En nye Portable In Vitro eksponering kassett for Aerosol prøvetaking

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utføre bærbare mobilnettet aerosol eksponeringer og måle cellulær respons. Metoden bruker celler, dyrket i luft-flytende grensesnittet, etterligne i vivo fysiologi. Cellulær respons til kobber hydrogenion aerosoler ble observert som oksidativt stress gjennom reaktive oksygen arter generasjon og cytotoksisitet som laktat dehydrogenase utgivelse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denne protokollen introduserer et nytt i vitro eksponering system kan bæres, inkludert sin karakteristikk og ytelse. Air-flytende grensesnitt (ALI) in vitro eksponering-systemer er ofte store og klumpete, gjør transport til feltet og drift på kilden av utslipp eller sonen puste vanskelig. Gjennom miniatyrisering av disse systemene, kan laboratoriet bli brakt til feltet påskynde behandlingstid og gir en mer passende eksponering metode som ikke endrer aerosoler før du kontakter cellene. Bærbare In vitro eksponering kassett (PIVEC) tilpasser en 37 mm filter kassett å tillate i vitro toksisitet testing utenfor tradisjonelle laboratorium innstillingen. PIVEC var preget bruker tre størrelsene av kobber nanopartikler å avgjøre deponering effektivitet basert på gravimetric og partikkel nummer konsentrasjon analyse. Første cytotoksisitet eksperimenter ble utført med synlige lungekreft cellene for å fastslå muligheten for systemet å sette partikler samtidig opprettholde celle levedyktighet. PIVEC gir en lignende eller økt deponering effektivitet når sammenligne tilgjengelig vinkelrett flyt i vitro eksponering enheter. Til tross for lavere eksempel gjennomstrømningen gir den lille størrelsen noen fordeler gjeldende i vitro ALI eksponering systemer. Disse inkluderer muligheten til å brukes for personlig overvåking, mobilitet fra laboratoriet til kilden til utslipp, og muligheten til å sette opp flere systemer for romlig oppløsning samtidig opprettholde en lavere bruker koste. PIVEC er et system kan samle aerosoler i feltet med sonen puste på en luft-tilkobles, i vitro modellen.

Introduction

Personlig prøvetaking med i vitro teknikker kan gi omfattende informasjon om biologiske effekter av aerosoler på arbeidsplassen. 1 for forurensninger i luften inkluderer eksponeringer til kjemiske, til luft utvalgene, under neddykket forhold hvor gassen er introdusert til celle suspensjon, intermitterende eksponeringer med en enhet som en rocker, eller direkte eksponeringer i luft-flytende grensesnittet (ALI). 2 mange av disse teknikkene utføres med celler dyrket i suspensjon eller innsamling av prøver før eksponering, hvorav hver kan påvirke toksikologiske studien på grunn av mulige endringer i aerosoler. 3 for å unngå disse endringene, laboratoriet kan bli brakt til feltet bruker flere i vitro ALI kultur eksponering systemer som brukes i litteratur,4,5,6,7, 8,,9,,10,,11,,12,,13 men få er kommersielt tilgjengelig. 8 , 9 , 12 disse systemene er ofte store, spesielt når inkludert instrumenter å regulere temperatur og fuktighet av mobilnettet miljø og flyt av prøven aerosoler. Ved hjelp av PIVEC, kan aerosol eksponeringer utføres utenfor en tradisjonell lab innstilling eller i sonen puste mens mimicking innånding forhold.

Fastsettelse av aerosol avsettelse i vitro er viktig å undersøke helseeffekter på grunn av innånding. Sonen puste området innenfor 30 cm fra munn og nese,14 er avgjørende for å forstå eksponering nanopartikler og for å koble til biologiske effekter i lungene. 2 ofte avsetning på celler er definert som en avsetning effektivitet, partikler avsatt på og tatt opp av cellene delt partikler administrert til systemet6,15 eller på masse basis av samme beløpene. 4 , 16 gjeldende metoder for måling aerosoler i sonen puste er filter basert, fange partikler over en gitt samplingsperiode og bruke filtre til å gjennomføre ytterligere testing. 17 personlig overvåking krever et lite system som følger med bakdelen av færre prøver.

Det er mange metoder å avgjøre helseeffekter fra eksponering for aerosol. ALI modellen gir aerosoler gis direkte til cellene til luften som en ekte eksponering scenario, men det er mer kostnadseffektiv og mindre tid intensive enn i vivo studier samtidig mimicking luft-flytende barrierer som øynene, huden og lungene. Lungekreft cellene vokst på ALI har muligheten til å generere en polarisert barriere lag,18,19 som produserer fysiologiske trekk som ligner i vivo lunge epitel, inkludert mucus og surfactant produksjon i spesifikke bronkial eller alveolar cellelinjer, flimmerhårene slo,19 stramt veikryss,19,20 og celle polarisering. 18 endre som dette kan påvirke den cellulær responsen målt i toksisitet studier. 21 i tillegg ALI i vitro modell resultater er ofte mer følsom enn celler utsatt via hjuloppheng modeller22 og er i stand til modell akutt i vivo innånding toksisitet. 23 , 24 derfor, en ALI eksponering system som kan utføre målinger i sonen puste er en naturlig neste steg.

