तंत्रिकाबंधार्बुद में Immunohistochemistry द्वारा आयल-एंबेडेड 3d तंत्रिकाबंधार्बुद Neurosphere संस्कृतियों का मूल्यांकन

Cancer Research

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Summary

Neurospheres 3 डी संस्कृतियों के रूप में उगाया तंत्रिकाबंधार्बुद जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का गठन । यहां हम immunohistochemistry प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान जबकि आयल embedding के माध्यम से तंत्रिकाबंधार्बुद neurospheres की 3d संरचना को बनाए रखने । इस विधि जैसे उपजी और तंत्रिका विभेद के रूप में तंत्रिकाबंधार्बुद neurosphere गुणों के लक्षण वर्णन करता है ।

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Núñez, F. J., Mendez, F. M., Garcia-Fabiani, M. B., Pardo, J., Edwards, M., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (143), e58931, doi:10.3791/58931 (2019).

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Abstract

तंत्रिकाबंधार्बुद में प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण अपनी विकृति के अध्ययन में कई पहलुओं के लिए प्रासंगिक है । कई प्रोटीन निदान, रोग का निदान, वर्गीकरण, ट्यूमर प्रगति की स्थिति, और सेल भेदभाव राज्य में अनुप्रयोगों के साथ के रूप में वर्णित किया गया है । तंत्रिकाबंधार्बुद रोगियों और तंत्रिकाबंधार्बुद मॉडल से उत्पन्न ट्यूमर neurospheres (एन एस) की विशेषता के लिए यह भी है कि इन मार्क्स का विश्लेषण उपयोगी है । ट्यूमर एन एस में एक मूल्यवान इन विट्रो मॉडल ट्यूमर है जिसमें से वे प्राप्त कर रहे हैं और अधिक सही तंत्रिकाबंधार्बुद जीव विज्ञान दर्पण कर सकते हैं की विभिन्न सुविधाओं का आकलन करने के लिए प्रदान करते हैं । यहाँ हम एक विस्तृत विधि का वर्णन करने के लिए ट्यूमर एनएस में immunohistochemistry (आइएचसी) का उपयोग कर तेल-एम्बेडेड ट्यूमर एनएस पर मार्क्स का विश्लेषण.

Introduction

ग्लियोमास विश्व स्वास्थ्य संगठन1के अनुसार उनके phenotypic और genotypic विशेषताओं द्वारा वर्गीकृत केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के प्राथमिक ठोस ट्यूमर हैं । इस वर्गीकरण की उपस्थिति या चालक उत्परिवर्तनों, जो2के एक आकर्षक स्रोत का प्रतिनिधित्व की अनुपस्थिति शामिल हैं । जैव मार्क्स जैविक विशेषताएं है कि मापा जा सकता है और सामान्य और रोग प्रक्रियाओं, साथ ही एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप करने के लिए औषधीय प्रतिक्रियाओं को इंगित करने के लिए मूल्यांकन कर सकते हैं3. जैव मार्क्स ट्यूमर ऊतक और तंत्रिकाबंधार्बुद से व्युत्पंन कोशिकाओं में पता लगाया जा सकता है, विभिंन पहलुओं में अपने जैविक लक्षण वर्णन सक्षम करने से । तंत्रिकाबंधार्बुद के कुछ उदाहरणों में isocitrate डिहाइड्रोजनेज 1 (IDH1), कम ग्रेड ग्लियोमास के एक उत्परिवर्ती एंजाइम विशेषता4बेहतर पूर्वानुमान के साथ जुड़े रूपांतरित होना शामिल हैं । रूपांतरित IDH1 अक्सर TP53 और अल्फा के साथ संयोजन में व्यक्त किया जाता है-thalassemia/मानसिक मंदता सिंड्रोम एक्स-लिंक्ड (ATRX)-उत्परिवर्तनों को निष्क्रिय, एक विशिष्ट तंत्रिकाबंधार्बुद उपप्रकार4,5परिभाषित । ATRX-निष्क्रिय उत्परिवर्तन भी बाल चिकित्सा उच्च ग्रेड ग्लियोमास2,6 के ४४% में होते है और आक्रामक ट्यूमर और जीनोमिक अस्थिरता6,7के साथ जुड़े रहे हैं । इसके अलावा, बाल चिकित्सा फैलाना आंतरिक pontine ग्लियोमास (DIPG) उपस्थिति या हिस्टोन H3 जीन H3F3A, या HIST1H3B में एक K27M उत्परिवर्तन की अनुपस्थिति के अनुसार उपसमूह में अंतर कर रहे हैं/सी जीन1,6। इसलिए, आणविक लक्षण वर्णन की शुरूआत उपखंड, अध्ययन, और अलग संस्थाओं के रूप में ग्लियोमास के उपचार, जो और अधिक प्रत्येक उपप्रकार के लिए और अधिक लक्षित चिकित्सा के विकास की अनुमति देगा परमिट । इसके अलावा, जैव चिह्नों के विश्लेषण apoptosis8, autophagy9, सेल चक्र प्रगति10, सेल जखीरे11, और सेल विभेदन 12 जैसे विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है .

आनुवंशिक रूप से मानव कैंसर में मौजूद आनुवंशिक घावों बंदरगाह कि पशु मॉडल है कि मध्यस्थता रोग प्रगति संकेत मार्ग के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं । हमारी प्रयोगशाला सो सौंदर्य (एसबी) transposase प्रणाली के उपयोग को लागू किया गया है आनुवंशिक रूप से तंत्रिकाबंधार्बुद विशिष्ट उत्परिवर्तनों कि दोहराऊंगा मानव तंत्रिकाबंधार्बुद13,14उपप्रकार के बंदरगाह के माउस मॉडल विकसित करने के लिए । इन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल ट्यूमर व्युत्पंन एनएस, जो एक 3 डी प्रणाली में इन विट्रो अध्ययनों में सक्षम,15 सीटू मेंट्यूमर में मौजूद मुख्य सुविधाओं को प्रतिबिंबित पैदा करने के लिए उपयोग किया जाता है । इसके अलावा, चूहों में एनएस के orthotopical ट्रांसप्लांटेशन प्राथमिक ट्यूमर की सुविधाओं को बनाए रखने और इसी प्राथमिक ट्यूमर15के histopathological, जीनोमिक, और phenotypic गुणों की नकल है कि माध्यमिक ट्यूमर उत्पन्न कर सकते हैं.

सीरम मुक्त संस्कृति में, स्टेम सेल गुणों के साथ मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं को समृद्ध किया जा सकता है, और एपिडर्मल वृद्धि कारकों की उपस्थिति में (EGF) और fibroblast वृद्धि कारकों (FGF), वे एक सेल के रूप में उगाया जा सकता है-प्राप्त कालोनियों जैसे एनएस संस्कृतियों । इस चयनात्मक संस्कृति प्रणाली में, सबसे फर्क या विभेदित कोशिकाओं तेजी से मर जाते हैं, जबकि स्टेम सेल विभाजन और सेलुलर समूहों के रूप में । यह एक एन एस संस्कृति है कि तंत्रिकाबंधार्बुद ट्यूमर16,17,18सुविधाओं का कहना है की पीढ़ी की अनुमति देता है । तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस ट्यूमर जीव विज्ञान के कई पहलुओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिनमें निदान, रोग का निदान, वर्गीकरण, ट्यूमर प्रगति के राज्य, और कोशिका विभेदन राज्य में आवेदन किया है । यहां, हम विस्तार एक प्रोटोकॉल तंत्रिकाबंधार्बुद एन एस उत्पंन करने के लिए और तेल में 3 डी संस्कृतियों एंबेड आइएचसी धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । फिक्सिंग और तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस embedding का एक लाभ यह है कि एनएस की आकृति विज्ञान बेहतर पारंपरिक cytospin विधि19, जिसमें तंत्रिकाबंधार्बुद एन एस सेल पृथक्करण के लिए तनावपूर्ण हेरफेर के अधीन है और समतल बनने की तुलना में बनाए रखा है । इसके अलावा, embedding आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ट्यूमर एनएस से किसी भी अंतर्जात fluorophore अभिव्यक्ति बुझती, फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रा भर में धुंधला को सक्षम करने से । इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक तेल embedding प्रक्रिया के माध्यम से तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं की 3d संरचना को बनाए रखने और immunohistochemistry का उपयोग कर तंत्रिकाबंधार्बुद neurospheres के लक्षण वर्णन सक्षम है ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को मिशिगन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. ब्रेन ट्यूमर Neurospheres एक माउस मॉडल से व्युत्पंन की पीढ़ी

  1. विच्छेदन प्रक्रिया से पहले, तंत्रिका स्टेम सेल मीडिया (एनएससी मीडिया: DMEM/F12 के साथ 1x B27 अनुपूरक, 1x N2 अनुपूरक, 1x normocin, और 1x एंटीबायोटिक/antimycotic के साथ पूरक मानव रिकॉमबिनेंट EGF और बुनियादी FGF की सांद्रता पर 20 एनजी/ बाद के लिए एनएससी मीडिया और रिजर्व के ३०० µ एल के साथ एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब भरें ।
  2. एक बड़े ट्यूमर के साथ एक माउस का चयन करें ।
    नोट: एक ट्यूमर के आकार bioluminescence द्वारा निगरानी की जा सकती है अगर प्लाज्मिड या वायरस इंजेक्ट luciferin encodes । आमतौर पर, एक बड़े ट्यूमर के एक bioluminescence है > 106 फोटॉनों/s/cm2/sr.
  3. isoflurane की अधिक मात्रा के साथ माउस Euthanize: isoflurane के साथ एक ऊतक कागज को भ्रमित और एक euthanization चैंबर में ऊतक परिचय, जलन को रोकने के लिए चूहों के साथ सीधे संपर्क से परहेज. चूहों एक पेडल पलटा (आमतौर पर 5-10 मिनट) नहीं दिखा है जब तक रुको. Decapitate ने माउस को काटना और Calinescu एट अल में बताए गए ब्रेन को बताया । 13.
  4. ट्यूमर फ्लोरोसेंट हैं, तो मस्तिष्क के भीतर ट्यूमर द्रव्यमान की पहचान करने के लिए एक फ्लोरोसेंट लैंप से सुसज्जित एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें । ठीक संदंश के साथ, काटना ट्यूमर (आमतौर पर 5-7 मिमी व्यास में) सामान्य मस्तिष्क ऊतक से.
  5. एनएससी मीडिया (स्टेप १.१) के साथ १.५ एमएल ट्यूब में विच्छेदित ट्यूमर रखें । एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक मूसल कि कोमल दबाव लागू करके microcentrifuge ट्यूब की दीवारों में फिट बैठता है के साथ ट्यूमर Homogenize ।
  6. सेल के झुरमुट अलग कर देना करने के लिए, एंजाइम मुक्त पृथक्करण मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
  7. एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फिल्टर और एनएससी मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ छलनी धोने ।
  8. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक, supernatant खिचड़ी भाषा, और फिर से 6 मिलीलीटर या एनएससी मीडिया के 15 मिलीलीटर में गोली निलंबित, गोली के आकार पर निर्भर करता है ।
  9. प्लेट एक टी 25 या टी-७५ संस्कृति कुप्पी और संस्कृति में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक संस्कृति मशीन में ९५% हवा और 5% सह2के वातावरण के साथ ट्यूमर सेल निलंबन ।
  10. 3 दिनों के बाद, स्वस्थ निलंबित एनएस और फिर उंहें एक टी-25 या टी-७५ ऊतक संस्कृति कुप्पी में प्लेट स्थानांतरण । यदि आवश्यक हो, संस्कृति को और अधिक एनएससी मीडिया जोड़ें ।
    नोट: आमतौर पर कोशिकाओं की एक मिश्रित आबादी होगी, कुछ मर जाएगा, कुछ का पालन किया जाएगा, और कुछ एन एस के गठन किया जाएगा कि मीडिया में तैर जाएगा

2. एनएस को बनाए रखना और Passaging

नोट: अधिक वृद्धि को रोकने और अपेक्षाकृत उच्च घनत्व पर कोशिकाओं को बनाए रखने. संगम क्षेत्रों आकार द्वारा निर्धारित किया जाता है (बड़े क्षेत्रों के काले केंद्रों ऊंचा मतलब है) । एन एस की वृद्धि दर ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल oncogenes पर निर्भर करेगा ।

  1. एक बार एनएस संस्कृति के प्रवाह तक पहुंच गया है, एक बाँझ केंद्रापसारक ट्यूब में संस्कृति इकट्ठा और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर एनएस गोली ।
  2. supernatant को छोड़ें, सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और गोली को फिर से निलंबित करने के लिए पिपेट ।
  3. 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन, ट्यूब हर 2 मिनट झाड़ना सेल पृथक्करण मदद करने के लिए ।
    नोट: जब NS पहुंच प्रवाह, वे आमतौर पर छोटे सफेद क्षेत्रों के रूप में macroscopically देखा जा सकता है । सेल पृथक्करण को आश्वस्त करने के लिए सभी दिखाई देने वाले एनएस गायब हो गए होंगे ।
  4. HBSS 1x और पिपेट की 5 मिलीलीटर कई बार जोड़ें । 5 मिनट के लिए ३०० x g पर गोली कोशिकाओं supernatant त्यागें । रिकॉमबिनेंट EGF और बुनियादी FGF के साथ पूरक एनएससी मीडिया के 5 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित ।
  5. एक टी-७५ कुप्पी में ३७ डिग्री सेल्सियस में एक ऊतक संस्कृति मशीन के वातावरण के साथ ९५% हवा और 5% सह2में एनएससी मीडिया और संस्कृति के 15 मिलीलीटर के लिए कक्षों की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. वृद्धि कारकों (EGF और बुनियादी FGF) हर 3 दिन जोड़ें । यदि मीडिया प्रकाश नारंगी बदल जाता है और कोशिकाओं को अभी तक धाराप्रवाह नहीं हैं, मीडिया बदल जाते हैं । ऐसा करने के लिए, 4 मिनट के लिए ३०० x g पर एनएस केंद्रापसारक और फिर से एनएससी मीडिया में विकास कारकों के साथ पूरक निलंबित ।
    नोट: गोली का गठन के आकार पर निर्भर करता है, कोशिकाओं को और अधिक कुप्पी में विभाजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।

3. लंबी अवधि के भंडारण के लिए फ्रीज एनएस

  1. जब NS कल्चर धाराप्रवाह हो जाता है, तो चरण 2.1-2.4 में बताए गए अनुसार कक्षों को अलग कर देना । एक बार गोली HBSS में फिर से निलंबित कर दिया गया है, एक aliquot को हटाने और कोशिकाओं की गिनती ।
  2. 4 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और supernatant के रूप में संभव के रूप में ज्यादा हटा दें ।
  3. फिर से ठंड में गोली निलंबित मीडिया (गर्मी-निष्क्रिय FBS, 10% DMSO) । यह 1 x 106 और 3 x 106 प्रति शीशी प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं के बीच फ्रीज करने के लिए सिफारिश की है ।
  4. की जरूरत के रूप में कई cryovials के रूप में फिर से निलंबित कोशिकाओं को विभाजित और धीरे से पहले उन्हें बर्फ के लिए स्थानांतरित करके शीशियों के नीचे शांत, तो करने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस, तो करने के लिए-८० ° c, और अंत में एक तरल नाइट्रोजन भंडारण कंटेनर के लिए अगले दिन.

4. ट्यूमर एनएस का निर्धारण

  1. संस्कृति ट्यूमर 2-3 दिनों के लिए एक टी-25 कुप्पी में एनएस जब तक कोशिकाओं (~ 3 एक्स 106 कोशिकाओं) धाराप्रवाह हैं । एक से कम एक टी-25 धाराप्रवाह कुप्पी से एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ट्यूमर एनएस लीजिए । 5 मिनट के लिए ३०० x g पर गोली ।
  2. फिर से 10% formalin के 1 मिलीलीटर में गोली निलंबित और कमरे के तापमान पर रखने के लिए (आरटी) 10 मिनट के लिए 1x HBSS के 5 मिलीलीटर जोड़ें और गोली के रूप में चरण ३.२ में किया कोशिकाओं । इस चरण को एक और बार दोहराएं ।
  3. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब बर्फ पर गोली युक्त प्लेस ।

5. आयल ट्यूमर एनएस की embedding

  1. 2% गर्म तरल agarose के ५०० µ एल में धोया एनएस गोली पुनः निलंबित और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण ।
  2. तुरंत बर्फ पर agarose-एंबेडेड एन एस agarose polymerizes जब तक जगह है । NS को आश्रय agarose टुकड़ा निकालें । ऊतक प्रसंस्करण के लिए कैसेट में एन एस के साथ बहुलक agarose टुकड़ा प्लेस (चित्रा 2) ।
  3. ऊतक प्रसंस्करण के साथ जारी रखें (एक स्वत: आयल प्रोसेसर का उपयोग) और आयल embedding (एक एंबेडिंग स्टेशन का उपयोग) ।

6. आयल-एंबेडेड एन एस के अनुभाग

  1. ४२ डिग्री सेल्सियस के लिए पानी स्नान सेट और ध्यान से microtome पर ब्लेड डालने के लिए सुनिश्चित करें कि यह स्तरित है बनाने के लिए दो पेंट ब्रश का उपयोग कर । केवल ट्रिमिंग के लिए इस ब्लेड का प्रयोग करें ।
  2. microtome पर आयल ब्लॉक लगाएं । गैर प्रमुख हाथ के साथ, बाएं हाथ की ओर है कि प्रत्येक अनुभाग की मोटाई को नियंत्रित करता है पर स्थित लीवर पर नीचे दबाएं । एक 30 µm मोटाई इंगित करता है कि दूसरा रोकने के लिए दबाएँ.
  3. ब्लॉक ट्रिमिंग शुरू (यानी, अतिरिक्त तेल हटाने) सही हाथ के साथ मोटे हाथ पहिया मोड़ से जब तक नमूना की सतह तक पहुंच गया है । इस बिंदु पर, या तो 10 माइक्रोन या 5 माइक्रोन ट्रिम मोटाई को नियंत्रित करता है कि लीवर छोड़ें । जब नमूना की सतह तक पहुँच गया है ट्रिमिंग रोकें ।
  4. बर्फ के साथ एक बर्फ बॉक्स भरें और बस इतना पानी जोड़ें कि जब आयल ब्लॉक बर्फ पर रखा गया है, पानी आयल ब्लॉक के आसपास एक फिल्म के रूप में कार्य करता है, यह सीधे बर्फ छू से बचाने । 20 मिनट के लिए बर्फ पर आयल ब्लॉक मशीन ।
  5. पुराने ब्लेड त्यागें और अनुभाग के लिए एक नया एक डालें । सूखी धुंध का उपयोग कर ब्लॉक, तो यह microtome पर जगह है ।
  6. गैर प्रमुख हाथ के साथ, घुमावदार संदंश कि आयल रिबन खींचने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की एक जोड़ी प्राप्त करें । दाहिने हाथ के पास एक नम पेंट ब्रश रखो, जो पानी के स्नान के लिए आयल रिबन हस्तांतरण किया जाएगा । एक तेज गति से दाहिने हाथ से मोटे हाथ का पहिया मोड़कर धारा को शुरू करें । बाएं हाथ में संदंश का उपयोग करने के लिए आयल रिबन पकड़ो ।
  7. जल स्नान करने के लिए आयल रिबन हस्तांतरण करने के लिए नम पेंट ब्रश का प्रयोग करें ।
  8. संदंश की वक्र का उपयोग करने के लिए अलग से सतही रूप से दो तेल वर्गों के बीच में संदंश रखकर वर्गों को तोड़ने, तो दो वर्गों धीरे दूर धक्का ।
    नोट: यह प्रस्ताव पूरी तरह से तेल अनुभाग की सतह पर होना चाहिए । अनुभाग पर नीचे प्रेस मत करो ।
  9. सकारात्मक चार्ज आसंजन माइक्रोस्कोप स्लाइड पर अलग आयल वर्गों धक्का करने के लिए नम पेंट ब्रश का प्रयोग करें ।
  10. स्लाइड्स को स्लाइड बक्सों में संग्रहीत करने से पहले एक केमिकल हुड के अंदर रात भर सूखने की अनुमति दें । स्लाइड का भंडारण प्रदर्शन दाग के प्रकार पर निर्भर करता है ।

7. Immunohistochemistry (आइएचसी) का आयल-एंबेडेड एनएस

  1. एक धातु रैक में स्लाइड रखकर और उंहें ६० ° c पर 20 मिनट के लिए गर्मी में तेल पिघला ।
  2. आर टी सी में एक जलयोजन ट्रेन में गर्मी से स्लाइड Deparaffinize: 5 मिनट के लिए 3x xylene, १००% 2 मिनट के लिए 2x इथेनॉल, 2 मिनट के लिए ९५% 2x इथेनॉल, 2 मिनट के लिए ७०% 1x इथेनॉल, और 1x 2 min. Hereon के लिए पानी में, स्लाइड रखें प्रतिजन तक नल में पानी है़ , के रूप में बाहर सुखाने गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी कारण होगा ।
  3. साइट्रेट बफर में स्लाइड मशीन (10 मिमी साइट्रिक एसिड, ०.०५% गैर ईओण डिटर्जेंट, पीएच 6) १२५ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए और ९० डिग्री सेल्सियस पर 10 एस के लिए । उन्हें ठंडा होने दें, फिर स्लाइड को 5 बार आसुत जल से कुल्ला करें ।
  4. ०.३% एच2में आरटी पर स्लाइड की मशीन 30 मिनट के लिए2 हे ।
  5. धोने बफर में 3 बार स्लाइड धो (टीबीएस में ०.०२५% डिटर्जेंट) कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए ।
  6. 30 मिनट के लिए समाधान अवरुद्ध (10% हार्स सीरम, टीबीएस में ०.१% BSA) के साथ आर टी पर स्लाइड ।
  7. एक humidified चैंबर में 4 ° c में रातोंरात स्लाइड कमजोर पड़ने समाधान में तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ गर्मी (०.१% BSA में टीबीएस) । 3 बार धोने बफर में कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लो ।
  8. biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले समाधान में तैयार के साथ 1 एच के लिए आरटी पर स्लाइड की मशीन । 3 बार धोने बफर में कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लो ।
  9. avidin-biotinylated सहिजन peroxidase परिसर के साथ 30 मिनट के लिए आर टी के अंधेरे में आरटी पर स्लाइड । 3 बार धोने बफर में कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लो ।
  10. सी. टी.-ज22 सब्सट्रेट यहां 2-5 मिनट के लिए आरटी पर ब्रांडों के साथ स्लाइड ।
  11. पानी के नल के साथ 3 बार कुल्ला । डुबकी (1-2 s) counterstain करने के लिए hematoxylin समाधान में स्लाइड, और उन्हें साफ करने तक नल के पानी में अच्छी तरह से कुल्ला.
  12. इस प्रकार के रूप में स्लाइड निर्जलीकरण: 2 मिनट के लिए आसुत जल में मशीन, ८०% इथेनॉल में 3 बार डुबकी, ९५% इथेनॉल में 2 मिनट प्रत्येक के लिए 2 बार, मशीन, १००% इथेनॉल में 2 मिनट प्रत्येक के लिए 2 बार मशीन, और अंत में 3 मिनट के लिए प्रत्येक xylene में 3 बार ।
  13. Coverslip एक xylene आधारित बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड और उंहें आरटी पर एक सपाट सतह पर शुष्क जब तक वे इमेजिंग के लिए तैयार हैं ।       नोट: यदि प्रदर्शन 3, 3 '-diaminobenzidine (ढाब) धुंधला, स्लाइड आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है । हालांकि, अगर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला कर दिया जाता है, स्लाइड पर अंधेरे में संग्रहित किया जाना चाहिए-20 डिग्री सेल्सियस फोटो ब्लीचिंग को कम करने के लिए ।

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Representative Results

ट्यूमर के विकास की निगरानी और ट्यूमर के लिए आवश्यक आकार तक पहुँच गया है, तो मूल्यांकन एनएस उत्पन्न करने के लिए, हम bioluminescence का उपयोग ट्यूमर द्वारा उत्सर्जित luminescence का विश्लेषण किया. यह luciferase (चित्रा 1 और 1b) के luminescence संकेत द्वारा पिल्ले और ट्यूमर प्रगति में transduction दक्षता के अध्ययन की अनुमति देता है । जब ट्यूमर का आकार 1 x 107 फोटॉनों/s/cm2/sr (चित्रा 1) के एक संकेत तक पहुंचता है, मस्तिष्क एनएस पीढ़ी के लिए संसाधित किया जा सकता है । इस प्रणाली का एक और लाभ यह है कि विभिंन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कोडिंग अनुक्रम जीन वितरण और ट्यूमर पीढ़ी के लिए इस्तेमाल plasmids को जोड़ा जा सकता है । हम तो डाला आनुवंशिक परिवर्तन की अभिव्यक्ति की पुष्टि कर सकते हैं, एक फ्लोरोसेंट लैंप (चित्रा 1सी) से सुसज्जित एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । wt से उत्पन्न एनएस-IDH1 (चित्रा 1डी) और mIDH1 (चित्रा 1) ट्यूमर विशेषता गोलाकार आकृति विज्ञान द्वारा पहचाने जाते हैं, और विशिष्ट आनुवंशिक घावों के साथ जुड़े fluorophores की अभिव्यक्ति ( यानी, shATRX और shp53 से जुड़े GFP, और mIDH1 के साथ जुड़े Katushka; चित्रा 1 D1E). एन एस पर आइएचसी के साथ आगे बढ़ना करने के लिए, कोशिकाओं को ठीक कर रहे हैं, तो agarose और आयल (चित्रा 2) में एंबेडेड । आयल ब्लॉक्स में एनएस एम्बेड करने से एनएस की 3डी संरचनाओं के संरक्षण और दीर्घकालिक भंडारण की अनुमति सहित कई फायदे हैं । एंबेडेड एन एस विशिष्ट तंत्रिकाबंधार्बुद के लिए दाग हो सकता है । इस तकनीक का उपयोग कर, हम ATRX की अभिव्यक्ति का विश्लेषण, Ki67 और OLIG2 (oligodendrocyte विभेद मार्कर) (चित्रा 3A-2 सी). हम हमारे एनएस संस्कृतियों में ATRX प्रोटीन के कम अभिव्यक्ति स्तर की पुष्टि की (चित्रा 3), जो रेनिन तंत्रिकाबंधार्बुद उपप्रकार की एक विशेषता है वर्तमान में4अध्ययन किया जा रहा है । इसके अलावा, Ki-६७, सेल प्रसार के एक अच्छी तरह से वर्णित है, mIDH1 एनएस (चित्रा 3बी) में सकारात्मक था, सक्रिय प्रसार का प्रदर्शन, जो ट्यूमर कोशिकाओं की एक प्रमुख विशेषता है । दिलचस्प है, बड़े तंत्रिकाबंधार्बुद एन एस क्लस्टर के केंद्र में स्थानीयकृत कोशिकाओं-६७ (चित्रा 3बी) के लिए नकारात्मक थे, यह दर्शाता है कि वे proliferating नहीं थे, की परिधि के लिए स्थानीय-६७ सकारात्मक कोशिकाओं के विपरीत । इस घटना तथ्य यह है कि परिधीय कोशिकाओं के विकास के मीडिया से पोषक तत्वों तक पहुंच नहीं है के कारण हो सकता है । जब वे इस बड़े आकार तक पहुंचते हैं, तो तंत्रिकाबंधार्बुद NS को असंबद्ध और गद्यांश किया जाना चाहिए । अंत में, wt-IDH1 एनएस Olig2, एक प्रतिलेखन कारक oligodendrocyte भेदभाव (चित्रा 3सी) में भाग लेने के लिए सकारात्मक थे ।

Figure 1
चित्रा 1 : तंत्रिकाबंधार्बुद neurospheres GFP से उत्पंन-और Katushka-सकारात्मक स्लीपिंग ब्यूटी (SB) ब्रेन ट्यूमर । (क) एक neonate माउस के Luminescent संकेत SB के साथ इंजेक्शन-transposase प्लाज्मिड plasmids के साथ संयोजन में आनुवंशिक घावों हार्बर तंत्रिकाबंधार्बुद के लिए प्रेरित करने के लिए (NRAS/shP53/ (ख) १३२ दिनों के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) पर ट्यूमर के विकास का संकेत Luminescence । (ग) एक उज्ज्वल क्षेत्र और एक मस्तिष्क की फ्लोरोसेंट छवि एक चूहा है कि अंत बिंदु मंच तक पहुंच से काटा । ट्यूमर क्षेत्र बिंदीदार रेखा से delineated और फ्लोरोसेंट पत्रकारों, GFP और Katushka के लिए सकारात्मक है । (डी और ई) shP53 और shATRX से जुड़े GFP व्यक्त करने वाले एसबी ब्रेन ट्यूमर से उत्पन्न ट्यूमर neurospheres; और IDH1-R132H से जुड़े Katushka. स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2 : आयल-एंबेडेड तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस के लिए कार्यप्रवाह का प्रतिनिधित्व । एनएस एक टी-25 कुप्पी से एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एकत्र और 10% formalin में तय कर रहे हैं । फिर, एन एस HBSS के साथ धोया और 2% agarose में एंबेडेड रहे हैं । पॉलिमर agarose युक्त तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस ऊतक प्रसंस्करण और आयल embedding के लिए एक कैसेट में रखा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : एचआरपी के साथ immunohistochemistry के प्रतिनिधि परिणाम--विरोधी चिह्नों के ढाब का पता लगाने । (A-C) आइएचसी पर प्रदर्शन किया आयल-एम्बेडेड mIDH1 तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस ATRX के लिए दाग (ए) और Ki67 (बी), और wt-IDH1 तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस OLIG2 (सी) के लिए दाग । लाल तीर-मार्कर धुंधला के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का संकेत है । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

इस अनुच्छेद में, हम विस्तार एक बहुमुखी और reproducible विधि पर immunohistochemistry प्रदर्शन करने के लिए आयल-एंबेडेड तंत्रिकाबंधार्बुद एनएस, जो ट्यूमर कोशिकाओं की विशेषता 3d संरचना को बनाए रखने में सीटू मेंमस्तिष्क में बढ़ रही है । यह तकनीक कांच या प्लास्टिक सतहों पर चढ़ाया कोशिकाओं का उपयोग कर पर निंनलिखित लाभ के पास: i) एनएस के 3d संरचना का संरक्षण; ii) प्रोटीन एक्सप्रेशन के विश्लेषण से पहले कोशिका पृथक्करण के तनाव से बचना; iii) आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ट्यूमर एनएस से किसी भी अंतर्जात fluorophore अभिव्यक्ति की शमन, फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रा भर में धुंधला को सक्षम करने; और iv) दीर्घकालिक भण्डारण ।

इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं को फिर से agarose में अच्छी तरह से निलंबित कर रहे है सुनिश्चित करने के लिए कि वे homogenously वितरित कर रहे है और एक साथ नहीं झुरमुट । इस तकनीक की एक सीमा समय लेने सेल संवर्धन और एन एस प्रसंस्करण आइएचसी धुंधला प्रक्रिया से पहले से संबंधित कदम है । एक दूसरी सीमा इस पद्धति को निष्पादित करने के लिए आवश्यक कक्षों की उच्च संख्या है । यदि कक्षों की संख्या 1 x 106 कक्षों से कम है, तो प्रत्येक अनुभाग में दृश्य NS क्लस्टर्स के प्रति फ़ील्ड बहुत कम कक्ष होंगे । इसलिए, अगर तंत्रिकाबंधार्बुद सेल संस्कृति धीमी गति से बढ़ रही है कोशिकाओं के आदर्श संख्या तक पहुंचने के लिए मुश्किल हो सकता है । हमने एक धाराप्रवाह टी-25 कुप्पी का उपयोग किया जिसमें कम से ३.० x 106 कोशिकाएं शामिल हैं । उपयोग किए गए कक्षों की संख्या वांछित के रूप में संशोधित की जा सकती है; हालांकि, यह एंबेडिंग प्रक्रिया के लिए उपयुक्त आकार के एक एनएस गोली प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । इस के बाद, एंबेडेड एन एस एक नियमित रूप से तेल-एंबेडेड ब्लॉक के रूप में हेरफेर किया जा सकता है, और यह तो अनुभाग और आइएचसी के लिए आगे बढ़ना इम्यूनोफ्लोरेसेंस या आइएचसी द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए धुंधला कर सकते है ढाब धुंधला ।

ब्लॉक के खंड और आइएचसी के लिए प्रोटोकॉल का पालन करने के बाद, वर्गों hematoxylin (नीला) के साथ counterstained किया जाना चाहिए । यदि ऊतक लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त करता है, एक भूरे रंग के संकेत दिखाई (चित्रा 3) होना चाहिए । आइएचसी के बाद यदि वर्गों भी भूरे रंग (उच्च पृष्ठभूमि) हैं, यह 1 के कारण हो सकता है) गैर माध्यमिक एंटीबॉडी के विशिष्ट बाईडिंग, 2) अंतर्जात peroxidase, या 3 की एक अधूरी शमन) अपर्याप्त अवरुद्ध । इन मुद्दों 1 से हल किया जा सकता है) एक नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड का उपयोग (केवल एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन) माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बाध्यकारी की जांच करने के लिए, 2) peroxidase शमन समय में वृद्धि, या 3) अवरुद्ध गर्मी की अवधि में वृद्धि । दूसरी ओर, यदि कोई संकेत का पता लगाया है, यह संभव है कि epitopes अभी भी नकाबपोश हैं, जो antigen पुनर्प्राप्ति के लिए उपयोग किया गया बफ़र के प्रकार से संबंधित हो सकता है । हमारे अनुभव में, हम संतोषजनक साइट्रेट बफर का उपयोग दाग पड़ा है, लेकिन यह ऊतक-और एंटीबॉडी-निर्भर हो सकता है, और antigen पुनर्प्राप्ति बफ़र्स के लिए विभिंन योगों ०.१ M Tris-HCl (pH ८.०) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है बफर21। इन सबसे आम आइएचसी धुंधला से संबंधित मुद्दों में से कुछ हैं, लेकिन अगर अंय कठिनाई पैदा होती है, समस्या निवारण के रूप में किसी भी अंय आइएचसी के साथ किया जाना चाहिए (यानी, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के विभिंन कमजोर पड़ने की कोशिश कर रहा, अलग अवरुद्ध रिएजेंट, विभिंन ब्लॉकिंग बार, आदि) ।

तेल-एंबेडेड कोशिकाओं का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक वैकल्पिक विधि पहले Hasselbach एट अल द्वारा वर्णित किया गया था । 20. इस विधि agarose चरण, जो इस प्रोटोकॉल में 3d कक्ष क्लस्टर्स के पर्याप्त विशेष वितरण सक्षम करने के लिए शामिल नहीं है । हम भी एनएस संवर्धन, passaging, और लंबी अवधि के भंडारण के लिए ठंड के लिए एक सटीक विधि का वर्णन । इस विधि भी कैसे इकट्ठा, फिक्स, और 3 डी संरचना (चित्रा 2) फेरबदल के बिना एनएस एंबेड करने के लिए दिखाता है ।

के बाद से एनएस तंत्रिकाबंधार्बुद रोगियों और तंत्रिकाबंधार्बुद पशु मॉडल से प्राप्त ऊतक से उत्पंन किया जा सकता है, इस तकनीक का गठन एक शक्तिशाली उपकरण है कि विभिंन तंत्रिकाबंधार्बुद suptypes में एक अगोचर अभिव्यक्ति का विश्लेषण और मूल मॉडल मांय इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां हम एनएस के साथ तकनीक का वर्णन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर SB transposase प्रणाली (चित्रा 1) का उपयोग चूहों से उत्पंन । हालांकि, इस तकनीक को भी तेल में प्रोटीन का विश्लेषण-एंबेडेड मानव तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं है कि प्रोटोकॉल के संशोधनों के बिना 3d संस्कृतियों के रूप में विकसित, सेल संस्कृति की स्थिति के अलावा अंय इस्तेमाल किया जा सकता है । तो, इस विधि भी 3 डी प्रत्यारोपण पशु मॉडल, मानव PDX मॉडल से प्राप्त संस्कृतियों के लिए लागू किया जा सकता है, और अंय आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल । अंत में, इस विधि कैंसर के अंय प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, दोनों माउस मॉडल और मानव कैंसर, ग्लियोमास के अलावा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया/मस्तिष्क संबंधी विकारों के राष्ट्रीय संस्थान & स्ट्रोक (NIH/NINDS) पलाश R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 को M.G.C.; NIH/NINDS पलाश R01-NS076991, R01-NS082311, और R01-NS096756 को P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; न्यूरोसर्जरी विभाग; लिआ के M.G.C. और P.R.L. को खुश दिल; और आरएनए M.G.C. F.M.M. के लिए F046166 अनुदान एक F31 NIH/NINDS-F31NS103500 द्वारा समर्थित है । जेपी एक फुलब्राइट द्वारा समर्थित था-अर्जेंटीना खेल और शिक्षा फैलोशिप मंत्रालय ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coated microtome blade HP35 Thermo Scientific 3150734
Microtome RM 2135 Leica MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-aldrich HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX, Santa Cruz Biotechnology sc-15408 IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67 Abcam Ab15580 IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2 Millipore AB9610 IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated Dako E0432 IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit Vector Laboratories Inc PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT Biocare medical BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048
N-27 Supplement ThermoFisher A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution Biolegend 423201
AGAROSE LE GoldBio A-201-1000
Genesee Sc. Corporation Olympus 15 ml 21-103
Genesee Sc. Corporation TC-75 treated Flask 25-209
Genesee Sc. Corporation TC-25 treated Flask 25-207
DMEM/F12 Gibco 11330-057 NS media
HBSS GibcoTM 14175-103 balanced salt solution
C57BL/6 Taconic B6-f C57BL/6 mouse

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References

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