Новый портативный в Vitro экспозиции кассета для аэрозольных проб

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы представляем протокол для выполнения портативный сотовый аэрозольных воздействий и измерить клеточный ответ. Данный метод использует клетки, выращенных на интерфейсе воздуха жидкость, подражая физиологии в естественных условиях . Клеточный ответ на медь наночастиц аэрозоли было отмечено как Оксидативный стресс через реактивнооксигенных видов генерации и цитотоксичность как лактатдегидрогеназа релиз.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Этот протокол вводит новый в vitro воздействия системы, способной носили, включая его квалификации и производительности. Воздух жидкий интерфейс (Али) в vitro воздействия системы часто большие и громоздкие, затрудняя транспорта на местах и операции на источнике выбросов или в зоне дыхания. Через миниатюризация этих систем лаборатории может быть доставлен на местах, ускорить время обработки и предоставления более подходящим метод воздействия, который не меняет аэрозоля до обращения клетки. Переносные в vitro экспозиции кассеты (PIVEC) адаптирует Кассетный фильтр 37 мм для тестирования вне традиционных лабораторных условиях токсичности в пробирке . PIVEC был охарактеризован с помощью трех размеров наночастиц меди для определения эффективности осаждения на основании гравиметрических и числовой анализ концентрации частиц. Были проведены эксперименты первоначальный цитотоксичности клетки подвергаются легких для определения способности системы на хранение частиц при сохранении жизнеспособности клеток. PIVEC обеспечивает эффективность подобных или увеличение осаждения при сравнении доступны перпендикулярно потока в vitro воздействия устройства. Несмотря на нижней образца пропускной способности малый размер дает некоторые преимущества для текущей в vitro Али воздействия систем. К ним относятся возможность носить для персонального мониторинга, мобильность из лаборатории на источник выбросов, и возможность настройки нескольких систем для пространственного разрешения при сохранении ниже пользователя стоимость. PIVEC является системой, способной сбора аэрозолей в поле и в зоне дыхания на воздух интерфейсом, в пробирке модель.

Introduction

Личные выборки с использованием методов в пробирке может предоставить всеобъемлющую информацию о биологических эффектов аэрозолей на рабочем месте. 1 воздействия загрязнителей в воздухе включают воздействия химических, собранных воздуха пробы, в подводных условиях, где газ вводится в суспензии клеток, прерывистый воздействия, с помощью устройства, такие как рокер, или прямой воздействия на интерфейсе воздуха жидкость (Али). 2 многие из этих методов выполняются с клетками, выращенных в подвеска или коллекции образцов до воздействия, каждый из которых может повлиять на токсикологические исследования из-за возможных изменений в аэрозоль. 3 чтобы избежать этих изменений, лаборатории могут быть доведены до поля, используя несколько в vitro Али культуры воздействия систем, которые используются в литературе,,4,5,6,7 8,9,10,11,12,13 однако, лишь немногие являются коммерчески доступными. 8 , 9 , 12 эти системы часто громоздки, особенно когда включая инструменты для регулирования температуры и влажности клеточной среды и скорость потока аэрозоля образца. С помощью PIVEC, воздействия аэрозолей может выполняться за пределами традиционных лабораторных условиях или в зоне дыхания во время имитируя условий ингаляции.

Определение аэрозольного осаждения в vitro имеет важное значение для расследования последствий для здоровья вследствие вдыхания. В зоне дыхания, район, в пределах 30 см от рот и нос,14 решающее значение для понимания воздействия наночастиц и увязки биологических эффектов в легких. 2 часто, осаждения на клетки определяется как эффективности осаждения частиц на и принятые клеток, разделенных частицы, управляемые системы6,15 или на массовой основе те же суммы. 4 , 16 текущие методы для измерения аэрозолей в зоне дыхания являются фильтр на основе, захват частиц в течение заданного выборки и использования фильтров для проведения дальнейших испытаний. 17 персонального мониторинга требует небольшой системы, которая поставляется с платой меньшее количество образцов.

Существует много подходов для определения воздействия на здоровье от воздействия аэрозоля. Али модель позволяет для аэрозолей под управлением непосредственно к клеткам через воздух как реального воздействием сценарий, но это более экономически эффективным и меньше времени, интенсивные чем в vivo исследований во время имитируя воздуха жидкость барьеры, такие как глаза, кожи и легких. Клетки легких, выращенных на Али имеют способность генерировать поляризованные барьерного слоя,18,19 , которая производит физиологические черты, которые напоминают в естественных условиях легких эпителия, включая производство слизи и ПАВ в конкретных бронхов или альвеолярного клеточных линий, реснички, избиение,19 плотные соединения,19,20 и ячейки поляризации. 18 изменения, такие, как они могут повлиять на клеточный ответ, измеряется в исследованиях токсичности. 21 Кроме того, Али в vitro модели результаты часто более чувствительны, чем клетки подвергаются через подвеска модели22 и состоянии модель острой в vivo ингаляционной токсичности. 23 , 24 Итак, Али воздействия системы, которая способна выполнять измерения в зоне дыхания является естественный следующий шаг.

Предоставляя клетки аэрозоля непосредственно у источника выбросов, исследование эффектов всех газов, полулетучих соединений и частиц, участвующих в смеси происходит. Когда смесь собираются в фильтра, газов и летучих соединений не захватываются и смеси в целом не могут быть расследованы. Кроме того растворение частиц в порошок или жидкое подвеска может привести к агрегации или частицы жидкости взаимодействиями, такими как растворение, в жидкой суспензии. 25 , 26 когда аэрозольные частицы добавляются к жидкости, есть высокий потенциал для агломерации,25,27 формирования белков Корона,28 или взаимодействия с соединениями в жидкости, которая может повлиять на осаждения и влияние биологической реакции. 29 , 30

Воздействия на Али основана на трех основных аэрозоля профили, Облако усадки, параллельных потока и потока перпендикулярно. Облако, оседая, используется интерфейс воздействия воздуха-жидкость по клеток (Алиса),4 является пакетной системы, где частицы депозит с помощью гравитационного и диффузионных урегулирования как аэрозоль рассматривается как единое целое. Параллельных потока, используется электростатический аэрозоля в vitro воздействия системы (КАРНИЗ)5 и многообразия экспозиции камеры (MEC) II,6 позволяет для осаждения путем добавления броуновского движения через профиля потока. Перпендикулярно потока, используется microsprayer,7 Nano аэрозольной камеры для In-Vitro токсичности (NACIVT),11 и коммерческих Али систем8,9,10,12, добавляет сдавление из частицы в регионе осаждения. Многие из этих систем экспозиции, большие и громоздкие, требуя избыточных систем для аэрозольных предварительного кондиционирования, насосы для потока, или даже нагрева камеры для инкубации клеток. Этот большой размер уменьшается переносимости системы. Вместо выборки непосредственно у источника выбросов, эти системы часто имеют образцы принесли в лаборатории или модели аэрозолей, созданный для анализа. Сложность выбросов аэрозолей могут быть потеряны в переводе из поля в лабораторию. PIVEC меньше, чем нынешние системы, с внешней поверхности площадью приблизительно 460 см2 и весом всего 60 грамм, с тепловлажностной управления включены в систему, позволяя для высоко портативного устройства. Уменьшение размера и веса позволяют системе изношены или принятых на источник облучения, позволяя прямой выборки.

Большой размер текущего воздействия систем также снижает способность выполнять выборки для изучения пространственных градиентов концентраций. Эта резолюция является ключевым при определении токсикологическое воздействие многих потенциальных экологических и профессиональных рисков например автомобильных выхлопных твердых частиц или на рабочем месте деятельности где аэрозолизации происходит. Сразу же после выбросов, там становится пространственной дисперсии в концентрации частиц. Это растет с течением времени, как частицы рассеивают всей атмосферы, и эти эффекты можно изменить на основании условий окружающей среды, таких как температура, давление, ветра и солнца. Частицы могут начать возраст и окисляются также раз выпущенного31,32 и разгон тарифы зависят от рельефа; более высокие концентрации будут найдены в каньоны и туннелей, где замедлился дисперсии эффекты, и более низкой концентрации можно найти там, где есть большой площади для распыления. 33 эти изменения ставок дисперсии могут иметь существенное воздействие на здоровье человека и можно видеть при сравнении количество астматических взрослых, живущих в городских и в сельских условиях. 34 в то время как многие воздействия системы обеспечивают сразу несколько образцов, несколько систем необходимы с обилием крупных оборудования для выполнения пространственного разрешения.

Собрав в лабораторию к полю, время анализа может быть уменьшена с помощью клеточных как датчик. После известных биологических механизмов и конечные точки могут помочь в определении состава аэрозолей и размер. Из-за медленного оформления методов, включая мукоцилиарный клиренс, фагоцитоз и транслокации эти частицы часто взаимодействуют с клеток примерно дней недели3 генерации оксидативного стресса, воспаления и даже смерти клетки. Эти биологические конечные точки могут быть отправной точкой для пути неблагоприятного исхода для сердечно-сосудистых заболеваний или хроническая обструктивная болезнь легких. Кроме того Wiemenn et al. выполнена массив в vitro анализов для сравнения с литературными значениями для краткосрочной перспективе в vivo ингаляционной токсичности. 35 В естественных условиях реакция была предсказана с двумя из четырех положительные результаты тестирования цитотоксичность через лактатдегидрогеназа релиз, оксидативный стресс от глутатион сокращения и перекись водорода формирования и выпуска и воспаление потенциал фактор некроза опухоли альфа-ген. Из десяти наноразмерные оксиды металлов испытания, 6 протестированы как активный (оксид титана, оксид цинка и четыре разных церия оксид) с помощью облучения в пробирке с подтверждением в естественных условиях

С целью изучения воздействия аэрозолей в профессиональной обстановке, наша лаборатория разработала PIVEC для воздействия на местах. Кроме того PIVEC можно носить для личного отбора проб для мониторинга и расследования вдыхания как Кассетный фильтр 37 мм36 или несколько систем может использоваться для достижения пространственное разрешение в пределах данной области. В этом протоколе обсуждается характеристика и использование PIVEC. После облучения биологические эффекты наблюдаются через цитотоксичность анализов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Операторы должны носить средства индивидуальной защиты (например, лаборатории пальто, перчатки, очки) при выполнении шагов 1, 2, 3, 5 и 6.

1. Подготовка материалов

  1. Подготовьте материалы для системы Ассамблеи и воздействия для обеспечения повторяемости.
    1. Убедитесь, что для использования новых или очищены на 70% спирте ¼" внутренний диаметр токопроводящих труб и ¼" наружный диаметр разъемы для сборки системы.
    2. Магазин тестовые материалы, включая фильтры, PIVEC компоненты, пинцеты и частиц порошков в хорошо управляемой среде, в отношении температуры и влажности, для по крайней мере за 24 часа до эксперимента.
      Примечание: Температура должна быть около комнатной температуре приблизительно 20 ° C, при относительной влажности воздуха менее 35%. Это очень важно для достижения повторяемость между экспериментов.
    3. Подготовьте счетчики частиц с использованием изопропиловый спирт для очистки деталей и для прогрева системы в соответствии с рекомендациями производителя, включая сканирование мобильность частиц Сайзер (SMPS) и оптических частиц Сайзер (ОПС) для измерения.

2. поколение сухого аэрозоля

Примечание: Аэрозольные поколение зонта должно выполняют операторы.

  1. Собрать систему для создания сухих аэрозолей
    Примечание: Подвеска частиц в газ или жидкость должна быть подходящими для моделируемого приложения и клетки культуры. Следующий метод может быть выполнена с помощью основе жидких аэрозолей. Конструкция системы сухого аэрозоля — от Тивари и др. 37 схема сухой разгон системы показан на рисунке 1.
    1. Подключите шаровой клапан к каждому концу трубы размер резьбовое 4» 1/8, это будет служить в качестве частицы Хоппер. Подключите 2" 1/8 размера трубы к один клапан.
    2. Весят наночастицы меди, в этом исследовании массовой концентрации для каждого размера частиц был неизменным при определении эффективности осаждения. Примерно используйте 7,5 мг 40 Нм меди наночастиц, 7 мг 100 Нм меди наночастиц и 13 мг наночастиц 800 Нм меди в экспозиции. Место меди наночастиц в воронку частиц через открытый конец.
      Примечание: Количество меди наночастиц весил будет служить массы на основе управляемых концентрации.
    3. Место 3" кусок ½" внешнего диаметра (OD) трубы вокруг 2» трубы и место, HEPA фильтр внутри этой короткой трубки, таким образом, чтобы направление потока является через шаровой клапан.
    4. Подсоедините вакуумный генератор к другие шаровой клапан с помощью резьбы. Подсоедините вакуумный генератор к баллон с воздухом, поставив 5/16" OD трубопровод в связи push-lock. Используйте ¼" OD труб для подключения выходе вакуумный генератор к экспериментальной установки, помещая труб на выходе вакуумный генератор.
  2. Использование системы сухого аэрозоля для получения сухого аэрозоля
    1. Откройте баллон с воздухом, повернув основной клапан и позволяют воздушного потока в системе. Открыть вентиль на регулятор потока на баллон с воздухом и установить таким образом, чтобы поток через систему эквивалентен нужные параметры на вакуумный насос.
    2. Откройте шаровой кран ближе к HEPA фильтр, а затем откройте шаровой кран ближе к вакуумным генератором. Держать их открытыми для примерно 3 s чтобы частицы быть вытащил в поток воздуха.
    3. Закройте шаровой кран ближе к вакуумный генератор и закройте клапан ближе к фильтр HEPA. Позвольте воздуху из бака поток в течение всего эксперимента при необходимости.
    4. Закройте главный и регулятор клапаны на воздушных резервуаров, чтобы остановить поток. Чистой шаровые и вакуумный генератор с помощью 70% этиловом спирте. Металлические трубы автоклав для стерилизации.

3. осаждения эффективность измерение с помощью PIVEC

Примечание: Операторы должны выполнить воздействия аэрозолей в зонта.

  1. Измерьте осаждения, собирая меди наночастиц аэрозоля, созданного на шаге 2.2 на фильтр предварительно взвешенным. Используйте хранение дозы, измеряется с помощью собранной массы на фильтре и введенной дозы, измеряется с помощью количество взвешенных частиц меди, для определения эффективности осаждения.
    1. Держите 1,00 мкм поры светофильтры волокна в условиях низкой влажности, описанные в 1.1.2, для по крайней мере за 24 часа до измерения до контакта. Весят неиспользуемые фильтр три раза и записывать фильтр весов. Вставить место неиспользуемые фильтр в культуре клеток.
    2. Выберите соответствующую ячейку культуры вставить адаптер (6 хорошо или хорошо 24) для PIVEC для поддержки Вставка культуры клеток с фильтром. Место культуры клеток вставить кусок адаптер на верхней части основания PIVEC, установив на место, таким образом, что база адаптер кусок шире верхней.
    3. Использование пинцета поставить фильтр загружен клеточной культуры вставить в адаптер кусок. Поместите верхнюю часть на вершине кусок адаптер, влиться в место, таким образом, что база верхнюю часть шире верхней. Обертывание PIVEC с одного слоя клейкой лентой.
    4. Подключите 37 мм кассетный штук на верхней и нижней части PIVEC, нажав на место. Поместите ¼" колючая адаптеры в кассету входным и выходным отверстием.
    5. Оберните резистивный нагревательный прибор вокруг PIVEC, таким образом, чтобы провода находятся на базе. Лента для защиты.
    6. Обертывание PIVEC с ~ 8 раундов алюминиевой фольги для изоляции. Закрепите скотчем.
    7. Подключить 2" длинный кусок 1/2" наружный диаметр гибкие шланги к адаптеру на вершине PIVEC. Удаление пористых трубок из стерильной водой и место внутри труб на вершине PIVEC.
    8. PIVEC место в зажим на стенде кольцо и безопасным. Полная установка с вакуумным насосом, счетчики частиц и аэрозолей set-up.
      Примечание: На основе числа хранение доза может быть определен только если счетчики частиц помещаются перед PIVEC и после PIVEC на отдельных трассах.
    9. Подвергайте фильтры с помощью шаг 2.2 протокола и желаемой экспозиции время и скорость потока, в этом исследовании был использован выдержка 10 мин на 0,5 LPM. Удалите PIVEC из установки. Вынуть вставки культуры клеток и место подвергаются фильтр в держатель фильтра в условиях низкой влажности для по крайней мере за 24 часа до измерения.
    10. Чистый PIVEC с 70% этиловом спирте. Стерилизуйте с ультрафиолетовым светом для по крайней мере 30 минут до следующего эксперимента.
    11. Весят подвергаются фильтр три раза и записывать фильтр весов. Место подвергаются фильтр в держатель фильтра помеченных для хранения.

4. Расчет хранение дозы и эффективности осаждения

Примечание: Знание осаждения имеет важное значение для аэрозольных администрации и интерпретации клеточного ответа.

  1. Вычислить осаждения из массы на основе измерений
    1. Вычислить масса осаждавшихся на фильтры как разница между средний вес до контакта и постконтактной средний вес. Это значение — на основе масса наплавленного доза для эксперимента.
    2. Использование управляемых массы, мadmin, и на основе массы на хранение доза определяется в 4.1.1, мdep, для расчета эффективности на основе массы осаждения, ηм, для эксперимента.
      Equation
    3. Средние значения с 4.1.1 и 4.1.2 для по крайней мере 3 экспериментов для определения осаждения и осаждения эффективности для PIVEC для размера частиц.
  2. Вычислить осаждения на основе числа измерений
    1. Убедитесь, что выполнены измерения с счетчики частиц с счетчики после PIVEC и для определения концентрации частиц до PIVEC. Интегрировать концентрации частиц со временем для счетчика частиц затем интегрировать над диаметр частиц для определения общего числа частиц измеряется.
    2. Вычислить номер частицы осаждаются как разница между управлением частиц и частиц измеряется пост PIVEC. Это значение — на основе числа хранение доза для эксперимента.
    3. Использование управляемых частицы, nадминистратора, на основе числа на хранение дозы, ndep, объемного расхода, V и времени, t, чтобы рассчитать эффективность на основе числа осаждения, ηn, для эксперимента.
      Equation
    4. Средние значения от 4.2.2 и 4.2.3 для по крайней мере 3 экспериментов для определения осаждения и осаждения эффективности для PIVEC для размера частиц.

5. Аэрозольные экспозиции клеток

Примечание: Для ячейки культуры на воздухе жидкость интерфейс читателя называется пустым и др. 38 операторы должны выполнить вставить культуры клеток нагрузки (шаги 5.1.2-5.1.4) в рамках биобезопасности кабинета. Операторы должны выполнить воздействия аэрозолей в зонта.

  1. Культура клетки на интерфейс воздуха жидкость
    1. Поднимите A549 клетки от культуры колбу путем добавления трипсина ЭДТА, 3 мл для T75 колбу или 1 мл раствора для T25 колбу и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C. Добавление 7 мл полной СМИ для T75 колбу или 4 мл полной СМИ для T25 колбу в колбу и промыть колбу стена с суспензию клеток для максимального количества изъятых клеток. Передача суспензию клеток стерильные 15 мл Конические трубки, а затем центрифуги клетки на 800 x g на 3 мин.
    2. Удалить супернатант содержащие трипсина ЭДТА и Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл полной СМИ. Удаление 10 мкл суспензии клеток и добавить Горяева. Подсчитать ячейки с помощью Горяева определить концентрацию и общее количество клеток.
    3. Место 0,5 мл полной СМИ для каждой скважины в течение 24 хорошо пластины. Поместите неиспользуемые ячейки культуры вставок в скважинах. Культура клеток семян вставляет на апикальной стороне на плотность клеток вблизи 1 х 105 клеток/см2 типов клеток, которые растут со скоростью около два раза в день. Для семян A549, хорошо вставить ячейки в течение 24 вставить клетки семян на плотности 1 х 105 клеток/см2 , добавив 35000 клеток в культуре клеток.
      Примечание: Клетки с замедлением темпов роста может быть заполнена на плотность рост клеток.
    4. Добавьте полный СМИ в апикальной части Вставка культуры клеток для достижения окончательный объем (для 24 хорошо пластины окончательный объем 0,25 мл).
    5. Культура для 7 дней в подводных условиях, заменив СМИ каждые 1-2 дня. После 7 дней удалите апикальной СМИ и культуры для по крайней мере 1 день в условиях Али, заменив только базолатеральной СМИ.
  2. Соберите PIVEC
    1. Позволяют клеткам макроэкономическую к интерфейсу воздуха жидкость для по крайней мере за 24 часа до облучения.
    2. Выберите соответствующую ячейку культуры вставить адаптер для PIVEC для поддержки Вставка культуры клеток с фильтром. Место культуры клеток Вставьте адаптер кусок на вершине PIVEC база, установив на место, таким образом, что база адаптер кусок шире верхней. Добавьте 4 мл клетки культуры средств массовой информации и базы PIVEC.
    3. Использование пинцета поставить клеточной культуры вставить в адаптер кусок в шаге 5.2.3. Поместите верхнюю часть на вершине кусок адаптер, влиться в место, таким образом, что база верхнюю часть шире верхней. Осторожно оберните PIVEC с одного слоя клейкой лентой.
    4. Подключите 37 мм кассетный штук на верхней и нижней части PIVEC, нажав на место. Поместите ¼" колючая адаптеры в кассету входным и выходным отверстием.
    5. Оберните резистивный нагревательный прибор вокруг PIVEC, таким образом, чтобы провода находятся на базе. Лента для защиты.
    6. Обертывание PIVEC с ~ 8 раундов алюминиевой фольги для изоляции. Закрепите скотчем.
    7. Подсоедините короткий кусок 1/2" наружный диаметр гибкие шланги к адаптеру на вершине PIVEC. Удаление пористых трубок из стерильной водой и место внутри труб на вершине PIVEC.
    8. PIVEC место в зажим на стенде кольцо и безопасным. Завершите настройки с вакуумный насос и аэрозолей set-up.
  3. Разоблачить клетки на Али с помощью PIVEC
    1. Использование осаждения эффективность определяется в шаге 2 для расчета массы быть аэрозольных частиц. Весят соответствующей массы и добавить в аэрозольные системы, созданной после шага 2 в пределах зонта.
    2. Разоблачение клетки, следуя шаг 2,2, в этом исследовании биологического конечных точек клетки подвергаются примерно 3,5 мг меди наночастиц с скорость потока 0,5 LPM и воздействия продолжительностью 10 минут исследования управления используется увлажненный воздух для определения влияние воздуха только. Удалите PIVEC из установки. Вынуть вставки культуры клеток, в стерильных хорошо пластины и вернуться к CO2 инкубатора (37 ° C, 5% CO2, 90% RH).
    3. Аспирационная СМИ от PIVEC. Если выполнять дополнительные эксперименты, промойте нижней части PIVEC с фосфатом буфер решение, а затем повторите шаг 5.1 и 5.2.
    4. Чистый PIVEC с 70% этиловом спирте, когда закончите. Стерилизуйте с ультрафиолетовым светом для по крайней мере 30 минут до следующего эксперимента.
  4. Биологическая проба процедуры
    Примечание: Анализов, выполненных в этом исследовании были поколения оксидативного стресса через DCFH-DA пробирного и цитотоксичность посредством выпуска Лактатдегидрогеназа (LDH).
    1. Растворите 24,4 мг в 50 мл метанола, чтобы сделать раствор 1 мм DCFH-да-да-DCFH. Этот раствор можно хранить при температуре-20 ° C до 4 месяцев. Разбавьте 1 мм DCFH-DA решение путем смешивания 0,1 мл 1 мм раствор DCFH-DA с 9,9 мл HBSS сделать 10 мл 10 мкм DCFH-DA.
    2. Удалите ячейку культуры средств массовой информации и мыть ячейки культуры вставка с примерно 1 мл PBS. Добавьте 0,5 мл раствора DCFH-DA 10 мкм в каждой скважине, заменив вставки после завершения. Крышка с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить photoactivation красителя и вернуться к инкубатора 37° C за 1 ч.
    3. Удаление ячеек из инкубатора и аспирационная DCFH-DA рабочий раствор из скважин. Добавить 0,5 мл HBSS скважин и заменить вкладыши культуры клеток.
    4. Загрузить хорошо пластины пластины читателя и мера базовых флуоресценции, с помощью волны возбуждения/выбросов 485/530 Нм. Удалите пластину из плиты читателя и нагрузки Вставка в PIVEC для экспозиции.
    5. Разоблачить клетки для желаемой экспозиции продолжительность. Снимите вставку из PIVEC и вернуться к хорошо пластины. Удаление 50 мкл базолатеральной жидкости из хорошо пластины и место в белый 96 хорошо пластины. Измерения флуоресценции DCF, с помощью волны возбуждения/выбросов 485/530 Нм каждые 30 мин после воздействия за 2 ч.
    6. Пусть жидкость базолатеральной сбалансировать до комнатной температуры для 20-30 мин добавьте 50 мкл ЛДГ пробирного раствора, смешанного следующий протокол производитель, базолатеральной жидкости из хорошо пластины и пусть реагировать на 10 минут добавить 25 мкл раствора стоп хорошо. Читайте флуоресценции resorufin продукта с использованием длины волны возбуждения/выбросов 560/590 нм.
    7. Удалите дополнительные базолатеральной жидкости и повторите шаг 5.4.6 на 4 ч. и 24 ч после воздействия.

6 статистические методы

  1. Анализ биологических анализа данных
    1. Доклад ROS производство как увеличение интенсивности флуоресценции клеток лечение относительно базового измерения. Отчет активность ЛДГ как увеличение интенсивности флуоресценции лечение клеток по отношению к необработанной клетки.
    2. Выполните один фактор дисперсионного анализа для определения статистических различий между наборами данных. Там, где это уместно, выполняют студенческих t тесты на значение значение 0,05. Данные отчета как среднее ± стандартное отклонение по крайней мере три измерения воздействия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Труда в vitro токсикологии включает в себя поддержание клеточной жизнеспособности при выполнении воздействия аэрозолей. PIVEC системы показано на Рисунок 2, включая температуру и контроль влажности и носить PIVEC. Температура поддерживалась с помощью батарейках резистивный нагревательный прибор и аэрозолей, увлажненный с помощью увеличилось природного увлажнения через пористые, смоченные трубку. В контролируемых аэрозоля, установив внутри лаборатории PIVEC может быть установка для облучения, показанный на рисунке 1. Характеристика системы позволяет для определения хранение дозы на клетки, которые затем могут быть соотнесены с клеточным ответом.