Ved å utsette cellene aerosol direkte på kilden til utslipp, oppstår undersøkelse av effekten av alle gasser, semi flyktige forbindelser og partikler i blandingen. Når blandingen samles på et filter, gasser og flyktige forbindelser er ikke tatt, og hele blandingen kan ikke undersøkes. I tillegg kan rekonstituering partikler i et pulver eller en flytende suspensjon føre til samling eller partikkel-fluid interaksjoner, for eksempel oppløsningen, i flytende suspensjon. 25 , 26 når aerosol partikler legges til væske, det er en høyere potensial for agglomeration,25,27 dannelsen av protein corona,28 eller interaksjon med forbindelser i væsken, noe som kan påvirke avsettelse og påvirke de biologiske responsen. 29 , 30

Eksponering på ALI er basert på tre viktigste aerosol profiler, Sky bosetting, parallelle flyt og vinkelrett flyt. Sky bosetting, brukes av luft-flytende grensesnitt celle eksponering (ALICE),4 er en batch-systemet der partikler innskudd gjennom gravitasjons og diffusional bosetting som aerosoler behandles som én enhet. Parallell flyt, brukes av elektrostatisk Aerosol i vitro eksponering systemet (TAKSKJEGGET)5 og flerkulturalitet eksponering kammer (MEC) II,6 kan til deponi gjennom tillegg av Brownsk bevegelse gjennom flyt profilen. Vinkelrett flyt, brukes av en microsprayer,7 Nano forstøverkammeret for In Vitro toksisitet (NACIVT),11 og kommersielle ALI systemer8,9,10,12, legger impaction av partikler i regionen deponering. Mange av disse eksponering systemer er stor og klumpete, krever overflødig systemer for aerosol pre condition, pumper for strømmen, eller selv oppvarming kamre for inkubering av celler. Denne størrelsen reduseres portabilitet av systemet. I stedet for prøvetaking direkte på kilden til utslipp har disse systemene ofte prøver brakt til lab eller modell aerosoler generert for analyse. Kompleksiteten av slippes ut aerosoler kan gå tapt i oversettelse fra feltet til laboratoriet. PIVEC er mindre enn gjeldende systemer, med en ekstern areal på ca 460 cm2 og veie bare 60 gram, termisk og fuktighet kontroll innlemmet i systemet muliggjør en svært bærbar enhet. Redusert størrelse og vekt tillater systemet å bli slitt eller tatt til kilden for eksponering, tillater direkte prøvetaking.

Den store størrelsen på gjeldende eksponering systemer reduserer også muligheten til å utføre prøvetaking for å undersøke romlige graderinger i konsentrasjoner. Denne løsningen er nøkkelen når toksikologiske effekten av mange potensielle miljømessige og yrkesmessig farer som vehicular eksos partikler saken eller arbeidsplass aktiviteter hvor aerosolization forekommer. Umiddelbart etter utslipp, blir det en romlig varians i partikkel konsentrasjon. Dette vokser med tid som partikler spre seg i hele atmosfæren og disse effektene kan endre basert på forholdene, som temperatur, trykk, vind og sol. Partikler kan begynne å alder og oksidere også når slippes ut31,32 og spredningen priser påvirkes av topografi; høyere konsentrasjoner vil bli funnet i daler og tunneler, der spredning effekten er redusert, og lave konsentrasjoner finnes der det er et stort område for spredning. 33 disse endringene i spredningen priser kan ha betydelig effekt på menneskers helse og kan ses når sammenlignende mange astmatisk voksne bor i urbane versus i landlige omgivelser. 34 mange eksponering systemer gir flere eksempler på en gang, flere systemer er nødvendig med en overflod av store utstyr å utføre romlig oppløsning.

Ved å bringe laboratoriet til feltet, kan tidspunktet for analysen reduseres ved å bruke hele cellen som en sensor. Følgende kjente biologiske mekanismer og endepunkt kan hjelpe i fastsettelse av aerosol sammensetning og størrelse. På grunn av treg klaring metoder, inkludert mucociliary klaring og fagocytose translokasjon, er disse partiklene ofte samspill med celler i ca dager til uker3 generere oksidativt stress, betennelser og selv celledød. Disse biologiske endepunkt kan være utgangspunkt for negative resultatet trasé for hjerte-og karsykdommer eller kroniske hindrende lunge sykdom. I tillegg utført Wiemenn et al. en rekke i vitro analyser sammenligne med litteratur verdier for kort sikt i vivo innånding toksisitet. 35 I vivo svar ble spådd med to av fire positive resultater fra testing cytotoksisitet via laktat dehydrogenase utgivelse, oksidativt stress fra glutation reduksjon og hydrogenperoksid dannelse og utgivelsen og betennelser potensielle fra tumor nekrose faktor alpha genet. Ut av ti nanosized-metalloksider testet, seks testet som aktiv (Titan oksid, sink oksid og fire ulike cerium-oksid) bruke eksponeringer i vitro med bekreftelse i vivo

For å studere virkningene av aerosoler i yrkesmessig omgivelser, utviklet vår lab PIVEC for eksponeringer i-feltet. I tillegg til PIVEC kan brukes for personlig prøvetaking overvåke og undersøke innånding som de 37 mm filter kassett36 eller flere systemer kan brukes til å oppnå romlig oppløsning innen et gitt område. I denne protokollen drøftes karakterisering og bruk av PIVEC. Etter eksponering, er biologiske effekter observert gjennom cytotoksisitet analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Operatorer må ha personlig verneutstyr (f.eks Laboratoriefrakk, hansker, beskyttelsesbriller) når utføre trinn 1, 2, 3, 5 og 6.

1. forberedelse av materialer

  1. Utarbeide materiale for systemet montering og eksponering for å sikre repeterbarhet.
    1. Sørg for å bruke nye eller 70% etanol renset ¼" indre diameter ledende rør og ¼" ytre diameter kontakter for samlingen systemet.
    2. Store testen materiale inkludert filtre, PIVEC komponenter, pinsett og partikkel pulver i et godt kontrollert miljø, med hensyn til temperatur og fuktighet, for minst 24 timer før eksperimentet.
      Merk: Temperaturen bør være nær romtemperatur, ca 20 ° C, med relativ luftfuktighet mindre enn 35%. Dette er veldig viktig å oppnå repeterbarhet mellom eksperimenter.
    3. Forberede partikkel tellere bruke isopropanol å rengjøre deler og tillate systemet oppvarmingen i henhold til produsenten anbefalingene, inkludert skanning mobilitet partikkel sizer (SMP) og optiske partikkel sizer (OPS) for måling.

2. generasjon av tørr Aerosol

Merk: Operatører bør utføre aerosol generasjon i avtrekksvifte.

  1. Sette sammen et system for å generere tørr aerosoler
    Merk: Suspensjon av partikler i gass eller væske bør være passende for modellerte program og celle kultur. Følgende metode kan utføres med et vannbasert aerosol. Utformingen av tørr aerosol system er fra Tiwari et al. 37 en skjematisk av tørr spredning er vist i figur 1.
    1. Koble kuleventil i hver ende av 4" 1/8 størrelse gjenger røret, dette vil fungere som partikkel beholderen. Koble 2" 1/8 størrelse rør til en ventil.
    2. Veie kobber nanopartikler, i denne studien masse konsentrasjonen for hver partikkelstørrelse ble holdt konstant under fastsettelse deponering effektiviteten. Ca bruke 7.5 mg på 40 nm kobber nanopartikler, 7 mg 100 nm kobber nanopartikler og 13 mg 800 nm kobber nanopartikler per eksponering. Plass kobber nanopartikler inn partikkel hopper gjennom den åpne enden.
      Merk: Mengden av kobber nanopartikler veide vil tjene som massen basert administrert konsentrasjon.
    3. Plasser en 3" stykke ½" ytre diameter (OD) rør rundt 2" røret og sted en HEPA filter inne denne korte rør slik at flytretningen gjennom kuleventil.
    4. Koble vakuum generatoren til andre kuleventil bruker threading. Koble vakuumgenerator til luft tank ved å plassere en 5/16" OD rør i push for å låse tilkoblingen. Bruk ¼" OD slange koble utløpet av vakuum generatoren til den eksperimentelle set-up ved å plassere slangen over utløpet av vakuum generatoren.
  2. Bruk av tørr aerosol system til å generere tørr aerosol
    1. Åpne luft tanken ved å slå hovedkranen og tillate luftstrømmen systemet. Åpne ventilen på flyt regulator på luften tanken og slik at flyten gjennom systemet er tilsvarende til de ønskede innstillingene på vakuumpumpe.
    2. Åpne kuleventilen nærmest HEPA-filter og åpne kuleventilen nærmest vakuumgenerator. Holde dette åpne for ca 3 s tillate partikler å bli trukket inn i luften strømmen.
    3. Lukk kuleventil nærmest vakuum generator deretter lukker kuleventil nærmest hepafilter. Tillate luft fra tanken flyt for varigheten av forsøket etter behov.
    4. Lukk main og regulator ventiler på luften tank å stoppe strømmen. Ren ball ventiler og vakuumgenerator med 70% etanol. Autoclave metallrør for sterilisering.

3. deponering effektivitet måling ved hjelp av PIVEC

Merk: Operatører bør utføre aerosol eksponeringer i avtrekksvifte.

  1. Måle avsetning ved å samle kobber hydrogenion aerosoler generert i trinn 2.2 på et pre vektet filter. Bruk avsatt dose, målt ved hjelp av innsamlede massen på filteret og administrert dose, målt ved hjelp av mengden vektet kobber partikler, for å avgjøre deponering effektiviteten.
    1. Holde 1.00 µm pore glass fiber filtre under lav luftfuktighet, beskrevet i 1.1.2, for minst 24 timer før pre-eksponering målinger. Veie et ubrukt filter tre ganger og registrere filteret vekter. Sted ubrukte filteret i en cellekultur sett.
    2. Velg aktuelle cellen kultur sette adapter (6 vel eller 24 vel) for PIVEC å støtte celle kultur innsatsen med filteret. Sted i cellekultur sette inn kortet på basen PIVEC, sette på plass slik at bunnen av kortet stykket er bredere enn toppen.
    3. Bruke pinsett plassere filter lastet cellekultur sette inn kortet stykke. Plass overstykket over kort stykke, bosatte seg på plass slik at bunnen av overstykket er bredere enn toppen. Pakk PIVEC med ett lag med duct tape.
    4. Koble 37 mm kassett stykker på toppen og bunnen av PIVEC ved å trykke på plass. Plass ¼" barbed kort i kassett innløp og utløp.
    5. Pakk resistiv varmeren rundt PIVEC slik at ledningene er ved basen. Tapen å sikre.
    6. Pakk PIVEC med ~ 8 runder med aluminiumsfolie for isolasjon. Sikker med tape.
    7. Koble 2" lang stykke 1/2" ytre diameter fleksibel slange til kortet på PIVEC. Fjern porøse rør fra sterilt vann og sted i rør på PIVEC.
    8. Plass PIVEC i klemme på ringen stå og sikre. Komplett oppsett med vakuumpumpe, partikkel tellere og aerosol oppsett.
      Merk: Tallbasert avsatt dosen kan fastslås bare hvis partikkel tellerne er plassert før PIVEC og etter PIVEC på separate løp.
    9. Utsett filtre bruker trinn 2.2 protokollen og ønsket eksponering tid og flyt priser, i denne studien en eksponeringstid på 10 min på 0,5 LPM ble brukt. Fjern PIVEC fra opplegget. Ta ut celle kultur innsatsen og plassere eksponert filteret i filterholderen under lav luftfuktighet for minst 24 timer før mål.
    10. Rengjør PIVEC med 70% etanol. Sterilisere med ultrafiolett lys i minst 30 min før neste eksperimentet.
    11. Veie eksponert filteret tre ganger og registrere filteret vekter. Plass eksponert filteret i en merket filterholderen for lagring.

4. beregning av avsatt Dose og deponering effektivitet

Merk: Kunnskap om avsetning er viktig for aerosol administrasjon og tolkning av cellulær respons.

  1. Beregne nedfall fra masse-baserte målinger
    1. Beregne avsatt massen på filtre som forskjellen mellom pre-eksponering gjennomsnittlig vekt og post-eksponering gjennomsnittlig vekt. Denne verdien er masse-baserte avsatt dosen for eksperimentet.
    2. Bruk administrert masse, madmin, og masse-baserte avsatt dose bestemt i 4.1.1, mdep, beregne masse-baserte deponering effektiviteten, ηm, for eksperimentet.
      Equation
    3. Gjennomsnitt verdier fra 4.1.1 og 4.1.2 for minst 3 eksperimenter å bestemme avsettelse og avsettelse effektivitet for PIVEC for partikkelstørrelse.
  2. Beregne nedfall fra tallbasert målinger
    1. Kontrollere at målinger med partikkel tellere er utført med tellere etter PIVEC og å bestemme partikkel konsentrasjonen før PIVEC. Integrere partikkel konsentrasjonen over tid for partikkel disken og deretter integrere over partikkel diameter å bestemme totalen partikler målt.
    2. Beregne hvor avsatt partikkel som forskjellen mellom partikler administrert og partikler målt innlegg-PIVEC. Denne verdien er tallbasert avsatt dosen for eksperimentet.
    3. Bruk administrert partikler, nadmin, tallbasert avsatt dose, ndep, volumetriske flyten hastighet, V og tid, t, å beregne tallbasert deponering effektivitet, ηnfor eksperimentet.
      Equation
    4. Gjennomsnitt verdier fra 4.2.2 og 4.2.3 for minst 3 eksperimenter å bestemme avsettelse og avsettelse effektivitet for PIVEC for partikkelstørrelse.

5. aerosol eksponering av celler

Merk: For cellen kultur på luft-flytende grensesnittet leseren kalles tom et al. 38 operatører bør utføre celle kultur sett inn lasting (trinn 5.1.2-5.1.4) i en biosafety kabinett. Operatører skal utføre aerosol eksponeringer i avtrekksvifte.

  1. Kultur cellene på Air-flytende grensesnitt
    1. Løfte A549 celler fra kultur kolbe ved å legge til trypsin-EDTA, 3 mL for en MT75 kolbe eller 1 mL for en T25 kolbe og Inkuber i 5 min på 37 ° C. Legge til 7 mL av komplett medier for en MT75 kolbe eller 4 mL komplett for T25 kolbe til kolbe og skyll kolbe vegg med cellen suspensjon å maksimere det gjenopprettede celle nummeret. Overføre celle suspensjon et sterilt 15 mL konisk rør så sentrifuge celler 800 x g i 3 minutter.
    2. Fjern supernatant som inneholder trypsin-EDTA og resuspend celle pellet i 10 mL av komplett. Fjerne 10 µL av cellen suspensjon og legge til hemocytometer. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer til å bestemme konsentrasjonen og antall celler.
    3. Plass 0,5 mL komplett hver brønn innen en 24 godt plate. Sett ubrukt celle kultur setter i brønner. Frø cellekultur setter inn på apikale side på en celle tetthet nær 1 x 105 celler/cm2 for celletyper som vokser med en rate i doble per dag. Frøet A549 celler innenfor en 24 godt sett, frø cellene på en tetthet på 1 x 105 celler/cm2 ved å legge til 35 000 celler i cellekultur sett.
      Merk: Celler med lavere vekst kan bli sådd i en økt celle tetthet.
    4. Legge til komplett apikale siden av cellen kultur sette å nå det siste bindet (for 24 godt plate siste bindet er 0,25 mL).
    5. Kultur i 7 dager på neddykket forhold, erstatte media hver 1-2 dager. Etter 7 dager, kan du fjerne apikale media og kultur for minst 1 dag i ALI forhold, erstatter bare basolateral media.
  2. Montere PIVEC
    1. Tillate at celler equilibrate i luften-væske-grensesnittet for minst 24 timer før eksponering.
    2. Velg aktuelle cellen kultur sette adapter for PIVEC å støtte celle kultur innsatsen med filteret. Sted cellekultur sett kort stykke på PIVEC base, sette på plass slik at bunnen av kortet stykket er bredere enn toppen. Legge til 4 mL celle kultur medier av bunnen av PIVEC.
    3. Bruke pinsett plassere i cellekultur sette inn kortet stykke plassert i trinn 5.2.3. Plasser overstykket over kort stykke, bosatte seg på plass slik at bunnen av overstykket er bredere enn toppen. Nøye, bryte PIVEC med ett lag med duct tape.
    4. Koble 37 mm kassett stykker på toppen og bunnen av PIVEC, ved å trykke på plass. Plass ¼" barbed kort i kassett innløp og utløp.
    5. Pakk resistiv varmeapparatet rundt PIVEC slik at ledningene er ved basen. Tapen å sikre.
    6. Pakk PIVEC med ~ 8 runder med aluminiumsfolie for isolasjon. Sikker med tape.
    7. Koble kort stykke 1/2" ytre diameter fleksibel slange til kortet på PIVEC. Fjern porøse rør fra sterilt vann og sted i rør på PIVEC.
    8. Plass PIVEC i klemme på ringen stå og sikre. Komplett oppsett med vakuum pumpe og aerosol oppsett.
  3. Utsette celler på ALI bruker PIVEC
    1. Bruke deponering effektivitet i trinn 2 for å beregne massen av partikler for å være aerosolized. Veie riktig masse og legge til aerosol systemet satt opp følgende trinn 2 i avtrekksvifte.
    2. Utsett celler ved å følge trinn 2.2, i denne studien av biologiske endepunkter cellene ble utsatt for ca 3,5 mg av kobber nanopartikler med en strømningshastighet på 0,5 LPM og en eksponering varigheten av 10 min. kontroll studier utført brukt fuktet luft å fastslå påvirkning av luften alene. Fjern PIVEC fra opplegget. Ta ut celle kultur innsatsen, plasser i sterilt godt platen og gå tilbake til CO2 inkubator (37 ° C, 5% CO2, 90% RH).
    3. Sug opp medier fra PIVEC. Hvis utfører flere eksperimenter, bufret skyll nederst PIVEC med fosfat løsning og deretter gjenta trinn 5.1 og 5.2.
    4. Rengjør PIVEC med 70% etanol når ferdig. Sterilisere med ultrafiolett lys i minst 30 min før neste eksperimentet.
  4. Biologiske analysen prosedyrer
    Merk: Analyser utført i denne studien var oksidativt stress generasjon gjennom DCFH-DA analysen og cytotoksisitet gjennom laktat dehydrogenase (LDH).
    1. Oppløse 24,4 mg DCFH-DA i 50 mL metanol å 1 mM DCFH-DA løsning. Denne løsningen kan lagres på 20 ° C for inntil 4 måneder. Fortynne 1 mM DCFH-DA løsning ved å blande 0,1 mL 1 mM DCFH-DA løsning med 9,9 mL HBSS å gjøre 10 mL 10 µM DCFH-DA.
    2. Fjerne celle kultur medier og vask celle kultur insert med ca 1 mL av PBS. Legge til 0,5 mL 10 µM DCFH-DA løsning i hver brønn, erstatte setter inn når du er ferdig. Dekkramme med aluminiumsfolie å hindre photoactivation av fargestoffet og 37° C inkubator 1t.
    3. Fjerne celler fra inkubator og Sug opp DCFH-DA fungerende løsning fra brønnene. Legg til 0,5 mL HBSS brønner og erstatte celle kultur setter.
    4. Laste inn godt platen i plate leseren og måle planlagte fluorescens bruker eksitasjon/utslipp bølgelengder av 485/530 nm. Fjern plate fra platen leseren og laste sett inn i PIVEC for eksponering.
    5. Utsette celler for ønsket eksponering varigheten. Fjern sette inn fra PIVEC og gå tilbake til godt plate. Fjern 50 µL basolateral væske fra godt plate og sted i hvit 96 godt plate. Måle fluorescens av DCF bruker eksitasjon/utslipp bølgelengder av 485/530 nm enhver 30 min etter eksponering for 2T.
    6. La basolateral væske equilibrate til romtemperatur for 20-30 min. legge 50 µL av LDH analysen løsning, blandet følgende produsenten protokoll, til basolateral væsken fra godt plate og la reagere for 10 min. legge 25 µL av stopp løsning til godt. Lese fluorescens resorufin produktet bruker eksitasjon/utslipp bølgelengder 560/590 nm.
    7. Fjerne ekstra basolateral væske og gjentar trinn 5.4.6 på 4 h og 24 timer etter eksponering.

6 statistiske metoder

  1. Analyse av biologiske analysen Data
    1. Rapporten ROS produksjon som fluorescens intensitet øker behandlet celler i forhold til opprinnelige mål. Rapporten LDH aktivitet som fluorescens intensitet øker behandlet celler i forhold til ubehandlet celler.
    2. Utfør enkelt faktor ANOVA til å finne statistiske forskjellen mellom datasett. Eventuelt utføre student t-tester til en verdi av betydningen av 0,05. Rapportdata som gjennomsnittlig ± standardavviket for minst tre Eksponeringsmålinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yrkesmessig i vitro toksikologi innebærer opprettholde mobilnettet levedyktighet mens du utfører aerosol eksponering. PIVEC systemet er vist i figur 2, inkludert temperatur og fuktighetskontroll og slitte PIVEC. Temperaturen var vedlikeholdt ved hjelp av en batteridrevet resistiv ovn og aerosoler fuktet med økt naturlig luftfukting gjennom en porøs, fuktet rør. I en kontrollert aerosol sette i et laboratorium, kan PIVEC settes opp for eksponering som vist i figur 1. Karakteristikk av systemet tillater fastsetting av avsatt dose på cellene som deretter kan samsvares med cellulær respons.

Deponering effektiviteten er avhengig av størrelsen på partikler i systemet siden deponering styrker inkluderer impaction, sedimentering og spredning. I tillegg er avsetning avhengig av flyt, eksponeringstid og egenskapene til eksponering systemet. Med denne informasjonen, kan avsetning forutsies. Deponering effektiviteten av PIVEC er fastslått gjennom to metoder, gravimetric analyse og partikkel nummer opptellingen. Ligninger 1 og 2 ble brukt til å bestemme deponering effektiviteten i tabell 1 bruker filteret basert, skanning mobilitet partikkel sizer (SMP) og optiske partikkel sizer (OPS) målinger, Figur 3. Økt deponering er observert samlet for 24 godt design enn 6 godt design og litt reduseres for 100 nm i forhold til 40 nm og 800 nm kobber partikler. Avsetning i 24 brønnene er svært jevn over innsatsen, men avsettelse i 6 godt utformingen mangler ensartethet som de fleste av partikler innskudd nær sentrum av innsatsen. Etter eksponering analyse kan være raskere ved å bestemme dose forholdet mellom 37 mm filteret og celle kultur innsatsen, reduserer nødvendigheten av å finne dosen etter mobilnettet eksponering. Sammenligning av avsetning 37 mm filteret kassetten og PIVEC viser en sterk korrelasjon for alle størrelser og brønner med en Pearson korrelasjon av over 0,7, men bare for 800 nm er sammenhengen betydelig med en p < 0,05, se Figur 4. Sammenlignet med lignende systemer gjennom litteratur, er11,12 deponering effektiviteten av PIVEC over rekke partikkelstørrelser testet tilsvarende eller økt over rapporteres verdier, observert i figur 5. Deponering effektiviteten i PIVEC kan forbedres gjennom minimere tapene til systemet benytter elektrostatisk dissipative eller ledende plast eller lignende materiale til design av PIVEC.

Hvis filtre ikke er godt tørket i luftfuktighet-kontrollerte omgivelser før eksponering, overskytende vann øker første massen og kan produsere ikke-fysisk, negative avsatt doser. Variabel flyt priser kan også fremme inkonsekvent avsatt doser i systemet. For å unngå disse problemene, kan du minst én dag før og etter eksponering for filtre tørke i luftfuktighet-kontrollerte omgivelser.

Mobilnettet svar påvirkes av avsatt dose og kan påvirkes av eksponering varigheten hvis cellene ikke er riktig vedlikeholdt. A549 celler, en alveolar epithelial karsinom cellen linje, ble utsatt i 10 min varierende størrelser av kobber nanopartikler på en strømningshastighet på 0,5 LPM. Alternative vinkelrett flyt eksponering systemer brukes mellom 0.005 LPM og 1,5 LPM på en vedvarende eksponering mens denne metoden bruker en moderat flow rate under en rask eksponering. Bruke masse-baserte deponering effektiviteten måles og administrert dose, 1.58 ± 0.04 mg/cm2 av 40 nm kobber, 0,30 ± 0,00 mg/cm2 av 100 nm kobber partikler, og 0.32 ± 0,01 mg/cm2 800 nm kobber partikler avsatt til cellene. Cytotoksisitet og oksidativt stress ble observert i første tjuefire timer etter eksponering. Cytotoksisitet ble målt med utgivelsen av laktat dehydrogenase (LDH) fra skadede celler umiddelbart og 4 timer 24 timer etter eksponering. Det var ingen betydelig toxicity fra kobber nanopartikler under 1,62 mg/cm2 innen 4 timer eksponering, figur 6b. Tjuefire timer etter eksponering det var en statistisk signifikant nedgang i cellen levedyktigheten til mindre enn 20% levedyktighet for cellene utsatt for kobber nanopartikler. Intracellulær oksidativt stress ble undersøkt ved hjelp av DCFH-DA analysen gjennom oksidasjon av DCFH av reaktive oksygen arter innen de første to timer etter eksponeringen, figur 6a. Betydelige nivåer av oksidativt stress ble målt på tretti minutter etter eksponering for cellene utsatt for kobber nanopartikler i alle størrelser. Nivået av oksidativt stress fortsatte å øke lignende priser for alle størrelser testet innen to timer observert.

Suksessen til eksponeringene kan bestemmes gjennom repeatability av cellulær respons. To akseptkriterier foreslått for cytotoksisitet analyser inkluderer: 1) % totalt LDH lekkasje for positiv kontrollen må være større enn 50%, og 2) den positive og eksempel Repliker koeffisienten varianter bør være innen 50%. 39 hvis disse kriteriene ikke er oppfylt, denne foreslå forskjellene mellom eksperimenter, som endret deponering beløp eller dårlig fuktighet eller temperatur kontroll. I tillegg kan observere cytotoksisitet målinger føre til forståelse av eksperimentelle kontrollene og hjelpe bestemme feilen. Når infusjonshastigheten er for høy, kan cellene dø fra store mengder skjæring stress. Ved å redusere infusjonshastigheten, kan vekten på cellene fra strømmen bli redusert.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk av tørr spredning System og eksperimentelle Set-up. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. PIVEC Design. A) full Design avbildet med 30 cm høye boksen for sammenligning. B) PIVEC med temperatur og fuktighetskontroll avbildet med 30 cm høye boksen for sammenligning. C) slitte PIVEC. D) PIVEC overstykket. E) celle kultur Adapter for 24 godt (venstre) og 6 vel (høyre). F) underdel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Antall basert deponering effektivitet (%) Masse basert deponering effektivitet (%)
6 vel 40 nm 17.83 ± 32.13 5.85 ± 0,85
100 nm 0.47 ± 4,06 5.11 ± 0,94
800 nm 3.70 ± 35,00 6,39 ± 1.01
24 godt 40 nm 1.43 ± 2.43 12.61 ± 1,34
100 nm 1.37 ± 19.45 2,95 ± 0,75
800 nm 6.98 ± 3.93 15.95 ± 0.53

Tabell 1. PIVEC avsettelse effektivitet.

Figure 3
Figur 3. Partikkel nummer konsentrasjon av kobber hydrogenion aerosoler. A) SMP mål. B) OPS mål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Forholdet mellom avsettelse på cellen setter og SKC 37 mm filter. Feil ± 0.002 mg. A) 40 nm kobber partikler. B) 100 nm kobber partikler. C) 800 nm kobber partikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Deponering effektiviteten av PIVEC sammenlignet med vinkelrett flyt eksponering systemer i litteratur. Litteratur verdier fra vinkelrett Flow eksponering systemer tegnes i Solid markører og PIVEC verdier i Tom markører. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Cellulær respons til kobber nanopartikler etter eksponering (PE). For alle målinger, n = 3 og p < 0,05. A) oksidativt Stress bestemmes ved hjelp av DCFH-DA analysen. B) cytotoksisitet bestemmes ved hjelp av LDH analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Filteret kassetter gir en enkel og rimelig metode for å samle aerosoler i sonen puste; imidlertid aerosol eksempler Hentet fra filtre ikke representerer hele aerosoler (i.e. gasser, flyktige og svevestøv) og dermed begrense vurdering av relaterte biologiske effekter. Bruker den opprinnelige utformingen av 37 mm filteret kassetten, er PIVEC utformet for å opprettholde flyttbarhet og etterligne i vivo avsetning av partikler fra innånding. PIVEC er betydelig mindre enn gjeldende ALI eksponering systemer, omtrent på størrelse med en vev boks med temperatur og luftfuktighet kontrollen. Størrelsen er lik for personlig gjennomgripende impactors samtidig som dataene på cellulær respons til aerosoler i tillegg. Mens PIVEC inneholder plass for ett utvalg i forhold til andre gjeldende eksponering systemer, tillater den lille størrelsen flere systemer som skal brukes samtidig, derfor øke utvalgsstørrelsen og tillate romlige fordelingen som skal overvåkes.

Det er flere viktige skritt i protokollen. For å bestemme deponering effektivitet, er det avgjørende å riktig tilstand filtrene, som beskrevet i trinn 1. I tillegg er det viktig å riktig veie den kobber nanopartikler før eksponering og filteret innlegget eksponering finne masse-baserte deponering effektiviteten. Antall deponering effektiviteten må bestemmes ved hjelp av forskjellen i avsetning mellom første aerosol konsentrasjonen og endelige konsentrasjon bestemmes ved hjelp av tellerne partikkel. Hvis avsetning effektiviteten ikke avgjøres riktig, er det vanskelig å finne biologisk respons forskjellene mellom aerosol. Modifikasjoner til avleiring inkluderer endre avsetning. Deponering kan økes ved å endre flow rate og eksponering varigheten. Dette kan også påvirke celle levedyktighet har potensial til å tørke ut cellene. Condition av aerosoler utføres ofte for å kompensere for fysiologiske attributter som kroppstemperatur og luftfukting i luftveiene. Økt fuktighet, over 50%, etterligner inhalert luft og reduserer celledød på grunn av kjøretøy eksponering. 43 når temperatur og luftfuktighet ikke er godt kontrollert, cellulær respons kan bli påvirket. Ved å redusere infusjonshastigheten, vil ekstra partikler av alle størrelser innskudd, øke avsetning. Eksponering varigheten er proporsjonal med deponering, slik at flere partikler innskudd over eksperimentell lengre. Condition av aerosoler er viktig når økende eksponering varigheten slik at cellene ikke tørr ut som kan påvirke biologiske respons.

PIVEC bruker vinkelrett flyt innskudd partikler via impaction, sedimentering og spredning på cellene som har potensial til å tørke ut celler gjennom flyten og lagt stress på cellene. Deponering effektiviteten er avhengig av størrelsen på partikkel på grunn av styrkene til deponi. Mange av dagens eksponering med vinkelrett flyt har en avsetning effektiviteten i under 10% og mye nærmere 1%. PIVEC har en avsetning effektivitet bestemmes av gravimetric analyse av 3 til 16% for en 24 godt celle kultur sett inn. Partikkel tallbasert deponering effektiviteten er ca 1% til 7% for samme innsatsen. Når du bruker en 6 vel cellekultur setter inn, disse tallene redusere, med unntak av den minste partikkelstørrelse, på grunn av strømlinjeforme aerosoler som mer partikler er begrenset i celle kultur sette inn uten plass for strømmen å utvikle. 6 vel celle kultur skivene tillater aerosol strømmer å omkjøringsvei deponering. Andre vinkelrett flyt systemer har vært preget med masse mellomrom med 60 nm fluorescein partikler40, 80 nm og 180 nm kobber partikler16og 60 nm adipic syre partikler41. Resulterende deponering effektiviteten er vanligvis mellom 0,05% og 11%. På nummer basis, har disse systemene vært preget med polystyren partikler12,15, karbon nanopartikler12og silika partikler42, gir effektivitet mellom 0,2% og 11%. PIVEC gir, lignende eller økt, deponering i forhold til tilgjengelig mobilnettet eksponering enheter.

