Una nuovo portatile In Vitro l'esposizione Cassette per il campionamento di Aerosol

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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire le esposizioni portatile cellulare aerosol e misurare la risposta cellulare. Il metodo utilizza cellule, coltivate all'interfaccia aria-liquido, che imita in vivo fisiologia. Risposta cellulare agli aerosol di rame delle nanoparticelle è stato osservato come lo stress ossidativo attraverso la generazione di specie reattive dell'ossigeno e citotossicità come rilascio del lattato deidrogenasi.

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Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

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Abstract

Questo protocollo introduce un nuovo in vitro l'esposizione sistema, capace di essere indossati, compresa la caratterizzazione e la performance. Sistemi di esposizione in vitro interfaccia aria-liquido (ALI) sono spesso grandi e ingombranti, rendendo il trasporto al campo e funzionamento alla sorgente di emissione o all'interno della zona di respirazione difficile. Attraverso la miniaturizzazione di questi sistemi, il laboratorio può essere portato al campo, accelerando il tempo di elaborazione e che forniscono un metodo più appropriato di esposizione che non altera l'aerosol prima di contattare le cellule. Il portatile In vitro l'esposizione Cassette (PIVEC) si adatta una cassetta filtro 37mm per consentire per la tossicità in vitro test di fuori di un ambiente di laboratorio tradizionale. Il PIVEC è stato caratterizzato utilizzando tre dimensioni delle nanoparticelle rame per determinare l'efficienza di deposizione basata su gravimetrico e numero analisi della concentrazione delle particelle. Citotossicità iniziali esperimenti sono stati eseguiti con cellule del polmone esposte per determinare la capacità del sistema di depositare particelle mantenendo attuabilità delle cellule. Il PIVEC fornisce un'efficienza di deposizione simile o maggiore quando si confrontano dispositivi di flusso perpendicolare disponibile in vitro l'esposizione. Nonostante il basso rendimento del campione, le piccole dimensioni dà alcuni vantaggi per la corrente in vitro ALI sistemi di esposizione. Questi includono la capacità di essere indossati per il monitoraggio personale, mobilità dal laboratorio per la fonte di emissione e la possibilità di set-up più sistemi per risoluzione spaziale mantenendo un utente più basso costano. Il PIVEC è un sistema in grado di raccogliere aerosol nel campo e all'interno della zona di respirazione su un modello di aria-interfacciato, in vitro .

Introduction

Campionamento personale utilizzando tecniche in vitro potrebbe fornire informazioni complete per quanto riguarda gli effetti biologici degli aerosol sul posto di lavoro. 1 esposizioni agli agenti inquinanti nell'aria comprendono esposizioni alla sostanza chimica stessa, per i campioni di aria raccolti, sommerso in condizioni dove il gas viene introdotto alla sospensione di cellule, le esposizioni intermittenti usando un dispositivo come un rocker, o diretto esposizioni all'interfaccia aria-liquido (ALI). 2 molte di queste tecniche vengono eseguite con le cellule che crescono in sospensione o il prelievo di campioni prima dell'esposizione, ognuno dei quali può influenzare lo studio tossicologico a causa di potenziali cambiamenti l'aerosol. 3 per evitare questi cambiamenti, il laboratorio può essere portato al campo utilizzando diversi in vitro sistemi di esposizione di cultura ALI che sono utilizzati nella letteratura,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 tuttavia, pochi sono disponibili in commercio. 8 , 9 , 12 questi sistemi sono spesso ingombranti, soprattutto quando compresi gli strumenti per regolare la temperatura e l'umidità dell'ambiente cellulare e la portata dell'aerosol del campione. Utilizzando il PIVEC, esposizioni di aerosol possono essere eseguite di fuori di un ambiente di laboratorio tradizionale o all'interno della zona di respirazione mentre che imita condizioni di inalazione.

La determinazione di aerosol deposizione in vitro è importante per l'indagine degli effetti sulla salute a causa di inalazione. La zona di respirazione, l'area all'interno di 30 cm dalla bocca e dal naso,14 è fondamentale per comprendere l'esposizione alle nanoparticelle e collegamento agli effetti biologici nei polmoni. 2 spesso, la deposizione sulle cellule è definita come un efficienza di deposizione, le particelle depositate sul e preso dalle cellule divise per le particelle somministrate al sistema6,15 o su una base di massa degli importi stessi. 4 , 16 i metodi correnti per aerosol nella zona di respirazione di misurazione sono filtro basato, catturando particelle su un periodo di campionamento specificato e utilizzando i filtri di condurre ulteriori test. 17 monitoraggio personale richiede un piccolo sistema che viene fornito con il compromesso di meno campioni.

Ci sono molti approcci per determinare gli effetti sulla salute da esposizione ad un aerosol. Il modello di ALI consente per l'aerosol deve essere somministrato direttamente alle cellule attraverso l'aria come in uno scenario di esposizione reale, ma è più conveniente e meno tempo intensivo che in vivo studi mentre che imita le barriere di aria-liquido ad esempio gli occhi, pelle e polmoni. Le cellule del polmone cresciute presso le ALI hanno la capacità di generare un strato di sbarramento polarizzato,18,19 che produce tratti fisiologici che assomigliano in vivo epitelio polmonare, compresa la produzione di muco e di agente tensioattivo in specifici linee cellulari bronchiali o alveolare, ciglia battendo,19 giunzioni strette, polarizzazione delle cellule e20 19,. 18 cambiamenti come questi possono influenzare la risposta cellulare misurata negli studi di tossicità. 21 inoltre, ALI in vitro modello risultati sono spesso più sensibile di cellule esposti via sospensione modelli22 e sono in grado di tossicità da inalazione acuta in vivo modello. 23 , 24 di conseguenza, un sistema di esposizione di ALI che è in grado di eseguire misure all'interno della zona di respirazione è un passaggio naturale.

Esponendo le cellule ad aerosol direttamente alla sorgente di emissione, indagine degli effetti di tutti i gas, composti semi-volatili e particelle coinvolte nella miscela si verifica. Quando la miscela viene raccolto su un filtro, i gas e composti volatili non vengono acquisiti e la miscela intera non può essere studiata. Inoltre, la ricostituzione delle particelle in una polvere o una sospensione liquida può portare all'aggregazione o interazioni particella-fluido, come dissoluzione, in sospensione liquida. 25 , 26 quando le particelle dell'aerosol sono aggiunto al liquido, c'è un maggiore potenziale per agglomerazione,25,27 formazione di una corona di proteina,28 o interazione con i composti nel liquido, che può influenzare la deposizione e influenzare la risposta biologica. 29 , 30

Esposizione presso le ALI si basa su tre principali aerosol profili, nube sedimentazione, parallelo flusso e flusso perpendicolare. Cloud di sedimentazione, utilizzato da aria-liquido Interfaccia cella esposizione (ALICE),4 è un sistema batch dove depositare i particelle attraverso gravitazionale e diffusionale stabilirsi come l'aerosol viene trattato come una singola unità. Flusso parallelo, utilizzato dagli Aerosol elettrostatica in vitro Exposure System (gronda)5 e multicultura esposizione camera (MEC) II,6 consente di deposizione mediante l'aggiunta del moto browniano attraverso il profilo di flusso. Flusso perpendicolare, utilizzato da un microsprayer,7 camera del nebulizzatore Nano per tossicità In Vitro (NACIVT),11 e commerciale ALI sistemi8,9,10,12, aggiunge il compressione di particelle all'interno della regione di deposizione. Molti di questi sistemi di esposizione sono grandi e ingombranti, che richiedono sistemi in eccesso per aerosol pre-condizionamento, pompe per il flusso, o persino il riscaldamento alloggiamenti per l'incubazione delle cellule. Questa grande dimensione diminuisce la portabilità del sistema. Invece di campionamento direttamente alla sorgente di emissione, questi sistemi hanno spesso portati agli aerosol lab o modello generato per analisi di campioni. La complessità dell'aerosol emesso può essere perso nella traduzione dal campo al laboratorio. Il PIVEC è più piccolo rispetto ai sistemi attuali, con una superficie esterna di circa 460 cm2 e pesa solo 60 grammi, con controllo termico e umidità incorporato nel sistema consentendo un dispositivo altamente portatile. La dimensione ridotta e il peso consentono al sistema di essere indossati o adottate per la fonte di esposizione, permettendo il campionamento diretto.

Le grandi dimensioni degli attuali sistemi di esposizione diminuisce anche la capacità di eseguire il campionamento per studiare gradienti spaziale delle concentrazioni. Questa risoluzione è chiave effetti tossicologici di molte potenzialità ambientali e rischi professionali come scarico veicolare particolato materia o sul posto di lavoro attività per determinare dove si verifica la nebulizzazione. Immediatamente post-emissione, là si trasforma in una variazione spaziale nella concentrazione di particelle. Questo cresce con il tempo come le particelle disperdono in tutta l'atmosfera e questi effetti possono modificare sulla base delle condizioni ambientali, quali temperatura, pressione, vento e sole. Le particelle possono cominciare a età e ossidare pure una volta emesso31,32 e tassi di dispersione sono influenzati dalla topografia; concentrazioni più elevate si trovano nel Canyon e tunnel, dove gli effetti di dispersione sono rallentati, e concentrazioni più basse possono essere trovate dove c'è una grande area per dispersione. 33 questi cambiamenti nei tassi di dispersione possono avere effetti significativi sulla salute umana e possono essere visto quando confronta il numero di asmatici adulti che vivono in urbano contro in ambienti rurali. 34 mentre molti sistemi di esposizione forniscono campioni multipli in una sola volta, sistemi multipli sono necessari con un'abbondanza di grandi apparecchiature per eseguire la risoluzione spaziale.

Portando il laboratorio al campo, al momento dell'analisi può essere ridotta utilizzando l'intera cellula come un sensore. Seguendo gli endpoint e i meccanismi biologici noti può aiutare nella determinazione della composizione di aerosol e dimensione. A causa dei metodi di liquidazione lento, tra cui la clearance mucociliare, fagocitosi e traslocazione, queste particelle sono spesso interagendo con le cellule per circa giorni a settimane3 generazione di stress ossidativo, infiammazione e anche la morte delle cellule. Questi endpoint biologici possono essere i punti di partenza per le vie di risultato avverso per malattia cardiovascolare o malattia polmonare ostruttiva cronica. Inoltre, Wiemenn et al. eseguite una serie di saggi in vitro da confrontare con i valori della letteratura per la tossicità a breve termine in vivo per via inalatoria. 35 Risposta in vivo è stato previsto con due dei quattro risultati positivi dai test di citotossicità tramite rilascio di lattato deidrogenasi, stress ossidativo dalla formazione di perossido di idrogeno e riduzione di glutatione e rilascio e infiammazione potenziale da gene dell'alfa di fattore di necrosi tumorale. Fuori dieci ossidi metallici di dimensioni nanometriche testati, sei testato come attivo (ossido di titanio, ossido di zinco e ossido di cerio diversi quattro) con esposizioni in vitro con conferma in vivo

Al fine di studiare gli effetti degli aerosol in un ambiente professionale, il nostro laboratorio ha sviluppato il PIVEC per le esposizioni nel campo. Inoltre, il PIVEC può essere indossato per campionamento personale monitorare e studiare l'esposizione di inalazione come il 37 mm filtro cassetta36 o più sistemi possono essere utilizzati per ottenere una risoluzione spaziale all'interno di una determinata area. In questo protocollo, la caratterizzazione e l'uso del PIVEC è discusso. Dopo l'esposizione, gli effetti biologici sono osservati mediante saggi di citotossicità.

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Protocol

Gli operatori devono indossare dispositivi di protezione individuale (camice, guanti, occhiali) quando eseguire passaggi 1, 2, 3, 5 e 6.

1. preparazione dei materiali

  1. Preparare i materiali per l'assemblaggio del sistema e l'esposizione assicurare la ripetibilità.
    1. Assicurati di uso nuovo o etanolo al 70% pulito ¼" diametro interno conduttivo della tubazione e ¼" diametro esterno connettori per l'assembly di sistema.
    2. Archivio test materiali inclusi filtri, componenti PIVEC, pinzette e polveri delle particelle in un ambiente ben controllato, per quanto riguarda la temperatura e l'umidità, per almeno 24 h prima dell'esperimento.
      Nota: La temperatura deve essere a temperatura ambiente, circa 20 ° C, con umidità relativa inferiore al 35%. Questo è molto importante per raggiungere ripetibilità tra esperimenti.
    3. Preparare i contatori di particelle utilizzando isopropanolo per pulire parti e consentire il riscaldamento del sistema secondo le raccomandazioni del produttore, tra cui la scansione mobilità particella sizer (SMPS) e la sizer ottici di particelle (OPS) per la misurazione.

2. generazione di Aerosol secco

Nota: Gli operatori dovrebbero eseguire la generazione di aerosol in una cappa aspirante.

  1. Assemblare un sistema per generare aerosol secco
    Nota: La sospensione di particelle di gas o liquido deve essere appropriata per la cultura delle cellule e applicazione modellata. Il metodo seguente può essere eseguito utilizzando un aerosol a base liquida. Il design del sistema aerosol secco è da Tiwari et al. 37 un disegno schematico del sistema asciutto dispersione è illustrato nella Figura 1.
    1. Collegare la valvola a sfera a ciascuna estremità del tubo di dimensioni filettati 4" 1/8, questo servirà come la tramoggia della particella. Collegare 2" 1/8 dimensioni tubo una valvola.
    2. Pesare le nanoparticelle di rame, in questo studio la concentrazione di massa per ogni dimensione delle particelle è stata mantenuta costante durante la determinazione dell'efficienza di deposizione. Utilizzare circa 7,5 mg di 40 nm rame nanoparticelle, 7 mg di 100 nm rame nanoparticelle e 13 mg di 800 nm rame nanoparticelle per l'esposizione. Posizionare le nanoparticelle di rame nella tramoggia della particella attraverso l'estremità aperta.
      Nota: La quantità di nanoparticelle rame pesate servirà come base la massa amministrata concentrazione.
    3. Posizionare un 3" pezzo di tubo di diametro esterno (OD) del ½" intorno al tubo da 2" e posto un HEPA filtro all'interno di questo tubo breve tale che la direzione del flusso attraverso la valvola a sfera.
    4. Collegare il generatore di vuoto ad altre valvola a sfera con filettatura. Collegare generatore di vuoto ad aria serbatoio inserendo una tubazione OD 5/16" nella connessione push-to-lock. Utilizzare tubazione OD di ¼" per collegare l'uscita del generatore di vuoto con il set-up sperimentale mettendo il tubo sopra l'uscita del generatore di vuoto.
  2. Uso del sistema di secchi di aerosol per generare aerosol secco
    1. Aprire il serbatoio dell'aria ruotando la valvola principale e consentire il flusso d'aria del sistema. Aprire la valvola del regolatore di flusso sul serbatoio dell'aria e impostato in modo che il flusso attraverso il sistema è equivalente alle impostazioni desiderate sulla pompa del vuoto.
    2. Aprire la valvola a sfera più vicina al filtro HEPA quindi la valvola a sfera più vicina al generatore di vuoto. Questi tenere aperto per circa 3 s per consentire le particelle essere tirato nel flusso d'aria.
    3. Chiudere la valvola a sfera più vicina al generatore di vuoto quindi chiudere la valvola a sfera più vicina al filtro HEPA. Consentire l'aria dal serbatoio a scorrere per tutta la durata dell'esperimento come necessario.
    4. Chiudere le valvole principali e regolatore sul serbatoio di aria per fermare il flusso. Valvole a sfera pulite e generatore di vuoto con etanolo al 70%. Tubi metallici di autoclave per la sterilizzazione.

3. deposizione efficienza misura utilizzando PIVEC

Nota: Gli operatori devono eseguire le esposizioni dell'aerosol in una cappa aspirante.

  1. Misurare la deposizione raccogliendo il rame nanoparticella aerosol generato nel passaggio 2.2 su un filtro pre-pesato. Utilizzare la dose depositata, misurata utilizzando la massa raccolta sul filtro e la dose somministrata, misurata con la quantità di particelle di rame pesate, per determinare l'efficienza di deposizione.
    1. Tenere 1,00 µm filtri di fibra di vetro di poro in condizioni di bassa umidità, descritto al punto 1.1.2, per almeno 24 h prima del pre-esposizione misure. Pesare un filtro inutilizzato tre volte e registrare i pesi dei filtri. Inserire il filtro inutilizzato in una coltura cellulare inserire.
    2. Selezionare cella appropriata cultura inserto adattatore (ben 6 o 24 bene) per PIVEC supportare l'inserto di cultura delle cellule con il filtro. Luogo la coltura cellulare inserire pezzo adattatore sulla parte superiore della base di PIVEC, l'impostazione in posizione tale che la base del pezzo adattatore è più larga della parte superiore.
    3. Uso delle pinzette per posizionare il filtro caricato coltura cellulare inserire all'interno del raccordo. Posizionare il pezzo superiore sopra pezzo adattatore, stabilendosi in posizione tale che la base della parte superiore è più larga della parte superiore. Avvolgere PIVEC con un singolo strato di nastro adesivo.
    4. Collegare pezzi cassetta 37 mm sulla parte superiore e inferiore della PIVEC spingendo in luogo. Inserire schede di ¼" spinato cassetta ingresso ed uscita.
    5. Avvolgere il riscaldatore resistivo intorno PIVEC tale che i fili sono alla base. Nastro per garantire la.
    6. Avvolgere PIVEC con ~ 8 giri di carta stagnola per isolamento. Fissarla con nastro adesivo.
    7. Collegare 2" lungo pezzo di 1/2" diametro esterno tubo flessibile alla scheda in cima PIVEC. Rimuovere tubo poroso da acqua sterile e posto all'interno della tubazione in cima PIVEC.
    8. PIVEC posto all'interno del morsetto sul cavalletto anello e sicuro. Completo set-up con la pompa del vuoto, contatori di particelle e set-up dell'aerosol.
      Nota: La dose depositata basati su numero può essere determinata solo se i contatori di particelle vengono inseriti prima del PIVEC e dopo il PIVEC su cicli separati.
    9. Esporre i filtri utilizzando passo 2.2 del protocollo e tempo e flusso tassi di esposizione desiderata, in questo studio che è stato utilizzato un tempo di esposizione di 10 min a 0,5 l/min. Rimuovere PIVEC dal set-up. Prendere l'inserto di cultura cellulare e inserire il filtro esposto nel portafiltro in condizioni di bassa umidità per almeno 24 h prima della misurazione.
    10. PIVEC pulito con etanolo al 70%. Sterilizzare con luce ultravioletta per almeno 30 min prima dell'esperimento successivo.
    11. Pesare il filtro esposto tre volte e registrare i pesi dei filtri. Inserire il filtro esposto in un portafiltro con etichetta per deposito.

4. calcolo della Dose depositato ed efficienza di deposizione

Nota: La conoscenza della deposizione è importante per l'amministrazione dell'aerosol e interpretazione della risposta cellulare.

  1. Calcolare la deposizione da misure basate su massa
    1. Calcolare la massa depositata sui filtri come la differenza tra il peso medio pre-esposizione e peso medio post-esposizione. Questo valore è la dose depositata basato sulla massa per l'esperimento.
    2. Uso amministrato massa, madmin, e basato sulla massa depositata dose determinata in 4.1.1, mdep, per calcolare l'efficienza di deposizione basato sulla massa, ηm, per l'esperimento.
      Equation
    3. Valori medi da 4.1.1 e 4.1.2 per almeno 3 esperimenti determinare la deposizione e l'efficienza di deposizione per PIVEC per dimensione delle particelle.
  2. Calcolare la deposizione da misure basate su numero
    1. Garantire che le misure con contatori di particelle sono state eseguite con contatori dopo la PIVEC e per determinare la concentrazione di particelle prima il PIVEC. Integrare la concentrazione delle particelle nel tempo per il contatore di particelle poi integrare sul diametro della particella per determinare il totale particelle misurate.
    2. Calcolare il numero di particelle depositate come la differenza tra le particelle amministrate e il post-PIVEC di particelle misurate. Questo valore è la dose depositata basato su numeri per l'esperimento.
    3. Particelle di uso amministrato, nadmin, basati su numero depositate dose, ndep, portata volumetrica, V e dal tempo, t, per calcolare l'efficienza di deposizione basata su numero, ηn, per l'esperimento.
      Equation
    4. Valori medi da 4.2.2 e 4.2.3 per almeno 3 esperimenti determinare la deposizione e l'efficienza di deposizione per PIVEC per dimensione delle particelle.

5. aerosol l'esposizione delle cellule

Nota: Per la cella viene definito cultura all'interfaccia aria-liquido il lettore in bianco et al. 38 gli operatori dovrebbero eseguire cultura inserto di cella di carico (misure 5.1.2-5.1.4) all'interno di una cappa di biosicurezza. Gli operatori dovrebbero eseguire esposizioni di aerosol in una cappa.

  1. Cellule di cultura all'interfaccia aria-liquido
    1. Sollevare le cellule A549 da matraccio di cultura con l'aggiunta di tripsina-EDTA, 3ml per un pallone da T75 o 1 mL per una boccetta di T25 e incubare per 5 min a 37 ° C. Aggiungere 7 mL di supporto completo per una boccetta di T75 o 4 mL di terreno completo per un T25 boccetta a boccetta e parete di boccetta di risciacquo con sospensione cellulare massimizzare il numero di cellulare recuperati. Trasferimento la sospensione cellulare in una provetta conica sterile 15 mL poi Centrifugare le cellule a 800 x g per 3 min.
    2. Rimuovere il surnatante contenente tripsina-EDTA e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di multimediale completo. Rimuovere 10 µ l di sospensione cellulare e aggiungere l'emocitometro. Contare le celle utilizzando un emocitometro per determinare la concentrazione e il numero totale di cellule.
    3. Posto 0,5 mL di terreno completo per ciascun pozzetto all'interno di un piatto ben 24. Posizionare inserti di cultura cellulare inutilizzato a wells. Coltura cellulare di seme si inserisce sul lato apicale con una densità di cella vicino a 1 x 105 cellule/cm2 per i tipi di cellule che crescono ad un tasso vicino raddoppio al giorno. Seed A549 celle all'interno di un 24 ben inserire, inserire celle di seme ad una densità di 1 x 105 cellule/cm2 aggiungendo 35.000 cellule alla coltura delle cellule.
      Nota: Le cellule con un tasso di crescita più lento possono essere seminate ad una densità aumentata delle cellule.
    4. Aggiungi media completi al lato apicale della cellula cultura inserto per raggiungere il volume finale (per 24 volume finale ben piatto è 0,25 mL).
    5. Cultura per 7 giorni in condizioni sommerse, sostituzione media ogni 1-2 giorni. Dopo 7 giorni, rimuovere i supporti apicali e la cultura per almeno 1 giorno in condizioni di ALI, sostituendo solo i media basolaterale.
  2. Assemblare PIVEC
    1. Consentire alle cellule di equilibrare all'interfaccia aria-liquido per almeno 24 h prima dell'esposizione.
    2. Selezionare cella appropriata cultura inserto adattatore per PIVEC supportare l'inserto di cultura delle cellule con il filtro. Coltura cellulare posto inserire pezzo adattatore in cima PIVEC base, impostazione in posizione tale che la base del pezzo adattatore è più larga della parte superiore. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura delle cellule della base della PIVEC.
    3. Uso delle pinzette per posizionare la coltura delle cellule ad inserire adattatore pezzo posizionato al punto 5.2.3. Posizionare il pezzo superiore sopra pezzo adattatore, stabilendosi in posizione tale che la base della parte superiore è più larga della parte superiore. Avvolgere attentamente, PIVEC con un singolo strato di nastro adesivo.
    4. Collegare pezzi cassetta 37 mm sulla parte superiore e inferiore della PIVEC, spingendo in luogo. Inserire schede di ¼" spinato cassetta ingresso ed uscita.
    5. Avvolgere il riscaldatore resistivo intorno PIVEC tale che i fili sono alla base. Nastro per garantire la.
    6. Avvolgere PIVEC con ~ 8 giri di carta stagnola per isolamento. Fissarla con nastro adesivo.
    7. Collegare all'adattatore sulla cima PIVEC breve pezzo di tubo flessibile di diametro esterno 1/2". Rimuovere tubo poroso da acqua sterile e posto all'interno della tubazione in cima PIVEC.
    8. PIVEC posto all'interno del morsetto sul cavalletto anello e sicuro. Completare il set-up con la pompa a vuoto e set-up dell'aerosol.
  3. Esporre le cellule alle ALI utilizzando il PIVEC
    1. Utilizzare l'efficienza di deposizione determinata nel passaggio 2 per calcolare la massa di particelle per essere aerosolized. Pesare massa adeguata e aggiungere al sistema aerosol istituito a seguito del passaggio 2 all'interno della cappa.
    2. Esporre le cellule seguendo passo 2.2, in questo studio di endpoint biologici le cellule sono state esposte a circa 3,5 mg di rame nanoparticelle con una portata di 0,5 l/min e una durata di esposizione di 10 min. studi di controllo effettuati utilizzata aria umidificata per determinare l'influenza dell'aria da solo. Rimuovere PIVEC dal set-up. Prendere l'inserto di cultura cellulare, inserire nella piastra ben sterile e tornare l'incubatrice di CO2 (37 ° C, 5% CO2, 90% RH).
    3. Aspirare la media da PIVEC. Se eseguendo ulteriori esperimenti, fondo di risciacquo di PIVEC con fosfato tampone soluzione quindi ripetere il punto 5.1 e 5.2.
    4. PIVEC pulito con etanolo al 70% al termine. Sterilizzare con luce ultravioletta per almeno 30 min prima dell'esperimento successivo.
  4. Procedure di saggio biologico
    Nota: Analisi eseguite in questo studio erano generazione di stress ossidativo attraverso l'analisi di DCFH-DA e citotossicità attraverso il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH).
    1. Sciogliere 24,4 mg di DCFH-DA in 50 mL di metanolo per fare 1 mM DCFH-DA soluzione. Questa soluzione può essere conservata a-20 ° C fino a 4 mesi. Diluire 1 mM DCFH-DA soluzione mescolando 0,1 mL di 1 mM DCFH-DA soluzione con 9,9 mL HBSS per rendere 10 mL di 10 µM DCFH-DA.
    2. Rimuovere la cella di terreni di coltura e lavaggio inserto di cultura di cella con circa 1 mL di PBS. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di DCFH-DA 10 µM in ciascun pozzetto, sostituendo inserti quando finito. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare fotoattivazione del colorante e tornare all'incubatore 37° C per 1 h.
    3. Rimuovere le cellule dall'incubatrice ed aspirare la soluzione di lavoro di DCFH-dai pozzi. Aggiungere 0,5 mL HBSS pozzetti e sostituire inserti di cultura cellulare.
    4. Caricare la piastra ben in fluorescenza lettore e misura piastra basale utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 485/530 nm. Rimuovere la piastra da inserto reader e carico piastra in PIVEC per l'esposizione.
    5. Esporre le cellule per la durata di esposizione desiderata. Rimuovere l'inserto da PIVEC e tornare alla piastra ben. Rimuovere 50 µ l di liquido basolateral da ben piatto e posto nella piastra ben bianco 96. Misurare la fluorescenza del DCF utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 485/530 nm ogni 30 min post-esposizione per 2 h.
    6. Lasciate che basolateral fluido stabilizzare a temperatura ambiente per 20-30 min. aggiungere 50 µ l di soluzione dosaggio LDH, misto seguente protocollo di produttore, basolaterale fluido dalla piastra bene e lasciare reagire per 10 min. aggiungere 25 µ l di soluzione bloccante a bene. Leggere la fluorescenza di Resorufina prodotto utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 560/590 nm.
    7. Rimuovere il liquido ulteriori basolaterale e ripetere il passaggio 5.4.6 alle 4h e post-esposizione di 24 ore.

6 metodi statistici

  1. Analisi dei dati di analisi biologica
    1. Rapporto produzione di ROS come l'aumento di intensità di fluorescenza delle cellule trattate rispetto a misurazioni di base. Relazione attività LDH come l'aumento di intensità di fluorescenza delle cellule trattate rispetto a cellule non trattate.
    2. Eseguire il singolo fattore ANOVA per determinare le differenze statistiche fra i set di dati. Se del caso, eseguire student t-test ad un valore di significatività di 0,05. Report dati come media ± deviazione standard di almeno tre misurazioni dell'esposizione.

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Representative Results

Tossicologia occupazionale in vitro coinvolge mantenere vitalità cellulare durante l'esecuzione di esposizione di aerosol. Il sistema di PIVEC è mostrato in Figura 2, tra cui la temperatura e controllo dell'umidità e la PIVEC consumato. La temperatura è stata mantenuta utilizzando un riscaldatore resistivo alimentati a batteria e l'aerosol umidificato utilizzando aumentato umidificazione naturale attraverso un tubo poroso, a contatto col prodotto. In un aerosol controllata impostazione all'interno di un laboratorio, il PIVEC può essere messa a punto per l'esposizione illustrata nella Figura 1. Caratterizzazione del sistema consente la determinazione della dose depositata sulle celle che può quindi essere correlata alla risposta cellulare.

L'efficienza di deposizione dipende dalla dimensione delle particelle aggiunti al sistema, poiché le forze deposizione includono compressione, sedimentazione e diffusione. Inoltre, la deposizione è dipenda dalla portata, tempo di esposizione e le caratteristiche del sistema di esposizione. Con queste informazioni, la deposizione può essere previsto. L'efficienza di deposizione del PIVEC è stato determinato attraverso due metodi, analisi gravimetrica e conteggio numero di particelle. Equazioni 1 e 2 sono state utilizzate per determinare l'efficienza di deposizione in tabella 1 utilizzando il filtro di base, ricerca di mobilità particella sizer (SMPS) e misure di ottici di particelle sizer (OPS), Figura 3. Aumento della deposizione è osservato nel complesso per il 24 design bene quanto il 6 bene design e diminuisce leggermente per 100 nm rispetto a 40 nm e 800 nm rame particelle. La deposizione a 24 pozzetti è molto uniforme sopra l'inserto, tuttavia, deposizione nella progettazione ben 6 manca uniformità come la maggior parte del deposito di particelle vicino al centro dell'inserto. Analisi post-esposizione possono essere accelerato determinando il rapporto di dose tra il filtro di 37 mm e l'inserto di cultura cellulare, diminuendo la necessità di determinare la dose dopo l'esposizione cellulare. Confronto tra la deposizione all'interno della cassetta filtro 37 mm e il PIVEC Mostra una forte correlazione per tutte le dimensioni e pozzi con una correlazione di Pearson di sopra 0.7, tuttavia soltanto per 800 nm è la correlazione significativa con una p < 0.05, Vedi Figura 4. Rispetto ai sistemi simili in tutta letteratura,11,12 l'efficienza di deposizione della PIVEC sopra la gamma di granulometrie testato è paragonabile o maggiore sui valori segnalati, osservati nella Figura 5. L'efficienza di deposizione entro il PIVEC può essere migliorata attraverso riducendo al minimo le perdite al sistema utilizzando elettrostatici dissipativo o conduttivo plastica o materiali simili per progettare il PIVEC.

Se i filtri non sono asciugati bene in un ambiente di umidità controllata prima dell'esposizione, l'acqua in eccesso aumenta la massa iniziale e può produrre dosi depositate non-fisico, negative. Tassi di flusso variabile possono anche promuovere incoerente dosi depositate all'interno del sistema. Per evitare questi problemi, è necessario consentire almeno un giorno prima e dopo l'esposizione per filtri a secco in un ambiente di umidità controllata.

Risposte cellulari saranno interessate dalla dose depositata e possono dipendere dalla durata di esposizione se le cellule non sono adeguatamente mantenute. Le cellule A549, una linea cellulare di carcinoma epiteliale alveolare, sono stati esposti per 10 min a dimensioni diverse delle nanoparticelle di rame con una portata di 0,5 l/min. Perpendicolare alternativo flusso esposizione sistemi uso tra 0,005 LPM e 1,5 l/min per un periodo di esposizione sostenuta considerando che questo metodo utilizza una velocità moderata durante una rapida esposizione. Utilizzando l'efficienza di deposizione basato sulla massa misurata e amministrato la dose, 1,58 ± 0,04 mg/cm2 di rame di 40 nm, 0.30 ± 0.00 mg/cm2 di 100 particelle di rame nm, e 0,32 ± 0,01 mg/cm2 di 800 particelle di rame nm sono stati depositati sulle celle. Citotossicità e lo sforzo ossidativo sono stati osservati all'interno del primo post-esposizione di venti-quattro ore. La citotossicità è stata misurata mediante il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) da cellule danneggiate immediatamente, 4 ore e 24 ore post-esposizione. Non c'era nessuna tossicità significativa da nanoparticelle di rame sotto 1,62 mg/cm2 entro 4 ore di esposizione, Figura 6b. Ventiquattro ore post-esposizione c'era una diminuzione statisticamente significativa nell'attuabilità delle cellule di meno del 20% redditività per le cellule esposte a nanoparticelle di rame. Lo stress ossidativo intracellulare è stato studiato facendo uso dell'analisi attraverso l'ossidazione di DCFH DCFH-DA specie reattive dell'ossigeno entro le prima due ore post-esposizione, Figura 6a. Livelli significativi di stress ossidativo sono stati misurati alla post-esposizione di trenta minuti per le cellule esposte a nanoparticelle di rame di tutte le dimensioni. Il livello di stress ossidativo ha continuato ad aumentare a ritmi simili per tutte le taglie testate entro le due ore osservate.

Successo delle esposizioni può essere determinato attraverso la ripetibilità della risposta cellulare. Due criteri di accettazione propongono per saggi di citotossicità includono: 1) la perdita di LDH totale % per il controllo positivo deve essere maggiore di 50% e 2) il coefficiente di replicare positivo e campione di variazioni dovrebbe essere all'interno di 50%. 39 se questi criteri non sono soddisfatti, questo suggerisce le differenze tra esperimenti, ad esempio gli importi alterata deposizione o scarso controllo di umidità o temperatura. Inoltre, osservando le misure di citotossicità può portare alla comprensione dei controlli sperimentali e aiutare a determinare l'errore. Quando la portata è troppo elevata, le cellule possono morire da elevate quantità di sollecitazione di taglio. Abbassando il tasso di flusso, può essere diminuito lo stress al momento le cellule dal flusso.

Figure 1
Figura 1. Schematica del sistema di dispersione asciutto e set-up sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Design PIVEC. A) completo di Design nella foto con scatola alta 30 cm per il confronto. B) PIVEC con controllo di temperatura e umidità nella foto con 30 cm Tall Box per confronto. C) consumato PIVEC. D) PIVEC pezzo superiore. E) delle cellule cultura adattatore per ben 24 (a sinistra) e 6 ben (a destra). F) fondo pezzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Numero base efficienza di deposizione (%) Massa base efficienza di deposizione (%)
ben 6 40 nm 17,83 ± 32.13 5,85 ± 0.85
100 nm 0,47 ± 4,06 5.11 ± 0.94
800 nm 3.70 ± 35.00 6.39 ± 1.01
ben 24 40 nm 1.43 ± 2.43 12,61 ± 1.34
100 nm 1.37 ± ore 19.45 2.95 ± 0,75
800 nm 6,98 ± 3,93 15.95 ± 0,53

Tabella 1. PIVEC efficienza di deposizione.

Figure 3
Figura 3. Concentrazione di numero di particelle di rame nanoparticella aerosol. A) misurazione SMPS. B) misura OPS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Relazione tra deposizione su inserto di cella e filtro 37mm SKC. Errore ± 0,002 mg. A) 40 particelle di rame nm. B) 100 particelle di rame nm. C) 800 particelle di rame nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. Efficienza di deposizione di PIVEC rispetto ai sistemi di esposizione di flusso perpendicolare nella letteratura. Valori di letteratura da sistemi di esposizione di flusso perpendicolare tracciati in marcatori solido e PIVEC valori sono in marcatori vuoto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Risposta cellulare al rame nanoparticelle post-esposizione (PE). Per tutte le misurazioni, n = 3 e p < 0.05. A) ossidativo determinato usando l'analisi di DCFH-DA. B) citotossicità valutata mediante il saggio di LDH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Cartucce filtro forniscono un metodo semplice, poco costoso di raccolta aerosol nella zona di respirazione; Tuttavia, campioni di aerosol estratti dai filtri non rappresentano l'intero aerosol (cioè gas, sostanze volatili e polveri) e di conseguenza limitare la valutazione degli effetti biologici correlati. Usando il disegno iniziale della cassetta filtro 37 mm, il PIVEC è progettato per mantenere la portabilità e imitare la deposizione in vivo delle particelle da inalazione. Il PIVEC è significativamente inferiore rispetto ai sistemi attuali di esposizione ALI, circa le dimensioni di una scatola del tessuto con controllo di temperatura e umidità incluso. La dimensione è simile a impattori cascata personali offrendo inoltre dati sulla risposta cellulare per l'aerosol. Mentre il PIVEC contiene lo spazio per un campione rispetto ad altri sistemi di esposizione corrente, le piccole dimensioni consentano più sistemi da utilizzare in una sola volta, quindi, aumentando la dimensione del campione e consentendo per distribuzione spaziale da monitorare.

Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Per determinare l'efficienza di deposizione, è fondamentale per condizionare correttamente i filtri, come descritto nel passaggio 1. Inoltre, è importante valutare correttamente le nanoparticelle rame prima dell'esposizione e il messaggio di filtro per determinare l'efficienza di deposizione basato sulla massa. L'efficienza di deposizione numero deve essere determinato utilizzando la differenza nella deposizione tra la concentrazione di aerosol iniziale e la concentrazione finale determinata utilizzando i contatori di particelle. Se l'efficienza di deposizione non è correttamente determinato, è difficile determinare le differenze di risposta biologica tra tipi di aerosol. Modifiche alla deposizione includono alterando la deposizione. Deposizione può essere incrementata modificando la durata di esposizione e tasso di flusso. Questo può anche influenzare l'attuabilità delle cellule con il potenziale di essiccazione fuori le cellule. Il condizionamento di aerosol è spesso eseguito per compensare gli attributi fisiologici quali la temperatura corporea e umidificazione delle vie aeree. Umidità aumentata, oltre il 50%, imita aria inalata e diminuisce la morte delle cellule dovuto l'esposizione del veicolo. 43 quando temperatura e umidità non sono ben controllati, la risposta cellulare può essere influenzata. Facendo diminuire la portata, depositerà ulteriori particelle di tutte le dimensioni, aumentando la deposizione. Durata di esposizione è direttamente proporzionale alla deposizione, consentendo più particelle a depositare per un periodo sperimentale. Condizionata dell'aerosol è importante quando si aumenta la durata di esposizione in modo che le cellule non asciugarsi che possono influenzare le risposte biologiche.

Il PIVEC utilizza flusso perpendicolare a depositare particelle tramite compressione, sedimentazione e diffusione sulle celle che hanno il potenziale per asciugare fuori le cellule attraverso il flusso e aggiunto lo stress sulle cellule. L'efficienza di deposizione è dipenda dalla dimensione della particella dovuto le forze di deposizione. Molti degli attuali sistemi di esposizione con flusso perpendicolare hanno un'efficienza di deposizione di inferiore al 10% e molto più vicino all'1%. Il PIVEC ha un'efficienza di deposizione determinata mediante l'analisi gravimetrica del 3% al 16% per un 24 ben celle inserto di cultura. L'efficienza di deposizione basata sul numero delle particelle è di circa 1% al 7% per l'inserto stesso. Quando si utilizza anche un 6 inserti in coltura cellulare, diminuiscono questi numeri, fatta eccezione per la più piccola dimensione delle particelle, dovuto la razionalizzazione dell'aerosol come più particelle sono confinate nell'inserto cultura cellulare senza spazio per il flusso di sviluppare. Gli inserti di cultura cellulare ben 6 consentono i flussi di aerosol di bypassare la deposizione. Altri sistemi di flusso perpendicolare sono state caratterizzate in base massa utilizzando 60 nm della fluorescina particelle40, 80 nm e 180 nm rame particelle16e 60 nm adipico acido particelle41. Le efficienze di deposizione risultanti sono generalmente tra 0,05% e 11%. Su un numero base, questi sistemi sono stati caratterizzati utilizzando particelle di polistirene12,15, nanoparticelle di carbonio12e silice particelle42, producendo efficienze tra 0,2% e l'11%. Il PIVEC fornisce, deposizione simile o maggiore, rispetto ai dispositivi dell'esposizione cellulari disponibili.

Le esposizioni delle cellule sono state eseguite utilizzando rame nanoparticelle di 40 nm, 100 nm e 800 nm. La vitalità cellulare è stata definita usando l'analisi LDH con nessuna diminuzione significativa nella redditività entro quattro ore di post-esposizione. Il dosaggio LDH è stato utilizzato con un sistema di esposizione commerciale per 74 ng/cm2 dopo 2 ore e 148 ng/cm2 dopo 4 ore di 9,2 nm rame ossido particelle44 e 1 µ g/cm2 depositato dopo un'esposizione sequenza 4 ore, incubazione per 2 ore, quindi un'altra esposizione di 4 ore di 25 nm rame ossido particelle40, entrambi misura diminuzioni significative nell'attuabilità delle cellule. La citotossicità è stata osservata in un altro sistema per 1.6-7.6 µ g/cm2 di 180 particelle nm nanoparticelle rame16 misurata dall'esclusione del colorante blu di trypan. Esposizioni di 15 minuti a 40-80 nm rame ossido nanoparticelle attuabilità in diminuzione, misurata 24 ore post-esposizione. La bassa tossicità osservata utilizzando il PIVEC era probabilmente dovuto il tempo di esposizione più breve di 10 minuti e più brevi tempi di misurazione esposizione post. Dopo quattro ore di post-esposizione, attuabilità delle cellule esposte alla PIVEC è diminuito. Le cellule esposte a controlli di aria umida non osservati Nessuna citotossicità significativa, in accordo con altri studi 9,40,44,45,46. Lo stress ossidativo è stato determinato usando l'analisi di DCFH-DA. La produzione di specie reattive dell'ossigeno, come il perossido di idrogeno o i radicali dell'ossigeno, generato una quantità di stress che può portare alla morte di arresto o cella di crescita. Dopo le esposizioni di cella, c'era un minimo aumento nello sforzo ossidativo per cellule tenute nell'incubatrice come controllo e per le cellule esposte all'aria umida. Lo sforzo ossidativo elevato si è verificato per tutte le dimensioni delle particelle, aumentando all'interno post-esposizione di 30 minuti. All'interno di uno studio, 9.2 nm ossido di rame particelle44 e particelle di ossido di rame 25 nm40 anche indotto da stress ossidativo misurato attraverso il dosaggio di carboxy-DCFH-DA. Tempo di esposizione aumentata da 2 ore per lo sforzo ossidativo elevato di 4 ore per 9,2 nm ossido di rame particelle44. Dopo quattro ore di esposizione, le particelle di ossido di rame nm 9,2 ha prodotto una simile risposta ossidativa come l'esposizione sequenza di 25 nm rame ossido particelle40, suggerendo che l'esposizione durata ha una maggiore influenza sulla risposta allo stress ossidativo di dimensione delle particelle. Cellule esposte all'interno del PIVEC prodotto lo sforzo ossidativo elevato rispetto a quello studio, tuttavia, le particelle esposte nel sistema alternativo sono ossido di rame e si dissolveranno meno rapidamente il rame esposto all'interno del PIVEC. Gli studi svolti sulla dissoluzione di rame basato sulla composizione e dimensione delle particelle d'accordo che le particelle più grandi e gli ossidi di metallo rilasciano ioni più lenti di particelle metalliche o loro nanoparticella controparti16,47 , 48 , 49 come i controlli di aria umida non hanno prodotto notevoli quantità di stress ossidativo rispetto al controllo incubatore, l'influenza delle particelle di rame per indurre lo stress ossidativo è coerenza entro il PIVEC simili in vitro dell'esposizione sistemi. Le risposte biologiche osservate utilizzando il PIVEC suggeriscono che il PIVEC è un sistema appropriato per l'esposizione cellulare.

Mentre la caratterizzazione e studi cellulari del PIVEC d'accordo bene con letteratura,9,16,40,44,46 il dispositivo presenta limitazioni. Il disegno piccolo diminuisce il numero di campioni che possono essere esposte simultaneamente all'interno di un singolo dispositivo rispetto ad altri sistemi di esposizione. Altri sistemi consentono per cellulare almeno tre esposizioni verso lo stesso aerosol9,12 facilitando replicando la determinazione. Anche se il PIVEC consente solo per una inserire per ogni sistema, le piccole dimensioni permettono per sistemi multipli per essere facilmente utilizzato, contribuendo ad per attenuare questo problema. Mentre altri sistemi di monitoraggio personale non utilizzano le cellule, il PIVEC devono tenere quasi verticale per ridurre la fuoriuscita di terreni di coltura delle cellule necessarie per preservare la vitalità cellulare. Anche se il PIVEC ancora non è stato ottimizzato per le gamme di particella specifica (ad es. PM10, PM2.5, PM0.1), il PIVEC è stato caratterizzato per una gamma di dimensioni delle particelle. Simile ad altri sistemi di flusso perpendicolare, il PIVEC Mostra una diminuita capacità di depositare particelle vicino a 100 nanometro di diametro, mentre 40 nm e 800 nm particelle, depositate con efficienza simile.

L'analisi di post-esposizione di cellule può essere accelerato eseguendo una collezione parallela di aerosol all'interno del PIVEC e un cassetto dei filtri SKC 37 mm. Un'alta correlazione di deposizione base gravimetrica consente per la stima della massa della particella raccolta sulle cellule dai dati raccolti utilizzando filtri di 37 mm. Confronto dell'inserto per la cassetta filtro riduce la necessità di raccogliere ulteriori esempi e ulteriori misure per determinare la dose. Lavori in corso include l'integrazione di un sistema di monitoraggio in tempo reale per citotossicità, stress ossidativo o altri endpoint biologici. Le piccole dimensioni del PIVEC permettono di essere utilizzato in una varietà di impostazioni, come ad esempio sul corpo come un monitor personale, su un drone sopra un impianto chimico, o all'esterno, nell'ambiente per la risoluzione spaziale. Questo metodo ha dimostrato l'uso della PIVEC per la raccolta delle particelle dell'aerosol in colture cellulari coltivate presso le ALI. Dal condizionamento l'aerosol a 37 ± 1 ° C e > 80% di umidità relativa, la vitalità cellulare può essere mantenuto durante le esposizioni acute. Questo metodo è appropriato per goccia di liquido e solido basato su particelle aerosol e ha dimostrato di depositare particelle tra 40 nm e 800 nm a inserti di cultura cellulare. La versatilità della PIVEC consente questo metodo essere utilizzato in più impostazioni con vari endpoint biologici.

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Disclosures

L'affiliazione degli autori è come indicato nel frontespizio. Gli autori sono supportati finanziariamente da Virginia Commonwealth University, dove il lavoro è stato completato a Richmond, in Virginia. Gli autori hanno la responsabilità esclusiva per la scrittura e il contenuto di questa carta. Gli autori dichiarano che non esistono nessun interessi concorrenti.

Acknowledgments

Gli autori vorrei ringraziare Boris Solomonov e la Virginia Commonwealth innovazione macchina negozio per aiutare con la prototipazione rapida del dispositivo. Gli autori inoltre ringraziare Cristian Romero-Fuentes del gruppo Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov e la Virginia Commonwealth nanomateriali Core caratterizzazione Facility per il loro aiuto con caratterizzazione delle particelle. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio forniti al Dr. Lewinski da College of Engineering presso la Virginia Commonwealth University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

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