Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

Cancer Research

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Summary

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

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Núñez, F. J., Mendez, F. M., Garcia-Fabiani, M. B., Pardo, J., Edwards, M., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (143), e58931, doi:10.3791/58931 (2019).

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Abstract

Análise da expressão da proteína no glioma é relevante para vários aspectos no estudo da sua patologia. Inúmeras proteínas têm sido descritas como biomarcadores com aplicações no diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Essas análises de biomarcadores também são úteis para caracterizar o tumor neurospheres (NS) gerados a partir de pacientes de glioma e modelos de glioma. Tumor NS fornecem um modelo valioso em vitro para avaliar diferentes características do tumor do qual eles são derivados e podem com mais precisão o espelho glioma biologia. Aqui nós descrevemos um método detalhado para analisar biomarcadores em tumor NS usando imuno-histoquímica (IHC) tumor de parafina NS.

Introduction

Gliomas são tumores sólidos primários do sistema nervoso central, classificadas por suas características fenotípicas e genotípicas de acordo com a Organização Mundial de saúde1. Esta classificação incorpora a presença ou ausência de mutações do motorista, que representam uma fonte atraente de biomarcadores2. Biomarcadores são características biológicas que podem ser medidas e avaliadas para indicar processos normais e patológicos, bem como respostas farmacológicas para uma intervenção terapêutica3. Biomarcadores podem ser detectados no tecido do tumor e células derivadas de glioma, permitindo a sua caracterização biológica em diferentes aspectos. Alguns exemplos de biomarcadores de glioma mutante isocitrato desidrogenase 1 (IDH1), uma enzima mutante característica de gliomas de baixo grau associadas a melhor prognóstico4. IDH1 mutado é expressa frequentemente em combinação com TP53 e síndrome de deficiência de alfa-talassemia/mental ligada ao X (ATRX)-Inactive mutações, definindo um glioma específico de subtipo4,5. ATRX-inactivar as mutações também ocorrem em 44% dos gliomas de alto grau pediátrica2,6 e têm sido associadas com tumores agressivos e instabilidade genômica6,7. Além disso, pediátricas gliomas Pontinas intrínsecas difusas (DIPG) são diferenciadas em subgrupos de acordo com a presença ou ausência de uma mutação K27M no gene de histona H3 H3F3A, ou no gene1,HIST1H3B/C6. Portanto, a introdução de caracterização molecular permite a subdivisão, estudo e tratamento de gliomas como entidades separadas, o que permitirá mais o desenvolvimento de mais direcionados a terapias para cada subtipo. Além disso, a análise de biomarcadores pode ser usada para avaliar diferentes processos biológicos, tais como apoptose8, autofagia9, de progressão do ciclo celular10, proliferação de célula11e diferenciação celular12 .

Modelos de animais geneticamente modificados que abrigam as lesões genéticas presentes em cânceres humanos são fundamentais para o estudo da sinalização de caminhos que medeiam a progressão da doença. Nosso laboratório implementou o uso do sistema de transposase beleza dormindo (SB) para desenvolver modelos de rato geneticamente modificados de glioma abrigando mutações específicas que recapitular glioma humano subtipos13,14. Estes modelos de rato geneticamente modificados são usados para gerar tumor derivado NS, que permitem estudos em vitro em um sistema 3D, espelhamento principais características presentes nos tumores in situ15. Além disso, o transplante de orthotopical de NS em ratos pode gerar tumores secundários que retêm características do tumor primário e imitam as propriedades fenotípicas, genômicas e histopatológicas do tumor primário correspondente15.

Em cultura livre de soro, células de tumor cerebral com propriedades de célula-tronco podem ser enriquecidas, e na presença de fatores de crescimento epidérmico (EGF) e fatores de crescimento do fibroblasto (FGF), eles podem ser crescidos como colônias única derivado de células, tais como culturas de NS. Neste sistema de cultura seletiva, a maioria das células de diferenciação ou diferenciados rapidamente morrer, Considerando que as células-tronco dividir e formar os grupos celulares. Isto permite a geração de uma cultura de NS que mantém glioma tumor características16,17,18. Glioma NS pode ser usado para avaliar diversos aspectos da biologia do tumor, incluindo a análise de biomarcadores que têm aplicações em diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Aqui, detalhamos um protocolo para gerar glioma NS e incorporar as culturas 3D em parafina a ser usado para coloração de IHC. Uma vantagem da fixação e incorporação de glioma NS é que a morfologia do NS é mantida melhor em comparação ao convencional cytospin método19, no qual glioma NS estão sujeitos à manipulação estressante para dissociação da célula em tornam-se achatados. Além disso, a incorporação sacia qualquer expressão de fluoróforo endógena de tumor geneticamente NS, permitindo que a coloração em todo o espectro fluorescente. O objectivo geral deste método é para preservar a estrutura 3D de células de glioma através de uma processo de incorporação de parafina e permitir a caracterização de glioma neurospheres usando imuno-histoquímica.

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.

1. geração de Neurospheres de Tumor de cérebro derivado de um modelo de Mouse

  1. Antes do procedimento de dissecação, preparar a mídia de células-tronco neurais (NSC Media: DMEM/F12 com 1 suplemento de x B27, 1 x N2 suplemento, 1 x normocin e 1 x antibiótico/antimicótico suplementado com humano recombinante EGF e basic-FGF em concentrações de 20 ng/mL cada). Encher um tubo de 1,5 mL com 300 µ l de mídia NSC e reservar para mais tarde.
  2. Selecione um rato com um grande tumor.
    Nota: O tamanho de um tumor pode ser monitorado por bioluminescência se o plasmídeo ou vírus injetado codifica luciferina. Geralmente, um grande tumor tem uma bioluminescência de > 106 fótons/s/cm2/sr.
  3. Eutanásia o mouse com uma overdose de isoflurano: infundir um papel de tecido com isoflurano e introduzir o tecido em uma câmara de eutanásia, evitando o contato direto com os ratos para evitar a irritação. Espere até que os ratos não mostram um reflexo pedal (geralmente 5-10 min). Decapitar o mouse e dissecar o cérebro conforme descrito em Calinescu et al 13.
  4. Se os tumores são fluorescentes, use um dissecação microscópio equipado com uma lâmpada fluorescente para identificar a massa tumoral dentro do cérebro. Com a pinça fina, disse o tumor (geralmente de 5 a 7 mm de diâmetro) no tecido cerebral normal.
  5. Coloque o tumor dissecado no tubo de 1,5 mL com mídia NSC (etapa 1.1). Homogeneizar o tumor com um pilão de plástico descartável que se encaixa as paredes do tubo microcentrifuga aplicando uma pressão suave.
  6. Para dissociar as touceiras de célula, adicione 1 mL de mídia livre de enzima dissociação e incubar durante 5 min a 37 ° C.
  7. Filtrar a suspensão através de um filtro de célula 70 µm e lavar o filtro com 20 mL de mídia NSC.
  8. Centrifugar a 300 x g por 5 min, decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 6 mL ou 15 mL de mídia do NSC, dependendo do tamanho da pelota.
  9. Placa da suspensão de células de tumor em um frasco de cultura T-25 ou T-75 e cultura a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos, com uma atmosfera de 95% de ar e 5% CO2.
  10. Depois de 3 dias, transferir o NS suspenso saudável e re-placa-los em um frasco de cultura de tecidos T-25 ou T-75. Se necessário, adicione mais mídia NSC para a cultura.
    Nota: Normalmente, haverá uma população mista de células, alguns estarão mortos, alguns vão ter aderido e algumas vão ser formando NS que irá flutuar na mídia

2. manutenção e passagem do NS

Nota: Prevenir o crescimento excessivo e manter as células em densidade relativamente alta. Confluência é determinada pelo tamanho de esferas (pretos centros de grandes esferas supercrescimento de média). A taxa de crescimento do NS dependerá as oncogenes usados para gerar tumores.

  1. Uma vez que a cultura de NS alcançou a confluência, pelota o NS a 300 x g por 5 min e coletar a cultura num tubo de centrífuga estéril.
  2. Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 mL da solução de desprendimento de célula Pipetar para Ressuspender o pellet.
  3. Incube a 37 ° C por 5 min, passando rapidamente o tubo cada 2 min para ajudar a dissociação de célula.
    Nota: Quando NS alcançar confluência, eles podem ser normalmente vistos macroscopicamente como pequenas esferas brancas. Para assegurar a dissociação de célula, pelo menos todos os NS visíveis deve ter desaparecido.
  4. Adicionar 5 mL de HBSS 1 x e pipeta várias vezes. Pellet de células a 300 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante. Ressuspender o pellet em 5 mL de mídia NSC suplementada com recombinante EGF e basic-FGF.
  5. Adicione 1 mL de células para 15 mL de NSC mídia e cultura num balão de T-75 a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos, com uma atmosfera de 95% de ar e 5% CO2.
  6. Adicione fatores de crescimento (EGF e basic-FGF) a cada 3 dias. Se a mídia se transforma luz laranja e as células ainda não são confluentes, mudar os meios de comunicação. Para fazer isso, centrifugar o NS a 300 x g, durante 4 min e ressuspender em mídia NSC suplementada com fatores de crescimento.
    Nota: Dependendo do tamanho da pelota formado, células podem precisar ser dividido em mais balões.

3. NS de congelamento para armazenamento a longo prazo

  1. Quando a cultura NS se tornar confluente, dissocia as células como descrito nos passos 2.1-2.4. Uma vez que o sedimento foi re-suspenso em HBSS, retirar uma alíquota e contar as células.
  2. Centrifugar as células em 300 x g, durante 4 min e remover o máximo possível do líquido sobrenadante.
  3. Ressuspender o pellet em congelamento mídia (FBS inactivados por calor, 10% DMSO). É aconselhável congelar entre 1 x 106 e 3 x 106 células por frasco por mL.
  4. Divida as células re-suspensas em tantas cryovials como necessários e lentamente arrefecer os frascos pela primeira transferi-las para gelo, então a-20 ° C, então a-80 ° C e, finalmente, no dia seguinte para um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido.

4. fixação do Tumor NS

  1. Tumor de cultura NS num balão de T-25 por 2-3 dias até que as células são confluentes (~ 3 x 106 células). Recolha o tumor NS em um tubo cônico de 15 mL de um frasco confluente menos de um T-25. Pelota a 300 x g por 5 min.
  2. Ressuspender o pellet em 1 mL de formol a 10% e manter à temperatura ambiente (RT) por 10 min. adicionar 5 mL de 1 x HBSS e as células como feito no passo 3.2 de Pelotas. Repita essa etapa mais uma vez.
  3. Coloque o tubo cônico de 15 mL, contendo a pelota no gelo.

5. parafina incorporação de Tumor NS

  1. Ressuspender o pellet NS lavado em 500 µ l de 2% de agarose líquido morno e misture suavemente pipetando.
  2. Coloca imediatamente o NS de agarose-incorporado no gelo até se polimeriza a agarose. Retire o pedaço de agarose abrigando o NS. Coloque o pedaço de agarose polimerizado com o NS na gaveta para tecido de transformação (Figura 2).
  3. Continuar com o processamento do tecido (usando um processador automático de parafina) e incorporação de objetos (usando uma estação de encaixe) de parafina.

6. corte de parafina NS

  1. Definir o banho-maria a 42 ° C e coloque a lâmina sobre o micrótomo com cuidado, usando dois pincéis para certificar-se de que está nivelado. Use esta lâmina apenas para aparar.
  2. Coloque o bloco de parafina no micrótomo. Com a mão não dominante, pressione a alavanca localizada no lado esquerdo que controla a espessura de cada seção. Pressione para a segunda parada que indica uma espessura de 30 µm.
  3. Começar a aparar o bloco (i. e., removendo o excesso parafina) girando a roda de mão grossa com a mão direita até atingir a superfície da amostra. Neste ponto, solte a alavanca que controla a espessura guarnição a 10 μm ou 5 μm. Pare de aparar quando a superfície da amostra é alcançada.
  4. Preencher uma caixa de gelo com gelo e adicione água suficiente apenas para que quando o bloco de parafina é colocado no gelo, a água atua como um filme em torno do bloco de parafina, protegendo-o de tocar diretamente o gelo. Incube o bloco de parafina no gelo por 20 min.
  5. Descarte a lâmina velha e inserir um novo para a corte. Bloco seco usando gaze, coloque-o sobre o micrótomo.
  6. Com a mão não dominante, obter um par de pinças curvas que serão usados para puxar a fita de parafina. Manter um pincel úmido perto da mão direita, que será usado para transferir a faixa de opções de parafina para banho. Começar a seção girando a roda de mão grossa com a mão direita em um rápido ritmo. Use a pinça na mão esquerda para segurar a fita de parafina.
  7. Use o pincel úmido para transferir a fita de parafina para o banho de água.
  8. Use a curva da pinça para separar as seções superficialmente colocando a pinça entre as duas secções de parafina, e pressionando as duas seções fora delicadamente.
    Nota: Este movimento deve ser totalmente sobre a superfície da seção de parafina. Não pressione a seção.
  9. Use o pincel úmido para empurrar as seções separadas de parafina em corrediças do microscópio de adesão carregadas positivamente.
  10. Permitir que os slides para secar durante a noite dentro de uma capa de química antes de armazená-los em caixas de slide. O armazenamento de slides depende do tipo de mancha realizada.

7. imuno-histoquímica (IHC) de parafina NS

  1. Derreta parafina colocando os slides em uma cremalheira do metal e incubando-os a 60 ° C por 20 min.
  2. Deparaffinize os slides de incubação em um trem de reidratação em RT: 3x xileno por 5 min, 100% de etanol x 2 para 2 min, etanol a 95% x 2 para 2 min, etanol a 70% 1 x por 2 min e 1 x água desionizada para 2 min. Hereon, manter as lâminas em água da torneira até a recuperação do antígeno , como secagem causará a ligação do anticorpo específico.
  3. A incubar em tampão citrato (ácido cítrico de 10mm, 0,05% de detergente não-iônico, pH 6) a 125 ° C por 30 s e 90 ° c, durante 10 s. Deixe-as arrefecer e, em seguida, enxágue as lâminas 5 vezes com água destilada.
  4. Incube em RT em 0,3% H2O2 por 30 min.
  5. Lave as lâminas 3 vezes no tampão (0.025% de detergente na TBS) por 5 min com agitação suave de lavagem.
  6. A incubar em RT com bloqueio de solução (soro de cavalo de 10%, 0,1% BSA em TBS) por 30 min.
  7. A incubar durante a noite a 4 ° C, numa câmara umidificada com anticorpo primário, preparado em solução de diluição (0,1% BSA em TBS). Lave as lâminas 3 vezes no buffer para 5 min com agitação suave de lavagem.
  8. Incube os slides no RT para 1 h com anticorpo secundário biotinilado, preparado em solução de diluição. Lave as lâminas 3 vezes no buffer para 5 min com agitação suave de lavagem.
  9. Incube em RT no escuro por 30 min com peroxidase de rábano avidina-biotinilado complexo. Lave as lâminas 3 vezes no buffer para 5 min com agitação suave de lavagem.
  10. Incubar as lâminas com DAB-H2O2 substrato marcas aqui durante 2-5 min à RT
  11. Lavar 3 vezes com água da torneira. Mergulho (1-2 s) as lâminas em solução de hematoxilina de counterstain e enxague bem em água corrente até a clareira.
  12. Desidratar os slides como segue: incubar em água destilada por 2 min, mergulhe 3 vezes em 80% de etanol, incubar em etanol a 95% 2 vezes por 2 min cada, incubar em etanol 100% 2 vezes por 2 min cada e finalmente em xilol 3 vezes por 3 min cada.
  13. Lamela dos slides com um meio de montagem baseada em xileno e deixe-os secar sobre uma superfície plana em RT até que estejam prontos para a imagem latente.       Nota: Se executar 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) coloração, as lâminas podem ser armazenadas no RT No entanto, se a mancha da imunofluorescência é executada, slides devem ser armazenados no escuro a-20 ° C para reduzir a foto-branqueamento.

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Representative Results

Para monitorar o desenvolvimento do tumor e avaliar se o tumor tiver atingido o tamanho necessário para gerar NS, analisamos a luminescência emitida por tumores usando a bioluminescência. Isso permite que o estudo da eficiência de transdução nos filhotes e progressão do tumor pelo sinal da luminescência de luciferase (Figura 1A e 1B). Quando o tamanho do tumor atinge um sinal de 1 x 107 fótons/s/cm2/RS (Figura 1B), o cérebro pode ser processado para geração de NS. Outra vantagem deste sistema é que a sequência de codificação de proteínas fluorescentes diferentes pode ser adicionada para o plasmídeo utilizado para geração de entrega e tumor de gene. Podemos então confirmar a expressão das alterações genéticas inseridas, usando um microscópio de dissecação equipado com uma lâmpada fluorescente (Figura 1C). O NS gerado a partir de wt-IDH1 (Figura 1D) e mIDH1 (Figura 1E) tumores é identificado pela morfologia característica esférica e a expressão de fluorophores associado com a lesão genética específica ( i.., GFP associado com shATRX e shp53 e Katushka associados com mIDH1; Figura 1 D e 1E). Para proceder com o IHC em NS, células são fixos, então incorporadas em agarose e parafina (Figura 2). Incorporando o NS em blocos de parafina tem várias vantagens, incluindo a preservação de estruturas 3D do NS e permitindo para armazenamento a longo prazo. O NS incorporado podem ser manchado por biomarcadores específicos glioma. Usando esta técnica, analisamos a expressão de ATRX, Ki67 e OLIG2 (marcador de diferenciação oligodendrocyte) (Figura 3A-3_C). Confirmamos que os níveis de baixa expressão da proteína ATRX em nossas culturas NS(Figura 3),que é uma característica do glioma LGG subtipo atualmente sendo estudado4. Além disso, Ki-67, um biomarcador bem-descrito de proliferação celular, foi positivo em mIDH1 NS (Figura 3B), demonstrando a proliferação ativa, que é uma característica-chave de células tumorais. Curiosamente, as células localizadas no centro dos maiores clusters NS glioma foram negativas para Ki-67 (Figura 3B), indicando que eles não foram proliferando-, ao contrário das células de Ki-67 positivas localizadas na periferia. Este fenômeno pode ser devido ao fato de que as células periféricas não têm acesso aos nutrientes da mídia de crescimento. Quando atingirem este tamanho maior, o glioma NS deve ser dissociado e passada. Finalmente, o wt-IDH1 NS foram positivas para Olig2, um factor de transcrição participando de diferenciação oligodendrocyte (Figura 3C).

Figure 1
Figura 1 : Neurospheres de glioma gerado de GFP e Katushka-positivo dormindo tumor cerebral de beleza (SB). (A) luminescente sinal de um rato de neonato injetado com SB-transposase plasmídeo em combinação com plasmídeos abrigando lesões genéticas para induzir glioma (ARN/shP53/shATRX/IDH1-R132H). (B) luminescência indica o desenvolvimento do tumor em pós-injeção de 132 dias (DPI). (C) um brilhante-campo e imagem fluorescente de um cérebro de um rato que chegou à fase de ponto de extremidade colhida. A área de tumor é delineado pela linha pontilhada e positivo para os repórteres fluorescentes, GFP e Katushka. (D e E) Tumor neurospheres gerado a partir de tumores cerebrais SB, expressando GFP associada à shP53 e shATRX; e Katushka associada à IDH1-R132H. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Representação do fluxo de trabalho para parafina glioma NS. NS são coletadas de um frasco de T-25 em um tubo cônico de 15 mL e fixadas em formol a 10%. Em seguida, NS são lavados com HBSS e incorporados em agarose 2%. Polimerizado agarose contendo glioma NS são colocados em uma gaveta para processamento do tecido e a incorporação de parafina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Resultados representativos de imuno-histoquímica com HRP-DAB detecção de biomarcadores. (A-C) IHC realizada na parafina mIDH1 glioma NS manchado para ATRX (A) e Ki67 (B), e glioma wt-IDH1 NS manchado para OLIG2 (C). Setas vermelhas indicam células positivas para a coloração de biomarcador. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste artigo, detalhamos um método versátil e pode ser reproduzido para realizar a imuno-histoquímica na parafina glioma NS, que mantêm a estrutura 3D característica de células de tumor crescendo no cérebro em situ. Esta técnica possui as seguintes vantagens sobre usando células chapeadas em vidro ou superfícies de plástico: eu) preservação da estrutura 3D do NS; II) evitando stress de dissociação de célula antes da análise da expressão da proteína; III) têmpera de qualquer expressão de fluoróforo endógena de tumor geneticamente NS, permitindo que a coloração em todo o espectro fluorescente; e iv) armazenamento de longo prazo.

Um passo fundamental desta técnica é para garantir que as células são re-suspensas bem no agarose para garantir que eles são distribuídos homogênea e não aglutinados. Uma limitação dessa técnica é as demorado etapas relacionadas ao cultivo de células e NS processamento antes o IHC mancham o procedimento. Uma segunda limitação é o alto número de células necessárias para executar este método. Se o número de células é inferior a 1 x 106 células, haverá muito poucas células por campo de visão NS clusters em cada seção. Portanto, pode ser difícil de alcançar o número ideal de células, se a cultura de células de glioma é de crescimento lento. Usamos um frasco de T-25 confluente, contendo pelo menos 3,0 x 106 células. O número de células utilizadas pode ser modificado como desejado; no entanto, é necessário obter uma pelota de NS de tamanho apropriado para o procedimento de incorporação. Depois disto, o NS incorporado pode ser manipulado como um bloco de parafina regular, e ele pode então prosseguir para seccionamento e IHC coloração para analisar a expressão da proteína por imunofluorescência ou IHC usando DAB coloração.

Após o corte dos blocos e seguindo o protocolo para IHC, seções devem ser counterstained com hematoxilina (azul). Se o tecido exprime a proteína alvo, um sinal marrom deve ser visível (Figura 3). Se depois de IHC as seções são também marrons (fundo elevado), isto pode ser devido a lances de 1) não-específica do anticorpo secundário, 2) uma têmpera incompleta da peroxidase endógena, ou bloqueio 3) insuficiente. Esses problemas podem ser resolvidos por 1) usando um slide de controle negativo (incubado apenas com um anticorpo secundário) para verificar a ligação não-específica do anticorpo secundário, 2) aumentando a peroxidase extinguem tempo ou 3) aumentando o período de incubação de bloqueio. Por outro lado, se nenhum sinal for detectado, é possível que os epítopos ainda são mascarados, o que pode estar relacionado com o tipo do buffer usado para recuperação do antígeno. Em nossa experiência, temos tido satisfatória de coloração usando tampão citrato, mas isso pode ser de tecido e anticorpo-dependente, e diferentes formulações para os buffers de recuperação de antígeno podem ser usadas como 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) reserva21. Estas são algumas das questões mais comuns relacionadas à IHC mancha, mas se outra dificuldade surge, solução de problemas deve proceder como com qualquer outro IHC (i. e., tentando diferentes diluições dos anticorpos primários e secundários, bloqueio de diferentes reagentes, diferentes tempos de bloqueio, etc).

Um método alternativo para avaliar a expressão de proteínas usando parafina células anteriormente foi descrito por Hasselbach et al 20. este método não inclui as etapas de agarose, que no presente protocolo permitem adequada distribuição especial dos clusters de célula 3D. Também descrevemos um método exato para NS, cultivo, passagem e congelamento para armazenamento a longo prazo. Esse método também ilustra como recolher, consertar e incorporar NS sem alterar a estrutura 3D (Figura 2).

Desde que o NS pode ser gerado do tecido de glioma obtido de pacientes e modelos animais de glioma, esta técnica constitui uma ferramenta poderosa que pode ser usada para analisar a expressão de biomarcador no glioma diferentes suptypes e validar os modelos originais. Aqui descrevemos a técnica com NS originada-se ratos geneticamente modificados, utilizando o sistema de transposase SB (Figura 1). No entanto, esta técnica também pode ser usada para analisar proteínas nas células de glioma humano parafina que crescem como culturas 3D sem modificações ao protocolo, que não sejam as condições de cultura celular. Então, este método também pode ser aplicado para 3D culturas obtidas a partir de modelos animais para transplante, modelos humanos PDX e outros modelos geneticamente modificados. Por último, esse método pode ser usado com outros tipos de câncer, ambos os modelos do rato e cânceres humanos, além de gliomas.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo National institutos de saúde nacional Instituto de doenças neurológicas & Stroke (NINDS/NIH) subvenções R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 para M.G.C.; NINDS/NIH concede R01-NS076991 e NS082311-R01 R01-NS096756 a P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; o departamento de neurocirurgia; Corações feliz da Leah M.G.C. e P.R.L.; e RNA biomedicina Grant F046166 para M.G.C. F.M.M. é suportado por um F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. foi apoiado por um argentino Fulbright Ministério do esporte e educação Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coated microtome blade HP35 Thermo Scientific 3150734
Microtome RM 2135 Leica MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-aldrich HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX, Santa Cruz Biotechnology sc-15408 IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67 Abcam Ab15580 IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2 Millipore AB9610 IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated Dako E0432 IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit Vector Laboratories Inc PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT Biocare medical BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048
N-27 Supplement ThermoFisher A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution Biolegend 423201
AGAROSE LE GoldBio A-201-1000
Genesee Sc. Corporation Olympus 15 ml 21-103
Genesee Sc. Corporation TC-75 treated Flask 25-209
Genesee Sc. Corporation TC-25 treated Flask 25-207
DMEM/F12 Gibco 11330-057 NS media
HBSS GibcoTM 14175-103 balanced salt solution
C57BL/6 Taconic B6-f C57BL/6 mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131, (6), 803-820 (2016).
  2. Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14, (4), 439-452 (2014).
  3. Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131, (10), 1627-1638 (2012).
  4. Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164, (3), 550-563 (2016).
  5. Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372, (26), 2481-2498 (2015).
  6. Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32, (4), 520-537 (2017).
  7. Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8, (328), (2016).
  8. Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99, (6), 841-846 (2008).
  9. Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10, (10), 1081-1094 (2016).
  10. Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226, (2), 352-364 (2012).
  11. Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53, (1), 39-47 (2008).
  12. Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36, (3), 1943-1953 (2015).
  13. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  14. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69, (2), 431-439 (2009).
  15. Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2, (10), 1351-1363 (2015).
  16. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
  17. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26, (17), 2916-2924 (2008).
  18. Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133, (2), 263-282 (2017).
  19. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
  20. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
  21. Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183, (1), 116-123 (1997).

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