 ms, gemiddelde = 1; spiegelen hoek = 30°; ECHO afstand = 3.805 ms; segment = 58 mm; Afbeeldingsgrootte = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; Scan tijd = 1 m 24 s 920 ms. voor scan shim, gebruik de volgende parameters: voxel selectieve excitatie = stoom Gaussian pols; TE = 5 ms; mengen van tijd = 10 ms; overname duur = 204.8 ms; bandbreedte = 10.000 Hz; Nadruktijd = 50 µs).
  5. Start de T2 Star_FID_EPI volgorde (TE = 16.096 ms; TR = 500 ms; gemiddelde = 1; herhaling = 600; segment = 1 mm; vier opeenvolgende segmenten; Afbeeldingsgrootte = 128 x 128; FOV = 20 x 20 mm; bandbreedte = 333,333.3 Hz; Scan tijd = 5 min 00 s).
    Opmerking: Als gevolg van de TTL-poort, een externe trigger signaal zal beginnen met de lucht-bladerdeeg systeem op hetzelfde moment. Het paradigma = [20 s activatie + 10 s rest] x 10, voor de totale duur van de 600 scans, 500 ms per scan. De segmenten zijn gecentreerd op het midden van het gebied van het vat.
  6. Het verwerven van een andere lokalisatie-reeks (hetzelfde als de één wordt beschreven in stap 5.3) te vergelijken met de eerste en te controleren of de rat heeft verplaatst tijdens de T2_Star_FID_EPI volgorde.
  7. Het bed in zijn oorspronkelijke positie te brengen, de spoel van de matrix volume verwijderen en sluit de oppervlakte spoel.

6. vet Processing

  1. Open het bestand Star_FID_EPI van de T2 en lees de T2 Star_FID_EPI afbeelding in Beeldweergave. Open het venster van de start-up van de functionele controller, genaamd FunController.
  2. In dit tabblad verwerking , selecteer het functionele beeldvorming venster en definiëren van het protocol van de stimulatie (duur en afwisseling van On/Off punten, overeenkomt met het paradigma gebruikt).
  3. Selecteer het protocol venster (dataset met 600 frames) en de waarde 40 in het tabblad Op periode en 20 in de Off periode tab. Klik op het tabblad Omkeren Naamsvermelding invoegen en sleep de schuifregelaar van de Stimulatie Staten aan de linkerkant om te selecteren de waarde 1.
  4. Klik op het filter van de mediaan in vlak voor het voorbewerken en op het filter mediaan (2D, 3D) voor postprocessing in het pre-processing venster.
  5. Klik op het tabblad uitvoeren en sleep de cursors om aan te passen de opzoektabel overlay. Visualiseer het gebied van de hersenen geactiveerd (figuur 4B).

7. proton mevrouw acquisities

  1. Wijzigen om de juist positie de oppervlakte spoel, de positie van het hoofd van de rat. Draai het hoofd (ongeveer 30° met de klok mee) zo dat de oppervlakte spoel (figuur 5A) kan worden geplaatst net boven de linker vat cortex terwijl het horizontale en gelegen in het midden van de magneet als binnen de magneet.
  2. Plaats de oppervlakte spoel, eraan op de hersenen van de rat met behulp van tape (figuur 5B) en controleer dat het zeil goed beweegt (anteroposterior beweging, geen rotatie en geen wrijving van het zeil) wanneer het lucht-bladerdeeg-systeem is ingeschakeld op; vervolgens uitschakelen op de hoofdschakelaar.
  3. Controleer of het zeil goed beweegt zodra het bed binnen de magneet is wanneer het lucht-bladerdeeg-systeem ingeschakeld is. Vervolgens, om het uitte schakelen.
  4. Controleer is de rat gepositioneerd correct met behulp van een reeks van lokalisatie. Stel parameters als volgt: TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; gemiddelde = 1; herhaling = 1; segment = 1 mm; Afbeeldingsgrootte = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm; Scan tijd = 12 s 800 ms.
    1. Sleep de tab van de volgorde van de Localizer in het venster instructie naam en klik op het tabblad Doorgaan naar het scan programma niet uitvoeren.
  5. Wanneer de hersenen lokalisatie klopt, Sleep de tab van de volgorde van de T2_TurboRARE in het venster instructie naam en klik op Doorgaan om het scan programma niet uitvoeren. Deze anatomische beelden, samen met de vorige vet fMRI overname, voorziet in de juiste lokalisatie van de voxel in de S1BF MRS.
    Opmerking: De T2_TurboRARE parameters zijn 14 segmenten, 2 mm per segment, FOV = 2,5 x 2,5 cm, TE = 100 ms, TR = 5000 ms, matrix = 128 x 128, volgorde tijd = 2 min 40 s.
  6. Sleep de tab van de volgorde van de LASER in het venster naam van instructie , plaatst u de voxel (2,5 mm lang, 2 mm hoog, 3 mm diep) in het midden van het S1BF-gebied.
    1. Een rat hersenen atlas en de verhoging van de vet fMRI gebruiken om te lokaliseren van de zone op de T2 beelden (Figuur 6). Klik op de tab aanpassing platform de bewerkte scan-instructie. Klik op het tabblad wiebelen en wijzigen van de impedantie (elektronische laden) van de ontvangen spoel iets naar het afstemmen. Klik op het tabblad toepassen wanneer de tuning is klaar met de instructie-editor sluiten en breng de wijzigingen aan in de bewerkte instructie.
  7. Opnemen van een B0 -kaart en ga naar de scan shim en voer vervolgens een lokale shim.
    Opmerking: Voor de B0 kaart, gebruikt u de volgende parameters: echo eerst = 1.65 ms; TR = 20 ms, gemiddelde = 1; spiegelen hoek = 30°; ECHO afstand = 3.805 ms; segment = 58 mm; Afbeeldingsgrootte = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; Scan tijd = 1 m 24 s 920 ms. voor de scan shim, gebruik de volgende parameters: voxel selectieve excitatie stoom Gaussian pols; TE = 5 ms; mengen van tijd = 10 ms; overname duur = 204.8 ms; bandbreedte = 10.000 Hz; Nadruktijd = 50 µs. Voor de lokale shim, gebruik de volgende parameters: water van onderdrukking, damp overname duur = 1,363.15 ms; punten = 4.096; bandbreedte in Hz = 3,004.81 Hz; bandbreedte in ppm = 10 ppm; Nadruktijd = 166.40 µs; spectrale resolutie = 0,37 Hz/punten. De LASER parameters zijn: echo tijd = 19.26 ms; TR = 2.500 ms; gemiddeld = 128 of 32; Scan tijd = 5 min 20 s of 1 min 20 s; overname punten = 4.096.
  8. 1H-mevrouw uitvoeren
    1. Start de 1H-mevrouw overname eerst gedurende een periode van rust (4 x 32 LASER scans + 128 LASER scant; 2.500 ms per scan).
    2. Een andere reeks van lokalisatie (hetzelfde als de één wordt beschreven in stap 5.3) verwerven om te vergelijken met de eerste opgenomen en ervoor te zorgen dat de rat niet bij de overname van LASER heeft verplaatst.
    3. 1H-mevrouw uitvoeren tijdens het friemeltje activeren met behulp van de LASER-reeks (4 x 32 LASER scans + 128 LASER scant; 2.500 ms per scan) met het systeem van de lucht-bladerdeeg op (paradigma = 20 s van activering en 10 s van rest).
    4. Nogmaals, voeren een localisatie-reeks om te controleren of de rat heeft verplaatst.
      Opmerking: Het aantal scans en rusten/geactiveerd perioden kan worden aangepast en gewijzigd, maar zorg er altijd voor dat de rat niet bewegen is door het regelmatig uitvoeren van een reeks van lokalisatie.
  9. Het bed in zijn oorspronkelijke positie brengen, verwijderen van de oppervlakte spoel en de rat teruggaan naar de Bank. Injecteren atipamezole in een huid vouw gemaakt in de rat terug te keren van de narcose en het ontwaken.

