Um novo portátil em Vitro Cassette exposição para amostragem de aerossol

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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar exposições de aerossol de celular portátil e medir a resposta celular. O método utiliza células, crescidas na interface ar-líquido, imitando a fisiologia na vivo . Observou-se resposta celular de aerossóis de nanopartículas de cobre como estresse oxidativo através da geração de espécies reativas de oxigênio e citotoxicidade como liberação de lactato desidrogenase.

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Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

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Abstract

Este protocolo introduz um novo em vitro sistema de exposição, capaz de ser usado, incluindo sua caracterização e desempenho. Sistemas de interface ar-líquido (ALI) em vitro exposição são frequentemente grandes e volumosas, tornando o transporte para o campo e a operação na fonte de emissão ou dentro da zona de respiração difícil. Através da miniaturização destes sistemas, o laboratório pode ser trazido para o campo, acelerando o tempo de processamento e fornecendo um método de exposição mais apropriado que não altera o aerossol antes de entrar em contato com as células. O portátil em vitro exposição Cassette (PIVEC) adapta-se uma fita de filtro de 37 mm para permitir a toxicidade em vitro testes fora de um ambiente de laboratório tradicional. O PIVEC foi caracterizado usando três tamanhos de nanopartículas de cobre para determinar a eficiência de deposição, com base em gravimétrica e análise de concentração número de partícula. Foram realizados experimentos de citotoxicidade inicial com células de pulmão exposto para determinar a capacidade do sistema de depósito de partículas, mantendo a viabilidade celular. O PIVEC fornece uma eficiência de deposição semelhante ou maior quando comparados aos dispositivos de fluxo perpendicular disponível em vitro exposição. Apesar da taxa de transferência de amostra menor, o tamanho pequeno dá algumas vantagens para o atual em vitro ALI sistemas de exposição. Estes incluem a capacidade de ser usado para monitoramento pessoal, custam de vários sistemas de resolução espacial, mantendo um usuário menor mobilidade do laboratório para a fonte de emissão e a opção de set-up. O PIVEC é um sistema capaz de coletar aerossóis no campo e dentro da zona de respiração em um modelo de ar-interfaceado, in vitro .

Introduction

Amostragem pessoal, usando técnicas em vitro pode fornecer informações abrangentes sobre os efeitos biológicos de aerossóis no ambiente de trabalho. 1 exposição a contaminantes no ar incluem exposições para o produto químico em si, para as amostras de ar coletadas, sob condições submersas, onde o gás é introduzido à suspensão de células, as exposições intermitentes usando um dispositivo como um roqueiro, directa ou exposições na interface ar-líquido (ALI). 2 muitas dessas técnicas são realizadas com células cultivadas em suspensão ou a coleta de amostras antes da exposição, cada um deles pode afetar o estudo toxicológico devido a possíveis alterações no aerossol. 3 para evitar essas alterações, o laboratório pode ser trazido para o campo usando vários em vitro sistemas de exposição de cultura ALI que são usados na literatura,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 no entanto, poucos são comercialmente disponíveis. 8 , 9 , 12 destes sistemas são frequentemente volumosos, especialmente incluindo instrumentos para regular a temperatura e a umidade do ambiente celular e a vazão do aerossol da amostra. Usando o PIVEC, exposições de aerossol podem ser executadas fora de um ambiente de laboratório tradicional ou dentro da zona de respiração enquanto simulando condições de inalação.

A determinação do aerossol deposição em vitro é importante para a investigação dos efeitos de saúde devido à inalação. A zona de respiração, a área dentro de 30 cm da boca e nariz,14 é crucial para a compreensão da exposição a nanopartículas e para ligar para os efeitos biológicos nos pulmões. 2 muitas vezes, a deposição de células é definida como uma eficiência de deposição, as partículas depositadas no e retomadas pelas células divididas pelas partículas administradas ao sistema6,15 , ou em uma base em massa dos mesmos montantes. 4 , 16 os atuais métodos para medir aerossóis na zona de respiração são filtro baseado, capturando as partículas ao longo de um período de amostragem determinado e usando os filtros para realizar mais testes. 17 monitoramento pessoal exige um sistema pequeno que vem com a troca de amostras menos.

Existem muitas abordagens para determinar os efeitos na saúde da exposição a aerossóis. O modelo ALI permite o aerossol deve ser administrado diretamente para as células através do ar, como em um cenário de exposição real, ainda é mais rentável e menos tempo intensivo que na vivo estuda enquanto imitando as barreiras de ar-líquido, tais como os olhos, pele e pulmões. Células de pulmão crescidas no ALI têm a capacidade de gerar uma camada de barreira polarizada,18,19 , que produz traços fisiológicos que lembram o epitélio pulmonar na vivo , incluindo a produção de muco e surfactante em específico linhas de células brônquicas ou alveolar, cílios batendo, junções apertadas19 ,19,20 e célula de polarização. 18 alterações tais como estas podem afetar a resposta celular medida em estudos de toxicidade. 21 além disso, ALI in vitro do modelo resultados são muitas vezes mais sensível do que as células exposta via suspensão modelos22 e são capazes para modelo aguda na vivo inalação toxicidade. 23 , 24 portanto, um sistema de exposição ALI que é capaz de realizar medições dentro da zona de respiração é um próximo passo natural.

Expondo as células para aerossol diretamente na fonte de emissão, a investigação dos efeitos de todos os gases compostos semi voláteis e partículas envolvidas na mistura ocorre. Quando a mistura é coletada em um filtro, os gases e compostos voláteis não são capturados e a mistura inteira não pode ser investigada. Além disso, reconstituição de partículas em um pó ou uma suspensão líquida pode levar à agregação ou interações partícula-fluido, tais como a dissolução, em suspensão líquida. 25 , 26 quando partículas de aerossol são adicionadas ao líquido, existe um potencial maior para a aglomeração, formação de27 25,de uma coroa de proteína,28 ou interação com compostos no líquido, que pode afetar a deposição e influencia a resposta biológica. 29 , 30

Exposição no ALI baseia-se em três perfis principais aerossol nuvem fluxo de assentamento, paralela e fluxo perpendicular. Nuvem de sedimentação, usado pela exposição de célula Interface ar-líquido (ALICE),4 é um sistema descontínuo onde partículas depositam através de difusão, estabelecendo-se como o aerossol é tratado como uma unidade e gravitacional. Fluxo paralelo, usado pelo aerossol eletrostática em vitro sistema de exposição (BEIRAIS)5 e Multiculture exposição câmara (MEC) II,6 permite a deposição por meio da adição de movimento browniano através do perfil de fluxo. Fluxo perpendicular, usado por um microsprayer,7 câmara de aerossol Nano para toxicidade In Vitro (NACIVT),11 e comercial ALI sistemas8,9,10,12, adiciona a impactação de partículas dentro da região de deposição. Muitos destes sistemas de exposição são grandes e volumosas, que exigem sistemas de excesso para aerossol pré-condicionamento, bombas de fluxo, ou até mesmo aquecimento câmaras para a incubação das células. Este grande tamanho diminui a portabilidade do sistema. Em vez de amostragem diretamente na fonte de emissão, estes sistemas têm frequentemente amostras trazidas para os laboratório ou modelo aerossóis gerados para análise. A complexidade do aerossol emitido pode ser perdida na tradução do campo para o laboratório. O PIVEC é menor do que os sistemas atuais, com uma área de superfície externa de aproximadamente 460 cm2 e pesando apenas 60 gramas, com controle térmico e umidade incorporado no sistema permitindo a um dispositivo altamente portátil. A diminuição do tamanho e peso permitem que o sistema a ser usado ou tomadas para a fonte de exposição, permitindo a amostragem direta.

O grande tamanho dos atuais sistemas de exposição também diminui a capacidade de realizar a amostragem para investigar espaciais gradientes em concentrações. Esta resolução é chave ao determinar efeitos toxicológicos de muitas potencialidades ambientais e riscos ocupacionais como atividades partículas de matéria ou local de trabalho de exaustão veicular onde ocorre o clorofórmio. Imediatamente após emissão, aí torna-se uma variação espacial na concentração de partículas. Isso cresce com o tempo como as partículas se dispersar por toda a atmosfera e esses efeitos podem mudar com base das condições ambientais, como temperatura, pressão, vento e sol. Partículas podem começar a envelhecer e oxidar também uma vez emitido31,32 e taxas de dispersão são afetadas pela topografia; concentrações mais elevadas serão encontradas nos cânions e túneis, onde os efeitos de dispersão são diminuiu, e concentrações menores podem ser encontradas onde há uma grande área de dispersão. 33 estas mudanças nas taxas de dispersão podem ter efeitos significativos na saúde humana e podem ser vistas quando se compara o número de asmáticos adultos vivendo em urbano versus em ambientes rurais. 34 enquanto muitos sistemas de exposição fornecem amostras múltiplas de uma só vez, vários sistemas são necessários com uma abundância de grandes equipamentos para executar a resolução espacial.

Trazendo o laboratório para o campo, o tempo de análise pode ser diminuído usando o celular como um sensor. Seguir os pontos de extremidade e conhecidos mecanismos biológicos pode auxiliar na determinação da composição de aerossol e tamanho. Devido aos métodos de liberação lenta, incluindo infralateral, fagocitose e translocação, estas partículas são frequentemente interagindo com células cerca de dias a semanas3 gerando estresse oxidativo, inflamação e até mesmo a morte celular. Esses pontos de extremidade biológicos podem ser pontos de partida para percursos de resultado negativo para doença cardiovascular ou doença pulmonar obstrutiva crônica. Além disso, Wiemenn et al realizaram uma matriz de ensaios em vitro para comparar com valores de literatura para o curto prazo em vivo inalação toxicidade. 35 Resposta na vivo foi predita com dois dos quatro resultados positivos de testes de citotoxicidade através da libertação de lactato desidrogenase, estresse oxidativo do formação de redução e peróxido de hidrogênio de glutationa e lançamento e potencial de inflamação o gene de fator de necrose tumoral alfa. Fora de dez nanosized de óxidos de metal testado, seis testaram como ativo (óxido de titânio, óxido de zinco e óxido de cério diferentes quatro) usando as exposições em vitro com confirmação na vivo

A fim de estudar os efeitos de aerossóis no ambiente ocupacional, nosso laboratório desenvolveu o PIVEC para exposições no campo. Além disso, o PIVEC pode ser usado para amostragem pessoal monitorar e investigar a exposição por inalação, como o filtro de 37 mm gaveta36 ou vários sistemas podem ser usados para alcançar a resolução espacial numa determinada área. Neste protocolo, a caracterização e utilização do PIVEC é discutido. Após a exposição, os efeitos biológicos são observados através de ensaios de citotoxicidade.

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Protocol

Os operadores devem usar equipamento de proteção pessoal (por exemplo, jaleco, luvas, óculos de proteção) quando executar etapas 1, 2, 3, 5 e 6.

1. preparação de materiais

  1. Prepare materiais para a montagem do sistema e exposição garantir repetibilidade.
    1. Certifique-se de nova utilização ou etanol a 70% limpo ¼" diâmetro interno condutiva e tubo de ¼" diâmetro exterior conectores para a montagem do sistema.
    2. Loja de materiais de teste incluindo filtros, componentes PIVEC, pinças e pós de partículas em um ambiente bem controlado, com relação a temperatura e umidade, pelo menos 24 h antes do experimento.
      Nota: A temperatura deve ser perto da temperatura ambiente, cerca de 20 ° C, com umidade relativa inferior a 35%. Isto é muito importante conseguir repetibilidade entre experiências.
    3. Prepare os contadores de partículas utilizando isopropanol para limpar as peças e permitir o aquecimento do sistema de acordo com as recomendações do fabricante, incluindo a digitalização dimensionador de partícula de mobilidade (SMPS) e o dimensionador de partículas óptico (OPS) para a medição.

2. geração de aerossol seco

Nota: Os operadores devem executar geração de aerossol em uma coifa.

  1. Montar um sistema para gerar aerossóis secos
    Nota: A suspensão de partículas em gás ou líquido deve ser apropriada para a cultura de aplicação e célula modelada. O método a seguir pode ser executado usando um aerossol líquido-baseado. O desenho do sistema aerosol seco é de Tiwari et al. 37 um diagrama esquemático do sistema de dispersão seca é mostrado na Figura 1.
    1. Conectar-se a válvula de esfera para cada extremidade do tubo de tamanho de rosca de 4" 1/8, isto servirá como o funil de partícula. Conecte 2" 1/8 tubulação do tamanho de uma válvula.
    2. Pese de nanopartículas de cobre, neste estudo, que a concentração em massa para cada tamanho de partícula foi mantida constante ao determinar a eficiência de deposição. Use aproximadamente 7,5 mg de 40 nm cobre nanopartículas, 7 mg de 100 nm cobre nanopartículas e 13 mg de 800 nm cobre nanopartículas por exposição. Coloque nanopartículas de cobre no funil das partículas através da extremidade aberta.
      Nota: A quantidade de nanopartículas de cobre pesadas servirá como a massa base concentração administrada.
    3. Coloque um 3" pedaço de tubo de diâmetro externo (OD) ½" ao redor do tubo de 2" e lugar um HEPA Filtro dentro deste tubo curto tal que a direção do fluxo é através da válvula de esfera.
    4. Ligue o gerador de vácuo a outra válvula de esfera usando segmentação. Conecte o gerador de vácuo para tanque de ar, colocando um tubo OD 5/16" para a conexão de encaixe para. Use ¼" tubo OD para conectar a saída do gerador de vácuo para a montagem experimental, colocando a tubulação sobre a saída do gerador de vácuo.
  2. Utilização do sistema aerosol seco para gerar aerossol seco
    1. Abra o tanque de ar girando a válvula principal e permitir o fluxo de ar para o sistema. Abra a válvula do regulador de fluxo no tanque de ar e conjunto tal que o fluxo através do sistema é equivalente às configurações desejadas na bomba de vácuo.
    2. Abra a válvula de esfera, mais próxima de filtro HEPA, em seguida, abra a válvula de esfera, mais próxima de gerador de vácuo. Manter estas aberto por aproximadamente 3 s para permitir que as partículas de ser puxado para o fluxo de ar.
    3. Feche a válvula de esfera, mais próxima de gerador de vácuo, em seguida, feche a válvula de esfera, mais próxima de filtro HEPA. Permitir que o ar do tanque para fluir para a duração da experiência, se necessário.
    4. Fechar as válvulas principais e regulador no tanque para parar o fluxo de ar. Válvulas de esfera limpas e gerador de vácuo usando etanol a 70%. Tubos de metal de autoclave para esterilização.

3. deposição medição de eficiência usando PIVEC

Nota: Os operadores devem realizar exposições de aerossol em uma coifa.

  1. Medir a deposição, recolhendo o aerossol de nanopartículas de cobre gerado na etapa 2.2 em um pré-filtrante. Use a dose depositada, medido usando a massa coletada no filtro e a dose administrada, medido usando a quantidade de partículas de cobre pesadas, para determinar a eficiência de deposição.
    1. Manter 1,00 poro µm filtros de fibra de vidro sob condições de baixa umidade, descritos em 1.1.2, pelo menos 24 h antes da pré-exposição medições. Pesar um filtro não utilizado três vezes e registar os pesos dos filtros. Insira o local do filtro não utilizado em uma cultura de células.
    2. Escolha a célula apropriada cultura Inserir adaptador (6 bem ou bem 24) para PIVEC apoiar a inserção de cultura de células com o filtro. Casa da cultura de pilha inserir pedaço do adaptador na parte superior da base de PIVEC, colocação em lugar tal que a base da peça adaptador é mais larga que o topo.
    3. Uso uma pinça para colocar o filtro carregado de cultura de células inserir dentro pedaço do adaptador. Coloque a parte superior em cima do pedaço de adaptador, fixando-se no lugar tal que a base da parte superior é mais larga que o topo. Enrole o PIVEC com uma única camada de fita adesiva.
    4. Encaixe peças de gaveta de 37 mm na parte superior e inferior da PIVEC no lugar. Coloque ¼" farpado adaptadores na saída e entrada da gaveta.
    5. Enrole o aquecedor resistivo em torno PIVEC tal que os fios estão na base. Fita para fixar.
    6. Enrole PIVEC com ~ 8 rodadas de folha de alumínio para a isolação. Fixe com a fita.
    7. Conectar 2" longo pedaço de tubo flexível 1/2" diâmetro exterior ao adaptador em cima PIVEC. Remova o tubo poroso de água estéril e coloque dentro de tubos em cima PIVEC.
    8. Lugar PIVEC dentro grampo sobre o suporte de anel e seguro. Set-up completo com a bomba de vácuo, contadores de partículas e afinação de aerossol.
      Nota: A dose depositada baseada no número pode ser determinada somente se os contadores de partículas são colocados antes do PIVEC e depois o PIVEC em separado é executado.
    9. Expor os filtros usando o passo 2.2 de protocolo e as taxas de fluxo e tempo de exposição desejada, neste estudo que utilizou-se um tempo de exposição de 10 min a 0,5 LPM. Remova PIVEC o set-up. Retire a inserção de cultura celular e coloque o filtro exposto no porta-filtro em condições de baixa umidade, pelo menos 24 h antes da medição.
    10. Limpe PIVEC com etanol a 70%. Esterilize com luz ultravioleta pelo menos 30 min antes do próximo experimento.
    11. Pesar o filtro exposto três vezes e registar os pesos dos filtros. Coloque o filtro exposto em uma porta-filtro etiquetados para armazenamento.

4. cálculo da Dose depositada e a eficiência de deposição

Nota: O conhecimento da deposição é importante para a administração de aerossóis e interpretação da resposta celular.

  1. Calcular a deposição de medições com base em massa
    1. Calcule a massa depositada sobre filtros como a diferença entre o peso médio de pré-exposição e pós-exposição de peso médio. Esse valor é a dose depositada massa-base para o experimento.
    2. Uso administrado massa, m,admin, e massa-base depositado dose determinada em 4.1.1, mdep, para calcular a eficiência de deposição de massa-base, ηm, para o experimento.
      Equation
    3. Valores médios de 4.1.1 e 4.1.2 pelo menos 3 experimentos determinar a deposição e a eficiência de deposição por PIVEC para tamanho de partícula.
  2. Calcular a deposição da baseado no número de medições
    1. Certifique-se de que as medições com os contadores de partículas foram executadas com contadores após o PIVEC e para determinar a concentração de partículas antes do PIVEC. Integrar a concentração de partículas ao longo do tempo para o contador de partículas, em seguida, integrar sobre o diâmetro da partícula para determinar o total de partículas medidas.
    2. Calcule o número de partículas depositadas como a diferença entre as partículas administradas e o post-PIVEC partículas medidas. Esse valor é a dose depositada baseada em número para o experimento.
    3. Partículas de uso administrado, nadmin, baseados no número depositadas dose, ndep, vazão volumétrica, V e tempo, t, para calcular a eficiência de deposição baseada em número, ηn, para o experimento.
      Equation
    4. Valores médios de 4.2.2 e 4.2.3 pelo menos 3 experimentos determinar a deposição e a eficiência de deposição por PIVEC para tamanho de partícula.

5. aerossol exposição das células

Nota: Para a célula cultura na interface ar-líquido, o leitor é referida em branco et al. 38 operadores devem executar a inserção de cultura celular carregando (passos 5.1.2-5.1.4) dentro de uma armário de biossegurança. Operadores devem realizar exposições de aerossol em uma coifa.

  1. Células de cultura na Interface ar-líquido
    1. Levantar A549 células do frasco de cultura pela adição do trypsin-EDTA, 3 mL para um balão de T75 ou 1 mL para um balão de T25 e incubar durante 5 min a 37 ° C. Adicione 7 mL de mídia completa para um balão de T75 ou 4 mL de mídia completa para um T25 balão de balão e parede de balão enxaguar com suspensão de células maximizar o número de células recuperadas. Transferi a suspensão de células para um tubo cônico estéril 15 mL, em seguida, células de centrífuga a x 800 g por 3 min.
    2. Remover o sobrenadante contendo tripsina-EDTA e ressuspender as células em 10 mL de mídia completa. 10 µ l de suspensão de células de remover e adicionar para o hemocytometer. Contar as células usando um hemocytometer para determinar a concentração e o número total de células.
    3. Coloque 0,5 mL de mídia completa a cada poço dentro de um prato bem 24. Colocar inserções de cultura de células não utilizadas em poços. Cultura de célula semente insere-se no lado apical em uma densidade de celular perto de 1 x 105 células/cm2 para os tipos de células que crescem a uma taxa perto de duplicação por dia. A semente A549 células dentro de uma 24 bem inserir, inserir células de sementes em uma densidade de 1 x 105 células/cm2 adicionando 35.000 células à cultura de pilha.
      Nota: As células com uma taxa de crescimento mais lenta podem ser semeadas em uma densidade maior célula.
    4. Adicione mídia completa ao lado apical da inserção de cultura celular para atingir o volume final (para volume final de placa bem 24 é 0,25 mL).
    5. Cultura por 7 dias em condições submersas, substituindo a mídia a cada 1-2 dias. Após 7 dias, remova a mídia apical e cultura pelo menos 1 dia em condições de ALI, substituindo apenas a mídia basolateral.
  2. Monte PIVEC
    1. Permitir que as células equilibrar à interface ar-líquido pelo menos 24 h antes da exposição.
    2. Escolha adaptador de inserção de cultura de célula apropriada para PIVEC apoiar a inserção de cultura de células com o filtro. Cultura de pilha do lugar inserir parte do adaptador sobre PIVEC base, colocação em lugar tal que a base da peça adaptador é mais larga que o topo. Adicione 4 mL de meio de cultura de células para o poço da base do PIVEC.
    3. Uso uma pinça para colocar a cultura de pilha inserir dentro adaptador pedaço colocado na etapa 5.2.3. Coloque a parte superior em cima do pedaço de adaptador, fixando-se no lugar tal que a base da parte superior é mais larga que o topo. Cuidadosamente, enrole PIVEC com uma única camada de fita adesiva.
    4. Conectar-se pedaços de fita de 37 mm na parte superior e inferior da PIVEC, inserindo no lugar. Coloque ¼" farpado adaptadores na saída e entrada da gaveta.
    5. Enrole o aquecedor resistivo em torno PIVEC tal que os fios estão na base. Fita para fixar.
    6. Enrole PIVEC com ~ 8 rodadas de folha de alumínio para a isolação. Fixe com a fita.
    7. Conecte o adaptador no topo PIVEC curto pedaço de 1/2" tubo flexível de diâmetro exterior. Remova o tubo poroso de água estéril e coloque dentro de tubos em cima PIVEC.
    8. Lugar PIVEC dentro grampo sobre o suporte de anel e seguro. Complete a configuração com a bomba de vácuo e afinação de aerossol.
  3. Expor as células no ALI usando o PIVEC
    1. Use a eficiência de deposição determinada na etapa 2 para calcular a massa de partículas para ser aerosolized. Pesar a massa apropriada e adicionar ao sistema aerossol configurar seguindo passo 2 dentro da coifa.
    2. Expor as células, seguindo o passo 2.2, neste estudo de pontos de extremidade biológicos as células foram expostas a cerca de 3,5 mg de nanopartículas de cobre com uma vazão de 0,5 LPM e uma duração de exposição de 10 min. estudos de controle realizados usado ar umidificado para determinar a influência do ar sozinho. Remova PIVEC o set-up. Tiro a inserção de cultura celular, coloque a placa bem estéril e retornar para a incubadora de CO2 (37 ° C, 5% CO2, 90% RH).
    3. Aspire a mídia de PIVEC. Se realizando experiências adicionais, fundo de enxaguamento do PIVEC com fosfato tamponado solução, em seguida, repita a etapa 5.1 e 5.2.
    4. Limpe PIVEC com etanol a 70% quando terminar. Esterilize com luz ultravioleta pelo menos 30 min antes do próximo experimento.
  4. Procedimentos de ensaio biológico
    Nota: Os ensaios realizados neste estudo foram citotoxidade através da liberação de lactato desidrogenase (LDH) e geração de estresse oxidativo através do ensaio de Diniz Melo-DA.
    1. Dissolva 24,4 mg de Diniz Melo-em 50 mL de metanol para fazer 1 mM Diniz Melo-DA solução. Esta solução pode ser armazenada a-20 ° C por até 4 meses. Diluir 1 mM Diniz Melo-DA solução através da mistura de 0,1 mL de 1mm Diniz Melo-DA solução com 9,9 mL HBSS tornar-se 10 mL de 10 µM Diniz Melo-DA.
    2. Remova célula meios de cultura e lavagem celular cultura inserir com aproximadamente 1 mL de PBS. Adicione 0,5 mL de solução de Diniz Melo-DA 10 µM para cada poço, substituindo inserções quando terminar. Cubra o prato com papel de alumínio para evitar photoactivation do corante e voltar à incubadora 37° C por 1 h.
    3. Remover células da incubadora e aspirar a solução Diniz Melo-dos poços. Adicionar 0,5 mL HBSS poços e substitua as inserções de cultura celular.
    4. Carregar a placa bem na placa leitor e medida da linha de base da fluorescência usando comprimentos de onda de excitação/emissão de 485/530 nm. Retire a placa da placa leitor e carga inserir em PIVEC para exposição.
    5. Expor as células para duração da exposição desejada. Remova a inserção do PIVEC e retornar a placa bem. Retire 50 µ l de fluido basolateral do prato bem e coloque em prato bem branco 96. Medir a fluorescência de DCF usando comprimentos de onda de excitação/emissão de 485/530 nm cada 30min pós-exposição por 2 h.
    6. Deixe basolateral fluido equilibrar a temperatura ambiente por 20-30 min. Adicionar 50 µ l de solução de ensaio LDH, misto seguinte protocolo do fabricante, ao fluido basolateral da placa bem e deixar reagir por 10 min. Adicione 25 µ l de solução de paragem para o bem. Lê a fluorescência de resorufin produto usando comprimentos de onda de excitação/emissão de 560/590 nm.
    7. Remover o líquido adicional basolateral e repita o passo 5.4.6 às 4h e pós-exposição de 24 h.

6 métodos estatísticos

  1. Análise de dados de ensaios biológicos
    1. Produção de ROS de relatório como o aumento da intensidade de fluorescência das células tratadas em relação a medidas de linha de base. Relatório de atividade LDH como o aumento de intensidade de fluorescência das células tratadas em relação as células não tratadas.
    2. Execute o único fator ANOVA para determinar diferenças estatísticas entre os conjuntos de dados. Se for caso disso, execute o estudante t-testes em um valor de significância de 0,05. Dados do relatório como o média ± desvio-padrão de pelo menos três medições de exposição.

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Representative Results

Toxicologia Ocupacional em vitro envolve a manutenção da viabilidade celular durante a realização de exposição de aerossol. O sistema PIVEC é mostrado na Figura 2, incluindo a temperatura e controle de umidade e o PIVEC desgastado. A temperatura foi mantida usando um aquecedor resistivo pilhas e o aerossol humedecido utilizando aumentou umidificação natural através de um tubo poroso, molhada. Em um aerossol controlado configuração dentro de um laboratório, o PIVEC pode ser set-up para exposição, mostrada na Figura 1. Caracterização do sistema permite a determinação da dose depositada sobre as células, que então pode ser correlacionada com a resposta celular.

A eficiência de deposição é dependente do tamanho de partículas adicionadas ao sistema, desde que as forças de deposição incluem impactação, sedimentação e difusão. Além disso, o depoimento é dependente da taxa de fluxo, tempo de exposição e as características do sistema de exposição. Com esta informação, pode prever-se a deposição. A eficiência de deposição do PIVEC foi determinada através de dois métodos, análise gravimétrica e contagem do número de partículas. Equações 1 e 2 foram usadas para determinar a eficiência de deposição em tabela 1 usando o filtro baseado, verificação de mobilidade partícula sizer (SMPS) e medições de partículas óptico dimensionador (OPS), Figura 3. Aumento da deposição é observado em geral para os 24 bem design do que o 6 bem projetar e diminui ligeiramente para 100 nm em comparação com 40 nm e 800 nm cobre de partículas. A deposição em 24 poços é muito uniforme sobre a inserção, no entanto, deposição no design bem 6 falta uniformidade como a maior parte do depósito de partículas perto do centro da inserção. Análise de pós-exposição pode ser expedido, determinando a relação de dose entre o filtro de 37 mm e a inserção de cultura celular, diminuindo a necessidade de se determinar a dose após exposição ao celular. Comparação da deposição dentro da gaveta de filtro de 37 mm e o PIVEC mostra uma correlação forte para todos os tamanhos e poços, com uma correlação de Pearson de acima de 0,7, entretanto somente para 800 nm é a correlação significativa com p < 0.05, veja a Figura 4. Comparado aos sistemas similares em toda a literatura,11,12 a eficiência de deposição do PIVEC na gama de tamanhos de partícula testado é comparável ou maior sobre valores relatados, observados na Figura 5. A eficiência de deposição dentro o PIVEC pode ser melhorada através de minimização de perdas no sistema usando eletrostática dissipativo ou condutora de material plástico ou similar para projetar o PIVEC.

Se os filtros não são bem secas em um ambiente de controle de umidade antes da exposição, o excesso de água aumenta a massa inicial e pode produzir doses depositados não-físicos, negativos. Taxas de fluxo variável também podem promover inconsistentes doses depositados dentro do sistema. Para evitar esses problemas, permitir que pelo menos um dia antes e após a exposição para filtros secar em um ambiente de controle de umidade.

Respostas celulares serão afetadas pela dose depositada e podem ser afetadas pela duração da exposição, se as células não são mantidas corretamente. A549 células, uma linhagem de células de carcinoma epitelial alveolar, foram expostas por 10 min de tamanhos variados de nanopartículas de cobre em uma taxa de fluxo de 0,5 LPM. Alternativa perpendicular fluxo uso de sistemas de exposição entre 0,005 LPM e LPM 1,5 durante um período de exposição sustentado enquanto este método usa uma velocidade moderada durante uma rápida exposição. Usando a eficiência de deposição de massa-base medido e administrada dose, 1,58 ± 0,04 mg/cm2 de 40 cobre nm, 0,30 ± 0,00 mg/cm2 de 100 partículas de cobre nm, e 0,32 ± 0,01 mg/cm2 de 800 partículas de cobre nm foram depositados sobre as células. Citotoxicidade e estresse oxidativo foram observados dentro a primeira pós-exposição de vinte e quatro horas. Citotoxicidade foi medida usando a liberação de lactato desidrogenase (LDH) de células danificadas imediatamente, 4 horas e 24 horas pós-exposição. Não havia nenhuma toxicidade significativa de nanopartículas de cobre abaixo de 1,62 mg/cm2 até 4 horas de exposição, Figura 6b. Vinte e quatro horas pós-exposição lá foi uma diminuição estatisticamente significante na viabilidade celular de menos de 20% viabilidade para células expostas a nanopartículas de cobre. O estresse oxidativo intracelular foi investigado usando o ensaio de Diniz Melo-DA através da oxidação de Diniz Melo por espécies reativas de oxigênio dentro da primeira exposição de duas horas após, Figura 6a. Níveis significativos de estresse oxidativo foram medidos em pós-exposição de trinta minutos para as células expostas a nanopartículas de cobre de todos os tamanhos. O nível de estresse oxidativo continuou a aumentar a taxas semelhantes para todos os tamanhos, testados dentro das duas horas observadas.

Sucesso das exposições pode ser determinado através da reprodutibilidade da resposta celular. Dois critérios de aceitação de propostas para ensaios de citotoxicidade incluem: 1) a fuga LDH total % para o controlo positivo deve ser superior a 50% e 2) o coeficiente positivo e amostra de replicar de variações deve estar dentro de 50%. 39 se estes critérios não são conhecido, este sugere diferenças entre experimentos, tais como quantidades de deposição alterado, ou pobre controle de humidade ou temperatura. Além disso, observar as medições de citotoxicidade pode conduzir a compreensão dos controles experimentais e ajudar a determinar o erro. Quando a taxa de fluxo é muito alta, as células podem morrer de quantidades elevadas de tensão de cisalhamento. Diminuindo a taxa de fluxo, o estresse sobre as células do fluxo pode ser diminuído.

Figure 1
Figura 1. Esquemático do sistema de dispersão seco e montagem Experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. PIVEC Design. A) completo Design retratado com caixa altura de 30 cm para comparação. B) PIVEC com controle de umidade e temperatura retratado com 30 cm de altura caixa para comparação. C) PIVEC desgastado. D) PIVEC parte superior. E) celular cultura adaptador para 24 bem (à esquerda) e 6 bem (à direita). F) parte inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Número com base em eficiência de deposição (%) Massa base eficiência de deposição (%)
6 bem 40 nm 17.83 ± 32.13 5.85 ± 0.85
100 nm 0,47 ± 4,06 5.11 ± 0.94
800 nm 3.70 ± 35,00 6.39 ± 1.01
24 bem 40 nm 1,43 ± 2.43 12.61 ± 1.34
100 nm 1.37 ± 19,45 2.95 ± 0.75
800 nm 6,98 ± 3,93 15,95 ± 0,53

Tabela 1. Eficiência de deposição de PIVEC.

Figure 3
Figura 3. Concentração de número de partículas de aerossóis de nanopartículas de cobre. A) medição SMPS. B) medida OPS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Relação entre deposição em Inserir célula e filtro de 37 mm SKC. Erro ± 0,002 mg. A) 40 partículas de cobre nm. B) 100 partículas de cobre nm. C) 800 partículas de cobre nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Eficiência de deposição de PIVEC em comparação com sistemas de exposição fluxo Perpendicular na literatura. Valores de literatura de sistemas de exposição de fluxo Perpendicular são plotadas em marcadores sólido e PIVEC valores são marcadores vazio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Resposta celular ao cobre nanopartículas pós-exposição (PE). Para todas as medições, n = 3 e p < 0,05. A) oxidative Stress determinado usando o ensaio de Diniz Melo-DA. B) determinada usando o LDH ensaio de citotoxicidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Fitas de filtro fornecem um método simples, barato, de coleta de aerossóis na zona de respiração; no entanto, amostras de aerossol extraídas de filtros não representam o aerossol inteiro (ou seja, gases voláteis e partículas) e, consequentemente, limitar a avaliação dos efeitos biológicos relacionados. Usando o projeto inicial da fita de filtro de 37 mm, o PIVEC é projetado para manter a portabilidade e imitar a deposição na vivo de partículas de inalação. O PIVEC é significativamente menor do que os atuais sistemas de exposição ALI, aproximadamente o tamanho de uma caixa de tecido com controle de temperatura e umidade incluído. O tamanho é semelhante ao pêndulos cascata pessoal oferecendo dados na resposta celular para o aerossol além disso. Enquanto o PIVEC contém espaço para uma amostra em comparação com outros sistemas de exposição atual, o tamanho pequeno permite vários sistemas para ser usado ao mesmo tempo, portanto, aumentar o tamanho da amostra e permitindo a distribuição espacial a ser monitorado.

Existem vários passos críticos no protocolo. Para determinar a eficiência de deposição, é crítico para condicionar adequadamente os filtros, conforme descrito na etapa 1. Além disso, é importante pesar corretamente as nanopartículas de cobre antes da exposição e da exposição de post de filtro para determinar a eficiência de deposição de massa-base. A eficiência de deposição número deve ser determinada usando a diferença entre a concentração inicial de aerossol e a concentração final determinado usando os contadores de partículas no depoimento. Se a eficiência de deposição não é devidamente determinada, é difícil determinar as diferenças de resposta biológica entre tipos de aerossol. Modificações para a deposição incluem alterando a deposição. Deposição pode ser aumentada pela alteração da duração de exposição e taxa de fluxo. Isso também pode influenciar a viabilidade celular com potencial de secagem para fora das células. O condicionamento dos aerossóis é frequentemente realizado para compensar a atributos fisiológicos tais como temperatura e umidificação das vias aéreas. Aumento de umidade, mais de 50%, imita o ar inalado e diminui a morte celular, devido à exposição do veículo. 43 quando a temperatura e umidade não são bem controlados, a resposta celular pode ser influenciada. Diminuindo a taxa de fluxo, depositaremos partículas adicionais de todos os tamanhos, aumentando a deposição. Duração da exposição é proporcional à deposição, permitindo que mais partículas depositar durante um longo período experimental. Condicionamento do aerossol é importante ao aumentar a duração da exposição, para que as células não secar que podem afetar as respostas biológicas.

O PIVEC usa fluxo perpendicular para depósito de partículas através de impactação, sedimentação e difusão para as células que têm potencial para secar as células através do fluxo e acrescentou o stress nas células. A eficiência de deposição é dependente do tamanho da partícula, devido à força do depoimento. Muitos dos atuais sistemas de exposição com fluxo perpendicular têm uma eficiência de deposição de abaixo de 10% e muito mais perto de 1%. O PIVEC tem uma eficiência de deposição, determinada pela análise gravimétrica de 3% a 16% para 24 bem inserção de cultura de células. A eficiência de deposição baseada no número de partícula é aproximadamente 1% a 7% para inserção da mesma. Ao usar um 6 bem cultura celular insere, diminuem estes números, com o menor tamanho de partícula, devido a racionalização do aerossol como mais partículas estão confinadas na inserção da cultura de célula sem espaço para o fluxo desenvolver a exceção. As 6 inserções de cultura celular bem permitam os fluxos de aerossol para contornear a deposição. Outros sistemas de fluxo perpendicular foram caracterizados em uma base de massa usando 60 nm fluoresceína partículas40, 80 nm e 180 nm cobre partículas16e 60 nm adípico partículas de ácido41. As eficiências de deposição resultante são geralmente entre 0,05% e 11%. Um número base, estes sistemas foram caracterizados usando partículas de poliestireno12,15, nanopartículas de carbono12e sílica partículas42, gerando eficiências entre 0,2% e 11%. O PIVEC fornece, deposição semelhante ou maior, em comparação com dispositivos de exposição celular disponível.

Célula de exposições foram realizadas usando nanopartículas de cobre de 40 nm, 100 nm e 800 nm. Viabilidade celular foi definida usando o ensaio LDH sem diminuição significativa na viabilidade dentro pós-exposição de quatro horas. O ensaio LDH foi usado com um sistema de exposição comercial para 74 ng/cm2 depois de 2 horas e 148 ng/cm2 após 4 horas de 9,2 de partículas de óxido de cobre nm44 e 1 µ g/cm2 depositado após uma exposição sequencial de 4 horas, a incubação por 2 horas e, em seguida, outra exposição de 4 horas de 25 nm cobre óxido partículas40, ambos medição diminuições significativas na viabilidade celular. Citotoxicidade foi observada em outro sistema para 1.6-7,6 µ g/cm2 de 180 partículas nm, nanopartículas de cobre16 medido pela exclusão do corante azul de Tripan. Exposições de 15 minutos de nanopartículas de óxido de cobre nm 40-80 diminuição da viabilidade, medida 24 horas pós exposição. A baixa toxicidade observada usando o PIVEC foi provavelmente devido ao menor tempo de exposição de 10 minutos e mais curtos tempos de medição de exposição de post. Pós-exposição de quatro horas, após a viabilidade das células expostas na PIVEC diminuiu. Células expostas a controles de ar húmido não observadas nenhuma citotoxidade significativa, de acordo com outros estudos 9,40,44,,45,46. O estresse oxidativo foi determinado utilizando o ensaio Diniz Melo-DA. A produção de espécies reativas de oxigênio, tais como peróxido de hidrogênio ou radicais de oxigênio, gerado uma quantidade de estresse que pode levar à morte de detenção ou de células de crescimento. Após as exposições de célula, houve um aumento mínimo no estresse oxidativo para células mantidas na incubadora como controle e para as células expostas ao ar húmido. Estresse oxidativo elevado ocorreu para todos os tamanhos de partículas, aumentando dentro de pós-exposição de 30 minutos. Dentro de um estudo, de partículas de óxido de cobre de nm 9,244 e 25 nm partículas de óxido de cobre40 também induzida por estresse oxidativo medido através do ensaio de carboxi-Diniz Melo-DA. Maior tempo de exposição de 2 horas para estresse oxidativo elevado de 4 horas para 9.2 nm partículas de óxido de cobre44. Após quatro horas de exposição, as partículas de óxido de cobre nm 9,2 produziram uma resposta oxidativa semelhante como a exposição sequencial de 25 nm cobre óxido partículas40, sugerindo que a exposição duração tem uma influência maior na resposta ao estresse oxidativo que tamanho de partícula. Células expostas dentro o PIVEC produziram estresse oxidativo elevado em comparação com esse estudo, no entanto, as partículas expostas no sistema alternativo são o óxido de cobre e irão dissolver-se menos rapidamente do que o cobre exposto dentro do PIVEC. Estudos realizados sobre a dissolução do cobre com base na composição e tamanho de partículas concordam que as partículas maiores e os óxidos de metal liberam íons mais lentos do que partículas de metal ou suas contrapartes de nanopartículas16,47 , 48 , 49 como os controles de ar húmido não produzem quantidades significativas de estresse oxidativo em comparação com o controle da incubadora, a influência de partículas de cobre para induzir o estresse oxidativo é consistente dentro o PIVEC semelhante em vitro exposição sistemas. As respostas biológicas observadas usando o PIVEC sugerem que o PIVEC é um sistema adequado de exposição celular.

Embora a caracterização e estudos celulares do PIVEC concordam bem com a literatura,9,16,40,44,46 o dispositivo tem limitações. O projeto pequeno diminui o número de amostras que podem ser expostos simultaneamente dentro de um único dispositivo em comparação com outros sistemas de exposição. Outros sistemas permitem pelo menos três exposições celulares aos mesmos aerossol9,12 facilitando medições replicar. Embora o PIVEC só permite uma inserção por sistema, o tamanho pequeno permite vários sistemas para ser facilmente usado, ajudando a atenuar este problema. Enquanto outros sistemas de monitoramento de pessoais não usar células, o PIVEC deve ser mantida próxima vertical para reduzir a derramar os meios de cultura de células necessária para preservar a viabilidade celular. Embora o PIVEC ainda não foi otimizado para intervalos específicos partículas (PM10, PM2.5, PM0.1), o PIVEC tem sido caracterizada por uma variedade de tamanhos de partículas. Similar a outros sistemas de fluxo perpendicular, o PIVEC mostra uma diminuição da capacidade de depositar partículas perto de 100 nm de diâmetro, enquanto 40 nm e 800 nm as partículas depositadas com eficiência semelhante.

A análise de pós-exposição de células pode ser acelerada através da realização de um conjunto paralelo de aerossóis dentro o PIVEC e uma gaveta de filtro SKC 37 mm. Uma alta correlação do depoimento com base gravimétrica permite a estimativa da massa das partículas coletada sobre as células de dados coletados usando filtros de 37 mm. Comparação da inserção ao estojo filtro reduz a necessidade de coletar amostras adicionais e medidas adicionais para determinar a dose. Trabalhos em curso inclui a integração de um sistema de monitoramento em tempo real para citotoxicidade, estresse oxidativo ou outros parâmetros biológicos. O pequeno tamanho do PIVEC lhe permite ser usado em uma variedade de configurações, tais como no corpo, como um monitor pessoal, um drone acima uma fábrica química, ou de fora para dentro do ambiente para resolução espacial. Esse método mostrou-se o uso da PIVEC para a coleta de partículas de aerossol em culturas de células cultivadas do ALI. Por condicionamento o aerossol a 37 ± 1 ° C e > 80% de humidade relativa, viabilidade celular pode ser mantida durante exposições agudas. Este método é adequado para sólida baseada em partículas de aerossóis e gotículas de líquido e tem sido mostrado para depósito de partículas entre 40 nm e 800 nm em inserções de cultura de células. A versatilidade do PIVEC permite que este método deve ser usado em várias configurações com uma variedade de pontos de extremidade biológicas.

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Disclosures

A afiliação dos autores é conforme mostrado na página de rosto. Os autores são apoiados financeiramente por Virginia Commonwealth University, onde o trabalho foi concluído em Richmond, VA. Os autores têm a responsabilidade para a redação e o conteúdo deste documento. Os autores declaram que não há nenhum interesses concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer a Boris Solomonov e Virginia Commonwealth inovação oficina para obter ajuda com o dispositivo de prototipagem rápida. Os autores também gostaria de agradecer Cristian Romero-Fuentes do grupo Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov e o Virginia Commonwealth nanomateriais caracterização facilidade do núcleo por sua ajuda com a caracterização de partículas. Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização fornecidos ao Dr. Lewinski pela faculdade de engenharia da Universidade de Virginia Commonwealth.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

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