Осаждения эффективность зависит от размера частиц, добавляемых в систему, так как осаждения силы включают сдавление, седиментации и диффузии. Кроме того осаждений зависит от скорости потока, время экспозиции и характеристики воздействия системы. С этой информацией можно предсказать осаждения. Осаждения эффективность PIVEC было определено два метода, гравиметрического анализа и подсчета числа частиц. Уравнения 1 и 2 были использованы для определения эффективности осаждения в таблице 1 с помощью фильтра, основанного, сканирование мобильность частиц Сайзер (SMPS) и оптических частиц Сайзер (ОПС) измерений, Рисунок 3. В целом наблюдается увеличение осаждения 24 хорошо дизайн чем 6 хорошо дизайн и слегка уменьшается на 100 Нм по сравнению с 40 Нм и 800 Нм медных частиц. Осаждения в 24 скважины очень равномерно через insert, однако, осаждения в 6 хорошо дизайн отсутствует единообразие как большинство частиц месторождения вблизи центра вставки. Постконтактная анализ можно ускорить путем определения дозы отношения между 37 мм фильтр и вставка культуры клеток, уменьшается необходимость определить дозу После выдержки сотовой. Сравнение осаждения в рамках 37-мм Кассетный фильтр и PIVEC показывает сильную корреляцию для всех размеров и скважин с корреляции Пирсона выше 0,7, однако только для 800 Нм достигается при корреляции с p < 0,05, смотрите Рисунок 4. По сравнению с аналогичными системами всей литературы,11,12 осаждения эффективность PIVEC в диапазоне размеров частиц испытания сопоставимым или более зарегистрированных значений, отмечено на рисунке 5. Эффективность осаждения в рамках PIVEC может быть повышена путем сведения к минимуму потерь в системе с помощью электростатического диссипативных или проводящего пластика или аналогичные материала для разработки PIVEC.

Если фильтры не хорошо просушенные в среде с контролируемой влажности до воздействия, избыток воды увеличивает первоначальной массы и может производить нефизических, негативные хранение доз. Переменный поток ставки могут также способствовать несовместимым хранение дозы в системе. Чтобы избежать этих проблем, позволяют по крайней мере за один день до и после воздействия для фильтров для просушки в среде с контролируемой влажности.

Клеточных реакций будет зависеть от вклада дозы и могут быть затронуты продолжительность воздействия, если ячейки не обслуживаются должным образом. A549 клеток, клеток линии альвеолярного эпителия рака, были выставлены за 10 мин до различных размеров наночастиц меди 0,5 LPM со скоростью потока. Альтернативные перпендикулярно потока воздействия использования систем между 0,005 л и 1,5 л для периода устойчивого воздействия, тогда как этот метод использует скорость умеренного потока во время быстрого воздействия. С помощью эффективности осаждения на основе массы измеряется и приеме внутрь дозы, 1,58 ± 0,04 мг/см2 40 Нм меди, 0.30 ± 0.00 мг/см2 , 100 Нм медных частиц и 0,32 ± 0,01 мг/см2 800 Нм медных частиц были депонированы на клетки. В первые двадцать четыре часа после воздействия были замечены цитотоксичности и окислительного стресса. Цитотоксичность была измерена с помощью выпуска Лактатдегидрогеназа (LDH) от поврежденных клеток немедленно, 4 часа и 24 часов после облучения. Там было без существенных токсичности от меди наночастиц ниже 1,62 мг/см2 в течение 4 часов воздействия, Рисунок 6b. Двадцать четыре часа после облучения там было статистически значимое снижение жизнеспособности клеток менее чем 20% жизнеспособности клетки подвергаются меди наночастиц. Внутриклеточных оксидативного стресса были исследованы с помощью DCFH-DA assay путем окисления DCFH реактивнооксигенных видов в течение первых двух часов постконтактная, Рисунок 6a. Значительный уровень оксидативного стресса были измерены в тридцать минут после воздействия на клетки подвергаются меди наночастиц всех размеров. Уровень оксидативного стресса продолжает увеличиваться на аналогичные показатели для всех размеров, протестированы в течение двух часов наблюдается.

Успех воздействия могут быть определены путем повторяемость клеточного ответа. Два критерии приемлемости предлагаемых цитотоксичность анализы включают: 1 % всего ЛДГ утечки для положительный контроль должен быть больше, чем 50% и 2) позитивные и образец реплицировать коэффициент вариации должно быть в пределах 50%. 39 если эти критерии не выполнены, это предложить различия между экспериментов, например изменения осаждения суммы, или плохой контроль влажности или температуры. Кроме того наблюдения за цитотоксичность измерений может привести к пониманию экспериментальных элементов управления и помощь в определении ошибки. Когда скорость потока слишком высока, клетки могут умереть от большое количество касательное напряжение. Снижая скорость потока, может быть уменьшена стресса на клетки из потока.

Figure 1
Рисунок 1. Схема системы сухой разгон и экспериментальной установки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Дизайн PIVEC. A) полный дизайн фото с 30 см высотой поле для сравнения. B) PIVEC с температуры и влажности на фото с 30 см высотой поле для сравнения. C) носить PIVEC. D) Верхняя часть PIVEC. E) клетки культуры адаптер для 24 хорошо (слева) и 6 хорошо (справа). F) Нижняя часть. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Число на основе эффективности осаждения (%) Масса на основе эффективности осаждения (%)
6 хорошо 40 Нм 17.83 ± 32.13 5.85 ± 0,85
100 Нм 0.47 ± 4.06 5.11 ± 0,94
800 Нм 3.70 ± 35.00 6.39 ± 1.01
24 хорошо 40 Нм 1.43 ± 2.43 12.61 ± 1.34
100 Нм 1.37 ± 19.45 2.95 ± 0.75
800 Нм 6.98 ± 3.93 15.95 ± 0,53

Таблица 1. Эффективность PIVEC осаждения.

Figure 3
Рисунок 3. Номер концентрации частиц аэрозолей меди наночастиц. A) SMPS измерение. B) OPS измерение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Взаимосвязь между осаждения на вставки ячейки и SKC 37 мм фильтр. Ошибка ± 0,002 мг. A) 40 Нм медных частиц. B) 100 Нм медных частиц. C) 800 Нм медных частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. Осаждения эффективность PIVEC, по сравнению с системами воздействия потока перпендикулярно в литературе. Литература значения из перпендикулярно потока воздействия систем строятся в твердых маркеры и PIVEC значения в пустых маркеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6. Клеточный ответ на медь постконтактная наночастиц (PE). Для всех измерений, n = 3 и p < 0,05. A) окислительный стресс, определяется с использованием DCFH-DA Assay. B) определяется с помощью ЛДГ Assay цитотоксичности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Фильтр кассеты обеспечивают простой и недорогой метод сбора аэрозолей в зоне дыхания; Однако образцы аэрозоля, извлеченные из фильтров не представляют всю аэрозоля (т.е. газов, летучих веществ и твердых частиц) и соответственно ограничить оценку соответствующих биологических эффектов. Используя первоначальный дизайн Кассетный фильтр 37 мм, PIVEC предназначен для поддержания переносимости и имитировать в естественных условиях осаждения частиц от вдыхания. PIVEC значительно меньше, чем текущее Али воздействия систем, примерно размер коробка ткани с включены контроль температуры и влажности. Размер похож на личные Каскад ударных Кроме предлагая данных на клеточный ответ на аэрозоля. В то время как PIVEC содержит пространство на одном образце по сравнению с других текущих систем экспозиции, малый размер позволяет несколько систем, которые будут использоваться одновременно, таким образом, увеличивая размер выборки и позволяет для пространственного распределения должно контролироваться.

Есть несколько важных шагов в протоколе. Для определения эффективности осаждения, важно правильно условию фильтры, как описано в шаге 1. Кроме того важно должным образом взвесить наночастицы меди до облучения и воздействия пост фильтр для определения эффективности на основе массы осаждения. Количество осаждения эффективность должна определяться с помощью разница в осаждения концентрации первоначального аэрозолей и конечная концентрация определяется с помощью счетчиков частиц. Если эффективность осаждения не определен должным образом, трудно определить биологический ответ различия между типами аэрозоля. Изменения в осаждение включает изменения осаждения. Осаждения может быть увеличен путем изменения длительности потока скорость и экспозиции. Это может также влиять на жизнеспособность клеток с потенциалом высыхания клетки. Принадлежности аэрозолей часто выполняется для компенсации физиологических атрибуты, такие как температура тела и увлажнения в дыхательных путях. Повышенная влажность, более 50%, имитирует вдыхаемого воздуха и снижает клеточной гибели вследствие воздействия транспортного средства. 43 когда температура и влажность не хорошо управляемы, клеточный ответ может влиять. Уменьшая скорость потока, сдаст дополнительных частиц всех размеров, увеличение осаждения. Продолжительность воздействия пропорциональна осаждения, позволяя больше частиц на хранение в течение длительного экспериментального периода. Принадлежности аэрозоля имеет важное значение при увеличении продолжительности воздействия, так что клетки не сушите, которые могут повлиять на биологических реакций.

PIVEC использует перпендикулярно потока для депозита частиц через сдавление, седиментации и распространения на клетки, которые имеют потенциал, чтобы высушить вне клетки через поток и добавил стресса на клетки. Осаждения эффективность зависит от размера частиц из-за силы осаждения. Многие из нынешних систем экспозиции с перпендикулярной потока имеют КПД осаждения ниже 10% и гораздо ближе к 1%. PIVEC имеет осаждения эффективность определяется гравиметрического анализа от 3% до 16% за 24 хорошо клетки культуры вставки. Эффективность на основе числа осаждения частиц — примерно на 1% до 7% для же вставки. При использовании 6 также вставляет культуры клеток, уменьшить эти цифры, за исключением наименьший размер частиц, благодаря рационализации аэрозоля, как больше частиц ограничены в Вставка культуры клеток без пространства для потока развивать. 6 хорошо клетки культуры вставок позволяют аэрозоля потоки, чтобы обойти осаждения. Другие перпендикулярные потока системы характеризовались на массовой основе, с использованием 60 Нм флуоресцеин частиц40, 80 Нм и 180 Нм медных частиц16и 60 Нм адипиновой кислоты частицы41. Результате осаждения эффективности, как правило, от 0.05% до 11%. На основе числа эти системы характеризуются использованием полистирола частицы12,15, углерода наночастиц12и кремнезема частицы42, уступая эффективности между 0,2% и 11%. PIVEC обеспечивает, аналогичные или более, осаждений по сравнению с доступных сотовой воздействия устройства.

Клетки воздействия были проведены с использованием меди наночастиц 40 Нм, 100 Нм до 800 Нм. Жизнеспособность клеток была определена с помощью ЛДГ assay без значительного снижения жизнеспособности в течение четырех часов после облучения. LDH assay был использован с системой коммерческого воздействия для 74 нг/см2 после 2 часов и 148 нг/см2 после 4 часов 9.2 Нм меди оксид частицы44 и 1 мкг/см2 хранение после последовательного воздействия 4 часа, инкубаторов для 2 часов, а затем другого воздействия на 4 часа 25 Нм меди оксид частиц40, оба измерения значительное сокращение жизнеспособность клеток. Цитотоксичность было отмечено в другой системе для 1.6-7,6 мкг/см2 180 Нм частиц меди наночастиц16 измеряется Трипановый синий краситель исключения. Воздействия 15 минут 40-80 Нм меди оксид наночастиц снижение жизнеспособности, измерить воздействие пост 24 часа. Нижняя токсичности, используя PIVEC, вероятно, из-за короче выдержка 10 минут и короче времени измерения экспозиции пост. После четырех часов после облучения жизнеспособность клеток в PIVEC уменьшилась. Клетки подвергаются воздействию влажного воздуха управления отмечено без существенных цитотоксичность, по согласованию с другими исследования 9,40,,4445,46. Оксидативный стресс был определен с помощью DCFH-DA assay. Производство активных форм кислорода, таких как перекись водорода или радикалов кислорода, созданный количество стресса, которые могут привести к смерти арест или клетки роста. После облучения клетки был минимальное увеличение окислительного стресса для клеток, хранится в инкубаторе как управления и клеток воздействию влажного воздуха. Повышенный Оксидативный стресс произошло для всех размеров частиц, увеличение в течение 30 минут после контакта. В одном исследовании, частицы оксида меди 9.2 Нм44 и 25 Нм частицами оксида меди40 индуцированного окислительного стресса, измеренные через карбоксильную DCFH-DA пробирного. Увеличение экспозиции время от 2 часов до 4 часов повышенный Оксидативный стресс для частиц оксида меди 9.2 Нм44. После четырех часов воздействия, 9.2 частицы окиси меди Нм подготовила аналогичные окислительного ответ как последовательное воздействие 25 Нм меди оксид частиц40, предполагая, что воздействие длительности выше влияет на реакции окислительного стресса чем размер частиц. Клетки подвергаются в течение PIVEC производятся повышенный Оксидативный стресс, по сравнению с исследования, однако, частицы, подвергаются в системе альтернативного оксида меди и будет распустить менее быстро, чем медь, воздействию в течение PIVEC. Исследования проведены на растворения меди, основанный на состав и размер частиц согласны с тем, что крупные частицы и оксидов металлов релиз ионов медленнее, чем металлические частицы или их коллегами наночастиц16,47 , 48 , 49 как влажный воздух управления не производит значительное количество оксидативного стресса, по сравнению с контролем инкубатор, влияние меди частиц побудить Оксидативный стресс согласуется в пределах PIVEC аналогичного воздействия в пробирке систем. Биологических реакций, используя PIVEC предположить, что PIVEC соответствующей системы для сотовых экспозиции.

В то время как характеристика и сотовых исследования PIVEC хорошо согласуются с литературой,9,16,40,,4446 устройство имеет ограничения. Небольшой дизайн уменьшается количество выборок, которые могут быть представлены одновременно в рамках одного устройства по сравнению с другими системами воздействия. Другие системы позволяют по крайней мере три сотовых воздействия же аэрозоля9,12 содействия измерений. Хотя PIVEC допускает только один вставки каждой системы, малый размер позволяет для нескольких систем легко использоваться, помогая смягчить эту проблему. В то время как другие личные системы мониторинга не использовать клетки, PIVEC должны храниться в вблизи вертикальных уменьшить разлив СМИ культуры клеток необходимо сохранить клеточной жизнеспособности. Хотя PIVEC еще не оптимизирована для конкретных частиц (10PM, PM2.5, вечера0.1), PIVEC характерны для диапазона размеров частиц. Подобно к другим системам перпендикулярно потока, PIVEC показывает снижение способности внести частиц вблизи 100 Нм в диаметре, а 40 Нм и 800 Нм частицами, хранение с аналогичными эффективностью.

Анализ клеток постконтактная можно ускорить путем выполнения параллельных коллекции аэрозолей в пределах PIVEC и кассетный фильтр SKC 37 мм. Высокая корреляция гравиметрических основе осаждения позволяет для оценки массы частицы собранные на клетки из данных, собранных с помощью фильтров 37 мм. Сравнение вставить кассету фильтр уменьшает необходимость сбора дополнительных образцов и дополнительные измерения для определения дозы. Работа включает в себя интеграцию системы реального времени мониторинга цитотоксичность, окислительного стресса или других биологических конечных точек. Небольшой размер PIVEC позволяет использовать его в различных параметров, таких как на теле как личный монитор, на БЛА выше химический завод, или снаружи в среде для пространственного разрешения. Этот метод показано использование PIVEC для сбора аэрозолей на клеточных культур, выращенных на Али. По принадлежности аэрозоля 37 ± 1 ° C и относительной влажности воздуха > 80%, клеточной жизнеспособности может поддерживаться во время острого облучения. Этот метод подходит для жидких капель и твердых частиц на основе аэрозолей и было показано, что вклад частиц между 40 Нм до 800 Нм в ячейку культуры вставок. Универсальность PIVEC позволяет этот метод, чтобы использоваться в нескольких параметров с различными биологическими конечных точек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Принадлежность авторов, как показано на обложке. Авторы при финансовой поддержке Университета Содружества Вирджинии, где работа была завершена в Ричмонд, штат Вирджиния. Авторы имеют исключительную ответственность за написание и содержание этого документа. Авторы заявляют, что существует не конкурирующие интересы.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Борис Соломонов и магазин машина инноваций Содружества Вирджиния за помощь с быстрое прототипирование устройства. Авторы хотели бы также поблагодарить Cristian Ромеро-Фуэнтес Левинский группы, д-р Виталий Аврутин, д-р Дмитрий Пестов и Вирджиния Содружества наноматериалов основных характеристик объекта за их помощь с гранулометрического состава. Эта работа была поддержана запуска средства, предоставленные для доктора Левинский Инженерный колледж Университета Содружества Вирджинии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61, (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3, (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013, (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51, (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26, (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10, (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97, (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20, (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11, (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8, (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9, (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103, (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36, (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19, (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41, (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47, (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27, (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26, (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29, (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206, (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9, (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5, (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5, (3), 389-399 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics