Определение клеточных поверхностных маркеров первичных нейронных стволовых и клеток-прародителей путем метаболической маркировки сиалогликан

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Представлен протокол, который сочетает в себе в пробирке нейроэндотелиальной системы ко-культуры и метаболического включения силогликан с биоортогональных функциональных групп для расширения первичных нейронных стволовых и прародителей клеток и этикетки их поверхности sialoglycoproteins для визуализации или масс-спектрометрии анализа маркеров поверхности клеток.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q. Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan. J. Vis. Exp. (151), e58945, doi:10.3791/58945 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Нейронные стволовые и клетки-прародители (NSPCs) являются клеточной основой для сложных структур и функций мозга. Они расположены в специализированных нишах in vivo и могут быть изолированы и расширены in vitro,служа важным ресурсом для трансплантации клеток для восстановления повреждения мозга. Тем не менее, NSPCs являются неоднородными и не четко определены на молекулярном уровне или очищены из-за отсутствия конкретных маркеров поверхности клеток. Представленный протокол, о котором сообщалось ранее, сочетает в себе нейроэндотелиальную систему кокультуры с метаболическим методом маркировки гликанов для идентификации поверхности сиологликопротеом первичных NSPCs. Система сокультуры NSPC-эндотелиальной позволяет самообновлять и расширять первичные NSPCs in vitro,генерируя достаточное количество NSPCs. Sialoglycans в культурных NSPCs помечены с помощью неестественной сиалевой кислоты метаболического репортера с биоортогоналальных функциональных групп. Сравнивая сиалогликопеом из самообновляющихся NSPCs, расширенный в эндотелиальной кокультуры с дифференциацией нейронной культуры, мы определяем список мембранных белков, которые обогащаются в NSPCs. Протокол подробно включает в себя: 1) создание андотелиальной культуры НСПК и дифференциационную культуру НСПК; 2) маркировка с азидосахаром за О-ацетиляцию N-азидоацетилманносамина (Ac4ManNAz); и 3) спряжение биотина с модифицированным сиалогликаном для визуализации после фиксации нейронной культуры или извлечения белка из нервной культуры для анализа масс-спектрометрии. Затем кандидаты на обогащенные поверхностью кандидаты, обогащенные NSPC, отбираются путем сравнительного анализа данных масс-спектрометрии как из расширенных NSPC, так и из дифференцированных нейронных культур. Этот протокол очень чувствителен для определения мембранных белков низкого изобилия в исходных материалах, и он может быть применен к обнаружению маркеров в других системах с соответствующими модификациями

Introduction

Нейронные стволовые клетки определяются как многопотентная популяция клеток, которые могут самообновляться для поддержания пула стволовых клеток и дифференцироваться в нейроны и глию. Они являются основными типами клеток в нервной системе и может предложить большой терапевтический потенциал в регенеративной медицине через пересадку клеток в больные и поврежденные мозги1,2. По мере развития популяция нервных стволовых клеток становится неоднородной3,4,а доля нервных стволовых клеток в головном мозге постепенно уменьшаетсяна 5. Вообще говоря, эмбриональные нервные стволовые клетки и другие нервные клетки-прародители, коллективно называемые нервными стволовыми и клетками-потоменками (NSPCs), расположены в зародышевых зонах, желудочковой зоне и субвентрикулярной зоне у мышей6. В эмбриональном мозге нервные стволовые клетки генерируют нейроны прямо или косвенно через промежуточные клетки-прародители (ИПК), а у некоторых видов через внешние субжелудочковые зоны прародителей (ОРГ)7,8. Специфическая молекулярная подпись, морфология, расположение в нише стволовых клеток и потенциал дифференциации определяют роль каждого подтипа в органогенезе мозга и клинических приложениях9. Однако имеющиеся в настоящее время маркеры поверхности клеток не могут однозначно дискриминировать и очищать различные подтипы NSPCs, ограничивая понимание и использование этих подтипов.

Идентификация первичных поверхностных маркеров NSPCs ограничена тремя основными препятствиями. Первый из них является ограниченное количество клеток NSPCs в ткани, что затрудняет подготовку образцов клеточного белка поверхности для общего анализа масс-спектрометрии. Вторым ограничением является трудность в производстве чистых подтипов клеток для генерации подтип-специфических данных мембранного белка. Наконец, третьей проблемой является низкое соотношение белков поверхности клеток в целых белках клеток, что затрудняет их чувствительность обнаружения с помощью анализа масс-спектрометрии.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали химиопротеомный подход к выборочноо обогащать и идентифицировать белки поверхности клеток в первичных NSPCs путем метаболически маркировки sialoglycoproteins10. Для создания достаточного количества NSPCs, мы воспользовались установленным протоколом для расширения и поддержания первичных эмбриональных NSPCs в недифференцированных состояниях in vitro, путем совместного культивирования NSPCs с мышью мозга эндотелиальных клеточных линий с использованием проницаемой поддержки матричная вставка(например, трансвелл) система11. В отличие от этого, NPSCs культивируется в одиночку без эндотелиальных клеток генерировать дифференцированное потомство11,12. Таким образом, образцы белков из этих двух систем культуры могут быть сравнительно проанализированы для выявления белков, которые дифференцированно выражены в NSPCs и дифференцированных нейронов. Поскольку большинство белков поверхности клеток модифицируются сиалевой кислотой13, неестественный сиалевой кислоты предшественник аналог N-азидоацетилманнозамин-тетраацилат (Ac4ManNAz) был использован для захвата внутренней метаболической пути так, что эндогенные, вновь синтезированные sialoglycans помечены группами азидо, генерации химической ручкой14. Через азидо-алкино-опосредованные биоортогональные реакции, которые спрягают биотин с силогликанами, белки поверхности клеток могут быть визуализированы и обогащены для протеомальной идентификации с помощью стрептавидидного фторофора или матрицы14.

Здесь мы выполняем анализ геля SDS-PAGE поверхности сиологликопротеома из NSPCs, расширенного в эндотелиальной кокультуры и дифференциирующих ячеек в не-кокультурной системе. Мы также избирательно очищаем поверхность силогликопеома в двух культурных системах для протеомического сравнения. Наш протокол, по сравнению с традиционными центрифугина на основе протоколов очистки поверхности клеток15, повышает эффективность экстракции за счет сокращения процедур экстракции поверхностного белка через конкретные спряжения тегов и сродство Очистки. Между тем, это увеличивает чистоту извлечения белков поверхности клеток на основе предпосылки, что сиилиляция происходит в основном на поверхности клеток белков. Хотя эндотелиальные факторы не могут полностью блокировать дифференциацию расширенных NSPCs, сравнительное исследование между совместной культурой и дифференцированной культурой обеспечивает удобный метод определения обогащенных стволовыми клетками поверхностных белков без необходимости анализировать белки из NPCs, очищенных FACS16. Мы считаем, что этот подход может быть применен к исследованиям поверхностных белков в других системах с соответствующими изменениями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы животных, используемые в этом исследовании, были одобрены IACUC (Институциональный комитет по уходу за животными и использованию) Университета Цинхуа и выполнены в соответствии с руководящими принципами IACUC. Лабораторное животное в Университете Цинхуа было аккредитовано AAALAC (Ассоциация по оценке и аккредитации Организации по уходу за животными International). Для постановки эмбрионов, в середине дня вагинальной вилки определены был рассчитан как эмбриональный день 0,5 (E0.5).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все клетки культивируются в клеточном инкубаторе в условиях 37 и 5% CO2.

1. Подготовка мыши эндотелиальной культуры в проницаемые вставки поддержки

ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки BEND3 поддерживаются в соответствии с инструкциями производителя.

  1. Подготовка BEND3 клеточной среды (BM), добавив 50 мл FBS и 5 мл пенициллина-стрептомицина в 500 мл DMEM и хорошо перемешать.
  2. Аспирируй среду из тарелки и мыть культуры клеток BEND3 с 1 мл PBS один раз. Добавьте 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в клетки и инкубировать клетки в течение 4 мин при 37 градусах Цельсия.
  3. Добавить 1 мл БМ в клетки, чтобы нейтрализовать Трипсин-EDTA и пипетка вверх и вниз осторожно, чтобы полностью разъединить клетки. Перенесите суспензию клетки в новую коническую трубку 15 мл и гранулы центрифугированием при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин при 400 х г.
  4. Приготовьте супернатант из трубки и resuspend клетки с 9 мл свежего БМ, затем добавить 1 мл клеточной подвески в одну проницаемую опорную вставку. Добавьте еще 2 мл свежего БМ на скважину в нижней камере матрицы. Продолжайте культивировать клетки в течение одного дня.

2. Подготовка мыши Первичной Кортикальной NSPCs культуры

  1. Подготовка культуры пластины, папаин пищеварения среды, и корковых приверженцев культуры среды (AM)
    1. Пальто 6-колодцы пластины с поли-L-лизин (PLL) путем добавления 1 мл раствора PLL в хорошо в 6-колодные пластины. Затем инкубировать пластины на RT в течение 30 минут.
    2. Перенесите раствор PLL в коническую трубку длиной 15 мл. Вымойте тарелки 3 раза с двойной дистиллированной водой. Airdry пластин и положить их в сторону до использования.
    3. Подготовка папаин пищеварения среды, добавив 50 U папаина, 50 Л L L L-глютамин, и 50 л 100 мг/мл ацетил-L-цистеин в 5 мл DMEM. Смешайте среду кратко и разогреть его до 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут для активации фермента.
    4. Подготовка корковых клеток приверженец культуры среды (AM): добавить 500 л L L L-глютамин, 500 л пирувата натрия, 500 л 100 мг/мЛ N-ацетил-L-Цистеин, 500 Л N2, 1 мл B27, и 5 мЛ 100 мкг/м0. Смешайте среду хорошо и разогреть его до 37 градусов по Цельсию перед использованием.
  2. Подготовка первичных корковых клеток головного мозга и последующее покрытие
    1. Пожертвуйте E10.5 приурочен беременной мыши шейки матки дислокации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На E10.5, большинство клеток размножаются NSPCs в коре головного мозга, что приводит к большим клонам потомства в пробирке.
    2. Стерилизовать брюшной полости на 75% этанола. Используйте тонкие ножницы и микрозубные щипцы, чтобы открыть живот, разрезая кожу и лежащие в основе мышцы вдоль правой стороны средней линии. Выньте матку из брюшной полости осторожно с зубчатыми щипками и вырежьте ее из брюшной полости тонкими ножницами.
    3. Вымойте матку 40 мл предварительно охлажденных HBSS в 10 см Чашка Петри. Затем перенесите матку в новую 10-сантиметровую чашку Петри и снова промойте ее 40 мл предварительно охлажденных HBSS.
    4. Перенесите матку в новую 10-сантиметровую чашку Петри с 40 мл предварительно охлажденных HBSS. Удалить эмбрионы из матки и амниотической мембраны, а затем сократить головы эмбрионов от стволов с Jewelers microforceps.
    5. Вымойте головки с 40 мл предварительно охлажденных HBSS и передать головы на новый 10 см Петри блюдо с 40 мл предварительно охлажденной HBSS. Используйте Microforceps Jewelers, чтобы очистить кожу от кожи и хряща, покрывающих мозг, затем отрежьте кортики головного мозга и соберите их в конической трубке 15 мл с предварительно охлажденной HBSS.
    6. Пеллет кортики центрифугированием в течение 3 мин при 4 кв и 300 х г. Аспирировать супернатант из трубки, затем добавить активированный папаин пищеварения среды и 15 qL 4 мг /мЛ DNase I в ткани гранулы.
    7. Resuspend ткани гранулы кратко нежный вихрь. Инкубировать ткань при 37 градусах По цельсии в течение 30 мин. В течение этого времени, ослабить ткани путем краткого вихря каждые 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В конце пищеварения, не должно быть видимых частей ткани в трубке.
    8. Пеллеткорные клетки центрификацией в течение 10 мин при 4 кв и 450 х г. Приготовьте супернатант из трубки и промойте клеточные гранулы с предварительно охлажденным DMEM. Повторите этот шаг один раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время пищеварения и мытья, будьте осторожны, чтобы не пипетка тканей и клеточных гранул примерно, чтобы избежать повреждения клеток с сильной силой стрижки.
    9. Аспирировать супернатант из трубки затем добавить 1,5 мл предварительно охлажденных HBSS в трубку. Диссоциатив ныетические клетки гранулы на одиночные клетки с нежным пипеттингом. Подсчитайте номер ячейки гемоситометром.
    10. Добавьте 2 мл AM и 2 x 104 корковых клеток на 6-колодые пластины. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 3 ч, чтобы клетки прикреплялись к пластине.

3. Настройка нейронно-эндотелиальной кокультуры и системы маркировки Ac4ManNAz

  1. Через день после покрытия BEND3 ячеек в вставках, осторожно аспирируем среду в нижней камере, а затем вставки. Вымойте облицо вставки 3 раза с предварительно подогретых DMEM. Вымойте внешнюю поверхность вставок путем полоскания предварительно подогретых DMEM.
  2. Добавьте 1 мл предварительно разогретого АМ в одну вставку, затем перенесите вставки в колодцы с первичными корковыми клетками. Инкубировать со-культуру при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 12 ч.
  3. Растворите Ac4ManNAz в DMSO для достижения концентрации запасов 200 мМ. 12 ч после создания нейроэнделиальной кокультуры добавьте 1 зл ac4ManNAz на нижнюю камеру и 0,5 л акций на одну вставку в со-культуру. Встряхните тарелки сразу и осторожно, чтобы смешать среду хорошо. Для контрольных ячеек добавьте равный объем DMSO.
  4. Культура клетки в течение еще 5 дней при 37 кС и 5% CO2. Подготовка AM с 10x bFGF как кормление среды (RM). В течение этого времени, добавить 100 л РМ на вставку и 200 Л Л РМ на нижнюю камеру, чтобы перекормить эндотелиальных и нервных клеток через день. Во время кормления, не поставляются Ac4ManNAz или DMSO в культуру.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание сиалогикопротеинов в Расширенные первичные NSPCs и дифференцированные нейроны

  1. Подготовка BTTAA-CuSO4 комплекса 1 30x запас, содержащий 1,5 мм CuSO4 и 9 мм BTTAA в двойной дистиллированной воды. Приготовьте свежеконюгбитовый буфер 1, содержащий 50 мкм биотин-алкин, аскорбат натрия 2,5 мм и комплекс 1x BTTAA-CuSO4 в PBS.
  2. Удалите вставки из пластин совместной культуры. Аспирируйте среду культуры из нижних колодцев и мыть нервные клетки один раз с предварительно разогретым PBS.
  3. Аспирируй PBS из скважин. Добавьте 1 мл предварительно охлажденных 4% параформальдегида PBS раствор а также в клетки и исправить клетки на RT в течение 10 минут. Затем промыть клетки 3 раза с предварительно охлажденной PBS.
  4. Аспирировать PBS из скважин и добавить 1 мл свежеприготовленного биотина-конъюгированного буфера 1 на хорошо в клетки. Инкубировать клетки на RT в течение 10 мин.
  5. Призадыхайный буфер реакции из скважин. Вымойте клетки 3 раза с ПОМОЩЬю PBS. Подготовьте окрашивание буфера, содержащего 1% FBS и 1 мкг/мл Alexa Fluor 647-стрептавидин. Добавьте 1 мл окрашивающего буфера на хорошо в клетки и инкубировать клетки на RT в течение 30 минут.
  6. Призадыхать окрашивающий буфер из колодцев и промытых клеток 3 раза с предварительно охлажденной PBS. Подготовьте блокирующий буфер, содержащий 5% BSA и 0,3% неионического моющего средства-100 в PBS. Добавьте 1 мл блокирующего буфера на скважину в клетки и инкубировать на RT в течение 10 минут.
  7. Подготовьте основной антитело, разбавив анти-нестхин и анти-тбулулин III антитела вместе в блокирующий буфер в соотношениях 1:20 и 1:1,000, соответственно. Удалите блокирующий буфер из скважин и добавьте 1 мл первичного раствора антитела в скважины. Инкубировать клетки при 4 градусах Цельсия в течение ночи.
  8. Удалите основной раствор антитела из скважин. Вымойте клетки 3 раза с предварительно охлажденной PBS. Подготовка вторичного решения антитела путем разбавления Alexa Fluor 488 коза анти-мышь IgG1, Alexa Fluor 546 коза анти-мышь IgG2b, и DAPI вместе в блокирование буфера при разбавлении 1:1,000. Аспирировать PBS из скважин и добавить 1 мл вторичного раствора антитела в хорошо в клетки. Инкубировать клетки на RT в течение 2 ч.
  9. Аспирируй раствор антител из колодцев и мыть клетки 3 раза с предварительно охлажденной PBS. После этого клетки готовы к захвату изображения.

5. Очистка сиалогикопротеинов от расширенных первичных NSPCs и дифференцированных нейронов

  1. Подготовка BTTAA-CuSO4 комплекса 2 15x запас, содержащий 1,5 мм CuSO4 и 3 мм BTTAA в двойной дистиллированной воды. Подготовка буфера повторной подвески белка А, содержащего 4% SDS и 10 мМ EDTA в двойной дистиллированной воде; белок resuspension буфер B, содержащий 150 мм NaCl, 50 мм триэтаноламин, и 1% полиоксиэтилен олеил эфир (например, Brij97) в двойной дистиллированной воды с рН 7,4. Перед использованием смешайте буфер A:buffer B 1:8 (vol/vol), чтобы подготовить полный буфер повторной протеин. Подготовка белка стиральный буфер 1, содержащий 2% SDS в PBS; белковый буфер для мытья 2, содержащий 8 м мочевины в 250 мМ бикарбонат аммония (ABC); и буфер промывки 3, содержащий 2,5 M NaCl в PBS.
  2. Удалите вставки из пластин совместной культуры. Аспирируй среду культуры из нижних колодцев и мыть нервные клетки один раз с предварительно охлажденной PBS.
  3. Аспирировать PBS из скважин и добавить 200 л предварительно охлажденных буфера RIPA на хорошо в пластины. Инкубировать пластины на льду в течение 5 мин. Соберите белковый лисис в трубки 1,5 мл. Пеллеты клеточного мусора центрифугированием в течение 10 мин при 4 кв кв и 12000 х г.
  4. Перенесите супернатант в новые трубы длиной 1,5 мл. Определить концентрацию белка с комплектом BCA в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте концентрацию белка до 1 мг/мл.
  5. Добавьте 100 мкм алкин-биотина, аскорбат натрия 2,5 мм и 1x BTTAA-CuSO4 комплекса 2-1 мл белкового лиза и хорошо перемешайте раствор. Инкубировать смесь на RT для 1 ч.
  6. Перенесите реакционный раствор в 20 мл предварительно охлажденного метанола в конической трубке 50 мл. Хорошо перемешать и инкубировать при -30 градусов на ночь, чтобы осадок белков.
  7. Пелле белок осаждает центрифугирование в течение 15 мин при 4 градусах и 4500 х г. Вымойте протеиновые гранулы дважды с 20 мл предварительно охлажденный метанол. Аспирируй супернатант из трубки. Отостановите протеиновые гранулы с 4 мл буфера повторного протеина и перенесите отсрочку белка в новую коническую трубку 15 мл.
  8. Возьмите 50 л стрептавидина бусин и мыть их 3 раза с PBS. Добавьте промытые бусины в белковую отсрочку. Инкубировать раствор при 4 градусах по Цельсию на 3 ч на вертикальном ротаторе со скоростью вращения 20 об/мин.
  9. Вымойте бисер последовательно с 6 типами буферов: белок стиральный буфер 1, буфер промывки белка 2, буфер промывки 3, 0,5 М ABC, 0,25 M ABC и 0,05 M ABC.
  10. После мытья, resuspend бусинки с 20 Л ПБС и передать бисер в новую трубку 1,5 мл. Добавьте 20 qL 2x буфера загрузки белка в бусы и обработать при 95 градусах По Цельсия в течение 10 минут. Образцы белка должны быть подвергнуты SDS-PAGE и окрашены Coomassie блестящий синий R-250 в соответствии с инструкциями производителя. Вырезать белки в гель, как указано Coomassie блестящий синий R-250 для анализа масс-спектрометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Вся процедура расширения in vitro и метаболической маркировки первичных эмбриональных NSPCs занимает 6 дней(рисунок 1A). Качество линии ячейки BEND3 и недавно изолированных первичных NSPCs являются ключом к успешному эксперименту. Клетки BEND3 являются источником растворимых факторов, стимулирующие самообновление и распространение NSPCs. Следует обеспечить, чтобы клетки BEND3 были свободны от какого-либо загрязнения и активно делятся с минимальной гибелью клеток, прежде чем со-культивировать с нервными клетками. Первичные NSPCs должны быть тщательно подготовлены, чтобы избежать избыточного ущерба во время диссоциации. Поврежденные NSPCs могут по-прежнему расти и дифференцироваться; однако, они не в состоянии реагировать на эндотелиальные стимулы хорошо поддерживать стебельность и расширяться. Особую осторожность следует принимать, чтобы быть асептическим во время культивирования клеток, так как протокол не предполагает добавление антибиотиков в среде первичной культуры.

Успешная эндотелиальная ко-культура приведет NSPCs к формированию больших, листоподобных клонов. Такие признакам формы клона становятся очевидными на 4-й день и очень типичны на 6-й день. В клонах клетки поддерживают тесный контакт друг с другом. Иммунопятно антителами против маркера NSPC Nestin и нейронального маркера З-тубулин III должно показать, что в клоне, большинство клеток Nestinи NSPCs и очень немногие из них являются З-тубулин IIIи нейрональные клетки. В отличие от этого, процент клеток Nestin и q-tubulin III- нейронных клеток в клоне, образуюаемых в не-кокультурной системе, почти одинаков(рисунок 1B, 1Dи 1E).

Химический репортер, Ac4ManNAz, является метаболическим аналогом и может быть включен в внутренний путь сиилиляции белка. Высокие дозы Ac4ManNAz токсичны для клеток. Для каждого конкретного типа клеток, концентрация маркировки Ac4ManNAz должны быть предварительно протестированы для достижения максимальной эффективности маркировки без значительной цитотоксичности. Здесь оптимизированная концентрация маркировки Ac4ManNAz для первичного NsPC составляет 100 мкм. Комбинированная оценка клеточной смертности, указанная клеточной и ядровой морфологией, позволяет предположить, что концентрация маркировки не вызывает очевидных цитотоксических эффектов и является эффективно маркировать NSPCs(рисунок 1C и 1D). Клональная морфология, самообновление и потенциал дифференциации NSPCs как в эндотелиальной совместной культуре, так и в некокультурной системе не затрагиваются(рисунок 1C, 1Dи 1E).

Успешная маркировка NSPCs Ac4ManNAz может быть рассмотрена после спряжения биотина с культурой, опосредованной биоортогональной реакцией между азидом и алкином. Каждая клетка в ac4ManNAz-маркированной культуры окрашены и визуализированы с Alexa Fluor 647-стрептавидин. Нет клетки является положительным для Alexa Fluor 647-стрептавидин окрашивания в контрольной группе DMSO. Кроме того, протеиновые образцы, подготовленные из ac4ManNAz-маркированной культуры с помощью биотина спряжения и стрептавидина очищается показать сильный Coomassie блестящий синий сигнал окрашивания в SDS-PAGE гелей. Между тем, в полосах движения, загруженных протеиновыми образцами из контрольной группы DMSO, были только окрашивание фона и неспецифические связывающие сигналы. Это также указывает на эффективную маркировку NSPCs Ac4ManNAz(рисунок 1F).

Figure 1
Рисунок 1 : Идентификация маркеров поверхности клеток для первичных NSPCs с помощью эндотелиальной системы совместной культуры и метаболической силогликанной маркировки. (A) Схема рабочего процесса для протокола. Эта цифра была изменена с Бай и др. 10. Клетки BEND3 посеяны в матричные вставки на D0. Подготовка первичных корковых NSPCs и создание системы совместной культуры выполняются на D1. Метаболическая маркировка культуры длится от D2 до D6. Культура кормления осуществляется на D3 и D5. (B) Иммунофлуоресцентные изображения для клонов, образованных первичными NSPCs после 5-дневной культуры с эндотелиальными клетками или без них. Шкала бар указывает 20 мкм. (C) Яркие поля изображения для клонов, образованных первичных NSPCs после 5-дневной культуры с Ac4ManNAz или DMSO. Ядра были противопомнены DAPI. Панель шкалы указывает на 20 мкм. Панель ошибок указывает SEM (n.s. - не значительный). (D) Иммунофлуоресцентные изображения для NSPC образуются клоны в эндотелиальной совместной культуры с Ac4ManNAz или DMSO. Dashed круг разгралит один нейронный клон. Шкала бар указывает 50 мкм. (E) Количественная оценка NSPCs и дифференцированных нейронов в клонах, образованных NSPCs в эндотелиальной совместной культуре и не-ко-культуры системы с Ac4ManNAz маркировки или DMSO управления. В баре ошибки указывается SEM (зп злт; 0,0005; n.s. - не значительный). (F) Coomassie блестящее синее окрашивание белков, очищенных стрептавидиновым бисером из нервных клеток, помеченных Ac4ManNAz или DMSO в эндотелиальной системе кокультуры и некокультуры. Диапазон 55 kD в группах контрольной маркировки представляет неспецифические связующих белки. (B, C, E и F), соответствующие этому протоколу, были адаптированы из Bai et al. 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поверхностные маркеры обычно используются для маркировки и очистки определенных типов клеток in vitro и in vivo17,18. Открытие поверхностных маркеров вносит значительный вклад в регенеративную медицину и исследования стволовых клеток, предоставляя молекулярные инструменты для выборочного обогащения популяции стволовых клеток от нормальных или патологических тканей и культурных блюд, предлагая очищенную клетку ресурс для клинического использования или изучения биологических свойств. Тем не менее, прогресс в разработке поверхностных маркеров для исследования нервных стволовых клеток был медленным из-за трудностей в изоляции стволовых клеток из первичных тканей. Описанный здесь протокол основан на упрощенной платформе in vitro. Сравнивая первичные NSPCs расширена эндотелиальной кокультуры дифференциальной нейронной культуры, белки дифференциально выражается в расширенных NSPCs выделены и позволяют для дальнейшей идентификации. Наш протокол также обеспечивает альтернативную стратегию для очистки белков поверхности клеток путем захвата внутренней метаболической путь для обозначения сиалогликан с биоортогоналовыми группами. По сравнению с традиционными протоколами для очистки белков поверхности клеток, преимущества этого протокола подкрепляются двумя специфическими особенностями: 1) распространенность сиалиляции белков поверхности клетки обеспечивает максимальное покрытие протеома поверхности клетки, и 2) специфичность реакции между биоортогональной группой и ее лигандами дает чистоту приобретенного поверхностного протеома. Таким образом, наш протокол приводит к более чувствительному протеомному анализу в случае меньшего количества исходных материалов. Мы продемонстрировали осуществимость этого протокола в первичных поверхностных маркерах NSPCs. При соответствующих изменениях в расширении стволовых клеток in vitro, этот химиопротеомный подход может быть совместим с определением поверхностных маркеров других типов стволовых клеток. Примечательно, что, поскольку Ac4ManNAz за-О-ацетилированный это может привести к искусственному S-гликозилляции. Использование незацейированных неестественных сахаров может избежать образования артефакта и улучшить специфичность и обоснованность метаболической гликановой маркировки в живых клетках19.

Подготовка первичных клеток корковых нейронных прародителей и эндотелиальных клеток являются критическими шагами протокола. Во-первых, при переваривании эмбриональных корковых тканей необходимо тщательно контролировать время пищеварения, количество ферментов и прочность обработки. Чрезмерное пищеварение и механические силы стрижки повредят целостность плазменной мембраны и рецепторов поверхности клеток, которые опосредуют трансдукцию сигнала для выживания и роста клеток, и они также будут нарушать отзывчивость NSPCs к стимуляции эндотелиальных клеток и их способность к самообновлению. Для достижения надлежащего пищеварения, экспериментаторы должны активировать папаин полностью и остановить пищеварение, как только блоки ткани исчезают. Во-вторых, клетки BEND3 должны поддерживаться в здоровом состоянии для поддержки секреции. Рекомендуется использовать bend3 пакеты клеток с меньшим количеством проходов и прохождения клеток, прежде чем они достигнут 100% слияния. Это предотвратит арест клеточного цикла и сенесценцию, вызванную повреждением ДНК, накопленным во время прохожего или переполненным контактом между клетками.

Технология секвенирования высокой пропускной способности повышает идентификацию маркеров поверхности клеток путем анализа экспрессии РНК, особенно для типов клеток, включая стволовые клетки тканей, которые часто присутствуют в vivo в количествах, слишком малых для выполнения протеомера масс-спектрометрии. Несмотря на то, что анализ РНК-сека может определить гены, специально выраженные в NSPCs, он не может действительно отражать уровни экспрессии белка, потому что экспрессия РНК не всегда согласуется с выражением белка20. Кроме того, небелковые биомолекулы, которые могут работать как поверхностные маркеры, не могут быть обнаружены транскриптомическими исследованиями. Например, олигосахарид Льюис X является известным поверхностным производителем широко используется для обозначения человеческих эмбриональных стволовых клеток и NSPCs, хотя это может быть связано с несколькими белками21. Поэтому прямой масс-спектрометрий ный анализ еще не заменяем, а разработка методов, которые могут сделать анализ масс-спектрометрии более осуществимым и удобным, представляет большой интерес для будущих исследований.

В дополнение к сиалиляции, другие типы посттрансляционных изменений белка играют важную роль в регулировании функций модифицированных белков. Эти изменения влияют на свойства белка, такие как конформация, период полураспада и субклеточной локализации22,23. Несколько модификаций протеина имеют специфическость типаклетки 24,25,26. С растущим содержанием химического инструментария, более типы модификаций поддаются метаболической маркировки с химическими репортерами27. Таким образом, описанный здесь химический подход может быть использован для изучения других различий в изменении белка между стволовыми клетками и дифференцированными клетками, иллюстрируя молекулярные механизмы, лежащие в основе поддержания свойств стволовых клеток и дифференциации Регулирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Рисунок 1B, 1C, 1E и 1F воспроизводятся на Бай и др. . 10 Лет с разрешения Королевского общества химии. Мы благодарим И Хао в лаборатории X. C. для редактирования фигур. Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (No 91753206 до З. С. и Х. К., No 31371093 до З. С., и No 21425204 и 21672013 до X. C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BEND3 ATCC CRL-229
DMEM Gibco 11960044
L-glutamine Gibco 25030081 1%
Sodium pyruvate Sigma P5280 1%
N2 supplement Gibco 17502048 1 to 100
N-acetyl-L-cysteine Sigma A7250 1 mM
Papain Worthington LS003726 10 U/mL
B27 supplement Gibco 17504044 1 to 50
Poly-L-lysine Sigma P4707
Basic Fibroblast growth factor Gibco PHG0261 10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 1%
Fetal bovine serum Gibco 10099141 10%
HBSS Gibco 14175095
Tripsin-EDTA, 0.25% Gibco 25200056
DPBS Gibco 14190094
Transwell Corning 3450
Paraformaldehyde Sigma 158127 4%
Sucrose Sangon A100335
DAPI Gibco 62248
RIPA buffer Thermo Scientific 89900
SDS-PAGE loading buffer 2x Solarbio P1018
6-well plate Corning 3335
Tris-Glycine protein gel invitrogen xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin Developmental Study Hybridoma Bank Rat-401 1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III Sigma T8860 1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 invitrogen A-21121 1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b invitrogen A-21143 1 to 1,000
Albumin Bovine V Amresco 0332
Triton X-100 Amresco 0694
BCA assay kit Thermo Scientific 23225
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Brij97 Aladdin B129088
CuSO4 Sigma 209198
Alkyne-biotin Click Chemistry Tools TA105
BTTAA Click Chemistry Tools 1236
Ac4ManNAz Click Chemistry Tools 1084 100 µM
9AzSia synthesized in lab
Sodium ascorbate Sigma A4034
Methanol Sigma 34860
EDTA Sangon A100322
NaCl Sangon A100241
SDS Sangon A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin invitrogen S21374 1 to 1,000
Triethanolamine Sigma V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  invitrogen 60210
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Scientific 20278
Isoflurane RWD Life Science Co. 970-00026-00
DNase I Sigma DN25 12 µg/mL
Urea Sigma U5378

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics