Funktionell magnetresonans-spektroskopi på 7 T i råtta fat Cortex under morrhår aktiveringen

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Efter kontroll av blod-syre-nivå-beroende funktionell magnetisk resonanstomografi (fet fMRI) som motsvarande somatosensoriska fat fältet cortex område (kallas S1BF) är korrekt aktiverad, viktigaste målet med denna studie är att kvantifiera Laktathalten fluktuationer i aktiverade råtta hjärnor av lokaliserade proton magnetisk resonans spektroskopi (1H-MRS) på 7 T.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blanc, J., Roumes, H., Mazuel, L., Massot, P., Raffard, G., Biran, M., Bouzier-Sore, A. K. Functional Magnetic Resonance Spectroscopy at 7 T in the Rat Barrel Cortex During Whisker Activation. J. Vis. Exp. (144), e58912, doi:10.3791/58912 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kärnmagnetisk resonans (NMR) erbjuder möjlighet att mäta cerebral metabolit innehållet i vivo och noninvasivt. Tack vare teknisk utveckling under det senaste decenniet och ökningen av magnetisk fältstyrka är det nu möjligt att få bra upplösning spectra i vivo i råtthjärna. Neuroenergetics (dvs., studier av hjärnans metabolism) och, särskilt, metaboliska interaktioner mellan de olika celltyper har lockade mer och mer intresse under de senaste åren. Bland dessa metaboliska interaktioner, är förekomsten av laktat transfer mellan nervceller och astrocyter fortfarande omdebatterat. Det är därför av stort intresse att utföra funktionella proton magnetisk resonans spektroskopi (1H-MRS) i en råtta modell av hjärnan aktivering och övervaka laktat. Dock metyl laktat toppen överlappar lipid resonanstoppar och är svårt att kvantifiera. Protokollet beskrivs nedan tillåter metabola och laktat fluktuationer som ska övervakas i ett aktiverat hjärnområde. Cerebral aktiveringen erhålls genom morrhår stimulering och 1H-MRS utförs i motsvarande aktiverade fat cortex, vars område detekteras med hjälp av blod-syre-nivå-beroende funktionell magnetisk resonanstomografi (fet fMRI). Alla stegen fullt beskrivs: valet av bedövningsmedel, spolar och sekvenser, att uppnå effektiv morrhår stimulering direkt i magnet och databehandling.

Introduction

Hjärnan besitter inneboende mekanismer som gör att regleringen av dess stora substrat (dvs, glukos), både för dess bidrag och kapacitetsutnyttjande, beroende på variationer i lokal cerebral aktivitet. Glukos är den främsta energi substraten för hjärnan, har experiment utförts under de senaste åren visat att laktat, som produceras av astrocyterna, kan vara en effektiv energi substrat för nervceller. Detta väcker hypotesen om en laktat transfer mellan astrocyter och nervceller1. Känd som ANLS, för Astrocyten-neuron laktat transfer2, teorin diskuteras fortfarande högt men har lett till förslaget att glukos, i stället för att gå direkt in i nervceller, kan ange astrocyterna, där det metaboliseras till laktat, en metabolit som är , sedan, överförs till nervceller, som använder det som effektiv energi substrat. Om sådan en pendelbuss finns i vivo, skulle det ha flera viktiga konsekvenser, både för att förstå grundläggande tekniker i funktionell cerebral imaging (positronemissionstomografi [sällskapsdjur]) och för att dechiffrera de metaboliska förändringar som observerats i hjärnans sjukdomar.

Att studera hjärnans metabolism och i synnerhet, metaboliska interaktioner mellan nervceller och astrocyter, fyra huvudsakliga tekniker är tillgänglig (inte inklusive mikro-/ nanosensorer): autoradiografi, PET, två-photon fluorescerande konfokalmikroskopi och MRS. Autoradiografi var en av de första metoder som föreslås och ger bilder av regionala ansamling av radioaktivt 14C-2-deoxyglucose i hjärnan skivor, medan PET avkastning i vivo bilder av det regionala upptaget av radioaktivt 18 F-deoxyglucose. De båda har nackdelen med att använda irradiative molekyler samtidigt som det producerar bilder med låg-spatial upplösning. Två-foton mikroskopi cellulära lösning av fluorescerande sonder, men ljusspridning av vävnad begränsar imaging djupet. Dessa tre tekniker har tidigare använts för att studera neuroenergetics hos gnagare under morrhår stimulering3,4,5,6. In vivo MRS har den dubbla fördelen av att vara icke-invasiv och nonradioactive, och någon hjärnstruktur kan utforskas. MRS kan dessutom utföras under neuronal aktivering, en teknik som kallas funktionell MRS (fMRS), som har utvecklats mycket nyligen i gnagare7. Därför föreslås ett protokoll för att övervaka hjärnans metabolism under cerebral aktivitet av 1H-MRS i vivo och noninvasivt. Förfarandet beskrivs i vuxna friska råttor med hjärnans aktivering erhålls genom en luft-puff morrhår stimulering utförd direkt i 7 T (herr) magnetkamera men kan anpassas i genetiskt modifierade djur samt i alla sjukdomstillstånd .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur förfaranden genomfördes enligt de riktlinjer som djur experiment av Europeiska gemenskapernas direktiv av den 24 November 1986 (86/609/EEG). Protokollet träffade de etiska riktlinjerna av det franska ministeriet för jordbruk och skogar och godkändes av de lokala etiska kommittéerna (Comité d 'éthique pour L' expérimentation Animale Bordeaux n ° 50112090-A).

Obs: Under herr mätningarna, adekvat anestesi och fysiologiska övervakning (kroppstemperatur, andningsfrekvens) är oundgängligt krav.

1. djur

  1. Använda manliga Wistar råttor som väger mellan 350 och 450 g.
  2. Hålla dem på en 12:12 h ljus: mörk cykel och ge mat och vatten ad libitum.

2. anestesi

  1. Förbereda den utrustning som behövs för anestesi (figur 1A, B, se Tabell för material): en 5 mL spruta innehåller Medetomidin i fysiologisk koksaltlösning lösning (240 µg/kg/h, med perfusion 20 µL/min), en 0,5 mL spruta som innehåller atipamezol (20 μL, i 0,5 mL koksaltlösning) och ögonsalva.
    Obs: Hålla all utrustning under extractor huven, utom 5 mL sprutan innehållande Medetomidin, som placeras i sprutpumpen nära magneten för anestesi under herr förvärv.
  2. Placera råtta i induktion kammaren, starta anestesi genom att leverera 4% isofluran och justera syre flödet till 1,5 L/min.
  3. Utvärdera djup anestesi genom att bedöma om återkallande av tass reflexer.
  4. När råttan inte svarar på stimulering, ta ut den ur rutan anestesi, placera den på bänken med nosen i isofluran masken och underhålla anestesi genom att leverera 2,5% syre vid 1,5 L/min.
  5. Försiktigt massera svansen och placera tourniquet (figur 1 c).
    Obs: Massagen kan utföras i ljummet vatten, med en temperatur mellan 38 och 42 ° C, för att få bättre vasodilatation av venerna.
  6. Infoga den perifer intravenös kateter (22 G), tidigare hepariniserad, i vänster eller höger svans anda. Observera att ett venöst återflöde följs (en droppe blod är synliga på den distala delen av nålen) när katetern är korrekt isatt (figur 1 d).
  7. Blås ut eventuella luftbubblor i katetern dödvolymen volymen med 2 mL sprutan innehållande fysiologisk koksaltlösning lösning och heparin.
  8. Salvan öga och Förbered sprutan innehållande atipamezol (17 µg/mL) för att väcka råtta vid slutet av experimentet.

3. råtta placering i Magnet för morrhår stimulering

  1. Placera en andning sensor på magnet sängen och sedan överföra råtta från bänken till magnet sängen. Placera den i liggande position med dess näsa i isofluran masken, med andning sensorn ligger mellan bröstkorgen och magnet sängen.
    Obs: All utrustning som går in i MRI rummet bör MRI-safe.
  2. Minska isofluran (från 4% till 1,5% – 2%) under råtta placering och växla anestesi till Medetomidin i slutet av detta förfarande. Säkerställa att rätt morrhåren är gratis, med skär högra kant framtill på råtta MRI säng i förväg för att möjliggöra rörlighet för morrhår.
  3. Håll råttan i position med tejp och övervaka dess andning som måste vara mellan 60 och 80 andetag per minut.
  4. Göra ett segel som fångar alla rätt morrhår i de papper tejpen (figur 2). Justera flexibla utloppsröret av det luft-puff-systemet längs råtta MRI säng så att det avslutas röret är vinkelrätt och ca 1,5 cm från seglet. Fixa det med tejp.

4. morrhår stimulering

  1. Anslut flexibla inloppsröret från en komprimerad luft källa (1 bar) till en magnetventil kontroll ventil ingång och utloppsröret till magnetventil kontroll ventil utgång (figur 3). Säkerställa att kontroll magnetventilen förblir utanför magnet rummet.
  2. Anslut enhetens pulserande till magnetventilen och till magneten hjälp av transistor-transistor logik (TTL)-port. Konfigurera den så att den pulserande frekvensen = 8 Hz, pulserande tid = 20 s, och vilan = 10 s.
    Obs: Dessa parametrar, visualiseras på små flytande kristaller (LCD) på skärmen, är justerbar via de tre dedikerade analogical potentiometrar. Elektroniska pulserande enheten, som kontrollerar paradigm, måste bestå av högkvalitativa elektroniska komponenter att undvika anborrningshjälp i tidsparametrar (för rätt postprocessing).

5. fet fMRI förvärv

  1. Placera råtthjärna så att den är i upprätt läge och använda örat barer för att behålla den. Placera volymen array spolen ovanför råttans huvud (figur 4A) och fixa det med tejp. Kontrollera att seglet går korrekt (anteroposterior rörelse, ingen rotation och ingen friktion av seglet) när det air-puff-systemet är vände ; sedan stänga av den.
  2. Sätt in sängen och spolen i mitten av magneten. Kontrollera att seglet är fortfarande rörliga när sängen är inuti magneten när det air-puff-systemet är ; sedan stänga av den. Växla helt från isofluran till Medetomidin (perfusion kurs: 20 µL/min).
  3. Kontrollera att råttan är väl beläget med en lokalisering sekvensen (TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; genomsnittliga = 1; upprepning = 1; skiva = 1 mm; bild storlek = 256 x 256; synfältet (FOV) = 50 x 50 mm. Scan tid = 12 s 800 ms). Dra fliken Localizer sekvens till instruktion namn och klicka på Fortsätt.
  4. Dra fliken T2_Star_FID_EPI sekvens till instruktion namn, center FOV på mitten av hjärnan, och klicka på fliken justering plattform att öppna instruktionen redigerade scan. Spela in kartan B0 och vidare till en scan-shim.
    Obs: För en B0 karta, använder följande parametrar: första echo tid = 1,65 ms; TR = 20 ms, genomsnittliga = 1; knäppa vinkel = 30°; ECHO avstånd = 3.805 ms; skiva = 58 mm; bild storlek = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; Scan tid = 1 m 24 s 920 ms. för scan shim, använder följande parametrar: voxel selektiv excitation = STEAM Gaussisk puls; TE = 5 ms; Blanda tid = 10 ms; förvärv varaktighet = 204,8 ms; bandbredd = 10.000 Hz; uppehållstid = 50 μs).
  5. Starta T2 Star_FID_EPI sekvensen (TE = 16.096 ms; TR = 500 ms; genomsnittliga = 1; upprepning = 600; skiva = 1 mm; fyra på varandra följande segment; bild storlek = 128 x 128; FOV = 20 x 20 mm; bandbredd = 333,333.3 Hz; Scan tid = 5 min 00 s).
    Obs: På grund av TTL hamnen, en extern trigger signal startar det air-puff-systemet samtidigt. Paradigm = [20 s aktiveringen + 10 s vila] x 10, för sammanlagt 600 skanningar, 500 ms per skanning. Skivor är centrerade på mitten av tunnan fältområdet.
  6. Förvärva en annan lokalisering sekvens (samma som det beskrivs i steget 5.3) för att jämföra med den första och kontrollera huruvida råtta har flyttat under T2_Star_FID_EPI sekvensen.
  7. Ta sängen till sitt ursprungliga läge, ta bort volym array spolen och ansluta surface spolen.

6. fetstil bearbetning

  1. Öppna filen T2 Star_FID_EPI och läsa T2 Star_FID_EPI bilden i Image Display. Öppna fönstret start-up av funktionella handkontrollen, kallas FunController.
  2. I denna bearbetning -fliken, Välj fönstret funktionella imaging och definiera protokollet stimulering (varaktighet och växlingen mellan /Off perioder, motsvarar paradigm används).
  3. Välj fönstret protokoll (datamängd med 600 ramar) och infogar värdet för 40 i fliken På perioden och 20 i den frysningsperiod tab. klick på fliken Invertera Attribution och dra skjutreglaget Stimulering stater till vänster för att markera den värde 1.
  4. I fönstret förbehandling, klicka på Median filter i planet för förbearbetning och på Median filter (2D, 3D) för postprocessing.
  5. Klicka på fliken Execute och dra markörerna för att justera overlay uppslagstabellen. Visualisera aktiverat hjärnan området (figur 4B).