8. proton mevrouw Processing

  1. Open de software van de LCModel en klik op het gewenste tabblad om te selecteren van het juiste gegevenstype ( Free Induction Decay -bestand) en kies het juiste bestand. Klik op het tabblad OK wanneer dit is gedaan.
  2. Optimaliseer de afstellingsparameters kwantificering stap voor stap.
    1. In de sectie titel handmatig Geef een titel en een voldoende ppm bereik (bijvoorbeeld, 0.2 tot 4.0 ppm) definiëren door handmatig te typen in de gewenste waarde in de respectieve gebieden.
    2. In de sectie Basis bestand selecteert en downloadt het vereiste bestand aanpassen aan de basislijn macromolecule correct (het kan worden verstrekt door de software-aanbieder).
    3. Definiëren en laadt u de parameters invoercontrole. Bereiden van het opslaan van alle nuttige bestandstypen vooraf (tabel = compact tabellen; PS = nodig PostScript-uitvoer; CSV = formaat voor werkbladen; COORD = coördinaten van de percelen). Klik op de tab van de RunLCModel om te beginnen de kwantificering van de LCModel.
  3. Define geselecteerde metabolieten voor het genereren van statistieken.
    Opmerking: LCModel biedt metaboliet kwantificering en schattingen van fouten door een waarde Cramer-Rao ondergrens (CRLB) genoemd. Een waarde met een CRLB < 15 wordt beschouwd als een optimale kwantificering. Een CRLB > 25 verwijst naar een onbetrouwbare waarde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol staat toe de kwantificering van de metaboliet schommelingen tijdens de cerebrale activering, die wordt verkregen door juiste friemeltje stimulatie rechtstreeks in de magneet.

In deze studie was het algemene doel van vet fMRI om te controleren dat de Bakkebaard stimulatie efficiënt was, te visualiseren de geactiveerde S1BF-gebied, en om correct vinden de voxel voor 1H-fMRS. Het apparaat gebouwd voor friemeltje activering is efficiënt. Inderdaad, wanneer de juiste snorharen werden gestimuleerd met behulp van de zelfgemaakte lucht-bladerdeeg-systeem, een positief signaal van vet werd ontdekt in de linker vat cortex (figuur 4B), ook genoemd de S1BF, voor het veld somatosensorische vat (n = 8). Een positief signaal verbetering is opgetreden in de cortex van de linker vat in acht van de acht ratten, overwegende dat alleen achtergrond werd ontdekt in de juiste hemisferen. Wanneer vet fMRI werd uitgevoerd zonder friemeltje stimulatie, werd geen signaal verbetering waargenomen links of in het recht S1BF.

In een vergelijking tussen anatomische heer beelden en rat hersenen atlas regelingen8kunt de geactiveerde hersenen gevisualiseerd door vet fMRI de voxel worden geplaatst in het S1BF gebied, dat wordt geactiveerd tijdens friemeltje stimulatie. Deze voxel is gelegen op drie opeenvolgende dia's (1 mm dik), aangezien de cortex vat 3 mm lang. Wanneer de hersenen dia is vrijwel in vier kwarten verdeeld, de voxel bevindt zich in de linksboven kwartaal op een ongeveer 45° hoek (Figuur 6).

Wanneer het paradigma voor friemeltje stimulatie was ingeschakeld, een toename van de lactaat inhoud werd waargenomen in de linker S1BF (Figuur 6, typische spectra verkregen in een rat). Om beter te visualiseren metabole schommelingen tussen rust en geactiveerde perioden, een spectrale aftrekken werden uitgevoerd (Figuur 6). Uit dit afgetrokken spectrum, was de stijging van de lactaat inhoud met het activeren van de hersenen gevisualiseerd veel gemakkelijker, terwijl in deze rat, was het N-acetylaspartate (NAA) signaal licht gedaald. Verhoging van de lactaat tijdens neuronale stimulatie werd ook waargenomen op de spectral deconvolutie (figuur 7AB). Terwijl de lactaat piek nauwelijks op het spectrum in vivo onbeweeglijk aangetroffen is, kon LCModel kwantificeren (figuur 7A) met nauwkeurigheid en goede CRLB waarden. Inderdaad, had slechts één spectrum uit 23 ratten, een CRLB-waarde voor lactaat kwantificering gelijk is aan 24. > 25 was geen sprake van. Voor alle andere spectra, de waarden die varieerde van 3 tot 19.

De variaties in lactaat gehalte in alle 23 ratten worden gepresenteerd in Figuur 8. Uit 23 ratten, werd een afname van de lactaat inhoud alleen in een rat waargenomen. Was er een statistisch significant verschil in lactaat content tussen rust en geactiveerde perioden (0.132 ± 0,012 en 0.163 ± 0.011, respectievelijk waarden familieleden aan PCr + Cr inhoud, gepaarde t-test, p = 0.0005 [parametrische, tweezijdige] n = 23). Daarom werd een 31,6% ± 7,8% toename in lactaat inhoud gemeten tijdens de neuronale stimulatie.

Een lichte afname van de NAA inhoud kan worden waargenomen in Figuur 6, die typische spectra verkregen in één dier vertegenwoordigt. Deze variatie NAA was echter niet significant (een daling met 1,2% ± 1,2% werd gemeten, n = 23).

Figure 1
Figuur 1: apparatuur en stappen voor anesthesie. (A) afbeelding van de apparatuur worden voorbereid voordat de verdoving. (B) Isofluraan pomp en inductie kamer. (C) Tourniquet plaatsing. (D) foto toont dat de katheter is correct ingevoegd; Opmerking de druppel bloed in de naald van de katheter, die een positief teken van een juiste locatie in de ader is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Whisker stimulatie. Oke snorharen zijn gevangen in een zeil dat is gemaakt met papieren rompslomp. Het zeil staat oke snorharen worden gestimuleerd op hetzelfde moment met de lucht-bladerdeeg-systeem en, dus, maximaliseert de neuronale activering van de cortex van het vat. De uitlaat van de lucht-bladerdeeg systeem (zwarte buis) moet worden gevestigd rond de 1.5 cm en loodrecht op het zeil. Selectievakje buiten de magneet om ervoor te zorgen dat het zeil in beweging is correct door te draaien aan de lucht-bladerdeeg-systeem op. Het zeil moet bij 8 Hz verplaatsen in de richting van een anteroposterior (geen rotatie). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Air-bladerdeeg systeem voor friemeltje stimulatie. (A) A flexibele pijp verbindt de samengeperste lucht met (B) de magneetklep voor controle. Een tweede flexibele pijp brengt gepulseerde lucht van de solenoïde controle klep uitvoer naar het zeil. De magneetklep voor de controle is op de pulserende inrichting, met behulp waarvan het paradigma aangesloten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: BOLD fMRI. (A) Volume array plaatsing van de spoel. De kop van de rat is in een horizontale positie en geblokkeerd door oor bars. Controleer of het zeil vrij bewegen is en niet wordt geblokkeerd door de spoel of door de MRI-bed. (B) een typische vet signaal in de cortex geactiveerd links vat (rode pijl). Geen signaal is gevonden in de contralaterale rechter hersenhelft (blauwe pijl). De drempel is vastgesteld op 76,5% van het maximumbedrag van de intensiteitswaarde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: oppervlakte spoel. (A) afbeelding van de oppervlakte spoel gebruikt in deze studie. (B) oppervlakte spoel plaatsing. De rat hoofd moet iets zijn ingeschakeld zodat de linker vat cortex en dus de oppervlakte spoel bevinden zich in het midden van het bed van de MRI (de kop staat onder een hoek van ongeveer 30°, een goed compromis tussen de juiste locatie van de cortex van de linker vat voor de surfa CE-spoel en vrije bewegingen van het zeil van de juiste snorharen, die moeten niet worden geblokkeerd door de MRI-bed). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: typisch gelokaliseerd 1H-mevrouw onbeweeglijk (blauwe spectrum) en tijdens de Bakkebaard activering (rode spectrum). De voxel (groene vierkantje) bevindt zich in de linker S1BF op de anatomische T2_TurboRARE beelden met behulp van rat hersenen atlas regelingen en signaal versterking op vet fMRI beelden. De spectrale aftrekken wordt uitgezet in het zwart. Lactaat en N-acetylaspartate (NAA) pieken zijn vermeld volgens 1,32 en 2.02 pag/min, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: typische spectral deconvolutie van MRS spectra. (A) deconvolutie van een 128-scan rest spectrum. (B) deconvolutie voor een 128-scan geactiveerd spectrum. Residu, aftrekken tussen experimentele spectrum (onbewerkte gegevens), en de LCModel passen; MM = macromolecule; CR = creatine + phosphocreatine; PCho + GPC = fosfocholine + glycerophosphocholine; NAA = N-acetylaspartate; Lac = lactaat; GABA = γ-aminoboterzuur; GLN = glutamine; Glu = glutamaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: variaties in lactaat gehalte tijdens hersenstimulatie. Blauwe stip: lactaat inhoud onbeweeglijk, bepaald door de LCModel en ten opzichte van de creatine + phosphocreatine inhoud. Rode stip: inhoud lactaat tijdens friemeltje stimulatie, bepaald door de LCModel en ten opzichte van de creatine + phosphocreatine inhoud. Het verschil tussen geactiveerd en rusten, p = 0.0005, gepaarde t-test (parametrische, tweezijdige), n = 23. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De vat cortex, ook wel genoemd S1BF voor de Somatosensorische cortex of vat veld, is een regio binnen de corticale laag IV die kan worden waargenomen met behulp van cytochroom c oxidase kleuring9, en de organisatie is bekend sinds het grotendeels beschreven 10,11. Een vibrissa is verbonden met één vat, waarop ongeveer 19.000 neuronen zijn georganiseerd in een kolom12. De Bakkebaard-naar-vat cortex-traject heeft verschillende voordelen. Eerst, kan deze worden geactiveerd binnen de magneet met behulp van een MRI-compatibele lucht-bladerdeeg systeem, die kan gemakkelijk zelfgemaakte (om ervoor te zorgen dat in het grootste deel van het S1BF-gebied, hetgeen overeenkomt met ongeveer de grootte van de voxel waarin MRS is uitgevoerd, alle snorharen zijn geperst in een zeil waarmee de stimulatie van een maximum van vibrissa). Ten tweede, rechts friemeltje activering leidt tot activering van de cortex van het linker vat, en dit gebied van de hersenen bevindt zich in de Somatosensorische cortex, waarmee het gebruik van een hoog-gevoelige oppervlak spoel. Ten derde is deze methode voor het activeren van de Somatosensorische cortex noninvasive vergeleken met elektrische paw stimulatie, de laatste die het nadeel van het stimuleren van andere breinstructuur, waaronder enkele van de rechter hersenhelft13. Het protocol gebruikt hier daarom de meest geschikte voor het uitvoeren van een in vivo noninvasive en longitudinale studie van het metabolisme van de hersenen onder cerebrale activering.

De keuze van de verdoving is van cruciaal belang, zoals veel van verdoving veranderingen bij neurovasculaire koppeling, de stofwisseling van de hersenen, en/of de14,15van de activiteit van de hersenen veroorzaken. Bijvoorbeeld Isofluraan, de meest voorkomende verdovingsmiddel gebruikt voor MRI, leidt tot een drie-tot zesvoudig toename van de hersenen lactaat inhoud15,16 en moet daarom niet worden gebruikt in hersenen metabole studies. Medetomidine is een alpha2-adrenoreceptor-agonist, die betrouwbare sedatie, analgesie, ontspanning van de spieren en anxiolysis17 induceert. Deze effecten kunnen snel worden teruggedraaid met behulp van atipamezole, een alpha2-antagonist. Medetomidine is de beste kandidaat voor het uitvoeren van functionele studies in knaagdieren18 omdat het heeft een zeer lage impact op het vet signaal en de laagste wijzigingen in hersenen metaboliet inhoud.

Het is ook belangrijk te volgen van het paradigma van de activering friemeltje correct. Aangezien NMR acquisities enkele minuten duren, is het gebruik van opeenvolgende activering/rusttijden essentieel voor het beperken van de desensibilisatie van neuronen in de hersenen geactiveerd. De parameters van dit paradigma (20 s van activering gevolgd door een rusttijd van 10 s) werden gekozen om te verkrijgen van de hoogste vet fMRI-signaal in de overeenkomstige vat cortex. Veel zorg moet men zich deze tijd om windows te respecteren aangezien het is van cruciaal belang om te bepalen van de geactiveerd/rusttijd voor BOLD behandeling, zelfs als het is gecontroleerd door de TTL-poort. Om op te halen van een hoog niveau van vat de activering van de cortex, het zeil dat groepen de snorharen samen is ook belangrijk omdat het toelaat het grootste deel van het S1BF gebied te worden gestimuleerd. Veel zorg moet men zich de luchtslang outlet voor dit zeil plaatsen zodat het op een anteroposterior vliegtuig bewegen kan. De frequentie moet zorgvuldig worden gekalibreerd, aangezien gebleken is dat neuronen in de cortex van het vat worden geactiveerd wanneer friemeltje stimulatie frequentie tussen 5 en 15 Hz-19 is. Met behulp van een lagere of hogere frequentie leidt niet tot de activering van het S1BF-gebied.

Het protocol dat wordt gebruikt in deze studie maakt het mogelijk om het vergelijken van spectra verworven in het zelfde gebied van de hersenen in rust en tijdens hersenstimulatie en, dus, als u wilt controleren metabole veranderingen gekoppeld aan cerebrale activering. Het is belangrijk voor het uitvoeren van een localisatie reeks aan het begin en aan het eind van de NMR spectroscopie protocol, om ervoor te zorgen dat het dier niet heeft verplaatst en dat de verschillen in metabole inhoud gemeten tussen de rust- en geactiveerde landen te wijten aan de hersenen zijn stimulatie en geen bewegingsartefacten.

Met het protocol beschreven hierin, een toename van de lactaat inhoud werd gemeten tussen rust en geactiveerd perioden. Verhoging van de lactaat met behulp van in-vivo NMR spectroscopie tijdens de activering van de hersenen werd voor het eerst waargenomen bij de mens in de vroege jaren 199020,-21. Echter, de meeste metingen werden uitgevoerd in mensen in plaats van knaagdieren, waarin de signal-to-noise verhouding veel lager is. In de rat, werd ex vivo NMR kwantificering van lactaat tijdens de activering van de hersenen van de rat uitgevoerd door Mazuel et al. 22, die de waargenomen toename van hersenen lactaat inhoud met neuronale activering. De resultaten hier gepresenteerd blijkt dat lactaat werd verhoogd tijdens de activering van de Bakkebaard. Echter aangezien gelokaliseerde MRS cellulaire resolutie niet mogelijk, is het nog onbekend welke cellulaire compartiment lactaat is komen (neuronen of astrocyten). Ga verder in het begrip van cerebrale metabole uitwisselingen, zoals de nog besproken ANLSH (Astrocyt-neuron lactaat shuttle hypothese), moet dit protocol worden toegepast op genetisch gemodificeerde dieren ten behoeve van de hoofdcomponenten in deze shuttle, zoals de monocarboxylate vervoerders.

In de studie die hier worden beschreven, werd geen statistisch significant verschil in NAA inhoud waargenomen. Een afname van de NAA inhoud tijdens visuele stimulatie was eerder gevonden in mens23,24,25, maar niet bevestigd door Mangia en Tkac26. In de huidige studie zien we een toename van de NAA inhoud tijdens de activering van de hersenen in 50% van de ratten en een daling in de andere helft. NAA moet daarom worden vermeden als de interne referentie voor kwantificering tijdens functionele MRS. No andere variatie in metaboliet inhoud werd ontdekt.

Beide lactaat en NAA variaties tijdens de neuronale activering hebben geleid tot controverses23,26,27,28,29. Ter bevordering van ons begrip van deze metabole schommelingen gekoppeld aan hersenactiviteit, zou het interessant zijn om dit protocol van toepassing op transgene dieren. Dit zou nadere informatie over het onderliggende proces. Algemene, gelokaliseerde 1H-mevrouw tijdens een taak- of functionele MRS29, is een opkomende techniek in knaagdieren, relevant zijn voor de studie van regionale dynamische veranderingen in metabolieten in normale of pathologische hersenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de subsidie LabEx TRAIL referentie ANR-10-LABX-57, en een Frans-Zwitsers ANR-FNS verlenen referentie ANR-15-CE37-0012. De auteurs bedanken Aurélien Trotier voor zijn technische ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL syringe with needle Becton, Dickinson and Company, USA 2020-10 0.33 mm (29 G) x 12.7 mm
1H spectroscopy surface coil Bruker, Ettlingen, Germany T116344
7T Bruker Biospec system Bruker, Ettlingen, Germany 70/20 USR
Arduino Uno based pulsing device custom made
Atipamezole Vétoquinol, S.A., France V8335602 Antisedan, 4.28 mg
Breathing mask custom made
Eye ointment TVM laboratoire, France 40365 Ocry gel 10 g
Induction chamber custom made 30x17x15 cm
Inlet flexible pipe Gardena, Germany 1348-20 4.6-mm diameter, 3m long
Isoflurane pump, Model 100 series vaporizer, classic T3 Surgivet, Harvard Apparatus WWV90TT from OH 43017, U.S.A
Isoflurane, liquid for inhalation Vertflurane, Virbac, France QN01AB06 1000 mg/mL
KD Scientific syringe pump KD sientific, Holliston, USA Legato 110
LCModel software LCModel Inc., Ontario, Canada 6.2
Medetomidine hydrochloride Vétoquinol, S.A., France QN05CM91 Domitor, 1 mg/mL
Micropore roll of adhesive plaster 3M micropore, Minnesota, United States MI912
Micropore roll of adhesive plaster 3M micropore, Minnesota, United States MI925
Monitoring system of physiologic parameter SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA Model 1025
NaCl Fresenius Kabi, Germany B05XA03 0.9 % 250 mL
Outlet flexible pipe Gardena, Germany 1348-20 4.6-mm diameter, 4m long
Paravision software Bruker, Ettlingen, Germany 6.0.1
Peripheral intravenous catheter Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon SP500930S 22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min
Rat head coil Bruker, Ettlingen, Germany
Sodic heparin, injectable solution Choai, Sanofi, Paris, France B01AB01 5000 IU/mL
Solenoid control valves, plunger valve 2/2 way direct-acting Burkert, Germany 3099939 Model type 6013
Terumo 2 ml syringe Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon SY243 with 21 g x 5/8" needle
Terumo 5 mL syringe Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon 05SE1
Wistar RJ-Han rats Janvier Laboratories, France

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55, 1251-1262 (2007).
  2. Pellerin, L., Magistretti, P. J. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10625-10629 (1994).
  3. Cholet, N., et al. Local injection of antisense oligonucleotides targeted to the glial glutamate transporter GLAST decreases the metabolic response to somatosensory activation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 404-412 (2001).
  4. Voutsinos-Porche, B., et al. Glial Glutamate Transporters Mediate a Functional Metabolic Crosstalk between Neurons and Astrocytes in the Mouse Developing Cortex. Neuron. 37, 275-286 (2003).
  5. Zimmer, E. R., et al. [18F]FDG PET signal is driven by astroglial glutamate transport. Nature Neuroscience. 20, (3), 393-395 (2017).
  6. Haiss, F., et al. Improved in vivo two-photon imaging after blood replacement by perfluorocarbon. The Journal of Physiology. (2009).
  7. Mullins, P. G. Towards a theory of functional magnetic resonance spectroscopy (fMRS): A meta-analysis and discussion of using MRS to measure changes in neurotransmitters in real time. Scandinvian Journal of Psychology. 59, 91-103 (2018).
  8. Rat Brain Atlas. Available from: http://Labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas/ (2018).
  9. Wong-Riley, M. T., Welt, C. Histochemical changes in cytochrome oxidase of cortical barrels after vibrissal removal in neonatal and adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77, 2333-2337 (1980).
  10. Petersen, C. C. The functional organization of the barrel cortex. Neuron. 56, 339-355 (2007).
  11. Cox, S. B., Woolsey, T. A., Rovainen, C. M. Localized dynamic changes in cortical blood flow with whisker stimulation corresponds to matched vascular and neuronal architecture of rat barrels. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13, 899-913 (1993).
  12. Feldmeyer, D. Excitatory neuronal connectivity in the barrel cortex. Frontiers in Neuroanatomy. 6, 24 (2012).
  13. Boussida, S., Traore, A. S., Durif, F. Mapping of the brain hemodynamic responses to sensorimotor stimulation in a rodent model: A BOLD fMRI study. PLoS One. 12, e0176512 (2017).
  14. Heinke, W., Koelsch, S. The effects of anesthetics on brain activity and cognitive function. Current Opinion in Anesthesiology. 18, 625-631 (2005).
  15. Horn, T., Klein, J. Lactate levels in the brain are elevated upon exposure to volatile anesthetics: a microdialysis study. Neurochemistry International. 57, 940-947 (2010).
  16. Boretius, S., et al. Halogenated volatile anesthetics alter brain metabolism as revealed by proton magnetic resonance spectroscopy of mice in vivo. Neuroimage. 69, 244-255 (2013).
  17. Sinclair, M. D. A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice. Canadian Veterinary Journal. 44, 885-897 (2003).
  18. Weber, R., et al. A fully noninvasive and robust experimental protocol for longitudinal fMRI studies in the rat. Neuroimage. 29, 1303-1310 (2006).
  19. Hartmann, M. J., Johnson, N. J., Towal, R. B., Assad, C. Mechanical characteristics of rat vibrissae: resonant frequencies and damping in isolated whiskers and in the awake behaving animal. The Journal of Neuroscience. 23, 6510-6519 (2003).
  20. Prichard, J., et al. Lactate rise detected by 1H NMR in human visual cortex during physiologic stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 5829-5831 (1991).
  21. Sappey-Marinier, D., et al. Effect of photic stimulation on human visual cortex lactate and phosphates using 1H and 31P magnetic resonance spectroscopy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 12, 584-592 (1992).
  22. Mazuel, L., et al. A neuronal MCT2 knockdown in the rat somatosensory cortex reduces both the NMR lactate signal and the BOLD response during whisker stimulation. PLoS One. 12, e0174990 (2017).
  23. Castellano, G., et al. NAA and NAAG variation in neuronal activation during visual stimulation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 45, 1031-1036 (2012).
  24. Sarchielli, P., et al. Functional 1H-MRS findings in migraine patients with and without aura assessed interictally. Neuroimage. 24, 1025-1031 (2005).
  25. Baslow, M. H., Hrabe, J., Guilfoyle, D. N. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 32, 235-245 (2007).
  26. Mangia, S., Tkac, I. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 245-248 (2008).
  27. Baslow, M. H., Hrabal, R., Guilfoyle, D. N. Response of the authors to the Letter by Silvia Mangia and Ivan Tkac. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 247-248 (2008).
  28. Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 347-350 (2018).
  29. Bak, L. K., Walls, A. B. CrossTalk opposing view: lack of evidence supporting an astrocyte-to-neuron lactate shuttle coupling neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 351-353 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics