Utvärdering av biomarkörer i gliom av immunohistokemi på Paraffin-inbäddat 3D gliom Neurosphere kulturer

Cancer Research

GE Global Research must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Neurospheres odlas som 3D kulturer utgör ett kraftfullt verktyg för att studera gliom biologi. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra immunohistokemi bibehållen 3D-strukturen för gliom neurospheres genom paraffin inbäddning. Denna metod gör det möjligt för karakterisering av gliom neurosphere egenskaper såsom stemness och neurala differentiering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Núñez, F. J., Mendez, F. M., Garcia-Fabiani, M. B., Pardo, J., Edwards, M., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (143), e58931, doi:10.3791/58931 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analys av proteinuttryck i gliom är relevant för flera aspekter i studien av dess patologi. Många proteiner har beskrivits som biomarkörer med tillämpningar i diagnos, prognos, klassificering, av tumör progression, och cell differentiering medlemsstat. Dessa analyser av biomarkörer är också användbara att karakterisera tumör neurospheres (NS) genereras från gliom patienter och gliom modeller. Tumör NS ger en värdefull in vitro- modell för att bedöma olika funktioner av tumören från vilken de härrör och kan mer exakt spegel gliom biologi. Här beskriver vi en detaljerad metod för att analysera biomarkörer i tumör NS med immunhistokemi (IHC) på paraffin-inbäddat tumör NS.

Introduction

Gliom är primära solida tumörer i centrala nervsystemet klassificeras efter deras fenotypiska och genotypiska egenskaper enligt Världshälsoorganisationen1. Denna klassificering omfattar närvaron eller frånvaron av drivrutinen mutationer, som utgör en attraktiv biomarkörer2. Biomarkörer är biologiska egenskaper som kan mätas och utvärderas för att indikera normala och patologiska processer, liksom farmakologiska Svaren till en terapeutisk intervention3. Biomarkörer kan upptäckas i tumörvävnad och celler från gliom, gör det möjligt för dess biologiska karakterisering i olika aspekter. Några exempel på gliom biomarkörer muterade isocitrate dehydrogenas 1 (IDH1), en mutant enzym för lägre kvalitet gliom associerade med bättre prognos4karakteristiska. Muterade IDH1 uttrycks ofta i kombination med TP53 och alfa-thalassemi/mental retardation syndrom X-länkade (ATRX)-inactivating mutationer, definiera en specifik gliom subtyp4,5. ATRX-inactivating mutationer också förekommer i 44% av pediatric höggradigt gliom2,6 och har förknippats med aggressiva tumörer och genomisk instabilitet6,7. Dessutom är pediatric diffusa inneboende pontine gliom (DIPG) differentierade i undergrupper enligt närvaron eller frånvaron av en K27M mutation i Histon H3 gen H3F3A eller i HIST1H3B/C gen1,6. Därför införandet av molekylär karakterisering tillåter den underavdelning, undersökning och behandling av gliomas som separata enheter, vilket gör mer utveckling av mer riktade terapier för varje subtyp. Dessutom kan en analys av biomarkörer användas för att utvärdera olika biologiska processer såsom apoptos8, autofagi9, cellcykeln progression10, cell spridning11och celldifferentiering12 .

Genmanipulerade djurmodeller som hysa de genetiska lesionerna i mänskliga cancerformer är kritiska för studien av signalering vägar som förmedlar sjukdomsprogression. Vårt laboratorium har infört användning av sovande skönhet (SB) transposase systemet att utveckla genetiskt modifierade musmodeller av gliom härbärgerat specifika mutationer som recapitulate mänskliga glioma subtyper13,14. Dessa genetiskt modifierade musmodeller används för att generera tumör-derived NS, som möjliggör in vitro- studier i en 3D-systemet presenterar spegling framträdande dragen i tumörer i situ15. Orthotopical transplantation av NS i möss kan också generera sekundära tumörer att behålla funktioner av den primära tumören och härma de histopatologiska, genomisk och fenotypiska egenskaperna av motsvarande primärtumör15.

I serumfritt kultur, hjärnan tumörceller med stamceller egenskaper kan berikas och i närvaro av epidermal tillväxtfaktorer (EGF) och fibroblast tillväxtfaktor (FGF), de kan odlas som enda cell-derived kolonier såsom NS kulturer. I detta selektiva kultur system dör mest särskiljande eller differentierade celler snabbt, medan stamceller delar och bildar de cellulära kluster. Detta tillåter generationen av en NS-kultur som upprätthåller gliom tumör funktioner16,17,18. Gliom NS kan användas för att utvärdera flera aspekter av tumörbiologi, inklusive analys av biomarkörer som har program i diagnos, prognos, klassificering, av tumör progression, och cell differentiering medlemsstat. Här, vi detalj ett protokoll att generera gliom NS och bädda in 3D kulturerna i paraffin som ska användas för IHC färgning. En fördel med fastställande och inbäddning gliom NS är att morfologi av NS bevaras bättre jämfört med den konventionella cytospin metod19, i vilka gliom NS utsätts för stressande manipulation för cell dissociation och bli tillplattad. Dessutom släcker inbäddning alla endogena fluorophore uttryck från genmanipulerade tumör NS, aktivera färgning över fluorescerande spektra. Det övergripande målet med denna metod är att bevara 3D-strukturen för gliom celler genom en paraffin inbäddning process och aktivera karakterisering av gliom neurospheres med immunohistokemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) från University of Michigan.

1. generering av hjärnan tumören Neurospheres härrör från en musmodell

  1. Innan dissektion förfarandet, Förbered neurala stamceller (NSC Media: DMEM/F12 med 1 x B27 tillägg, 1 x N2 tillägg, 1 x normocin och 1 x antibiotikum/antimycotic kompletteras med humant rekombinant EGF och basic-FGF vid koncentrationer på 20 ng/mL vardera). Fyll en 1,5 mL tub med 300 µL av NSC medier och reservera för senare.
  2. Välj en mus med en stor tumör.
    Obs: Storleken på en tumör kan övervakas av Mareld om den plasmid eller virus injiceras kodar luciferin. En stor tumör har vanligtvis en mareld i > 106 fotoner/s/cm2/sr.
  3. Avliva musen med en överdos av isofluran: ingjuta ett silkespapper med isofluran och införa vävnaden i en dödshjälp kammare, undvika direktkontakt med mössen att förhindra irritation. Vänta tills mössen inte visar en pedal reflex (vanligtvis 5-10 min). Halshugga musen och dissekera hjärnan som beskrivs i Calinescu o.a. 13.
  4. Om tumörerna är fluorescerande, använda dissekera Mikroskop utrustat med ett lysrör för att identifiera tumören massan i hjärnan. Med fin pincett, dissekera tumören (vanligen 5-7 mm i diameter) från den normala hjärnvävnaden.
  5. Placera dissekerade tumören i 1,5 mL röret med NSC media (steg 1.1). Homogenisera tumören med en disponibel plast mortelstöt som passar in i väggarna av mikrocentrifug röret genom att tillämpa mild tryck.
  6. Att separera cell klumpar, tillsätt 1 mL av enzym-fri dissociation media och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
  7. Filtrera cellsuspensionen genom en 70 µm cell sil och skölj silen med 20 mL NSC media.
  8. Centrifugera vid 300 x g i 5 min, Dekantera supernatanten och resuspendera pelleten i 6 eller 15 mL av NSC media, beroende på storleken på pelleten.
  9. Tallrik tumör cellsuspensionen till en T-25 eller T-75 kultur mätkolv och kultur vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator med en atmosfär av 95% luft och 5% CO2.
  10. Efter 3 dagar, överföra friska svävande NS och åter tallrik dem i en T-25 eller T-75 vävnadsodling kolv. Om det behövs, tillsätt mer NSC media till kulturen.
    Obs: Det blir oftast en blandad population av celler, några kommer vara död, några kommer har följt och några skall bilda NS som kommer att vara flytande i media

2. att upprätthålla och Passaging NS

Obs: Förhindra överväxt och underhålla celler på relativt hög densitet. Sammanflödet bestäms av sfärer storlek (svart centrerar av stora sfärer genomsnittlig överväxt). NS ökningstakt beror på de onkogener som används för att generera tumörer.

  1. När NS kulturen har nått konfluens, samla kulturen i ett sterilt centrifugrör och pellet NS vid 300 x g i 5 min.
  2. Tag bort supernatanten, tillsätt 1 mL av cell avlossning lösningen och pipett för att resuspendera pelleten.
  3. Inkubera vid 37 ° C i 5 min, snärta röret varje 2 min för att hjälpa cellen dissociation.
    Obs: När NS når konfluens, de kan oftast ses makroskopiskt som små vita kulor. Att försäkra cell dissociation, åtminstone alla synliga NS måste ha försvunnit.
  4. Tillsätt 5 mL HBSS 1 x och pipett flera gånger. Pellet celler vid 300 x g i 5 min. Tag bort supernatanten. Resuspendera pelleten i 5 mL NSC media kompletteras med rekombinant EGF och basic-FGF.
  5. Tillsätt 1 mL av celler till 15 mL av NSC media och kultur i en T-75 kolv vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator med en atmosfär av 95% luft och 5% CO2.
  6. Lägg till tillväxtfaktorer (EGF och basic-FGF) varje 3 dagar. Om medierna vänder ljus orange och cellerna är ännu inte konfluenta, ändra media. För att göra detta, Centrifugera NS vid 300 x g i 4 min och resuspendera i NSC media kompletteras med tillväxtfaktorer.
    Obs: Beroende på storleken på den pellets som bildas, celler kan behöva delas upp i fler kolvar.

3. frysning NS för långsiktig lagring

  1. När NS kulturen blir konfluenta, separera celler enligt beskrivningen i steg 2.1-2.4. När pelleten har åter svävande i HBSS, ta bort en alikvot och räkna cellerna.
  2. Centrifugera celler vid 300 x g i 4 min och ta bort så mycket som möjligt av supernatanten.
  3. Resuspendera pelleten i frysning media (Värmeinaktiverade FBS, 10% DMSO). Det rekommenderas att frysa mellan 1 x 106 och 3 x 106 celler per injektionsflaska per mL.
  4. Dela upp åter suspenderade celler i så många cryovials som behövs och långsamt svalna av injektionsflaskorna av första överföra dem till is, till-20 ° C och sedan till-80 ° C, och slutligen nästa dag till en behållare för lagring av flytande kväve.

4. upptagning av tumör NS

  1. Kultur tumör NS i en T-25 kolv för 2-3 dagar tills cellerna är konfluenta (~ 3 x 106 celler). Samla in tumör NS i en 15 mL koniska rör från en minst en T-25 konfluenta kolv. Pellet vid 300 x g i 5 min.
  2. Resuspendera pelleten i 1 mL 10% formalin och förvara i rumstemperatur (RT) i 10 min. Tillsätt 5 mL av 1 x HBSS och pellet cellerna som gjort steg 3,2. Upprepa detta en gång.
  3. Plats 15 mL koniska röret som innehåller pelleten på is.

5. paraffin inbäddning av tumör NS

  1. Re centrifugerade tvättade NS i 500 µL 2% varm flytande agaros och blanda försiktigt genom pipettering.
  2. Placera omedelbart agaros-embedded NS på is tills Agarens polymerizes. Ta bort agaros lappa härbärgerat NS. Placera polymeriserat agaros pjäsen med NS i kassetten för vävnad behandling (figur 2).
  3. Fortsätt med vävnad behandling (med en automatisk paraffin-processor) och paraffin inbäddning (med en inbäddning station).

6. snittning av Paraffin-inbäddat NS

  1. Ställ i vattenbad till 42 ° C och sätt i bladet på mikrotomen noggrant med två penslar för att se till det är planat. Använd det här bladet endast för trimning.
  2. Placera det paraffin-blocket på mikrotomen. Den icke-dominanta hand, tryck ned spaken ligger på vänster sida som styr tjockleken på varje avsnitt. Tryck för att den andra hållplatsen som anger en 30 µm tjocklek.
  3. Börja trimma blocket (dvs., att ta bort överflödig paraffin) genom att vrida grova inställningsratten med höger hand tills ytan av provet nås. Vid denna punkt, släpp spaken som styr trim tjockleken till 10 μm eller 5 μm. Stoppa putsning när ytan av provet nås.
  4. Fyll en ice box med is och tillsätt bara tillräckligt med vatten så att när det paraffin-blocket placeras på is, vattnet fungerar som en film runt paraffin block, skydda den från att röra direkt vid isen. Inkubera paraffin blocket på is i 20 min.
  5. Kasta gamla bladet och infoga en ny för snittning. Torra block med gasbinda, placera det på mikrotomen.
  6. Den icke-dominanta hand, skaffa ett par böjda pincetter som kommer att användas att dra menyfliken paraffin. Hålla en fuktig pensel nära höger hand, som används för att överföra menyfliken paraffin till vattenbadet. Börja avsnitt genom att vrida grova inställningsratten med höger hand i snabb takt. Använda tången i vänster hand för att hålla menyfliken paraffin.
  7. Använd en fuktig pensel för att överföra menyfliken paraffin till vattenbadet.
  8. Använd kurvan för tången för att bryta isär avsnitten av ytligt att placera pincetten mellan två paraffin avsnitt, sedan trycka de två avsnitten bort försiktigt.
    Obs: Denna rörelse ska vara helt på ytan av avsnittet paraffin. Tryck inte ner på avsnittet.
  9. Använd en fuktig pensel i separerade paraffin avsnitt på positivt laddade vidhäftning objektglas.
  10. Låt bilderna ska torka över natten släpper en kemisk huva innan du förvarar dem i bild lådor. Lagring av bilder beror på vilken typ av fläck utförs.

7. immunhistokemi (IHC) av Paraffin-inbäddat NS

  1. Smält paraffin genom att placera bilderna i en metall rack och inkubering vid 60 ° C i 20 min.
  2. Deparaffinize bilderna genom inkubation i ett rehydrering tåg på RT: 3 x xylen i 5 min, 100% 2 x etanol för 2 min, 2 x 95% etanol för 2 min, 1 x 70% etanol för 2 min och 1 x avjoniserat vatten för 2 min. Hereon, hålla glasen i kranvatten tills antigen retrieval , som torkar ut kommer att orsaka icke-specifik antikropp bindande.
  3. Inkubera bilder i citratbuffert (10 mM citronsyra, 0,05% icke-joniskt rengöringsmedel, pH 6) vid 125 ° C i 30 s vid 90 ° C för 10 s. Låt dem svalna och skölj glasen 5 gånger med destillerat vatten.
  4. Odling av objektglas på RT i 0,3% H2O2 i 30 min.
  5. Tvätta objektglasen 3 gånger i tvätt buffert (0.025% tvättmedel i TBS) för 5 min med försiktig skakning.
  6. Inkubera i bilderna på RT med blockering lösning (10% häst serum, 0,1% BSA i TBS) i 30 min.
  7. Inkubera bilderna över natten vid 4 ° C i en fuktig kammare med primär antikropp beredd i lösningen för spädning (0,1% BSA i TBS). Tvätta objektglasen 3 gånger i tvätt buffert för 5 min med försiktig skakning.
  8. Inkubera bilderna på RT för 1 h med biotinylerade sekundär antikropp beredd i lösningen för spädning. Tvätta objektglasen 3 gånger i tvätt buffert för 5 min med försiktig skakning.
  9. Inkubera bilder på RT i mörkret för 30 min med avidinen-biotinylerade pepparrotsperoxidas komplexa. Tvätta objektglasen 3 gånger i tvätt buffert för 5 min med försiktig skakning.
  10. Inkubera i bilderna med DAB-H2O2 substrat varumärken här för 2-5 min på RT.
  11. Skölj 3 gånger med kranvatten. Doppa (1-2 s) glasen i hematoxylin lösning motfärg och skölj dem i vatten tills clearing.
  12. Torkar glasen som följer: Inkubera i destillerat vatten i 2 min, doppa 3 gånger i 80% etanol, inkubera i 95% etanol 2 gånger i 2 min varje, inkubera i 100% etanol 2 gånger i 2 min varje, och slutligen i xylen 3 gånger i 3 min varje.
  13. Täckglas bilderna med en xylen-baserade monteringsmedium och låt dem torka på en plan yta på RT tills de är redo för avbildning.       Obs: Om utför 3, 3'-Diaminobenzidin (DAB) färgning, bilder kan lagras på RT. Dock om immunofluorescens färgning utförs, ska diabilder förvaras i mörker vid 20 ° C till minska foto-blekning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att övervaka tumörutveckling och utvärdera om tumören har nått storlek krävs för att generera NS, analyserade vi de luminiscens som avges av tumörer med Mareld. Detta tillåter studier av transduktion effektivitet i ungar och tumör progression av luminiscens signalera av luciferas (figur 1A och 1B). När storleken på tumören når en signal av 1 x 107 fotoner/s/cm2/sr (figur 1B), kan hjärnan bearbetas för NS generation. En annan fördel med detta system är att den kodande sekvensen av olika fluorescerande proteiner kan läggas till de plasmider som används för genen leverans och tumör generation. Vi kan sedan bekräfta uttrycket av de infogade genetiska förändringarna, med dissekera Mikroskop utrustat med ett lysrör (figur 1C). NS genereras från wt-IDH1 (figur 1D) och mIDH1 (figur 1E) tumörer identifieras genom den karakteristiska sfäriska morfologin och uttrycket av fluorophores som är associerade med specifika genetiska lesionen ( dvs., GFP är associerad med shATRX och shp53 och Katushka är associerad med mIDH1; Figur 1 D och 1E). För att fortsätta med IHC på NS, är celler fast, sedan inbäddade i agaros och paraffin (figur 2). Bädda in NS i paraffinblock har flera fördelar, inklusive bevarandet av 3D-strukturer av NS och möjliggör långsiktig lagring. Inbäddade NS kan färgas för specifika gliom biomarkörer. Med denna teknik, analyserade vi uttryck för ATRX, Ki67 och OLIG2 (oligodendrocyte differentiering markör) (figur 3A-3_C). Vi bekräftade de låga uttrycksnivåerna av ATRX protein i våra NS kulturer (figur 3A), som är en funktion av den LGG gliom subtyp för närvarande vara studerade4. Ki-67, en väl beskrivna biomarkör för cellproliferation, var också positiva i mIDH1 NS (figur 3B), visar aktiv spridning, vilket är ett centralt inslag i tumörceller. Intressant, var celler lokaliserade i mitten av de större gliom NS kluster negativa för Ki-67 (figur 3B), vilket indikerar att de inte frodas, till skillnad från Ki-67 positiva cellerna lokaliserade till periferin. Detta fenomen kan vara på grund av att perifera celler inte har tillgång till näringsämnen från tillväxt medier. När de når detta större storlek, bör gliom NS skiljas och anpassade. Slutligen, wt-IDH1 NS var positiva för Olig2, en transkriptionsfaktor som deltar i oligodendrocyte differentiering (figur 3C).

Figure 1
Figur 1 : Gliom neurospheres genereras från GFP - och Katushka-positiva sovande skönhet (SB) hjärntumör. (A) självlysande signal nyfödda musklick injiceras med SB-transposase plasmid i kombination med plasmider härbärgerat genetiska skador att inducera gliom (de nationella Regleringsmyndigheterna/shP53/shATRX/IDH1-R132H). (B) luminiscens indikerar tumörutveckling på 132 dagar efter injektion (DPI). Ljusa (C) A-området och fluorescerande bild av en hjärna som skördas från en mus som nått slutpunkten stadiet. Tumören är avgränsade med den streckade linjen och positivt för fluorescerande reportrar, GFP och Katushka. (D och E) Tumör neurospheres genereras från SB hjärntumörer uttrycker GFP är kopplade till shP53 och shATRX; och Katushka associerade till IDH1-R132H. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Representation av arbetsflödet för paraffin-inbäddat gliom NS. NS samlas in från en T-25 kolv till en 15 mL koniska rör och fasta i 10% formalin. Sedan, NS tvättas med HBSS och inbäddade i 2% agaros. Polymeriserat agaros innehållande gliom NS placeras i en kassett för vävnad behandling och paraffin inbäddning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Representativa resultat av immunhistokemi med HRP-DAB upptäcka biomarkörer. (A-C) IHC utförs på paraffin-inbäddat mIDH1 gliom NS färgas för ATRX (A) och Ki67 (B) och wt-IDH1 gliom NS färgas för OLIG2 (C). Röda pilarna visar positiva celler för biomarkör färgningen. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna artikel detalj vi en mångsidig och reproducerbar metod att utföra immunohistokemi på paraffin-inbäddat gliom NS, som upprätthåller den karakteristiska 3D-strukturen för tumörcellerna växer i den hjärnan i situ. Denna teknik har följande fördelar jämfört med celler pläterade på glas eller plast ytor: jag) bevarandet av 3D-strukturen för NS; (II) att undvika stress av cell dissociation före analys av proteinuttryck. (III) kylning av alla endogena fluorophore uttryck från genmanipulerade tumör NS, aktivera färgning över fluorescerande spektra; och iv) långsiktig lagring.

Ett avgörande steg med denna teknik är att säkerställa att cellerna är åter svävande väl i Agarens att säkerställa att de är likartad distribueras och inte klumpgranulat tillsammans. En begränsning av denna teknik är de tidskrävande åtgärder relaterade till cell odling och NS bearbetning innan den IHC färgning förfarande. En andra begränsningen är antalet celler som behövs för att utföra denna metod. Om antalet celler är mindre än 1 x 106 celler, blir det för få celler per synfält NS kluster i varje avsnitt. Det kan därför vara svårt att nå perfekt antal celler om glioma cellkulturen är långsamt växande. Vi använde en konfluenta T-25 kolv som innehåller minst 3,0 x 106 celler. Antalet celler som används kan ändras som önskas; Det är dock nödvändigt att erhålla en NS pellet av lämplig storlek för inbäddning förfarandet. Efter detta, inbäddade NS kan manipuleras som en vanlig paraffin-inbäddat block, och den kan sedan fortsätta att snittning och IHC färgning för att analysera proteinuttryck med immunofluorescens eller IHC använder DAB färgning.

Efter snittning av blocken och följande protokoll för IHC, bör sektioner vara counterstained med hematoxylin (blå). Om vävnad uttrycker målproteinet, bör en brun signal vara synliga (figur 3). Om efter IHC avsnitten är alldeles för brun (hög bakgrund), detta kan bero på (1) icke-specifik Bidar av sekundär antikropp, 2) en ofullständig härdning av endogena peroxidas, eller 3) otillräcklig blockering. Dessa problem kan lösas genom 1) använder en negativ kontroll bild (inkuberas endast med en sekundär antikropp) att kontrollera icke-specifik bindning av sekundär antikropp, 2) öka peroxidaset snabbkylning tid eller 3) öka blockerande inkubationstiden. Däremot, om ingen signal detekteras, är det möjligt att epitoper är fortfarande maskerad, som kan vara relaterade till typ av buffert används för antigen retrieval. Vår erfarenhet har vi haft tillfredsställande färgning med citratbuffert, men detta kan vara vävnad - och antikropp-beroende, och olika formuleringar för antigen retrieval buffertar kan användas såsom 0.1 M Tris-HCl (pH 8,0) buffert21. Dessa är några av de vanligaste frågor som rör IHC färgning, men om andra svårigheter uppstår, felsökning bör utföras som med alla andra IHC (dvs., försöker olika spädningar av primära och sekundära antikroppar, olika blockering reagens, olika blockerande gånger, etc).

En alternativ metod för att utvärdera proteinuttryck med paraffin-inbäddat celler beskrevs tidigare av Hasselbach o.a. 20. denna metod inkluderar inte agaros stegen, som i detta protokoll aktivera lämpliga särskilda distribution av 3D cell kluster. Vi beskriver också en exakt metod för NS odling, passaging och frysning för långsiktig lagring. Denna metod visar också hur du samlar in, fixa och bädda in NS utan att ändra 3D-strukturen (figur 2).

Eftersom NS kan genereras från gliom vävnad från patienter samt djurmodeller för gliom, utgör denna teknik ett kraftfullt verktyg som kan användas för att analysera biomarkör uttryck i olika gliom suptypes och validera de ursprungliga modellerna. Här beskriver vi tekniken med NS som härstammar från genetiskt modifierade möss med hjälp av SB transposase systemet (figur 1). Denna teknik kan emellertid också användas för att analysera protein i paraffin-inbäddat mänskliga glioma celler som växer som 3D kulturer utan ändringar i protokollet, än cell kultur villkoren. Så, denna metod kan också tillämpas på 3D kulturer erhållits från transplanterbara djurmodeller, mänskliga PDX modeller och andra genetiskt modifierade modeller. Slutligen, kan denna metod användas med andra typer av cancer, både musmodeller och mänskliga cancerformer, förutom gliom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa och nationella institutet för neurologiska sjukdomar & Stroke (NIH/NINDS) bidrag R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 till M.G.C.; NIH/NINDS beviljar R01-NS076991, R01-NS082311 och R01-NS096756 till P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Avdelningen för neurokirurgi; Leah's Happy Hearts till M.G.C. och P.R.L.; och RNA biomedicin Grant F046166 till M.G.C. F.M.M. stöds av en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. stöddes av ett Fulbright-argentinska ministeriet för idrott och utbildning gemenskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coated microtome blade HP35 Thermo Scientific 3150734
Microtome RM 2135 Leica MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-aldrich HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX, Santa Cruz Biotechnology sc-15408 IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67 Abcam Ab15580 IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2 Millipore AB9610 IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated Dako E0432 IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit Vector Laboratories Inc PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT Biocare medical BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048
N-27 Supplement ThermoFisher A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution Biolegend 423201
AGAROSE LE GoldBio A-201-1000
Genesee Sc. Corporation Olympus 15 ml 21-103
Genesee Sc. Corporation TC-75 treated Flask 25-209
Genesee Sc. Corporation TC-25 treated Flask 25-207
DMEM/F12 Gibco 11330-057 NS media
HBSS GibcoTM 14175-103 balanced salt solution
C57BL/6 Taconic B6-f C57BL/6 mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131, (6), 803-820 (2016).
  2. Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14, (4), 439-452 (2014).
  3. Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131, (10), 1627-1638 (2012).
  4. Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164, (3), 550-563 (2016).
  5. Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372, (26), 2481-2498 (2015).
  6. Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32, (4), 520-537 (2017).
  7. Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8, (328), (2016).
  8. Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99, (6), 841-846 (2008).
  9. Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10, (10), 1081-1094 (2016).
  10. Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226, (2), 352-364 (2012).
  11. Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53, (1), 39-47 (2008).
  12. Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36, (3), 1943-1953 (2015).
  13. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  14. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69, (2), 431-439 (2009).
  15. Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2, (10), 1351-1363 (2015).
  16. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
  17. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26, (17), 2916-2924 (2008).
  18. Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133, (2), 263-282 (2017).
  19. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
  20. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
  21. Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183, (1), 116-123 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics