一种用于气溶胶取样的新型便携式体外曝光盒

Environment

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Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以执行便携式细胞气溶胶暴露和测量细胞反应。该方法使用细胞, 生长在空气液体界面,模仿体内生理。通过活性氧的产生和乳酸脱氢酶释放的细胞毒性, 观察到细胞对铜纳米颗粒气溶胶的反应为氧化应激。

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Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

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Abstract

该协议引入了一种新的体外暴露系统, 能够磨损, 包括其特性和性能。体外接触系统中的空气-液体界面 (ali) 通常是大的和笨重的, 使在排放源或呼吸区内的场和操作运输变得困难。通过这些系统的小型化, 实验室可以被带到现场, 加快处理时间, 并提供更合适的曝光方法, 在接触细胞之前不改变气溶胶。便携式体外曝光盒 (pivec) 采用37毫米滤镜盒, 允许在传统实验室环境之外进行体外毒性测试。利用三种尺寸的铜纳米粒子对 pivec 进行了表征, 在重量和颗粒数量浓度分析的基础上确定了沉积效率。对暴露的肺细胞进行了初步的细胞毒性实验, 以确定该系统在保持细胞活力的同时沉积颗粒的能力。与体外接触设备中可用的垂直流动相比, pivec 提供了类似或更高的沉积效率。尽管样品吞吐量较低, 但小尺寸为目前的体外 ali暴露系统提供了一些优势。其中包括个人监测所需佩戴的能力、从实验室到排放源的流动性, 以及在保持较低用户成本的同时设置多个空间分辨率系统的选项。pivec 是一个系统, 能够收集气溶胶在现场和呼吸区到一个空气接口,体外模型。

Introduction

使用体外技术进行个人取样可以提供有关气溶胶在工作场所的生物效应的全面信息。1接触空气中的污染物包括在将气体引入电池悬浮液的淹没条件下接触到化学品本身、接触采集到的空气样本、使用摇杆等装置进行间歇性接触或直接接触在空气-液体界面 (ali) 处曝光。2其中许多技术是在悬浮液中生长的细胞或在接触前收集样品的情况下进行的, 由于气溶胶的潜在变化, 每一种技术都会影响毒理学研究。3为避免这些变化, 可以使用文献中使用的几个体外ali 培养暴露系统将实验室带到现场, 这些系统在文献中使用, 4,5,6, 7,然而,891011、12、13很少有商业产品可供选择。8,9,12这些系统通常体积庞大, 特别是在包括调节细胞环境的温度和湿度以及样品气溶胶流量的仪器时。通过使用 pivec, 气溶胶暴露可以在传统实验室环境之外进行, 也可以在呼吸区内进行, 同时模拟吸入条件。

体外气溶胶沉积的测定对研究吸入对健康的影响具有重要意义。呼吸区, 距离口腔和鼻子不到 3 0 厘米的区域,1 4对于了解纳米颗粒的暴露程度和与肺部的生物效应联系起来至关重要。2通常, 细胞上的沉积被定义为沉积效率, 即沉积在细胞上并由被给系统的粒子 615 或在相同数量的质量基础上吸收的颗粒。4 个,16目前测量呼吸区气溶胶的方法是以过滤器为基础的, 在给定的采样期间捕获粒子, 并使用过滤器进行进一步的测试。17个人监控需要一个小系统, 附带较少样本的权衡。

有许多方法可以确定暴露于气溶胶对健康的影响。ali 模型允许气雾剂通过空气直接给细胞, 就像在实际暴露情况下一样, 但它比体内研究更具成本效益, 时间密集程度更低, 同时模仿空气液体屏障, 如眼睛,皮肤和肺。在 ali 生长的肺细胞具有产生偏振屏障层的能力, 18-19,产生类似于体内肺上皮的生理特征, 包括特定的粘液和表面活性剂的产生支气管或肺泡细胞系, 纤毛跳动,19个紧密连接,19个,20个和细胞极化。18这样的变化会影响毒性研究中测量的细胞反应。21此外, ali体外模型结果往往比通过悬浮液模型22暴露的细胞更敏感, 能够在体内模拟急性吸入毒性。23,24因此, 能够在呼吸区内进行测量的 ali 暴露系统是自然的下一步。

通过将细胞直接暴露在排放源处的气溶胶中, 就会对混合物中的所有气体、半挥发性化合物和颗粒的影响进行调查。当混合物收集在过滤器上时, 气体和挥发性化合物不会被捕获, 也无法对整个混合物进行调查。此外, 将颗粒重组为粉末或液体悬浮液会导致液体悬浮液中的聚集或颗粒-流体相互作用, 如溶解。25,26当气溶胶颗粒被添加到液体中时, 聚集的可能性较高,25, 27 形成蛋白质电晕, 28 或与液体中的化合物相互作用,可能会影响沉积和影响生物反应。29,30

ali 的暴露是基于三个主要的气溶胶剖面, 云沉降, 平行流动, 和垂直流动。云沉降, 空气-液界面细胞暴露 (alice) 使用,4是一个批处理系统, 其中粒子沉积通过重力和扩散沉降作为气溶胶作为一个单位处理。平行流动, 由静电气溶胶体暴露系统 (eaves)5和多文化曝光室 (mec) ii, 6 允许沉积通过增加布朗运动通过流动剖面。垂直流量, 由一个微喷雾器,7纳米气溶胶室用于体外毒性 (nacivt),11和商业 ali 系统8,9,10, 12,增加了冲击沉积区域内的颗粒。其中许多暴露系统体积大、体积大, 需要过多的气雾剂预处理系统、流量泵, 甚至是细胞孵化加热室。这种较大的尺寸降低了系统的可移植性。而不是直接在排放源取样, 这些系统往往有样品带到实验室或模型气溶胶产生进行分析。从现场到实验室的转换可能会降低发射气溶胶的复杂性。pivec 比当前系统更小, 外部表面积约为460厘米2 , 重量仅为60克, 并在系统中集成了热和湿度控制, 可实现高度便携的设备。尺寸和重量的减少使系统能够磨损或带到接触源, 从而允许直接取样。

目前暴露系统的巨大规模也降低了进行取样以调查浓度空间梯度的能力。在确定许多潜在环境和职业危害的毒理影响时, 该决议是关键, 例如发生雾化的车辆排气颗粒物或工作场所活动。发射后, 粒子浓度立即出现空间方差。这随着粒子在整个大气中的扩散而随时间增长, 这些影响可能会根据温度、压力、风和太阳等环境条件而改变。颗粒一旦发出3132,就会开始老化和氧化, 扩散率也会受到地形的影响;在峡谷和隧道中会发现浓度较高, 那里的分散效应会变慢, 在分散面积较大的地方可以发现浓度较低。33 . 分散率的这些变化可对人类健康产生重大影响, 在比较生活在城市和农村的哮喘成年人人数时可以看到这些变化。34 . 虽然许多曝光系统同时提供多个样本, 但需要多个系统, 并配备大量大型设备来执行空间分辨率。

通过将实验室带到现场, 可以通过使用整个细胞作为传感器来减少分析时间。遵循已知的生物机制和终点可以帮助确定气溶胶的组成和大小。由于缓慢的清除方法, 包括黏膜清除, 吞噬, 和移位, 这些粒子往往与细胞相互作用约几天到第3周产生氧化应激, 炎症, 甚至细胞死亡。这些生物终点可能是心血管疾病或慢性阻塞性肺病不良结局途径的起点。此外, wiemenn等人还进行了一系列体外检测, 以便与短期体内吸入毒性的文献值进行比较。35通过乳酸脱氢酶释放、谷胱甘肽还原和过氧化氢的形成和释放以及炎症潜能检测细胞毒性的四个阳性结果中的两个预测了体内反应。肿瘤坏死因子α基因。在10种纳米金属氧化物测试中, 6 种使用体外暴露进行活性测试 (氧化钛、氧化锌和4种不同的氧化锆),并在体内确认。 

为了研究气溶胶在职业环境中的影响, 我们的实验室开发了用于现场曝光的 pivec。此外, 可以佩戴 pivec 进行个人取样, 以监测和调查吸入暴露情况, 如37毫米滤芯盒36或多个系统可用于在给定区域内实现空间分辨率。在该协议中, 讨论了 pisec 的特性和使用。接触后, 通过细胞毒性检测观察生物效应。

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Protocol

操作人员在执行步骤1、2、3、5和6时必须佩戴个人防护设备 (如实验室涂层、手套、护目镜)。

1. 材料的制备

  1. 准备系统装配和曝光材料, 以确保可重复性。
    1. 确保在系统装配中使用新的或70% 的乙醇清洗的 "内径导电管和外径连接器。
    2. 在实验前, 将包括过滤器、pivec 组件、推子和颗粒粉末在内的测试材料存储在控制良好的环境中, 在温度和湿度方面至少24小时。
      注: 温度应接近室温, 约 20°c, 相对湿度低于35%。这对于实现实验之间的可重复性非常重要。
    3. 准备使用异丙醇清洁部件的粒子计数器, 并根据制造商的建议进行系统预热, 包括用于测量的扫描移动性颗粒片 (smps) 和光学颗粒片 (ops)。

2. 干式气溶胶的产生

注: 操作人员应在烟罩中进行气溶胶生成。

  1. 组装一个系统以产生干燥的气溶胶
    注: 气体或液体中颗粒的悬浮液应适用于模拟应用和细胞培养。以下方法可以使用基于液体的气溶胶来执行。干式气雾剂系统的设计来自 tiwari人。37干分散系统的示意图如图 1所示。
    1. 将球阀连接到 4 "1.5 大小的螺纹管的每一端, 这将作为粒子料斗。将 2 "1.5 大小的管道连接到一个阀门。
    2. 在确定沉积效率的同时, 对不同粒径的质量浓度保持恒定。近似使用7.5 毫克的40纳米铜纳米颗粒, 7 毫克的100纳米铜纳米颗粒, 和13毫克800纳米铜纳米粒子每次接触。通过开口端将铜纳米颗粒放入粒子料斗中。
      注: 称量的铜纳米颗粒的用量将作为质量为基础的管理浓度。
    3. 将 3 "片半" 管在 2 "管周围放置, 并在这个短管内放置一个 hepa 过滤器, 使流动方向通过球阀。
    4. 使用螺纹将真空发生器连接到其他球阀。将真空发生器连接到空气罐, 将一个/1 6 英寸的 od 管放入推送锁定连接中。使用-"od 管将真空发生器的出口放置在真空发生器的出口上, 将其连接到实验装置。
  2. 使用干式气溶胶系统生成干气溶胶
    1. 通过转动主阀打开气罐, 并允许气流进入系统。打开空气罐上流量调节器上的阀门, 并设置为通过系统的流量相当于真空泵上所需的设置。
    2. 打开离 hepa 滤清器最近的球阀, 然后打开离真空发生器最近的球阀。保持这些开放约 3秒, 以允许粒子被拉到气流中。
    3. 关闭最接近真空发生器的球阀, 然后关闭最接近 hepa 过滤器的球阀。必要时, 允许油箱中的空气在实验期间流动。
    4. 关闭空气罐上的主阀门和调节器阀门, 以阻止流动。使用70% 乙醇清洁球阀和真空发生器。用于灭菌的高压灭菌金属管。

3. 使用 pivec 测量沉积效率

注: 操作人员应在烟罩中进行气溶胶暴露。

  1. 通过在预称滤波器上收集步骤2.2 中产生的铜纳米颗粒气溶胶来测量沉积。使用沉积剂量, 使用过滤器上收集的质量进行测量, 并使用称重铜颗粒量测量的给值剂量, 以确定沉积效率。
    1. 在低湿度条件下保持1.00 微米的孔隙玻璃纤维过滤器 (1.1.2 所述), 在曝光前测量前至少24小时。对未使用的滤清器称重三次, 并记录滤清器的重量。将未使用的筛选器放在单元培养插入中。
    2. 为 pivec 选择合适的细胞培养插入适配器 (6 孔或24孔), 以支持与过滤器一起插入细胞培养。将细胞培养件插入适配器件放在 pivec 基座的顶部, 设置到位, 使适配器件的基座比顶部宽。
    3. 使用推子将过滤加载的细胞培养插入物放置在适配器件中。将顶部件放在适配器件的顶部, 沉降到位, 使顶部的底部比顶部宽。用一层管道胶带包裹 pivec。
    4. 通过推入到位, 连接 piveec 顶部和底部的37毫米盒式磁带件。将带刺的适配器放入盒式进气道和出气口。
    5. 将 pivec 周围的电阻加热器包裹起来, 使电线位于底座上。要保护的磁带。
    6. 用 ~ 8 轮铝箔包裹 pivec 进行绝缘。用磁带固定。
    7. 将 2个 "长的半" 外径软管连接到 piveec 顶部的适配器。从无菌水中取出多孔管, 并将其放置在 pivec 顶部的管材内。
    8. 将 pivec 放置在环支架上的夹具内并保持安全。通过真空泵、粒子计数器和气雾剂设置完成设置。
      注: 基于数字的沉积剂量只能在粒子计数器放置在 pivec 之前和 pivec 之后单独运行的情况下才能确定。
    9. 使用协议的步骤2.2 和所需的曝光时间和流量公开过滤器, 本研究使用了 0.5 lpm 时10分钟的曝光时间。从设置中删除 pivec。取出细胞培养物插入并将暴露的过滤器放置在低湿度条件下的过滤器支架中, 在测量前至少24小时。
    10. 用70% 乙醇清洁 pivec。在下一次实验之前, 用紫外线消毒至少30分钟。
    11. 对暴露的滤清器称重三次, 并记录滤清器的重量。将暴露的过滤器放在带标签的过滤器支架中进行存储。

4. 沉积剂量和沉积效率的计算

注: 对沉积的了解对于气溶胶的管理和细胞反应的解释很重要。

  1. 根据质量测量计算沉积
    1. 计算过滤器上的沉积质量作为曝光前平均重量和曝光后平均重量之间的差异。这个值是实验的基于质量的沉积剂量。
    2. 在4.1.1 中确定的给量质量、m管理和基于质量的沉积剂量, 计算了基于质量的沉积效率, 为实验计算了 m。
      Equation
    3. 4.1.1 的平均值和4.1.2 至少3个实验, 以确定 pivec 的沉积和沉积效率的粒径。
  2. 根据数字测量计算沉积
    1. 确保在 pivec 之后使用计数器进行了粒子计数器测量, 并在 pivec 之前确定粒子浓度。随着时间的推移, 将粒子浓度与粒子计数器集成, 然后在颗粒直径上进行整合, 以确定测量的总颗粒。
    2. 计算沉积粒子数作为被施用的粒子和在 pivec 后测量的粒子之间的差异。此值是实验的基于数字的沉积剂量。
    3. 采用给药剂颗粒、n管理、数字沉积剂量、ndep、体积流量、v、时间等方法, 计算出基于数字的沉积效率, 为实验进行计算.
      Equation
    4. 4.2.2 的平均值和4.2.3 至少3个实验, 以确定 pivec 的沉积和沉积效率的粒径。

5. 细胞的气溶胶暴露

注: 为细胞培养在空气液体接口读者提到空白人。38操作人员应在生物安全柜内进行细胞培养插入加载 (步骤 5.1.2-5.1.4)。操作人员应在烟罩中进行气溶胶暴露。

  1. 空气-液体界面中的培养细胞
    1. 通过添加胰蛋白酶 edta、t75 烧瓶3毫升或 t25 烧瓶3毫升, 在37°c 下孵育 5分钟, 从培养瓶中提取 a549 细胞。添加7毫升的完整介质为 t75 烧瓶或4毫升的完整介质的 t25 烧瓶烧瓶和冲洗烧瓶壁与细胞悬浮液, 以最大限度地恢复细胞数量。将细胞悬浮液转移到无菌的15毫升锥形管, 然后以 800 x g离心细胞3分钟。
    2. 取出含有胰蛋白酶 edta 的上清液, 并在10毫升的培养基中重新悬浮细胞颗粒。去除10μl 细胞悬浮液, 加入血细胞计。用血细胞仪计数细胞, 以确定细胞的浓度和总数。
    3. 将 0.5 ml 的完整介质放置在24井板内的每个井。将未使用的细胞培养插入物放入井中。种子细胞培养在顶端的一侧插入, 细胞密度接近 1 x10 5细胞/厘米2 , 用于以每天近一倍的速度生长的细胞类型。为了在24井插入中播种 a549 细胞, 种子细胞的密度为 1x10 5细胞 2, 在细胞培养中加入 35, 000个细胞插入。
      注: 生长速度较慢的细胞可以在细胞密度增加的情况下播种。
    4. 添加完整的培养基到细胞培养插入的顶端一侧, 达到最终体积 (24 孔板最终体积为0.25 毫升)。
    5. 在水下条件下培养 7天, 每1-2天更换一次介质。7天后, 在 ali 条件下, 取出顶端培养基和培养物至少 1天, 只替换基外侧培养基。
  2. 组装 pibec
    1. 在暴露前, 允许细胞平衡到空气-液体界面至少24小时。
    2. 为 pivec 选择适当的细胞培养插入适配器, 以支持与过滤器一起插入细胞培养。将细胞培养插入适配器件放在 pivec 基座的顶部, 设置到位, 使适配器件的基座比顶部宽。在 pivec 基部的井中加入4毫升的细胞培养基。
    3. 使用推子将细胞培养插入物放置在放置在步骤5.2.3 中的适配器件内。将顶部件放在适配器件的顶部, 沉降到位, 使顶部件的底部比顶部宽。小心地用一层管道胶带包裹 pivec。
    4. 通过推入到位, 连接 piveec 顶部和底部的37毫米盒式磁带件。将带刺的适配器放入盒式进气道和出气口。
    5. 在 pivec 周围包裹电阻加热器, 使电线在基座上。要保护的磁带。
    6. 用 ~ 8 轮铝箔包裹 pivec 进行绝缘。用磁带固定。
    7. 将半直径软管的短片连接到 piveec 顶部的适配器上。从无菌水中取出多孔管, 并将其放置在 pivec 顶部的管材内。
    8. 将 pivec 放置在环支架上的夹具内并保持安全。通过真空泵和气雾剂设置完成设置。
  3. 使用 pisec 在 ali 处释放细胞
    1. 使用步骤2中确定的沉积效率来计算要雾化的颗粒质量。称量适当的质量, 并添加到气雾剂系统设置以下步骤2内的烟罩。
    2. 按照步骤2.2 释放细胞, 在这项生物终点的研究中, 细胞接触到大约3.5 毫克的铜纳米颗粒, 流速为 0.5 lpm, 接触时间为10分钟。空气的影响单独。从设置中删除 pivec。取出细胞培养物插入, 放置在无菌井板中, 然后返回到 co2孵化器 (37°C, 5% co 2,90% rh)。
    3. 从 pivec 吸收媒体。如果进行额外的实验, 用磷酸盐缓冲溶液冲洗 pivec 底部, 然后重复步骤5.1 和5.2。
    4. 用70% 乙醇清洁 pivec。在下一次实验之前, 用紫外线消毒至少30分钟。
  4. 生物检测程序
    注: 本研究中进行的检测是通过 dcfh-da 分析产生氧化应激, 以及通过乳酸脱氢酶 (ldh) 释放产生细胞毒性。
    1. 在50毫升甲醇中溶解24.4 毫克 dcfh-da, 制成 1 mL dcfh-da 溶液。此解决方案可在20°C 存储长达4个月。将 1 mm dcfh-da 溶液与 9.9 ml hbss 混合, 将 1 mm dcfh-da 溶液混合 0.1 ml, 制成 10μm dcfh-da 的10ml。
    2. 去除细胞培养培养基, 用大约1毫升的 pbs 洗细胞培养。在每口井上加入0.5 毫升 10μm dcfh-da 解决方案, 完成后更换刀片。盖板与铝箔, 以防止染料的光活化, 并返回37°C 孵化器1小时。
    3. 从孵化器中取出细胞, 并从井中吸气 dcfh-da 工作溶液。在油井中加入 0.5 ml hbss, 并更换细胞培养插入物。
    4. 将井板加载到读卡器中, 并使用 485530 nm 的发射波长测量基线荧光。从读卡器中取出板, 并将插入 pivec 进行曝光。
    5. 将细胞暴露在所需的曝光时间内。从 pivec 中取出刀片, 返回到良好的板材。从井板上取出50μl 的基底外侧流体, 放在白色96井板中。使用485530纳米的发射波长测量 dcf 的荧光, 曝光后每 30分钟2小时一次。
    6. 让基外侧流体平衡到室温 20-30. 加入50μl 的 ldh 检测溶液, 按照制造商协议混合, 到井板的基外侧流体, 并作出反应 10分钟, 加入25μl 的停止溶液。使用 560/590 纳米的发射波长读取间素产品的荧光。
    7. 在接触后4小时和24小时内取出额外的基底外侧液体, 并重复步骤5.4.6。

6统计方法

  1. 生物检测数据分析
    1. 报告 ros 的生产, 因为相对于基线测量, 处理过的细胞的荧光强度增加。报告 ldh 活性, 因为相对于未经处理的细胞, 经处理的细胞的荧光强度增加。
    2. 执行单因素方差分析以确定数据集之间的统计差异。在适当的情况下, 以0.05 的重要值进行学生 t 考试。报告数据作为至少三次曝光测量的均值±标准偏差。

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Representative Results

职业体外毒理学包括在接触气溶胶时维持细胞活力。pivec 系统如图 2所示, 包括温度和湿度控制以及磨损的 pivec。温度使用电池供电的电阻加热器和气雾剂通过多孔湿管使用增加的自然加湿进行加湿。在实验室内的受控气溶胶设置中, 可以设置 pivec 进行曝光, 如图 1所示。通过对该系统进行表征, 可以确定细胞上的沉积剂量, 然后将其与细胞反应相关。

沉积效率取决于添加到系统中的粒子的大小, 因为沉积力包括撞击、沉积和扩散。此外, 沉积还取决于流速、曝光时间和暴露系统的特点。有了这些信息, 可以预测沉积。通过重量分析和粒子数计数两种方法确定了 piveec 的沉积效率。利用基于滤波器的扫描移动粒子分析器 (smps) 和光学粒子分析器 (ops) 测量图3, 使用公式 1和2确定表 1中的沉积效率。与6口井设计相比, 24 口井设计的沉积总体上有所增加, 与40纳米和800纳米铜颗粒相比, 100 纳米的沉积量略有下降。24口井的沉积在刀片上非常均匀, 但6口设计中的沉积缺乏均匀性, 因为大多数颗粒沉积在刀片中心附近。通过确定 37 mm 过滤器与细胞培养插入物之间的剂量关系, 可以加快接触后分析, 从而减少在细胞暴露后确定剂量的必要性。对37毫米滤芯和 pivec 内的沉积进行比较后发现, 所有尺寸和井的皮尔逊相关性均在0.7 以上, 但只有800纳米与 p<0.05 的相关性显著, 见图 4。与文献中的类似系统相比,图 5观察到的情况下, pivec 在所测试的颗粒大小范围内的沉积效率是可比或增加的。通过最大限度地减少使用静电耗散或导电塑料或类似材料设计 pivec 的系统的损耗, 可以提高 pivec 内的沉积效率。

如果过滤器在暴露前在湿度控制的环境中没有很好地干燥, 多余的水会增加初始质量, 并可能产生非物理的、负沉积的剂量。可变流速也会促进系统内不一致的沉积剂量。为了避免这些问题, 在暴露前后至少有一天的过滤器在湿度控制的环境中干燥。

细胞反应将受到沉积剂量的影响, 如果细胞没有得到适当维护, 可能会受到接触持续时间的影响。a549 细胞是肺泡上皮癌细胞系, 以 0.5 lpm 的流速暴露在不同大小的铜纳米颗粒中10分钟。替代垂直流动暴露系统在持续曝光期间使用 0.005 lpm 和 1.5 lpm, 而这种方法在快速曝光期间使用中等流量。利用测量和施用的质量沉积效率, 将40纳米铜的 1.58±0.04 mgcm 2、100纳米铜颗粒的 0.58±0.00mgmcm 2 和800纳米铜颗粒的 0.32±0.01 mgcm 2 沉积到细胞上. 在接触后的头24小时内观察到细胞毒性和氧化应激。细胞毒性是通过暴露后4小时和24小时从受损细胞中立即释放乳酸脱氢酶 (ldh) 来测量的。在接触4小时内, 低于 1.62 mgcm 2 的铜纳米颗粒没有明显毒性,图 6b。暴露在铜纳米颗粒中的细胞存活能力在统计上显著下降, 低于20%。采用 dcfh-da 法研究了接触后前两小时内活性氧对 dcfh 的氧化, 并对细胞内氧化应激进行了研究,图 6a.在暴露后30分钟内, 对暴露于各种大小铜纳米颗粒的细胞进行了显著的氧化应激测量。在观察到的两个小时内测试的所有尺寸中, 氧化应激水平继续以类似的速度增加。

曝光的成功与否可以通过细胞反应的可重复性来确定。为细胞毒性检测提出的两个验收标准包括: 1) 阳性对照的总 ldh 泄漏率应大于 50%, 2) 正和样品复制的变异系数应在50% 以内。39如果不符合这些标准, 这表明实验之间存在差异, 例如沉积量改变或湿度差或温度控制差。此外, 观察细胞毒性测量可以导致对实验控制的理解, 并有助于确定误差。当流速过高时, 细胞可能会死于较高的剪切应力。通过降低流速, 可以降低流动对细胞的压力。

Figure 1
图1。干分散系统原理图及实验设置.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。pivec 设计.a) 全设计图与30厘米高框的比较。b) 与温度和湿度控制的 pivec 与30厘米高的盒子进行比较。c) 磨损 pivec。d) piveec 顶件。e) 细胞培养适配器, 适用于24口 (左) 和6井 (右)。f) 底部件。请点击这里查看此图的较大版本.

基于数量的沉积效率 (%) 基于质量的沉积效率 (%)
6井 40海里 17.83 ± 32.13 5.85 ± 0.85
100海里 0.47 ± 4.06 5.11 ± 0.94
800海里 3.70 ± 35.00 6.39 ± 1.01
24井 40海里 1.43 ± 2.43 12.61 ± 1.34
100海里 1.37 ± 19.45 2.95 ± 0.75
800海里 6.98 ± 3.93 15.95 ± 0.53

表1。pivec 沉积效率。

Figure 3
图3。铜纳米颗粒气溶胶的粒子数浓度.a) smps 测量。b) ops 测量。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。细胞刀片上的沉积与 skc 37 mm 过滤器的关系.误差±0.002 毫克。a) 40 纳米铜颗粒。b) 100 纳米铜颗粒。c) 800 纳米铜颗粒。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图5。文献中 pivec 与垂直流动暴露系统的沉积效率比较。垂直流曝光系统的文献值以实体标记绘制, pivec 值在空标记中绘制。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图6。对铜纳米粒子接触后的细胞反应 (pe).对于所有测量, n= 3 和 p<0.05。a) 用 dcfh-da 测定确定氧化应激。b) 使用 ldh 测定确定的细胞毒性。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

滤芯提供了一种简单、廉价的方法来收集呼吸区的气溶胶;然而, 从过滤器中提取的气溶胶样本并不代表整个气溶胶 (即气体、挥发物和微粒), 因此限制了对相关生物效应的评估。pivec 采用37毫米滤芯盒的初步设计, 旨在保持可移植性, 并模拟吸入颗粒的体内沉积。pivec 明显小于当前的 ali 曝光系统, 大约与包含温度和湿度控制的纸巾盒的大小相当。大小类似于个人级联撞击器, 同时提供有关细胞对气溶胶的反应的数据。虽然与其他现有曝光系统相比, piveec 包含一个样本的空间, 但小尺寸允许同时使用多个系统, 因此, 增加了样本的大小, 并允许监测空间分布。

协议中有几个关键步骤。为了确定沉积效率, 必须对过滤器进行适当的配置, 如步骤1中所述。此外, 在曝光前适当称量铜纳米颗粒和曝光后的滤芯也很重要, 以确定基于质量的沉积效率。数字沉积效率必须使用初始气溶胶浓度与使用粒子计数器确定的最终浓度之间的沉积差异来确定。如果沉积效率没有得到适当的确定, 就很难确定气溶胶类型之间的生物反应差异。对沉积的修改包括改变沉积。通过改变流速和暴露持续时间, 可以增加沉积。这也可能影响细胞的活力, 并有可能使细胞干燥。气溶胶的调节通常是为了补偿生理属性, 如体温和气道中的加湿。增加的湿度, 超过 50%, 模仿吸入空气, 减少细胞死亡, 由于车辆接触。43当温度和湿度不能很好地控制时, 细胞的反应可能会受到影响。通过降低流速, 各种大小的额外颗粒都会沉积, 从而增加沉积。暴露时间与沉积成正比, 允许更多的粒子在较长的实验时间内沉积。在增加接触时间时, 气雾剂的调节很重要, 这样细胞就不会干涸, 从而影响生物反应。

pivec 利用垂直流通过撞击、沉淀和扩散将颗粒沉积到细胞上, 这些细胞有可能通过流动使细胞干涸, 并增加细胞的压力。由于沉积力的作用, 沉积效率取决于颗粒的大小。目前许多垂直流动的曝光系统的沉积效率低于 10%, 接近1%。对于24井细胞培养物的浓度分析, pivec 具有3% 至16% 的重量分析确定的沉积效率。同一刀片的颗粒数字沉积效率约为1% 至7%。当使用6井细胞培养插入物时, 这些数字减少, 但最小的粒径除外, 由于气溶胶的精简, 因为更多的颗粒被限制在细胞培养中, 没有空间为流动开发。6井细胞培养插入物允许气溶胶流绕过沉积。其他垂直流动系统的质量基础上使用60纳米荧光素颗粒40, 80 纳米和180纳米铜颗粒16, 和60纳米己二酸颗粒41。由此产生的沉积效率一般在0.05% 至11% 之间。在许多基础上, 这些系统的特征是使用聚苯乙烯颗粒12,15, 碳纳米粒子12和二氧化硅颗粒42, 产生效率在0.2% 到11% 之间。与现有的蜂窝曝光装置相比, pivec 提供了类似或更多的沉积。

细胞接触是使用40纳米、100纳米和800纳米的铜纳米粒子进行的。使用 ldh 测定确定细胞活力, 接触后4小时内, 其活力没有明显下降。ldh 检测用于商业接触系统 74 ngcm 2 后2小时和 148 ngcm 2 后 4小时 9.2 nm 氧化铜颗粒44和 1μgcm 2 沉积后连续接触 4小时, 孵育 2 小时, 然后再次暴露4小时的25纳米氧化铜颗粒40, 这两个测量显著降低细胞的活力。在另一个系统中观察到了180纳米粒子铜纳米颗粒16多的细胞毒性, 并通过色氨酸蓝色染料排除。暴露15分钟至40-80 纳米氧化铜纳米颗粒会降低其生存能力, 测量出暴露后24小时。使用 pivec 观察到的毒性较低, 可能是由于接触时间较短, 接触时间缩短, 接触后测量时间较短。暴露后4个小时后, 在 pivec 中暴露的细胞的生存能力下降。暴露在潮湿空气控制下的细胞没有明显的细胞毒性, 与其他研究9404445、46一致.用 dcfh-da 法测定了氧化应激。活性氧的产生, 如过氧化氢或氧自由基, 会产生一定的压力, 导致生长抑制或细胞死亡。在细胞暴露后, 作为控制的留在孵化器中的细胞和暴露在潮湿空气中的细胞的氧化应激增加最小。所有颗粒大小的氧化应力都会升高, 暴露后30分钟内就会增加。在一项研究中, 9.2 nm 氧化铜颗粒44和25纳米氧化铜颗粒40也通过羧基-dcfh-da 法诱导氧化应激。9.2 nm 氧化铜颗粒暴露时间从2小时增加到 4小时, 氧化应激升高。经过4个小时的接触, 9.2 纳米氧化铜颗粒产生的氧化反应与25纳米氧化铜颗粒40的顺序接触相似, 这表明接触时间对氧化应激反应的影响更大比颗粒大小。与该研究相比, 暴露在 pivec 内的细胞产生了较高的氧化应力, 然而, 在替代系统中暴露的颗粒是氧化铜, 溶解速度低于在 pibec 体内暴露的铜。根据颗粒的组成和大小对铜的溶解进行的研究一致认为, 较大的颗粒和金属氧化物释放的离子比金属颗粒或纳米颗粒的含量慢16、47,48,49由于与孵化器控制相比, 潮湿的空气控制没有产生大量的氧化应激, 因此, 在 pisec 中, 铜颗粒诱导氧化应激的影响与类似的体外暴露是一致的系统。使用 pivec 观察到的生物反应表明, pibec 是一个适当的细胞暴露系统。

虽然 pivec 的表征和细胞研究与文献吻合较好, 但该装置有局限性。与其他曝光系统相比, 小设计减少了可在单个设备中同时暴露的样本数量。其他系统允许至少三次细胞暴露在相同的气溶胶912个可促进复制测量。虽然 piveec 每个系统只允许插入一个, 但小尺寸允许轻松使用多个系统, 有助于缓解此问题。虽然其他个人监测系统不使用细胞, 但 pivec 必须保持在垂直附近, 以减少保持细胞活力所需的细胞培养介质的溢出。虽然 pivec 尚未针对特定的粒子范围 (例如 pm10、pm 2.5、pm0.1) 进行优化,但对 pivec 的特性已达到了各种颗粒大小。与其他垂直流动系统类似, pivec 显示出在直径100纳米附近沉积颗粒的能力下降, 而40纳米和800纳米颗粒的沉积效率类似。

通过在 piveec 内同时收集气溶胶和 skc 37 毫米滤芯盒, 可以加快对细胞接触后的分析。由于重力沉积具有高度的相关性, 因此可以估计从使用37毫米过滤器收集的数据中收集到的细胞上的粒子质量。将刀片插入滤芯的比较减少了收集额外样品和额外测量以确定剂量的需要。正在进行的工作包括整合实时监测系统, 用于细胞毒性、氧化应激或其他生物端点。piveec 体积小, 可用于各种环境, 如作为个人显示器的机身、化工厂上方的无人机或环境中的空间分辨率。这种方法表明了利用 pivec 收集气溶胶颗粒到在 ali 生长的细胞培养物上的方法。通过将气溶胶调节为37±1°c 和 > 80% 的相对湿度, 可在急性暴露过程中保持细胞活力。这种方法适用于液滴和固体颗粒基气溶胶, 并已被证明在细胞培养插入物中沉积颗粒在40纳米和800纳米之间。pivec 的多功能性使这种方法能够在具有各种生物端点的多个设置中使用。

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Disclosures

作者的隶属关系如封面所示。作者得到弗吉尼亚联邦大学的财政支持, 该工作在弗吉尼亚州里士满完成。作者对本文的写作和内容负全部责任。提交人声明不存在相互竞争的利益。

Acknowledgments

作者要感谢鲍里斯·索洛莫诺夫和弗吉尼亚联邦创新机器商店对该设备的快速原型设计。作者还要感谢 lewinski 集团的克里斯蒂安·罗梅罗-富恩特斯、维塔利·阿夫鲁廷博士、德米特里·佩斯托夫博士和弗吉尼亚联邦纳米材料核心表征设施在粒子表征方面提供的帮助。这项工作得到了弗吉尼亚联邦大学工程学院向 leeinski 博士提供的创业资金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

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References

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61, (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3, (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013, (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51, (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26, (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10, (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97, (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20, (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11, (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8, (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9, (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103, (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36, (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19, (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41, (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47, (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27, (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26, (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29, (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206, (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9, (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5, (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5, (3), 389-399 (2009).

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