Cellen eksponeringer som ble utført med kobber nanopartikler 40 nm, 100 nm og 800 nm. Cellen levedyktighet ble definert med LDH analysen med ingen signifikant nedgang i levedyktighet innen fire timer etter eksponering. LDH analysen ble brukt med en kommersiell eksponering for 74 ng/cm2 etter 2 timer og 148 ng/cm2 etter 4 timer med 9.2 nm kobber oksid partikler44 og 1 µg/cm2 avsatt etter en sekvensiell eksponering 4 timer, inkubasjonstiden for 2 timer, så en annen eksponering for 4 timer med 25 nm kobber oksid partikler40, begge måling signifikant nedgang i cellen levedyktighet. Cytotoksisitet ble observert i et annet system for 1.6-7.6 µg/cm2 180 nm partikler kobber nanopartikler16 målt ved trypan blå fargestoff eksklusjon. Eksponeringer av 15 minutter til 40-80 nm kobber oksid nanopartikler redusert levedyktighet, målt 24 timer innlegget eksponering. Lavere toksisitet observert med PIVEC var sannsynlig kortere eksponeringstid på 10 minutter og kortere innlegg eksponeringstider måling. Etter fire timer etter eksponering redusert levedyktigheten til celler i PIVEC. Celler utsatt for fuktig luft kontroller observert ingen betydelig cytotoksisitet, med andre studier 9,40,44,45,46. Oksidativt stress var fast bestemt på å bruke DCFH-DA analysen. Produksjon av reaktive oksygen arter, som hydrogenperoksid eller oksygen radikaler, generert en mengde stress som kan føre til vekst arrestasjon eller celle død. Etter de celle eksponeringene var det en minimal økning i oksidativt stress for celler i inkubator som kontroll og celler som er utsatt for fuktig luft. Forhøyet oksidativt stress inntraff for alle partikkelstørrelser, øke innen 30 minutter etter eksponering. I en studie, 9.2 nm kobber oksid partikler44 og 25 nm kobber oksid partikler indusert40 også oksidativt stress målt via carboxy-DCFH-DA analysen. Økt eksponeringstid fra 2 timer til timer forhøyet oksidativt stress for 9.2 nm kobber oksid partikler44. Etter fire timer med eksponering, 9.2 nm kobber oksid partikler produsert en lignende oksidativt respons som sekvensiell eksponering for 25 nm kobber oksid partikler40, antyder at eksponering varigheten har en større innflytelse på oksidativt stressrespons enn partikkelstørrelse. Celler utsatt innenfor PIVEC produsert forhøyet oksidativt stress sammenlignet med denne studien, men partikler i alternative systemet er kobber oksid og løses mindre raskere enn kobber utsatt innenfor PIVEC. Studier utført av kobber basert på sammensetningen og størrelsen på partikler godtar at større partikler og metalloksider slipper ioner tregere enn metall partikler eller deres hydrogenion kolleger16,47 , 48 , 49 som fuktig luft kontrollene ikke produserer betydelige mengder oksidativt stress sammenlignet med kontrollen inkubator, påvirkning av kobber partikler å indusere oksidativt stress er konsekvent i PIVEC til lignende i vitro eksponering systemer. Biologiske svar observert med PIVEC foreslår at PIVEC er et passende system for mobilnettet eksponering.

Mens karakterisering og mobilnettet studier av PIVEC enig med litteratur, har9,16,40,44,46 enheten begrensninger. Liten design reduserer antallet eksempler som kan eksponeres samtidig i én enhet i forhold til andre eksponering-systemer. Andre systemer tillater minst tre mobilnettet eksponeringer til de samme aerosol9,12 tilrettelegge Repliker målinger. Selv om PIVEC tillater bare en setter inn per system, tillater den lille størrelsen flere systemer enkelt brukes, bidrar til å redusere problemet. Mens andre personlige overvåkingssystemer ikke bruker cellene, holdes PIVEC nær loddrett for å redusere søl celle kultur media nødvendig å bevare mobilnettet levedyktighet. Selv om PIVEC ikke har ennå blitt optimalisert for spesifikk områder (f.eks PM10PM2.5, PM0.1), har PIVEC vært preget for en rekke partikkelstørrelser. Ligner andre vinkelrett flyt systemer, PIVEC viser en redusert evne til å sette inn partikler nær 100 nm i diameter, mens 40 nm og 800 nm partikler med lignende effektivitet.

Analyse av cellene etter eksponering kan være raskere ved å utføre en parallell samling av aerosoler innen PIVEC og en SKC 37 mm filter kassett. En høy korrelasjon gravimetric baserte program lar for estimering partikkel massen samlet på cellene fra data samlet inn ved hjelp av 37 mm filtre. Sammenligning av innsatsen til filteret kassetten reduserer behovet for å samle flere prøver og flere mål å finne dosen. I arbeid inkluderer integrasjon av et sanntids overvåking system for cytotoksisitet, oksidativt stress eller andre biologiske endepunktene. Den lille størrelsen på PIVEC gjør at den kan brukes i en rekke innstillinger som på kroppen som en personlig skjerm, en drone over en kjemisk plante, eller ute i et miljø for romlig oppløsning. Denne metoden har vist bruk av PIVEC for samlingen av aerosol partikler på cellekulturer vokst på ALI. Ved condition aerosoler 37 ± 1 ° C og > 80% relativ luftfuktighet, kan mobilnettet levedyktighet vedlikeholdes under akutt eksponeringer. Denne metoden passer for både flytende slippverktøy og solid partikkel-baserte aerosoler og har vist seg å sette partikler mellom 40 nm og 800 nm i celle kultur setter. Allsidighet av PIVEC kan denne metoden brukes i flere innstillinger med en rekke biologiske endepunktene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tilknytning av forfatterne er som vist på forsiden. Forfatterne er økonomisk støttet av Virginia Commonwealth University, der arbeidet ble fullført i Richmond, VA Forfatterne har eneansvaret for skriving og innholdet i dette dokumentet. Forfatterne erklærer at det ikke er noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Boris Solomonov og Virginia Commonwealth innovasjon maskin butikken for hjelp med rapid prototyping enheten. Forfatterne vil også gjerne takke Cristian Romero-Fuentes av Lewinski Group, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov og Virginia Commonwealth nanomaterialer Core karakterisering anlegg for deres hjelp med partikkel karakterisering. Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler formidles til Dr. Lewinski av College of Engineering ved Virginia Commonwealth University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61, (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3, (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013, (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51, (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26, (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10, (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97, (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20, (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11, (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8, (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9, (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103, (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36, (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19, (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41, (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47, (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27, (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26, (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29, (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206, (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9, (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5, (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5, (3), 389-399 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics