Un nuevo portátil In Vitro exposición Cassette para el muestreo de aerosoles

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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para realizar exposiciones de aerosol celular portable y medir la respuesta celular. El método utiliza las células, cultivadas en la interfase aire-líquido, imitando en vivo fisiología. Respuesta celular a aerosoles de nanopartículas de cobre se observó como el estrés oxidativo a través de la generación de especies reactivas de oxígeno y la citotoxicidad como liberación de lactato deshidrogenasa.

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Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

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Abstract

Este Protocolo introduce un nuevo en vitro exposición sistema, capaz de ser usado, incluyendo su caracterización y funcionamiento. Sistemas de interfaz de aire líquido (ALI) en vitro exposición suelen ser grandes y voluminosos, dificultando el transporte al campo y la operación en la fuente de emisión o dentro de la zona de respiración. A través de la miniaturización de estos sistemas, el laboratorio puede ser traído al campo, acelerar el tiempo de procesamiento y proporciona un método de exposición más apropiado que no altere el aerosol antes de ponerse en contacto con las células. El Portable In vitro exposición Cassette (PIVEC) adapta un casete de filtro de 37 mm para permitir en vitro toxicidad pruebas fuera de un entorno de laboratorio tradicional. El PIVEC fue caracterizado mediante tres tamaños de nanopartículas de cobre para determinar eficacia de deposición basada en gravimétrico y análisis número de concentración de partículas. Se realizaron experimentos de citotoxicidad inicial con células pulmonares expuestas para determinar la capacidad del sistema para depositar las partículas mientras que mantiene la viabilidad celular. El PIVEC proporciona una eficiencia de deposición similar o mayor al comparar a los dispositivos de flujo perpendicular disponible en vitro exposición. A pesar de la baja demanda, el tamaño pequeño le da algunas ventajas a la actual en vitro ALI sistemas de exposición. Estos incluyen la capacidad de ser usado para control de personal, movilidad del laboratorio a la fuente de emisión y la opción de configuración múltiples sistemas de resolución espacial manteniendo un usuario más bajo costo. El PIVEC es un sistema capaz de recoger los aerosoles en el campo y dentro de la zona de respiración en una interfaz de aire, en vitro modelo.

Introduction

Muestreo personal de vitro técnicas podría proporcionar información completa sobre los efectos biológicos de los aerosoles en el lugar de trabajo. 1 exposición a contaminantes en el aire incluye exposición a producto químico sí mismo, a las muestras de aire recogidas en condiciones sumergidas, donde el gas se introduce a la suspensión de células, exposición intermitente utilizando un dispositivo como un balancín, o en la exposiciones en la interfase aire-líquido (ALI). 2 muchas de estas técnicas se realizan con células cultivadas en suspensión o en la recogida de muestras antes de la exposición, cada una de ellas puede afectar el estudio toxicológico debido a posibles cambios en el aerosol. 3 para evitar estos cambios, el laboratorio puede ser traído al campo, utilizando varios en vitro ALI exposición los sistemas de cultivo que se utilizan en la literatura,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 sin embargo, pocos están comercialmente disponibles. 8 , 9 , 12 estos sistemas suelen ser voluminosos, especialmente cuando se incluye instrumentos para regular la temperatura y la humedad del ambiente celular y el flujo del aerosol de la muestra. Usando el PIVEC, exposiciones de aerosol pueden realizarse fuera de un entorno de laboratorio tradicional o dentro de la zona de respiración mientras que mímico las condiciones de la inhalación.

La determinación de la deposición de aerosoles en vitro es importante a la investigación de efectos sobre la salud debido a la inhalación. La zona de respiración, el área dentro de los 30 cm de la boca y la nariz,14 es crucial para la comprensión de la exposición a las nanopartículas y para vincular a los efectos biológicos en los pulmones. 2 a menudo, la deposición en las células se define como una eficiencia de deposición, las partículas deposita en y tomado por las células que se dividen las partículas administrada al sistema6,15 o en una base total de la misma cantidad. 4 , 16 los métodos actuales para la medición de aerosoles en la zona de respiración son filtro base, capturando las partículas durante un período de muestreo dado y con los filtros para llevar a cabo más pruebas. 17 monitoreo personal requiere un pequeño sistema que viene con el compromiso de pocas muestras.

Hay muchos métodos para determinar los efectos de la exposición a un aerosol. El modelo ALI permite el aerosol ser administrado directamente a las células a través del aire como en un escenario de exposición real, sin embargo, es más rentable y menos tiempo intensivo que en vivo los estudios mientras que mímico las barreras de aire líquido como los ojos, piel y pulmones. Las células del pulmón en el ALI tienen la capacidad para generar una capa de polarizado,18,19 que produce características fisiológicas que se parecen al en vivo pulmón epitelio, incluyendo la producción de moco y surfactante en específico líneas de célula bronquial o alveolar, cilia bate,19 ensambladuras apretadas,19,20 y cell polarización. 18 cambios como estos pueden afectar la respuesta celular en los estudios de toxicidad. 21 además, ALI en vitro modelo resultados son a menudo más sensibles que las células expuestas mediante suspensión modelos22 y capaz modelo aguda en vivo inhalación Toxicidad. 23 , 24 por tanto, un sistema de exposición de ALI que es capaz de realizar mediciones dentro de la zona de respiración es un siguiente paso natural.

Al exponer las células a aerosol directamente a la fuente de emisión, se produce la investigación de los efectos de todos los gases, compuestos semi volátiles y partículas en la mezcla. Cuando la mezcla se recoge en un filtro, no se capturan los gases y compuestos volátiles y la mezcla entera no puede ser investigada. Además, la reconstitución de partículas en un polvo o una suspensión líquida puede conducir a la agregación o interacciones partícula-líquido, como la disolución, en suspensión líquida. 25 , 26 cuando se agregan partículas de aerosol al líquido, hay un mayor potencial para la formación de27 25,de corona de proteína,28 o interacción con los compuestos en el líquido, que puede afectar a la deposición, aglomeración y influir en la respuesta biológica. 29 , 30

Exposición en la ALI se basa en tres perfiles principales aerosol nube dirimentes, paralelo de flujo y flujo perpendicular. Nube de adaptación, utilizado por el aire líquido interfaz celular exposición (ALICE),4 es un sistema por lotes donde depositan las partículas gravitacionales y difusionales colocar como el aerosol es tratado como una unidad. Flujo paralelo, utilizado por el Aerosol electrostático en vitro exposición sistema (aleros)5 y Multicultura exposición cámara (MEC) II,6 permite la deposición mediante la adición de movimiento browniano a través del perfil de flujo. Flujo perpendicular, usado por un microsprayer,7 Nano cámara de Aerosol para la toxicidad In Vitro (NACIVT),11 y comercial ALI sistemas8,9,10,12, añade la impactación de partículas dentro de la región de deposición. Muchos de estos sistemas de exposición son grandes y voluminosos, que requieren sistemas de exceso para aerosol previamente acondicionado, bombas de flujo, o incluso la calefacción cámaras de incubación de las células. Este gran tamaño disminuye la portabilidad del sistema. En lugar de muestreo directamente a la fuente de emisión, estos sistemas tienen a menudo las muestras que el laboratorio o modelo aerosoles generados para el análisis. La complejidad de los aerosoles emitidos se puede perder en la traducción del campo al laboratorio. El PIVEC es más pequeño que los sistemas actuales, con una superficie externa de aproximadamente 460 cm2 y pesa sólo 60 gramos, con control de humedad y térmico incorporado en el sistema que permite a un dispositivo portátil. La disminución del tamaño y peso permiten que el sistema de ser usado o tomado a la fuente de exposición, permitiendo el muestreo directo.

El gran tamaño de los actuales sistemas de exposición también disminuye la capacidad para realizar el muestreo para investigar gradientes espaciales en las concentraciones. Esta resolución es clave para determinar los efectos toxicológicos de potencial ambiental y riesgos laborales como escape vehicular partículas materia o lugar de trabajo actividades donde se produce la aerosolización. Inmediatamente la emisión, allí se convierte en una variación espacial en la concentración de partículas. Esto crece con el tiempo las partículas se dispersan en la atmósfera y estos efectos pueden cambiar en base a las condiciones ambientales, como temperatura, presión, viento y sol. Las partículas pueden comenzar a la edad, así como una vez emitidos31,32 se oxida y las tasas de dispersión están afectadas por la topografía; concentraciones más altas se encuentran en cañones y túneles, donde efectos de dispersión se ralentizó, y concentraciones más bajas pueden encontrarse donde hay una gran área de dispersión. 33 estos cambios en las tasas de dispersión pueden tener efectos significativos sobre la salud humana y pueden verse al comparar el número de adultos asmáticos viven en urbanos y en entornos rurales. 34 mientras que los sistemas de exposición muchos proporcionan múltiples muestras a la vez, múltiples sistemas son necesarios con una abundancia de grandes equipos para realizar la resolución espacial.

Al llevar el laboratorio al campo, el momento del análisis puede reducirse mediante el uso de la célula entera como un sensor. Siguiendo criterios de valoración y los mecanismos biológicos conocidos puede ayudar en la determinación de la composición del aerosol y el tamaño. Debido a los métodos de remoción lenta, incluyendo depuración mucociliar, fagocitosis y desplazamiento, estas partículas son a menudo interactuando con las células para unos días a la semanas3 generadoras de estrés oxidativo, inflamación y hasta la muerte celular. Estos criterios de valoración biológicos pueden ser los puntos de partida para rutas de resultados adversos para la enfermedad cardiovascular o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Además, Wiemenn et al realizó una serie de ensayos en vitro para comparar con los valores de la literatura para a corto plazo en vivo inhalación Toxicidad. 35 Respuesta in vivo fue predicho con dos de los cuatro resultados positivos de ensayos de citotoxicidad por liberación de lactato deshidrogenasa, el estrés oxidativo de glutatión reducción y peróxido de hidrógeno formación y liberación y potencial de la inflamación el gene alfa del factor de necrosis tumoral. De combinar diez óxidos metálicos probados, seis prueban como activo (óxido de titanio, óxido de zinc y óxido de cerio diferentes cuatro) mediante exposiciones in vitro con confirmación en vivo

Para estudiar los efectos de los aerosoles en un ámbito laboral, nuestro laboratorio desarrollado PIVEC para exposiciones en el campo. Además, el PIVEC puede usarse para que muestreo personal para vigilar e investigar la exposición por inhalación como el filtro de 37 mm cassette36 o sistemas múltiples pueden utilizarse para lograr la resolución espacial dentro de un área determinada. En este protocolo, se discute la caracterización y el uso de la PIVEC. Después de la exposición, los efectos biológicos se observan a través de ensayos de citotoxicidad.

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Protocol

Los operadores deben usar equipo de protección personal (bata, guantes, gafas) cuando realice los pasos 1, 2, 3, 5 y 6.

1. preparación de materiales

  1. Preparar materiales para sistema de montaje y exposición para asegurar repetibilidad.
    1. Asegúrese de que uso nuevo o etanol al 70% limpia ¼" diámetro interno conductora tubería y ¼" diámetro exterior conectores para el conjunto del sistema.
    2. Almacén materiales de prueba incluyendo filtros, componentes PIVEC, pinzas y polvos de partículas en un entorno bien controlado, con respecto a la temperatura y la humedad, durante al menos 24 h antes del experimento.
      Nota: La temperatura debe estar cerca de temperatura ambiente, aproximadamente 20 ° C, con humedad relativa inferior al 35%. Esto es muy importante para lograr la repetibilidad entre experimentos.
    3. Preparar contadores de partículas usando isopropanol para limpiar las piezas y permite el calentamiento del sistema según las recomendaciones del fabricante, incluyendo el medidor de partículas de exploración movilidad (SMPS) y sizer de partículas óptico (OPS) para la medición.

2. generación de Aerosol seco

Nota: Los operadores deben realizar generación de aerosol en una campana de humos.

  1. Montar un sistema para generar aerosoles secos
    Nota: La suspensión de partículas en el gas o líquido debe ser apropiada para la cultura de célula y aplicación modelada. El siguiente método se puede realizar utilizando un aerosol de base líquida. El diseño del sistema de aerosol seco es de Tiwari et al. 37 un esquema del sistema de dispersión seca se muestra en la figura 1.
    1. Conectar la válvula de bola en cada extremo de la tubería de 4" 1/8 de tamaño de rosca, esto servirá como la tolva de la partícula. Conecte 2" 1/8 tamaño de tubería a una válvula.
    2. Pesar de nanopartículas de cobre, en este estudio la concentración en masa para cada tamaño de partícula se mantuvo constante al determinar la eficiencia de deposición. Utilice aproximadamente 7,5 mg de 40 nm cobre nanopartículas, 7 mg de 100 nm cobre nanopartículas y 13 mg de nanopartículas de cobre nm 800 por exposición. Colocar nanopartículas de cobre en la tolva de la partícula a través del extremo abierto.
      Nota: La cantidad de nanopartículas de cobre pesadas será la masa base concentración administrada.
    3. Coloque 3" ½" tubo de diámetro exterior (OD) alrededor de la tubería de 2" y el lugar un HEPA Filtro interior de este tubo corto que la dirección del flujo es a través de la válvula de bola.
    4. Conecte el generador de vacío a otra válvula de bola con rosca. Conecte el generador de vacío al tanque de aire colocando un tubo 5/16" OD en la conexión de la cerradura del empuje. Use ¼" OD de tubería para conectar la salida del generador de vacío para el montaje experimental mediante la colocación de la tubería sobre la salida del generador de vacío.
  2. Uso del sistema de aerosol seco para generar aerosol seco
    1. Abrir el tanque de aire girando la válvula principal y permitir el flujo de aire al sistema. Abra la válvula en el regulador de flujo en el tanque de aire y establecer de forma que el flujo a través del sistema es equivalente a la configuración deseada de la bomba de vacío.
    2. La válvula de bola más cercana al filtro HEPA y abra la válvula de bola más cercana al generador de vacío. Mantener estas abierto para aproximadamente 3 s para permitir que las partículas se tiró en la corriente de aire.
    3. Cierre la válvula de bola más cercana para generador de vacío y luego cierre la válvula de bola más cercana al filtro HEPA. Permitir que el aire desde el tanque de flujo para la duración del experimento según sea necesario.
    4. Cerrar las válvulas principal y regulador en el tanque de aire para detener el flujo. Limpia las válvulas de bola y generador de vacío con etanol al 70%. Tubos de metal de autoclave para la esterilización.

3. deposición eficiencia medición PIVEC

Nota: Los operadores deben realizar exposiciones de aerosol en una campana de humos.

  1. Medir la deposición por recoger los aerosoles de nanopartículas de cobre generado en el paso 2.2 de un filtro previamente tarado. Utilizar la dosis depositada, con la masa recogida en el filtro y la dosis administrada, con la cantidad de partículas de cobre pesadas, para determinar la eficiencia de deposición.
    1. Mantener filtros fibra vidrio 1,00 μm de poro bajo condiciones de baja humedad, descritos en 1.1.2, durante al menos 24 h antes de las medidas pre-exposición. Pesar un filtro sin usar tres veces y registrar los pesos de los filtros. Introduzca el lugar del filtro sin usar en un cultivo celular.
    2. Elegir el celular adecuado cultura insertar adaptador (bueno 6 o bien 24) para PIVEC apoyar la inserción de la cultura de célula con el filtro. Lugar cultivo celular Inserte adaptador en la parte superior de la base de PIVEC, puesta en lugar tal que la base de la pieza de adaptador es más ancha que la parte superior.
    3. Pinzas de uso para cultivo celular de filtro cargado Inserte dentro de pieza del adaptador. Coloque la pieza superior sobre la pieza de adaptador, colocar en su lugar que la base de la pieza superior es más ancha que la parte superior. Envuelva PIVEC con una sola capa de cinta adhesiva.
    4. Conectar piezas de cassette de 37 mm en la parte superior e inferior de PIVEC empujándolo a su lugar. Coloque un ¼" púas adaptadores de salida y entrada de cassette.
    5. Envuelva el calentador resistivo alrededor PIVEC tal que los cables están en la base. Cinta para asegurar.
    6. Envuelva PIVEC con 8 rondas de papel de aluminio para aislamiento. Asegure con cinta.
    7. Conectar 2" pedazo largo de 1/2" diámetro exterior tubería flexible para el adaptador en la parte superior PIVEC. Quite la tubería porosa del lugar dentro de la tubería en la parte superior PIVEC y agua estéril.
    8. PIVEC de lugar dentro de la abrazadera en el soporte de anillo y seguro. Montaje completo con bomba de vacío, contadores de partículas y configuración de aerosol.
      Nota: Se puede determinar la dosis depositada basados en número sólo si los contadores de partículas se colocan antes el PIVEC y después PIVEC en carreras separadas.
    9. Exponer los filtros usando paso 2.2 del protocolo y deseado de las tasas de flujo y tiempo de exposición, en este estudio que se utilizó un tiempo de exposición de 10 min a 0,5 LPM. Quitar PIVEC de la instalación. Saque el inserto de la cultura de célula y el filtro expuesto en soporte del filtro en condiciones de baja humedad durante al menos 24 h antes de las mediciones.
    10. PIVEC limpia con etanol al 70%. Esterilización con luz ultravioleta por lo menos 30 minutos antes del siguiente experimento.
    11. Pesar el filtro expuesto tres veces y registrar los pesos de los filtros. Coloque el filtro expuesto en un portafiltros etiquetados para el almacenamiento.

4. cálculo de la dosis depositada y la eficiencia de deposición

Nota: El conocimiento de la deposición es importante para administración de aerosol y la interpretación de la respuesta celular.

  1. Calcular la deposición de medidas basadas en la masa
    1. Calcule la masa depositada en los filtros como la diferencia entre el peso promedio antes de la exposición y el peso promedio posterior a la exposición. Este valor es la dosis depositada en base masa para el experimento.
    2. Uso administrado masa, madmin, y masas depositaron dosis determinada en 4.1.1, mdep, para calcular la eficiencia de deposición basado en la masa, ηm, para el experimento.
      Equation
    3. Valores promedio del 4.1.1 y 4.1.2 para por lo menos 3 experimentos determinar la deposición y la eficiencia de deposición para PIVEC de tamaño de partícula.
  2. Calcular la deposición de medidas basadas en el número
    1. Asegurar que se han realizado mediciones con contadores de partículas con contadores después la PIVEC y para determinar la concentración de partículas antes de la PIVEC. Integrar la concentración de partículas en el tiempo para el contador de la partícula entonces integrar sobre el diámetro de la partícula para determinar el total de partículas medidas.
    2. Calcular el número de la partícula depositada como la diferencia entre las partículas administradas y el post-PIVEC de partículas medidas. Este valor es la dosis depositada número-basado para el experimento.
    3. Uso administrado las partículas, nadmin, basado en el número depositadas dosis, ndep, flujo volumétrico, V y el tiempo, t, para calcular la eficacia de deposición basada en número, ηn, para el experimento.
      Equation
    4. Valores promedio de 4.2.2 y 4.2.3 para por lo menos 3 experimentos determinar la deposición y la eficiencia de deposición para PIVEC de tamaño de partícula.

5. aerosol exposición de las células

Nota: Para la célula cultura en la interfase aire-líquido al lector se denomina blanco et al. 38 los operadores deben realizar inserción de cultura celular carga (medidas 5.1.2-5.1.4) dentro de un gabinete de bioseguridad. Los operadores deben realizar exposiciones de aerosol en una campana de humos.

  1. Células en cultivo en la interfase aire-líquido
    1. Levantar las células A549 frasco de cultivo mediante la adición de tripsina-EDTA 3 mL para un frasco de T75 o 1 mL para un frasco de T25 e incubar 5 min a 37 ° C. Agregar 7 mL de medio completo para un matraz T75 o 4 mL de medio completo para que un T25 frasco a frasco y enjuague frasco pared con suspensión maximizar el número de células recuperadas. Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL estéril y centrifugar las células a 800 x g durante 3 minutos.
    2. Retire el sobrenadante que contiene tripsina-EDTA y resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio completo. Extraiga 10 μl de suspensión celular y añadir al hemocitómetro. Contar las células utilizando un hemocitómetro para determinar la concentración y el número total de células.
    3. Colocar 0,5 mL de medio completo para cada bien dentro de una placa bien 24. Lugar sin usar de la célula cultura insertos en los pozos. Cultivo de células de la semilla se inserta en el lado apical en una densidad de célula cerca de 1 x 105 células/cm2 para los tipos de células que crecen a un ritmo cerca de duplicar por día. A semilla A549 células dentro de 24 bien insertar, insertar células de semilla con una densidad de 1 x 105 células/cm2 agregando 35.000 células al cultivo celular.
      Nota: Las células con una tasa de crecimiento más lenta pueden ser sembradas a una densidad creciente de la célula.
    4. Añadir media completa en el lado apical de la célula cultura inserto para alcanzar el volumen final (para 24 volumen final del pozo de la placa es 0.25 mL).
    5. Cultura para 7 días en condiciones sumergidas, reemplazando a los medios de comunicación cada 1-2 días. Después de 7 días, retire la media apical y la cultura para al menos 1 día en condiciones de ALI, reemplazar sólo los medios de comunicación basolateral.
  2. Montar PIVEC
    1. Permitir que las células alcancen la interfaz aire-líquido durante al menos 24 h antes de la exposición.
    2. Elegir celda apropiada cultura Inserte adaptador para PIVEC apoyar la inserción de la cultura de célula con el filtro. Cultivo de células de lugar Inserte adaptador encima PIVEC base, puesta en lugar tal que la base de la pieza de adaptador es más ancha que la parte superior. Añadir 4 mL de medio de cultivo celular para el bien de la base de la PIVEC.
    3. Pinzas de uso para el cultivo celular insertar dentro pieza adaptador colocado en el paso 5.2.3. Coloque la pieza superior sobre la pieza de adaptador, colocar en su lugar que la base de la pieza superior es más ancha que la parte superior. Cuidadosamente Envuelva PIVEC con una sola capa de cinta adhesiva.
    4. Conectar piezas de cassette de 37 mm en la parte superior e inferior de PIVEC, empujándolo a su lugar. Coloque un ¼" púas adaptadores de salida y entrada de cassette.
    5. Envuelva el calentador resistivo alrededor PIVEC tal que los cables están en la base. Cinta para asegurar.
    6. Envuelva PIVEC con 8 rondas de papel de aluminio para aislamiento. Asegure con cinta.
    7. Conectarse el adaptador en la parte superior PIVEC a pedazo corto de tubería flexible de 1/2" de diámetro exterior. Quite la tubería porosa del lugar dentro de la tubería en la parte superior PIVEC y agua estéril.
    8. PIVEC de lugar dentro de la abrazadera en el soporte de anillo y seguro. Completar la instalación con la bomba de vacío y el ajuste de aerosol.
  3. Exponer las células a ALI con el PIVEC
    1. Eficiencia de deposición determinada en el paso 2 del uso para calcular la masa de las partículas a ser aerosolized. Pesar la masa adecuada y añadir al sistema de aerosol siguiente paso 2 dentro de la campana.
    2. Exponer las células siguiendo el paso 2.2, en este estudio de criterios de valoración biológicos las células fueron expuestas a aproximadamente 3,5 mg de nanopartículas de cobre con un caudal de 0,5 LPM y una duración de exposición de 10 minutos estudios de Control realizados utiliza aire humidificado para determinar la influencia del aire solamente. Quitar PIVEC de la instalación. Saque el inserto de la cultura de célula, colocar en la placa de la pozo estéril y vuelva a la incubadora de CO2 (37 ° C, 5% CO2, 90% HR).
    3. Medios de comunicación de PIVEC de aspirar. Si realizar experimentos adicionales, Fondo de enjuague de PIVEC con fosfato tamponada con solución a continuación, repita el paso 5.1 y 5.2.
    4. PIVEC limpia con etanol al 70% cuando haya terminado. Esterilización con luz ultravioleta por lo menos 30 minutos antes del siguiente experimento.
  4. Procedimientos de ensayo biológico
    Nota: Ensayos realizados en este estudio fueron la generación de estrés oxidativo mediante el ensayo de DCFH-DA y la citotoxicidad a través de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).
    1. Disolver 24,4 mg de DCFH-DA en 50 mL de metanol a 1 mM DCFH-DA solución. Esta solución puede conservarse a-20 ° C hasta 4 meses. Diluir 1 mM solución DCFH-DA mediante la mezcla de 0,1 mL de 1 mM DCFH-DA solución con 9,9 mL HBSS para realizar 10 mL de 10 μm DCFH-DA.
    2. Quite la célula medios de cultivo y lavado celular cultura inserto con aproximadamente 1 mL de PBS. Añadir 0,5 mL de 10 μm DCFH-DA solución a cada pocillo, sustitución de insertos cuando haya terminado. Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la fotoactivación de colorante y volver a incubadora de 37° C durante 1 hora.
    3. Eliminar las células de la incubadora y aspirar la solución de trabajo DCFH-DA de los pozos. Añadir 0.5 mL HBSS a pozos y reemplazar la célula cultura insertos.
    4. La placa de la pozo de carga en placa lector y medida basal de la fluorescencia usando longitudes de onda de excitación/emisión de 485/530 nm. Retire la placa placa lector y carga insertar en PIVEC para exposición.
    5. Exponer a las células para la duración de la exposición deseada. Quitar relleno del PIVEC y regresar a la placa de la pozo. Quitar 50 μl del líquido basolateral del placa de la pozo y en la placa bien blanco 96. Medir la fluorescencia de DCF usando longitudes de onda de excitación/emisión de 485/530 nm cada 30 min posterior a la exposición durante 2 h.
    6. Que basolateral líquido alcancen la temperatura ambiente durante 20-30 minutos añadir 50 μl de solución de ensayo LDH mezcla siguiente protocolo del fabricante, a basolateral el fluido de la placa de la pozo y dejar reaccionar durante 10 minutos añadir 25 μl de solución de parada a. Leer la fluorescencia de resorufin producto, utilizando longitudes de onda de excitación/emisión de 560/590 nm.
    7. Extraer el líquido adicional basolateral y repita paso 5.4.6 en 4 h y 24 h post-exposición.

6 métodos estadísticos

  1. Análisis de los datos de ensayo biológico
    1. Informe producción de ROS como el aumento de la intensidad de fluorescencia de células tratadas con respecto a las mediciones de línea base. Informe de actividad LDH como el aumento de la intensidad de fluorescencia de células tratadas con respecto a las células no tratadas.
    2. Realizar solo factor ANOVA para determinar diferencias estadísticas entre los conjuntos de datos. En su caso, realizar estudiante t-pruebas en un valor de significación de 0.05. Informe datos como la media ± desviación estándar de al menos tres mediciones de la exposición.

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Representative Results

Toxicología ocupacional en vitro implica mantener la viabilidad celular mientras realiza la exposición de aerosoles. El sistema PIVEC se muestra en la figura 2, incluyendo la temperatura y control de humedad y la PIVEC desgastada. La temperatura se mantuvo utilizando un calentador resistivo pilas y aerosol humidificado con mayor humectación natural a través de un tubo poroso, húmedo. En un aerosol controlado ajuste dentro de un laboratorio, el PIVEC puede ser instalado para la exposición que se muestra en la figura 1. Caracterización del sistema permite la determinación de la dosis depositada en las células que luego puede ser correlacionada con la respuesta celular.

La eficiencia de deposición es dependiente en el tamaño de las partículas agregado al sistema ya que las fuerzas de deposición incluyen impactación, sedimentación y difusión. Además, la deposición es dependiente en la tasa de flujo, tiempo de exposición y las características de la exposición. Con esta información, se puede predecir la deposición. La eficiencia de deposición de la PIVEC ha determinado a través de dos métodos de Análisis gravimétrico y conteo del número de partículas. Las ecuaciones 1 y 2 fueron utilizadas para determinar la eficiencia de deposición en la tabla 1 utilizando el filtro de base, análisis sizer de la partícula de movilidad (SMPS) y medidas de partículas óptico sizer (OPS), figura 3. Depósito creciente se observa en general para el 24 bien diseño de 6 bien diseño y disminuye ligeramente para 100 nm en comparación con 40 nm y 800 nm cobre partículas. La deposición en los 24 pozos es muy uniforme sobre el inserto, sin embargo, la deposición en la diseño del pozo 6 carece de uniformidad como la mayor parte del depósito de las partículas cerca del centro del inserto. Análisis posterior a la exposición pueden ser acelerada mediante la determinación de la relación de dosis entre el filtro de 37 mm y el inserto de cultura celular, disminuyendo la necesidad de determinar la dosis después de la exposición celular. Comparación de la deposición dentro del cartucho de filtro de 37 mm y el PIVEC muestra una fuerte correlación de todos los tamaños y pozos con una correlación de Pearson de por encima de 0,7, sin embargo solamente para 800 nm es la correlación significativa con una p < 0.05, vea la figura 4. En comparación con sistemas similares a lo largo de la literatura,11,12 la eficacia de deposición de la PIVEC sobre la gama de tamaños de partícula probado es comparable o mayor sobre reportaron valores, observados en la figura 5. La eficiencia de deposición en el PIVEC puede mejorarse a través de minimizar las pérdidas en el sistema utilizando electrostático disipativo o conductora plástico o material similar para diseñar el PIVEC.

Si los filtros no se secan bien en un ambiente controlado de humedad antes de la exposición, el exceso de agua incrementa la masa inicial y puede producir dosis depositadas no físico, negativo. Caudal variable puede también promover inconsistentes dosis depositadas en el sistema. Para evitar estos problemas, deje al menos un día antes y después de la exposición para los filtros se sequen en un ambiente de humedad controlada.

Respuestas celulares se verán afectadas por la dosis depositada y pueden verse afectadas por la duración de la exposición si las células no se mantienen correctamente. Las células A549, una línea celular de carcinoma epitelial alveolar, fueron expuestas durante 10 min para diferentes tamaños de nanopartículas de cobre con un caudal de 0,5 LPM. Alternativa perpendicular flujo uso de sistemas de exposición entre 0,005 LPM y 1,5 LPM durante un período de exposición sostenida mientras que este método utiliza un caudal moderado durante una exposición rápida. Usando la eficiencia de deposición base medido y había administrado dosis, 1.58 ± 0,04 mg/cm2 de cobre de 40 nm, 0.30 ± 0.00 mg/cm2 de 100 partículas de cobre nm, y 0,32 ± 0.01 mg/cm2 de partículas de cobre nm 800 se deposita en las células. Dentro de la primeras veinticuatro horas posterior a la exposición se observan citotoxicidad y estrés oxidativo. La citotoxicidad se midió mediante la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de las células dañadas inmediatamente, 4 horas y después de 24 horas de exposición. No había ninguna toxicidad significativa de nanopartículas de cobre por debajo de 1,62 mg/cm2 a 4 horas de exposición, figura 6b. Veinticuatro horas posterior a la exposición allí era una disminución estadísticamente significativa en la viabilidad celular de menos de 20% la viabilidad de las células expuestas a nanopartículas de cobre. El estrés oxidativo intracelular fue investigado usando el ensayo DCFH-DA a través de la oxidación de DCFH por especies reactivas de oxígeno dentro de la primeras dos horas posterior a la exposición, Figura 6a. Se midieron niveles significativos de estrés oxidativo en post exposición de treinta minutos para que las células expuestas a nanopartículas de cobre de todos los tamaños. El nivel de estrés oxidativo continuó aumentando a tasas similares para todos los tamaños probados en las dos horas observadas.

Éxito de las exposiciones puede ser determinado a través de la repetibilidad de la respuesta celular. Dos criterios de aceptación propusieron para los ensayos de citotoxicidad son: 1) la salida % LDH total para el control positivo debe ser mayor a 50% y 2) el coeficiente replicar positivo y muestra de las variaciones debe estar dentro de 50%. 39 si estos criterios no se reunió, este sugiere diferencias entre experimentos, tales como cantidades de deposición alterada o mal control de la humedad o temperatura. Además, observando las medidas de la citotoxicidad puede conducir a la comprensión de los controles experimentales y ayuda en la determinación del error. Cuando el caudal es demasiado alto, las células pueden morir por altas cantidades de tensión de esquileo. Al reducir la tasa de flujo, puede reducirse el estrés en las células de la corriente.

Figure 1
Figura 1. Esquema de instalación y sistema seco dispersión Experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. PIVEC diseño. A) diseño completo en la foto con la caja alta de 30 cm para la comparación. B) PIVEC con Control de temperatura y humedad en la foto con 30 cm Tall Box para la comparación. C) PIVEC gastada. D) PIVEC pieza superior. E) de la célula cultura adaptador para 24 bien (izquierda) y pozo 6 (derecha). F) inferior de cierre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Número base eficiencia deposición (%) Masa base eficiencia deposición (%)
6 bien 40 nm 17.83 ± 32.13 5.85 ± 0.85
100 nm 0.47 ± 4.06 5.11 ± 0.94
800 nm 3.70 ± 35.00 6.39 ± 1.01
24 bien 40 nm 1.43 ± 2.43 12.61 ± 1.34
100 nm 1.37 ± 19.45 2.95 ± 0.75
800 nm 6,98 ± 3.93 15.95 ± 0.53

Tabla 1. Eficiencia de deposición PIVEC.

Figure 3
Figura 3. La concentración de número de partículas de aerosoles de nanopartículas de cobre. A) medición SMPS. B) medida OPS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Relación entre deposición en el parte movible de la célula y el filtro de 37 mm SKC. Error ± 0,002 mg. A) partículas de cobre nm 40. B) partículas de cobre nm 100. C) partículas de cobre nm 800. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Eficiencia de deposición de PIVEC comparado con sistemas de exposición de flujo Perpendicular en la literatura. Valores de la literatura de sistemas de exposición de flujo Perpendicular se trazan en los marcadores sólidos y PIVEC valores en marcadores vacíos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Respuesta celular a las nanopartículas posterior a la exposición (PE) de cobre. Para todas las mediciones, números = 3 y p < 0.05. A) oxidativo determinado utilizando el ensayo de DCFH-DA. B) determinada mediante el ensayo de LDH de citotoxicidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Cartuchos del filtro proporcionan un método simple y económico de la recogida de aerosoles en la zona de respiración; sin embargo, muestras de aerosol extraídas de los filtros representan la entera del aerosol (es decir, gases volátiles y partículas) y por lo tanto limitar la evaluación de efectos biológicos relacionados. Utilizando el diseño inicial del cartucho de filtro de 37 mm, el PIVEC está diseñado para mantener la portabilidad y mímico en vivo la deposición de partículas de la inhalación. El PIVEC es significativamente menor que los actuales sistemas de exposición ALI, aproximadamente del tamaño de una caja de tejido con control de temperatura y humedad incluido. El tamaño es similar a los impactadores de cascada personal ofreciendo además datos sobre la respuesta celular a los aerosoles. Mientras que el PIVEC contiene espacio para una muestra en comparación con otros sistemas de exposición actuales, el tamaño pequeño permite múltiples sistemas que se utilizarán al mismo tiempo, por lo tanto, aumentando el tamaño de la muestra y teniendo en cuenta la distribución espacial que se monitorea.

Hay varios pasos críticos en el protocolo. Para determinar la eficiencia de deposición, es crítica para acondicionar adecuadamente los filtros, como se describe en el paso 1. Además, es importante sopesar adecuadamente las nanopartículas de cobre antes de la exposición y la exposición de post filtro para determinar la eficiencia de deposición basado en la masa. La eficiencia de deposición número deberá determinarse mediante la diferencia en la deposición entre la concentración inicial de aerosol y concentración final determinada los contadores de partículas. Si no se determina correctamente la eficacia de deposición, es difícil determinar las diferencias de respuesta entre tipos de aerosol. Modificaciones a la deposición incluyen alteración de la deposición. Depósito se puede aumentar cambiando la duración de exposición y tasa de flujo. Esto también puede influir en la viabilidad de las células con el potencial de la desecación de las células. El acondicionamiento de aerosoles se realiza a menudo para compensar los atributos fisiológicos como la temperatura corporal y humidificación de las vías respiratorias. Aumento de la humedad, más del 50%, imita el aire inhalado y disminuye la muerte celular debido a la exposición de vehículos. 43 cuando temperatura y humedad no están bien controlados, la respuesta celular puede ser influenciada. Al disminuir el caudal, depositará partículas adicionales de todos los tamaños, aumentando la deposición. Duración de la exposición es proporcional a la deposición, permitiendo que las partículas más depositar durante un largo período experimental. Acondicionado del aerosol es importante al aumentar la duración de la exposición para que las células no seque que pueden afectar a las respuestas biológicas.

El PIVEC utiliza flujo perpendicular a depositar las partículas mediante impactación, sedimentación y difusión en las células que tienen el potencial a las células a través del flujo y añadir estrés en las células. La eficiencia de deposición es dependiente en el tamaño de la partícula debido a las fuerzas de la deposición. Muchos de los actuales sistemas de exposición, con flujo perpendicular tienen una eficiencia de deposición de por debajo de 10% y mucho más cerca de 1%. El PIVEC tiene una eficiencia de deposición determinada por Análisis gravimétrico de 3% a 16% para 24 bien insertar la cultura de la célula. La eficiencia de deposición basada en el número de partículas es aproximadamente del 1% al 7% para el mismo inserto. Al usar un 6 bien insertos para cultivo celular, estas cifras disminuyen, excepto el tamaño de partícula más pequeño, debido a la racionalización del aerosol, como partículas más están confinadas en la inserción de la cultura de célula sin espacio para el flujo a desarrollar. Los insertos de cultura celular bien 6 permitan las corrientes de aerosol a la deposición de derivación. Otros sistemas de flujo perpendicular se han caracterizado de forma masiva utilizando 60 nm fluoresceína partículas40, 80 nm y 180 nm cobre partículas16y 60 nm adípico ácido partículas41. Las eficiencias de deposición resultante generalmente son entre 0.05% y 11%. Basándose en los números, estos sistemas se han caracterizado utilizando partículas de poliestireno de12,15, las nanopartículas de carbono12y sílice partículas42, rindiendo eficacias entre 0,2% y el 11%. El PIVEC proporciona, deposición similar o mayor, en comparación con los dispositivos disponibles de exposición celular.

Exposiciones de célula fueron realizadas usando nanopartículas de cobre de 40 nanómetros, 100 nm y 800 nm. Viabilidad celular fue definido usando el análisis LDH con ninguna disminución significativa de viabilidad dentro de la exposición de cuatro horas. El análisis LDH se utiliza con un sistema de exposición comercial 74 ng/cm2 después de 2 horas y 148 ng/cm2 después de 4 horas de 9,2 de partículas de óxido de cobre nm44 y 1 μg/cm2 depositado después de una exposición secuencial 4 horas, incubación de 2 horas, y luego otra exposición durante 4 horas de de las partículas de óxido de cobre nm 2540, ambos miden una disminución significativa en la viabilidad celular. La citotoxicidad se observó en otro sistema para 7.6 1.6 μg/cm2 de 180 partículas nm medidos de nanopartículas de cobre16 por exclusión de colorante azul de trypan. Exposiciones de 15 minutos a nanopartículas de óxido de cobre nm 40-80 disminución de viabilidad, mide 24 horas post exposición. La toxicidad más baja observada utilizando el PIVEC fue probablemente debido al más corto tiempo de exposición de 10 minutos y tiempos más cortos de medición de la exposición del mensaje. Después de la exposición después de cuatro horas, viabilidad de las células expuestas en el PIVEC disminuido. Las células se exponen al aire húmedo controles no observados citotoxicidad significativa, de acuerdo con otros estudios 9,40,44,45,46. El estrés oxidativo se determinó mediante el ensayo de DCFH-DA. La producción de especies reactivas del oxígeno, tales como el peróxido de hidrógeno o radicales de oxígeno, genera una cantidad de estrés que puede conducir a la muerte de detención o célula de crecimiento. Después de la exposición de la célula, hubo un aumento mínimo en el estrés oxidativo en la incubadora como control de células y células está expuestas al aire húmedo. Elevado estrés oxidativo producido para todos los tamaños de partícula, aumento en la exposición de 30 minutos. En un estudio, 9.2 de las partículas de óxido de cobre nm44 y partículas de óxido de cobre de 25 nm40 también inducida por el estrés oxidativo, medido mediante el ensayo de carboxi-DCFH-DA. Tiempo de exposición mayor de 2 horas a elevado estrés oxidativo 4 horas 9.2 de las partículas de óxido de cobre nm44. Después de cuatro horas de exposición, las partículas de óxido de cobre nm 9,2 producción una respuesta oxidativa similar como la exposición secuencial de 25 nm cobre óxido partículas40, lo que sugiere que la exposición duración tiene una influencia mayor sobre la respuesta de estrés oxidativo que el tamaño de las partículas. Las células expuestas dentro de la PIVEC producen estrés oxidativo elevado en comparación con el estudio, sin embargo, las partículas en el sistema alternativo son óxido de cobre y se disolverán menos rápidamente que el cobre expuesto dentro la PIVEC. Estudios realizados en la disolución del cobre basado en la composición y tamaño de las partículas de acuerdo en que las partículas más grandes y los óxidos de metal liberan iones más lentos que las partículas del metal o sus contrapartes de nanopartículas16,47 , 48 , 49 como los controles de aire húmedo no produjeron cantidades significativas de estrés oxidativo en comparación con el control de la incubadora, la influencia de las partículas de cobre para inducir el estrés oxidativo es consistente dentro de la PIVEC similares en vitro exposición sistemas. Las respuestas biológicas observadas utilizando el PIVEC sugieren que el PIVEC es un sistema apropiado para la exposición celular.

Aunque la caracterización y estudios celulares de la PIVEC de acuerdo con la literatura,9,16,40,44,46 el dispositivo tiene limitaciones. El diseño pequeño disminuye el número de muestras que pueden estar expuestos simultáneamente en un solo dispositivo en comparación con otros sistemas de exposición. Otros sistemas permiten al menos tres exposiciones celulares al mismo aerosol9,12 facilitando las mediciones replicadas. Aunque el PIVEC sólo permite uno insertar por sistema, el tamaño pequeño permite múltiples sistemas para usarse fácilmente, ayudando a mitigar este problema. Mientras que otros sistemas de monitoreo personales no utilizan las células, el PIVEC debe guardarse cerca de vertical para reducir el derrame de los medios de cultivo celular necesario para preservar la viabilidad celular. Aunque el PIVEC todavía no ha sido optimizado para rangos específicos de partículas (PM10, PM2.5, PM0.1), el PIVEC se ha caracterizado por una gama de tamaños de partícula. Similar a otros sistemas de flujo perpendicular, la PIVEC muestra una disminución de la capacidad para depositar las partículas cerca de 100 nm de diámetro, mientras que 40 nm y 800 partículas nm depositadas con similar eficacia.

Se facilite el análisis de la exposición de las células mediante la realización de una colección paralela de aerosoles dentro de la PIVEC y un casete de filtro SKC 37 mm. Una alta correlación de deposición base gravimétrica permite la estimación de la masa de la partícula recogida en las celdas de los datos recogidos mediante filtros de 37 mm. Comparación del inserto el cartucho de filtro reduce la necesidad de recoger muestras adicionales y medidas adicionales para determinar la dosis. Trabajo en curso incluye la integración de un sistema de monitoreo en tiempo real para citotoxicidad, estrés oxidativo u otros puntos finales biológicos. El tamaño pequeño de la PIVEC permite que sea utilizado en una variedad de entornos, como en el cuerpo como un monitor personal, en un zumbido por encima de una planta química, o en el entorno de resolución espacial. Este método ha demostrado el uso de la PIVEC para la colección de partículas de aerosol en cultivos de células cultivadas en el ALI. Por acondicionado el aerosol a 37 ± 1 ° C y > 80% de humedad relativa, se puede mantener viabilidad celular durante la exposición aguda. Este método es apropiado para la gota líquida y sólidas basada en partículas aerosoles y se ha demostrado para depositar partículas entre 40 nm y 800 nm en célula cultura insertos. La versatilidad de la PIVEC permite este método ser utilizado en varios ambientes con una gran variedad de criterios de valoración biológicos.

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Disclosures

La afiliación de los autores es como se muestra en la portada. Los autores son apoyados financieramente por Virginia Commonwealth University, donde el trabajo fue terminado en Richmond, Virginia. Los autores tienen la responsabilidad de la escritura y el contenido de este documento. Los autores declaran que no hay ningún intereses en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Boris Solomonov y la tienda de máquina de innovación de Virginia Commonwealth para ayuda con el prototipado rápido el dispositivo. Los autores también desean agradecer a Cristian Romero-Fuentes del grupo Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov y el Virginia Commonwealth nanomateriales caracterización instalaciones centrales para su ayuda con la caracterización de partículas. Este trabajo fue apoyado por fondos de arranque a Dr. Lewinski por la Facultad de ingeniería en Virginia Commonwealth University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

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