7. proton MRS förvärv

  1. För att korrekt placera surface spolen, ändra positionen för råtta huvudet. Rotera huvudet (cirka 30° medurs) så att ytan spolen (figur 5A) kan placeras strax ovanför vänster fat cortex samtidigt vara horisontell och ligger på stadens magnet när släpper magneten.
  2. Placera surface spolen, fixa det på råtta hjärnan med tejp (figur 5B) och kontrollera att seglet går korrekt (anteroposterior rörelse, ingen rotation och ingen friktion av seglet) när det air-puff-systemet är vände ; sedan stänga av den med huvudströmbrytaren.
  3. Kontrollera att seglet går korrekt när sängen är inuti magneten när det air-puff-systemet är . Sedan stänga av den.
  4. Kontrollera råtta är placerade korrekt med en lokalisering sekvens. Ställa in parametrar som följer: TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; genomsnittliga = 1; upprepning = 1; skiva = 1 mm; bild storlek = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm. Scan tid = 12 s 800 ms.
    1. Dra fliken Localizer sekvens till fönstret instruktion namn och klicka på fliken Fortsätt att köra scan programmet.
  5. När hjärnan lokaliseringen är korrekt, dra fliken T2_TurboRARE sekvens i fönstret instruktion namn och klicka på Fortsätt om du vill köra programmet scan. Dessa anatomiska bilder, tillsammans med tidigare DJÄRVA fMRI förvärv, kommer att möjliggöra korrekt lokalisering av voxel i S1BF MRS.
    Obs: De T2_TurboRARE parametrarna är 14 skivor, 2 mm per skiva, FOV = 2,5 x 2,5 cm, TE = 100 ms, TR = 5.000 ms, matrix = 128 x 128, sekvens tid = 2 min 40 s.
  6. Dra fliken LASER sekvens till fönstret instruktion namn , placera voxel (2 mm höga, 2,5 mm lång, 3 mm djup) i mitten av området S1BF.
    1. Använd en rat brain atlas och DJÄRVA fMRI tilläggsprodukt till lokalisera zon på T2 bilderna (figur 6). Klicka på fliken justering plattform att öppna instruktionen redigerade scan. Klicka på fliken vingla och ändra impedans (elektroniska lastning) ta emot spolen något för att finjustera den. Klicka på fliken Verkställ när stämningen är klar och Stäng Redigeraren instruktion som du kan tillämpa ändringar i instruktionen redigerade.
  7. Spela in kartan B0 och fortsätt att skanna shim och utför sedan en lokal shim.
    Obs: För B0 kartan, använder följande parametrar: första echo tid = 1,65 ms; TR = 20 ms, genomsnittliga = 1; knäppa vinkel = 30°; ECHO avstånd = 3.805 ms; skiva = 58 mm; bild storlek = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; Scan tid = 1 m 24 s 920 ms. för scan shim, använder följande parametrar: voxel selektiv excitation STEAM Gaussisk puls; TE = 5 ms; Blanda tid = 10 ms; förvärv varaktighet = 204,8 ms; bandbredd = 10.000 Hz; uppehållstid = 50 μs. För lokala shim, använder följande parametrar: vatten dämpning, VAPOR förvärv varaktighet = 1,363.15 ms; Poäng = 4 096; bandbredd i Hz = 3,004.81 Hz; bandbredd i ppm = 10 ppm. uppehållstid = 166.40 μs; spektral upplösning = 0,37 Hz/poäng. LASER parametrarna är: echo tid = 19,26 ms; TR = 2 500 ms; i genomsnitt = 128 eller 32; Scan tid = 5 min 20 s eller 1 min 20 s; förvärv punkter = 4 096.
  8. Utför 1H-MRS.
    1. Starta den 1H-MRS förvärv först under en viloperiod (4 x 32 LASER scans + 128 LASER Analysis; 2 500 ms per scan).
    2. Förvärva en annan lokalisering sekvens (samma som det beskrivs i steget 5.3) för att jämföra med den första inspelade och säkerställa att råttan inte har flyttat under LASER förvärvet.
    3. Utför 1H-MRS under morrhår aktiveringen använda LASER sekvensen (4 x 32 LASER scans + 128 LASER Analysis; 2 500 ms per scan) med det air-puff-systemet (paradigm = 20 s av aktivering och 10 s vila).
    4. Återigen, utföra en lokalisering sekvens för att kontrollera huruvida råtta har flyttat.
      Obs: Antal skanningar och vilande/aktiverad perioder kan anpassas och ändras, men se alltid till att råttan inte är rörliga genom att regelbundet utföra en lokalisering sekvens.
  9. Ta sängen till sitt ursprungliga läge, ta bort ytan spolen och flytta råtta tillbaka till bänken. Injicera atipamezol i ett hudveck i råttans tillbaka till omvänd anestesi och väcka den.

8. proton MRS bearbetning

  1. Öppna programvaran för LCModel och klicka på lämplig flik att välja rätt datatyp ( Gratis induktion Decay fil) och välj rätt fil. Klicka på fliken OK när detta görs.
  2. Optimera kvantifiering styrparametrar steg för steg.
    1. I avsnittet titel , manuellt ange en titel och definiera en adekvat ppm spänner (e.g., 0,2 till 4,0 ppm) genom att manuellt skriva in nödvändiga värdet i respektive fält.
    2. Markera i avsnittet grund fil och ladda ner filen som behövs för att passa makromolekyl baslinjen korrekt (det kan tillhandahållas av programvaruleverantören).
    3. Definiera och läsa ingående styrparametrar. Förbereda Spara processen med alla användbara filtyper i förväg (tabell = kompakt tabeller; PS = nödvändiga PostScript-utdata; CSV = format för kalkylblad; COORD = koordinater för tomter). Klicka på fliken RunLCModel att börja LCModel kvantifiering.
  3. Definiera markerade metaboliter för att generera statistik.
    Obs: LCModel ger metabolit kvantifiering och uppskattar fel genom att ett värde som kallas Cramér-Rao nedre gräns (CRLB). Ett värde med en CRLB < 15 anses en optimal kvantifiering. En CRLB > 25 indikerar en opålitlig värde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll tillåter kvantifiering av metaboliten fluktuationer under hjärnans aktivering, som erhålls genom rätt morrhår stimulering direkt i magneten.

I denna studie var det övergripande målet för DJÄRVA fMRI att kontrollera att morrhår stimulering var effektiva, att visualisera området aktiveras S1BF och korrekt lokalisera voxel för 1H-fMRS. Byggd för morrhår aktivering av enheten är effektiv. Verkligen, när rätt morrhår stimuleras med hjälp av hemmagjord luft-puff-system, en positiv fet signal identifierades i vänster fat cortex (figur 4B), även kallad S1BF, för fältet somatosensoriska fat (n = 8). En positiv signal enhancement upptäcktes i vänster fat cortex i åtta av åtta råttor, medan endast bakgrunden upptäcktes i de högra hjärnhalvorna. När DJÄRVA fMRI utfördes utan morrhår stimulering, observerades ingen signal förbättring antingen vänster eller höger S1BF.

I en jämförelse mellan anatomiska herr bilder och rat brain atlas system8tillåter aktiverat hjärnan området visualiseras av DJÄRVA fMRI voxel placeras i området S1BF, som aktiveras vid morrhår stimulering. Detta voxel ligger på tre på varandra följande bilder (1 mm tjock) eftersom fat cortex är 3 mm lång. När hjärnan bilden är nästan uppdelad i fyra inkvarterar, voxel ligger i det övre vänstra kvartalet på en ca 45° vinkel (figur 6).

När paradigmet för morrhår stimulering var påslagen, observerades en ökning Laktathalten i den vänstra S1BF (figur 6, typiska spectra erhålls en råtta). Att bättre visualisera metabola svängningar mellan vila och aktiverade perioder, en spektral subtraktion utfördes (figur 6). Från detta subtraherade spektrum, ökningen Laktathalten med aktivering av hjärnan var visualiserat mycket lättare, medan i detta råtta, var N-acetylaspartate (Nordqvist) signalen minskat något. Laktat ökar under neuronal stimulering observerades också den spektrala deconvolution (figur 7AB). Medan den laktat toppen upptäcktes knappt på i vivo spektrumet i vila, kunde LCModel att kvantifiera (figur 7A) med noggrannhet och bra CRLB värden. Sannerligen ur 23 råttor hade endast en spectrum ett CRLB värde för laktat kvantifiering motsvarar 24. Ingen var > 25. För alla andra spectra, värdena varierade mellan 3 och 19.

Variationerna i Laktathalten i alla 23 råttor presenteras i figur 8. Av 23 råtta observerades en minskning av Laktathalten endast i en råtta. Det fanns en statistiskt signifikant skillnad i laktat innehåll mellan vila och aktiverade perioder (0.132 0,012 och 0.163 ± 0,011, respektive värden släktingar till PCr + Cr innehåll, parat t-test, p = 0,0005 [parametrisk, tvåsidiga] n = 23). Därför mättes en 31,6% ± 7,8% ökning Laktathalten under neuronal stimulering.

En liten minskning NAA innehåll kan observeras i figur 6, som representerar typiska spectra som erhållits i ett djur. Denna NAA variation var dock inte signifikant (en minskning med 1,2% ± 1,2% mättes, n = 23).

Figure 1
Figur 1: utrustning och åtgärder för anestesi. (A) bild av utrustningen att vara förberedd innan du börjar anestesi. (B) isofluran pump och induktion kammare. (C) Tourniquet placering. (D) bilden visar katetern har infogats korrekt; Observera droppen blod i katetern nålen, som är ett positivt tecken på en korrekt plats i venen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: morrhår stimulering. Alla rätt morrhår är instängd i ett segel med papperstejp. Seglet gör alla rätt Morris att stimuleras samtidigt med det air-puff-systemet och därför maximerar neuronal aktivering av fat cortex. Uttaget av det luft-puff-systemet (svart tub) ska placeras runt 1,5 cm och vinkelrätt mot seglet. Kontrollera utanför magneten så att seglet är rörliga korrekt genom att aktivera det air-puff-systemet. Seglet måste flytta vid 8 Hz i anteroposterior riktning (ingen rotation). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Air-puff-system för morrhår stimulering. (A) A flexibla röret ansluts tryckluften till (B) kontrollera magnetventilen. Ett andra flexibla rör ger pulserande luft från magnetventil kontroll ventil utdata till seglet. Kontrollera magnetventilen är ansluten till den pulserande anordning, som styr paradigm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: fet fMRI. (A) volym array spole placering. Rat huvudet är i horisontellt läge och blockeras av örat barer. Kontrollera att seglet är röra sig fritt och inte blockeras av spolen eller MRI sängen. (B) en typisk fet signal i aktiverade vänster fat cortex (röd pil). Ingen signal detekteras i den kontralaterala högra hjärnhalvan (blå pil). Tröskeln har angetts till 76,5% av maximalt antalet intensitetsvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Surface spole. (A) bild av ytan spolen används i denna studie. (B) Surface spole placering. Rat huvudet måste vridas något så att vänster fat cortex och därmed ytan spolen är beläget i centrum av MRI sängen (huvudet vänds i en vinkel på ca 30°, en bra kompromiss mellan rätt plats för den vänstra fat cortexen för att surfa CE-spole och fria rörelser av seglet av rätt morrhår, som inte ska blockeras av MRI sängen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: typiskt lokaliserade 1H-MRS i vila (blå spektrumet) och under morrhår aktiveringen (röda spektrat). Voxel (Grön fyrkant) ligger i den vänstra S1BF på anatomiska T2_TurboRARE bilderna med rat brain atlas system och signal förbättring på fet fMRI bilder. Den spektrala subtraktionen ritas i svart. Laktat och N-acetylaspartate (Nordqvist) toppar indikeras på 1,32 och 2,02 ppm, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: typiska spektrala deconvolution av MRS spektra. (A) Deconvolution en 128-scan resten spektrum. (B) Deconvolution av en 128-scan aktiveras spektrum. Rester, subtraktion mellan experimentell spektrum (rådata), och LCModel fit; MM = makromolekyl; CR = kreatin + phosphocreatine; PCho + GPC = phosphocholine + glycerophosphocholine; NAA = N-acetylaspartate; Lac = laktat; GABA = γ-aminobutyric syra; GLN = glutamin; GLU = glutamat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: variationer i laktat innehåll under hjärnstimulering. Blå prick: laktat innehåll i vila, avgörs av LCModel och i förhållande till den kreatin + phosphocreatine innehåll. Röd prick: laktat innehåll under morrhår stimulering, avgörs av LCModel och i förhållande till den kreatin + phosphocreatine innehåll. Skillnaden mellan aktiverad och vila, p = 0,0005, parat t-test (parametrisk, tvåsidiga), n = 23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fat cortex, även kallad S1BF för fältet somatosensoriska cortex eller fat, är en region inom det kortikala skiktet IV som kan observeras med hjälp av cytokrom c oxidas färgning9, och dess organisation är väl kända eftersom det har varit till stor del beskrivs 10,11. En vibrissa är ansluten till ett fat, som omkring 19.000 nervceller är organiserade i en kolumn12. Whisker-till-fat cortex vägen har flera fördelar. Först, den kan aktiveras inuti magneten med hjälp av en Mr-kompatibla luft-puff-system, som kan vara enkelt hemmagjord (för att säkerställa att i den största delen av området S1BF, som motsvarar ungefärligt till storleken på den voxel där MRS utförs, alla morrhår pressas i ett segel som gör att stimulering av högst vibrissa). För det andra, höger morrhår aktivering leder till vänster fat cortex aktivering och hjärnan området ligger i somatosensoriska cortex, som tillåter användning av en hög-känsliga yta spole. Tredje, denna metod för att aktivera den somatosensoriska cortexen är noninvasiv jämfört med elektriska tass stimulering, den senare har nackdelen att stimulera andra hjärnstrukturer, inklusive några i högra hjärnhalvan13. Protokollet som används här är därför den mest lämpade att utföra en in vivo noninvasiv, och longitudinella studie av hjärnans metabolism under hjärnans aktivering.

Valet av bedövningsmedel är avgörande, eftersom många av anestetika framkalla förändringar i neurovaskulära koppling, hjärnans metabolism eller hjärnans aktivitet14,15. Till exempel isofluran, det vanligaste bedövningsmedlet används för MRI, leder till en tre-sixfold ökning i hjärnan laktat innehåll15,16 och bör därför inte användas i hjärnan metabola studier. Medetomidin är en α2-stimulerande-agonist, vilket inducerar tillförlitlig sedering, analgesi, muskelavslappning och anxiolysis17. Dessa effekter kan återföras snabbt med hjälp av atipamezol, en α2-antagonist. Medetomidin är den bästa kandidaten att utföra funktionella studier i gnagare18 eftersom den har en mycket låg inverkan på fet signalen och de lägsta ändringarna i hjärnan metabolit innehållet.

Det är också viktigt att följa morrhår aktiveringen böjningsmönstret korrekt. Sedan NMR förvärv senast flera minuter, är användning av successiva aktivering/viloperioder nödvändigt att begränsa Desensibilisering av nervceller i området aktiverat hjärnan. Parametrarna för detta paradigm (20 s av aktiveringen följt av en viloperiod om 10 s) valdes för att erhålla högsta DJÄRVA fMRI signalen i motsvarande fat cortex. Vara måste mycket försiktig att respektera dessa tid windows eftersom det är avgörande för att bestämma aktiverat/vila perioden för fet behandling, även om den styrs av TTL-port. För att få en hög nivå av fat cortex aktiveringen, seglet det grupper morrhåren tillsammans är också viktigt eftersom det tillåter den största delen av området S1BF stimuleras. Vara måste mycket försiktig att placera outlet luftslangen framför detta segel så att det kan röra sig på en anteroposterior plan. Frekvensen måste kalibreras noggrant eftersom det har visat att nervceller i fat cortex aktiveras när morrhår stimulering frekvens är mellan 5 och 15 Hz19. Med hjälp av en lägre eller högre frekvens leder inte till aktivering av området S1BF.

Protokollet som används i denna studie gör det möjligt att jämföra spectra förvärvade i området samma hjärnan i vila och under hjärnstimulering och, därför, för att övervaka metabola förändringar kopplade till cerebral aktivering. Det är viktigt att utföra en lokalisering sekvens i början och i slutet av protokollet NMR spektroskopi, att säkerställa att djuret inte har flyttat och att skillnaderna i metabola innehållet mätt mellan vila och aktiverade är på grund av hjärnan stimulering och inte rörelse artefakter.

Använder protokollet beskrivs häri, en ökning av Laktathalten mättes mellan vila och aktiverat perioder. Laktat ökar med i vivo NMR spektroskopi under hjärnans aktivering observerades först hos människor i början av 1990-talet20,21. Dock var de flesta mätningar utförs i människor snarare än gnagare, där signal-brus-förhållandet är mycket lägre. Hos råtta utfördes ex vivo NMR kvantifiering av laktat under råtta hjärnan aktiveringen av Mazuel et al. 22, som observerade en ökning i hjärnan laktat innehåll med neuronal aktivering. Resultaten presenteras här visar att laktat ökades under morrhår aktiveringen. Men, eftersom lokaliserad MRS inte tillåter cellulära upplösning, är det fortfarande okänt från vilken mobilfack laktat kommer (nervceller eller astrocyter). För att gå vidare i förståelsen av cerebrala metabola utbyten, såsom fortfarande debatteras ANLSH (astrocyt-neuron laktat transfer hypotes), har detta protokoll tillämpas på genetiskt modifierade djur för de viktigaste komponenterna i denna flygplatstransfer, såsom den monocarboxylate transportörer.

I studien beskrivs här, observerades ingen statistiskt signifikant skillnad i NAA innehåll. En minskning av NAA innehåll under visuell stimulans var tidigare hittade i människor23,24,25, men inte bekräftats av Mangia och Tkáč26. I den aktuella studien observerat vi en ökning av NAA innehåll under hjärnans aktivering i 50% av råttor och en minskning i den andra halvan. NAA bör därför undvikas som intern referens för kvantifiering under funktionella Mrs No andra variation i metaboliten innehåll upptäcktes.

Båda laktat och NAA variationer under neuronal aktivering har lett till kontroverser23,26,27,28,29. För att ytterligare vår förståelse av dessa metabola svängningar kopplade till hjärnans aktivitet, skulle det vara intressant att tillämpa detta protokoll på transgena djur. Detta skulle ge ytterligare information om underliggande processen. Övergripande, lokaliserad 1H-MRS under en aktivitet eller funktionella MRS29, är en framväxande teknik hos gnagare, relevanta för studien av regionala dynamiska förändringar i metaboliter, i normal eller patologisk hjärnor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av LabEx TRAIL bidraget, referens ANR-10-LABX-57 och en Fransman-Schweizare ANR-FNS bevilja referens ANR-15-CE37-0012. Författarna vill tacka Aurélien Trotier för hans teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL syringe with needle Becton, Dickinson and Company, USA 2020-10 0.33 mm (29 G) x 12.7 mm
1H spectroscopy surface coil Bruker, Ettlingen, Germany T116344
7T Bruker Biospec system Bruker, Ettlingen, Germany 70/20 USR
Arduino Uno based pulsing device custom made
Atipamezole Vétoquinol, S.A., France V8335602 Antisedan, 4.28 mg
Breathing mask custom made
Eye ointment TVM laboratoire, France 40365 Ocry gel 10 g
Induction chamber custom made 30x17x15 cm
Inlet flexible pipe Gardena, Germany 1348-20 4.6-mm diameter, 3m long
Isoflurane pump, Model 100 series vaporizer, classic T3 Surgivet, Harvard Apparatus WWV90TT from OH 43017, U.S.A
Isoflurane, liquid for inhalation Vertflurane, Virbac, France QN01AB06 1000 mg/mL
KD Scientific syringe pump KD sientific, Holliston, USA Legato 110
LCModel software LCModel Inc., Ontario, Canada 6.2
Medetomidine hydrochloride Vétoquinol, S.A., France QN05CM91 Domitor, 1 mg/mL
Micropore roll of adhesive plaster 3M micropore, Minnesota, United States MI912
Micropore roll of adhesive plaster 3M micropore, Minnesota, United States MI925
Monitoring system of physiologic parameter SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA Model 1025
NaCl Fresenius Kabi, Germany B05XA03 0.9 % 250 mL
Outlet flexible pipe Gardena, Germany 1348-20 4.6-mm diameter, 4m long
Paravision software Bruker, Ettlingen, Germany 6.0.1
Peripheral intravenous catheter Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon SP500930S 22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min
Rat head coil Bruker, Ettlingen, Germany
Sodic heparin, injectable solution Choai, Sanofi, Paris, France B01AB01 5000 IU/mL
Solenoid control valves, plunger valve 2/2 way direct-acting Burkert, Germany 3099939 Model type 6013
Terumo 2 ml syringe Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon SY243 with 21 g x 5/8" needle
Terumo 5 mL syringe Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon 05SE1
Wistar RJ-Han rats Janvier Laboratories, France

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55, 1251-1262 (2007).
  2. Pellerin, L., Magistretti, P. J. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10625-10629 (1994).
  3. Cholet, N., et al. Local injection of antisense oligonucleotides targeted to the glial glutamate transporter GLAST decreases the metabolic response to somatosensory activation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 404-412 (2001).
  4. Voutsinos-Porche, B., et al. Glial Glutamate Transporters Mediate a Functional Metabolic Crosstalk between Neurons and Astrocytes in the Mouse Developing Cortex. Neuron. 37, 275-286 (2003).
  5. Zimmer, E. R., et al. [18F]FDG PET signal is driven by astroglial glutamate transport. Nature Neuroscience. 20, (3), 393-395 (2017).
  6. Haiss, F., et al. Improved in vivo two-photon imaging after blood replacement by perfluorocarbon. The Journal of Physiology. (2009).
  7. Mullins, P. G. Towards a theory of functional magnetic resonance spectroscopy (fMRS): A meta-analysis and discussion of using MRS to measure changes in neurotransmitters in real time. Scandinvian Journal of Psychology. 59, 91-103 (2018).
  8. Rat Brain Atlas. Available from: http://Labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas/ (2018).
  9. Wong-Riley, M. T., Welt, C. Histochemical changes in cytochrome oxidase of cortical barrels after vibrissal removal in neonatal and adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77, 2333-2337 (1980).
  10. Petersen, C. C. The functional organization of the barrel cortex. Neuron. 56, 339-355 (2007).
  11. Cox, S. B., Woolsey, T. A., Rovainen, C. M. Localized dynamic changes in cortical blood flow with whisker stimulation corresponds to matched vascular and neuronal architecture of rat barrels. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13, 899-913 (1993).
  12. Feldmeyer, D. Excitatory neuronal connectivity in the barrel cortex. Frontiers in Neuroanatomy. 6, 24 (2012).
  13. Boussida, S., Traore, A. S., Durif, F. Mapping of the brain hemodynamic responses to sensorimotor stimulation in a rodent model: A BOLD fMRI study. PLoS One. 12, e0176512 (2017).
  14. Heinke, W., Koelsch, S. The effects of anesthetics on brain activity and cognitive function. Current Opinion in Anesthesiology. 18, 625-631 (2005).
  15. Horn, T., Klein, J. Lactate levels in the brain are elevated upon exposure to volatile anesthetics: a microdialysis study. Neurochemistry International. 57, 940-947 (2010).
  16. Boretius, S., et al. Halogenated volatile anesthetics alter brain metabolism as revealed by proton magnetic resonance spectroscopy of mice in vivo. Neuroimage. 69, 244-255 (2013).
  17. Sinclair, M. D. A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice. Canadian Veterinary Journal. 44, 885-897 (2003).
  18. Weber, R., et al. A fully noninvasive and robust experimental protocol for longitudinal fMRI studies in the rat. Neuroimage. 29, 1303-1310 (2006).
  19. Hartmann, M. J., Johnson, N. J., Towal, R. B., Assad, C. Mechanical characteristics of rat vibrissae: resonant frequencies and damping in isolated whiskers and in the awake behaving animal. The Journal of Neuroscience. 23, 6510-6519 (2003).
  20. Prichard, J., et al. Lactate rise detected by 1H NMR in human visual cortex during physiologic stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 5829-5831 (1991).
  21. Sappey-Marinier, D., et al. Effect of photic stimulation on human visual cortex lactate and phosphates using 1H and 31P magnetic resonance spectroscopy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 12, 584-592 (1992).
  22. Mazuel, L., et al. A neuronal MCT2 knockdown in the rat somatosensory cortex reduces both the NMR lactate signal and the BOLD response during whisker stimulation. PLoS One. 12, e0174990 (2017).
  23. Castellano, G., et al. NAA and NAAG variation in neuronal activation during visual stimulation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 45, 1031-1036 (2012).
  24. Sarchielli, P., et al. Functional 1H-MRS findings in migraine patients with and without aura assessed interictally. Neuroimage. 24, 1025-1031 (2005).
  25. Baslow, M. H., Hrabe, J., Guilfoyle, D. N. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 32, 235-245 (2007).
  26. Mangia, S., Tkac, I. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 245-248 (2008).
  27. Baslow, M. H., Hrabal, R., Guilfoyle, D. N. Response of the authors to the Letter by Silvia Mangia and Ivan Tkac. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 247-248 (2008).
  28. Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 347-350 (2018).
  29. Bak, L. K., Walls, A. B. CrossTalk opposing view: lack of evidence supporting an astrocyte-to-neuron lactate shuttle coupling neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 351-353 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics