Kvantitativ undersøgelse af antibiotika følsomhed af Neisseria gonorrhoeae aggregater bruger ATP-udnyttelse kommercielle Assays og Live/døde farvning

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

En simpel måling af ATP assay og live/døde farvning metode blev brugt til at kvantificere og visualisere Neisseria gonorrhoeae overlevelse efter behandling med ceftriaxon. Denne protokol kan udvides til at undersøge enhver antibiotikum antimikrobielle virkninger og kan bruges til at definere den minimale hæmmende koncentration af antibiotika i bakterielle biofilm.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fremkomsten af antibiotika-resistente Neisseria gonorrhoeae (GC) er et verdensomspændende sundhedstrussel og fremhæver behovet for at identificere personer, der ikke behandling. Denne Gram-negative bakterier forårsager gonoré udelukkende hos mennesker. Under infektion er den købedygtig form aggregater og/eller biofilm. Den mindste hæmmende koncentration (MIC) test bruges til at bestemme følsomhed over for antibiotika og fastlægge passende behandling. Mekanismen af udryddelse in vivo og dens forhold til laboratorieresultaterne kendes dog ikke. Blev udviklet en metode, der undersøger hvordan GC sammenlægning påvirker antibiotikaresistens og viser forholdet mellem samlede størrelse og antibiotikaresistens. Når GC aggregat, de er mere resistente over for antibiotika drab, overlevende med bakterier i midten ceftriaxon behandling bedre end i periferien. Dataene angiver, at N. gonorrhoeae sammenlægning kan reducere dets modtagelighed for ceftriaxon, hvilket ikke afspejles ved hjælp af standard agar plade-baserede MIC metoder. Metoden i denne undersøgelse giver forskere til at teste bakteriel følsomhed under klinisk relevante forhold.

Introduction

Gonoré er et fælles seksuelt overført infektion (TSI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), en Gram-negative diplococcal bakterie, er den udløsende agens af denne sygdom. Symptomerne på genital infektion kan resultere i smerter under vandladning, generaliseret genital smerte og urethrae udledning. Infektionen er ofte asymptomatisk2,3,4,5, og dette giver mulighed for udvidede kolonisering. Disse ubehandlede infektioner er en større sundhedsmæssig bekymring, som de har potentiale til at lette transmission af organismen, og dette kan føre til komplikationer såsom bækkenbetændelse (PID) og formidlet gonococcal infektion (DGI)6. Antibiotikaresistente gonoré er en større folkesundhedskrise og en øget samfundsøkonomisk byrde7. Reduceret følsomhed over for cefalosporiner har resulteret i behandling Régimen ændring fra et enkelt antibiotikum dual therapy, som kombinerer azithromycin eller doxycyklin med ceftriaxon8. Ceftriaxon og azithromycin9,10, i kombination med asymptomatiske infektioner, øget fiasko understreger behovet for forståelse gonoré behandling fiaskoer.

Den mindste hæmmende koncentration (MIC) test, herunder agar fortynding og disc diffusion tests, har været brugt som standard medicinsk test for at identificere resistens over for et antibiotikum. Det er dog uklart, om MIC test afspejler bakteriel antibiotikaresistens in vivo. Dannelsen af bakterielle biofilm bidrager til overlevelse af bakterier i nærværelse af bakteriedræbende koncentrationer af antibiotikum: mikrofon test er i stand til at opdage denne effekt11. Fordi GC kan danner biofilm på slimhindeinfektioner12, vi hypotesen, at antibiotikum modtagelighed i aggregater ville være forskellige fra, ses i enkelte GC. Desuden, har undersøgelser vist at trefaset variable overflade molekyler, Pili, opacitet-forbundet protein (Opa), og lipooligosaccharides (LOS), at regulerer Inter bakterie interaktioner, føre til forskellige størrelse aggregater13, 14 , 15. bidrag af disse komponenter til antibiotikaresistens er ikke blevet undersøgt på grund af manglen på ordentlig metoder.

I øjeblikket, er der flere metoder til at måle biofilm udryddelse. Den mest udbredte kvantitative metode er ved at måle ændringer i biomasse ved hjælp af krystalviolet farvning16. Metoden kræver imidlertid betydelig eksperimentelle manipulation, der potentielt kan generere fejl i eksperimentet gentager17. Live/døde farvnings-metoden bruges her giver mulighed for visualisering af levende og døde bakterier og deres fordeling i biofilm. Dog kan biofilm struktur optræde som en fysisk barriere, der reducerer farvestof penetration. Derfor, for at kvantificere live/døde bakterier inden for en gruppe, farvning er begrænset til små biofilm eller dens forløber-microcolonies eller sammenlægninger. Andre metoder, herunder agar fortynding og disc diffusion-testene er ikke i stand til at måle virkningerne af sammenlægning. At undersøge GC modtagelighed inden for sammenlægning efter antibiotisk eksponering, en ideel metode ville har brug for at have både en kvantitativ analyse, der kan måle live bakterier og visualisere deres distribution.

Proceduren beskrevet her kombinerer en ATP-udnyttelse måling og en live/døde farvning assay til kvantitativt og visuelt undersøge GC modtagelighed i aggregater under tilstedeværelse af antibiotika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generel vedligeholdelse af GC stammer

  1. Streak N. gonorrhoeae stammer på GCK agar med 1% Kellogg kosttilskud18 (tabel 1, tabel 2) fra fryseren bestande og inkuberes 37 ° C med 5% CO2 til 16-18 h. Brug MS11 udtrykker fase-variabel Opa (MS11Opa +), ingen Opa (MS11ΔOpa), eller en afkortet LOS (MS11ΔLgtE).
  2. Omhyggeligt vælge pili negative (koloni uden mørk kant) eller positiv (koloni med mørk kant) kolonier fra hver stamme baseret på koloni morfologi19 ved hjælp af en dissekere lysmikroskop og streak på en ny GCK tallerken.
  3. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 til 16-18 timer før brug.

2. levedygtighed kvantificering af GC sammenlægninger

  1. Indsamle GC ved hjælp af en steril applikator. Vatpind GC fra pladen og genopslæmmes GC i pre varmede bouillon (GCP, tabel 3) suppleret med 4,2% NaHCO3 og 1% Kellogg løsninger18. Bruge spektrofotometri ved en bølgelængde på 650 nm (en OD650 1 = ~ 1 x 109 CFU/mL) til at bestemme koncentrationen af suspenderede bakterier.
  2. Justere koncentrationen af GC til ~ 1 x 108 CFU/mL.
  3. Tilsæt 99 µL af justerede GC suspension i brønd af en 96-brønd plade.
  4. Inkuber plade i 6 timer ved 37 ° C med 5% CO2 til at tillade bakterier til aggregat.
  5. Tilføj 1 µL af serielle fortyndet ceftriaxon (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µg/mL) i hver brønd. Efterlad nogle brønde, ubehandlet for at tjene som kontrol.
  6. Inkuber plade i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
  7. Der sonikeres suspension 3 gange i hver brønd for 5 s på 144 W og 20 kHz.
  8. Tilsæt 100 µL af kommercielt tilgængelige ATP udnyttelse glød reagens til hver brønd, pipetteres op- og ned til 3 gange, og der inkuberes i 15 min. ved 37 ° C med 5% CO2.
  9. Omhyggeligt overføre 150 µL af blandingen fra hver brønd i en ny brønd i en 96-brønd sort mikrotiterplade og undgå at indføre bobler.
  10. Absorbansen af hver brønd på 560 nm med i pladelæseren.
  11. Beregne overlevelsesraten ved forholdet mellem læsning fremstillet efter seriel ceftriaxon behandling til læsning af ubehandlet brønde.

3. fluorescens mikroskopisk analyse af Live/døde af GC aggregater

  1. Indsamle GC ved hjælp af en steril applikator. Vatpind GC fra pladen og genopslæmmes GC i pre varmede GCP media plus 1% Kellogg kosttilskud.
  2. Bestemme antallet af bakterier ved spektrofotometri ved en bølgelængde på 650 nm og justere koncentrationen af GC til ~ 1 x 107 CFU/mL.
  3. Tilføje 198 µL af GC suspension ind i 8-godt coverslip-bunden kamre.
  4. Inkuber kammer i 6 timer ved 37 ° C med 5% CO2 til at tillade sammenlægning dannelse.
  5. Tilføj 2 µL af ceftriaxon (100 µg/mL eller forskellige fortyndinger) i hver brønd indenfor hver aggregering betingelse. Inkuber i den ønskede tid ved 37 ° C med 5% CO2.
  6. Tilføje 0,6 µL af live/døde farvning løsning blandingen i hver brønd og Inkuber i 20 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
  7. Erhverve Z-serie billeder ved hjælp af en Konfokal mikroskop (en tilsvarende mikroskop kan bruges).
  8. Analysere billeder ved hjælp af ImageJ software til måling af størrelsen af GC aggregater og fluorescens intensitet ratio (FIR) af live-til-døde pletter i hver aggregat.

4. billedanalyse

  1. Skøn over størrelsen af bakteriel aggregater.
    1. Åbne ImageJ og åbne et billede ved at trække en raw-billedfil til ImageJ menu advokatstanden.
    2. Klik på Frihånd linjer i menulinjen ImageJ og cirkel området i hver aggregering i billedet.
    3. Klik på analyser | Foranstaltning i menulinjen ImageJ.
    4. Få vist nummeret i et nyt vindue under kolonnen område .
  2. Kvantificering af live-til-døde forholdet mellem sammenlægninger
    1. Åbne ImageJ og åbne et billede ved at trække en raw-billedfil til ImageJ menu advokatstanden.
    2. Klik på analyser | Sæt målinger i menulinjen ImageJ.
    3. Kontroller den integrerede tæthed i pop-up vinduet og klik OK.
    4. Klik på billedet for | Farve | Kanaler værktøj i menulinjen og vælge farve.
    5. Tjek kanal 1 som fluorescens for levende bakterier farvning.
    6. Klik på Frihånd linjer i menulinjen ImageJ og cirkel inden for hver opgørelse.
    7. Klik på analyser | Foranstaltning i menulinjen ImageJ.
    8. Få vist nummeret under IntDen kolonne.
    9. Tjek kanal 2 som fluorescens for døde bakteriel farvning. Gentag trin 4.2.6-4.2.8.
    10. Få live-til-døde forholdet ved at dividere tal fra trin 4.2.8 med tal fra trin 4.2.9.
  3. Statistisk analyse
    1. Åbne GraphPad prisme og Indtast numrene fremstillet af ImageJ til den ønskede kolonne.
    2. Klik på analyser og vælg t test under kolonnen analyser.
    3. Marker den ønskede kolonne til sammenligning og klik på OK.
    4. Få P-værdien under analyse vindue.
    5. Vælg Lineær Regression under XY analyser fra trin 4.3.3
    6. R-kvadrat og P-værdi under vinduet analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To metoder var ansat: en ATP udnyttelse analyse og en live/døde farvning assay. Resultaterne kan enten være kombineret eller individuelt bruges til at undersøge bakteriel overlevelse inden for tilslagsmaterialer efter behandling med antibiotika. ATP udnyttelse analysen har vist at måle præcist levedygtige bakterier i S. aureus biofilm20,21. Her, blev MS11Opa + Pil + stamme brugt til at undersøge rollen, som GC sammenlægning i antibiotikaresistens. Ikke-aggregerede MS11Opa + Pil + aggregerede MS11Opa + Pil +, eller aggregerede og derefter afbrydes ved hjælp af sonikering MS11Opa + Pil + blev behandlet med serielle fortyndinger af ceftriaxon og ATP niveau målt (fig. 1A). Sammenligne den procentvise overlevelse med og uden antibiotisk behandling, havde pre aggregerede GC signifikant højere overlevelse end ikke-aggregerede eller sammenlægning-forstyrret GC med lige på eller over 0,015 µg/mL af ceftriaxon (MIC fra agar fortynding test ( Tabel 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa eller MS11ΔLgtE, der har den samme agar fortynding MIC (tabel 4), men formen mindre aggregater, blev undersøgt og sammenlignet med MS11Opa + Pil + (figur 1B). MS11Opa + Pil + danner større aggregater, havde højere ATP niveauet med ceftriaxon behandling end de mutante stammer.

Live/døde farvning er blevet brugt i flere biofilm/sammenlægning-relaterede studier22,23. At bestemme virkningen af sammenlægning, pre aggregerede MS11Opa + Pil + blev behandlet med eller uden ceftriaxon og afbildet. Dette giver både visualisering (som kan kvantificeres) og distribution af levende og døde GC efter behandling med antibiotika (figur 2A- venstre to paneler). Døde bakterier (red) var stort set ligger på de ydre lag, mens live GC (grøn) var placeret primært i kernen af ceftriaxon behandlet aggregater. Denne procedure blev udført med MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa eller MS11ΔLgtE, at undersøge sammenlægning størrelse og overlevelse sats (fig. 2A). MS11Opa + Pil + blev vist til at danne den største og MS11Opa + Pil-de mindste aggregater (figur 2A, B). MS11Opa + Pil + aggregater var stadig i live i det centrale lag mens GC i små løs aggregater af MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, og MS11ΔLgtEPil + var døde (figur 2A, C). Baseret på størrelse og overlevelse, kan en korrelation graf afbildes at undersøge forholdet mellem sammenlægning størrelse og antibiotika overlevelse (figur 2D).

Table 1
Tabel 1: Opskrift på 1 L af GCK Agar plade.

Table 2
Tabel 2: Opskrift på 1 L 100 x Kellogg's supplement.

Table 3
Tabel 3: Opskrift på 1 L GCP bakteriel vækst medier.

Table 4
Tabel 4: Minimum hæmmende koncentration af GC stammer behandlet med ceftriaxon. MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE og MS11Opa + Pil - var vokset og suspenderet i GCP. Agar fortynding test blev derefter udført med seriel koncentration af ceftriaxon fra 0.0016 - 0,25 µg/mL.

Figure 1
Figur 1 : Repræsentative data af overlevelsesraten for aggregerede GC under ceftriaxon behandling af ATP-udnyttelse assay. (A) overlevelse Vurder sammenligning af MS11Opa + Pil + suspension uden pre sammenlægning, før sammenlægning til 6 h eller forstyrre efter pre sammenlægning til 6 h. (B) overlevelse sats sammenligning af 6 h aggregerede MS11Opa + Pil + med MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, eller MS11ΔLgtEPil +. Vist er de gennemsnitlige værdier (±SD) fremstillet af tre uafhængige forsøg. p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05. Dette tal var tidligere udgivne 24 og bruges med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentative data af live/døde bakterier fordeling i aggregater under ceftriaxon behandling. (A) før aggregerede MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, eller MS11ΔLgtEPil + var enten inkuberes i tilstedeværelse eller fravær af 1 µg/mL ceftriaxon 2 h. aggregater blev derefter farves for at visualisere levedygtige (grøn) og døde (rød) GC og visualiseret med Konfokal fluorescens mikroskop. Skalalinjen: 50 µm. billeder blev derefter analyseret for (B) sammenlægning størrelse og (C) forholdet mellem live-til-døde GC og (D) en korrelation graf blev derefter lavet. Vist er de gennemsnitlige værdier (SD) fremstillet af > 40 billeder af tre uafhængige forsøg. p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05. Dette tal var tidligere udgivne 24og bruges med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bakterier kan danne biofilm under infektion af det menneskelige legeme. Traditionelle MIC test kan ikke afspejle den koncentration, der er nødvendige for at udrydde bakterier i en biofilm. For at teste antimikrobielle virkninger på en biofilm, kan metoder baseret på biofilm biomasse samt plating CFUs være forkert på grund af virkningen af biofilm struktur. For eksempel, virker plating metode kun hvis biofilm kan være afbrudt. Derfor, CFU fremstillet kan være lavere end det faktiske antal levedygtige bakterier. Visualisering døde og levende bakterier i biofilm er blevet fastlagt for måling overlevelse af bakterier i biofilm, dog afhængigt af strukturen og tætheden af biofilm, farvning kan undlader at trænge ind i biofilm og resultere i en unøjagtige og undervurderet overlevelsesrate.

Metoden her bruger både en kvantitativ og en visualisering analyse til måling af bakteriel overlevelse efter behandling af aggregater. Fordelen ved denne metode er at det måler den bakterielle overlevelse i et miljø, der er tættere på, hvad der er set i en reel infektion. Overlevelse sats forskelle mellem ikke-aggregerede og aggregerede bakterier vil tillade os at afgøre, om in vitro-MIC korrelerer med in vivo MIC.

ATP udnyttelse assay, som måler ATP produktion, måle kvantitativt overlevelse af aggregater. Analysen er mere følsomme og kan differentiere overlevelse mellem små forskelle i antibiotikum koncentration, sammenlignet med andre lignende assays. Men på grund af den høje følsomhed af denne analyse, kvalitetssikring af bakteriel celle lysis er kritisk. Derfor blev en sonikering skridt brugt. Derudover kan ikke denne metode bruges til at måle bakteriel overlevelse in vivo på grund af den store mængde af ATP, der værtsceller producere der kan maskere bakteriel ATP niveauet. Derudover kan samspillet mellem værtsceller og bakterier påvirke bakteriel ATP produktion. Ved hjælp af denne analyse på bakterier med pigmenter kan være begrænsende som pigmenter kan interferere med læsning.

Live/døde pletten har været meget anvendt i biofilm undersøgelser. Dog kan penetration af farvning farvestoffer plette kun de yderste bakterier, der henviser til kernen ikke kan farves. Det kan derfor kun bruges til visualisering, men ikke kvantificering, som følge af ujævn fordeling af farvestoffet. Vi brugte små aggregater for denne farvning og demonstreret dette assay kan bruges til at kvantificere den samlede bakteriel overlevelse inden for aggregaterne. Desuden, negative og positive kontroller er nødvendige for at justere koncentrationen af farvestoffet for forskellige bakterier.

I kombination med MIC-protokollen, kan ATP udnyttelse assay og live/døde pletter tjene som en effektiv metode til kvantitativt og visuelt analysere N.gonorrhoeae samt andre bakterielle sammenlægninger25,26. Anvendelsen af den kombinerede protokollen kunne give en bedre forståelse af sygdom dannelsen sammen med dens alsidige anvendelser i stof screening baseret på bakterier biofilm. Denne metode kan mere præcist at afspejle i vivo MIC af et antibiotikum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institute of Health D.C.S. og WS AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., og E.N. blev støttet i del/deltage i "Den første års Innovation & forskning Experience" program finansieret af University of Maryland. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. Vi anerkender UMD CBMG Imaging kernen for alle mikroskopi eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
  2. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17, (1), (2017).
  3. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90, (4), 634-635 (1977).
  4. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43, (10), 608-616 (2016).
  5. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. accessed Oct 5 (2011).
  6. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86, (10), 931-938 (2012).
  7. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14, (7), (2017).
  8. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  9. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), (2018).
  10. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14, (7), 1002344 (2017).
  11. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  12. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73, (4), 1964-1970 (2005).
  13. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10, (8), 0134342 (2015).
  15. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194, (23), 6468-6478 (2012).
  16. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
  17. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72, (2), 157-165 (2008).
  18. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  19. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134, (4), 886-906 (1971).
  20. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  21. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14, (1), 23-31 (1999).
  22. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185, (15), 4585-4592 (2003).
  23. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  24. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7, (2), (2018).
  25. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78, (3), 510-543 (2014).
  26. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65, (2), 127-145 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics