L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Un'analisi di ATP-misurazione semplice e live/dead metodo di colorazione sono stati usati per quantificare e visualizzare le gonorree di Neisseria sopravvivenza dopo il trattamento con ceftriaxone. Questo protocollo può essere esteso per esaminare gli effetti antimicrobici di qualsiasi antibiotico e può essere utilizzato per definire la concentrazione inibitoria minima di antibiotici in biofilm batterici.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

L'emergere di resistenti agli antibiotici Neisseria gonorrhoeae (GC) è una minaccia per la salute in tutto il mondo e mette in evidenza la necessità di identificare gli individui che non riescono di trattamento. Questo batterio gram-negativo causa gonorrea esclusivamente in esseri umani. Durante l'infezione, è in grado di formare aggregati e/o biofilm. Il test di concentrazione inibitoria minima (MIC) è utilizzato per determinare la suscettibilità agli antibiotici e di definire il trattamento adatto. Tuttavia, il meccanismo di eradicazione in vivo e la sua relazione ai risultati di laboratorio non sono noti. È stato sviluppato un metodo che esamina come aggregazione di GC influisce sulla sensibilità agli antibiotici e illustrata la relazione tra dimensioni di aggregazione e di sensibilità agli antibiotici. Quando aggregato GC, sono più resistenti agli antibiotici uccisione, con batteri nel centro della sopravvivenza ceftriaxone trattamento meglio di quelli in periferia. I dati indicano che l'aggregazione di N. gonorrhoeae può ridurre la sua suscettibilità a ceftriaxone, che non trova riscontro utilizzando i metodi MIC basati su piastra di agar standard. Il metodo utilizzato in questo studio permetterà ai ricercatori di testare la suscettibilità batterica in condizioni clinicamente rilevanti.

Introduction

La gonorrea è che una comune infezione (STI)1trasmesse per via sessuale. Neisseria gonorrhoeae (GC), un batterio gram-negativo diplococcal, è l'agente eziologico di questa malattia. I sintomi dell'infezione genitale possono provocare dolore durante la minzione, dolore genitale generalizzato e scarico uretrale. L'infezione è spesso asintomatica2,3,4,5, e in questo modo estesa colonizzazione. Queste infezioni non trattate sono un problema sanitario importante, come hanno il potenziale per facilitare la trasmissione dell'organismo e questo può portare a complicazioni come la malattia infiammatoria pelvica (PID) e diffuso l'infezione gonococcica (DGI)6. Gonorrea resistente agli antibiotici è una crisi di salute pubblica e un crescente onere socio-economico7. Ridotta sensibilità alle cefalosporine ha provocato il cambiamento di regime di trattamento da un singolo antibiotico a duplice terapia, che combina azitromicina o doxiciclina con ceftriaxone8. Il guasto aumentato di ceftriaxone e azithromycin9,10, in combinazione con le infezioni asintomatiche, evidenzia l'esigenza di comprendere gli insuccessi del trattamento di gonorrea.

La prova di concentrazione inibitoria minima (MIC), tra cui agar diluizione e disco test di diffusione, è stata usata come la prova medica standard per l'identificazione di resistenza ad un antibiotico. Tuttavia, non è chiaro se il MIC test riflette la resistenza antibiotica batterica in vivo. La formazione di biofilm batterici contribuisce alla sopravvivenza di batteri in presenza di concentrazioni battericide di antibiotico: il MIC Test è in grado di rilevare questo effetto11. Perché GC può formare biofilm su superfici mucose12, possiamo ipotizzare che tale antibiotico suscettibilità all'interno di aggregati sarebbe diverso da quello visto in GC individuali. Inoltre, gli studi hanno indicato che la proteina molecole di superficie variabile, Pili, opacità (Opa) a tre fasi, e lipooligosaccharides (LOS), che regolano le interazioni inter-batterio, portare a diversi aggregati di dimensioni13, 14 , 15. il contributo di questi componenti di resistenza agli antibiotico non è stato esaminato a causa della mancanza di metodi adeguati.

Attualmente, ci sono diversi metodi per misurare l'eradicazione biofilm. Il metodo quantitativo più ampiamente usato è misurando i cambiamenti nella biomassa usando cristalvioletto macchiatura16. Tuttavia, il metodo richiede significativi manipolazione sperimentale, che potenzialmente possa generare errori in esperimento ripetizioni17. Il metodo di macchiatura live/dead qui utilizzato permette la visualizzazione di batteri vivi e morti e loro distribuzione all'interno del biofilm. Tuttavia, la struttura di biofilm può rappresentare come una barriera fisica che riduce la penetrazione della tintura. Pertanto, per quantificare i batteri vive/morte all'interno di un gruppo, la colorazione è limitata a piccole biofilm oppure il suo precursore-microcolonies o aggregazioni. Altri metodi, compreso le prove di diffusione agar diluizione e disco, non sono in grado di misurare gli effetti dell'aggregazione. Per esaminare la suscettibilità di GC all'interno di aggregazione dopo esposizione agli antibiotici, un metodo ideale avrebbe bisogno di avere entrambi un dosaggio quantitativo che può misurare batteri vivi e visualizzare la loro distribuzione.

La procedura qui descritta combina una misurazione di ATP-utilizzazione e un live/dead colorazione dosaggio a quantitativamente ed esaminare visivamente la suscettibilità di GC all'interno di aggregati in presenza di antibiotici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generale manutenzione dei ceppi di GC

  1. Striscia N. gonorrhoeae ceppi su agar GCK con 1% Kellogg integratori18 (tabella 1, tabella 2) dalle scorte di congelatore e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 16-18 h. uso MS11 esprimendo la variabile phase Opa (MS11Opa +), nessuna Opa (MS11ΔOpa), o un LOS troncato (MS11ΔLgtE).
  2. Scegliere attentamente pili negativi (Colonia, senza bordo scuro) o colonie positive (Colonia con bordo scuro) da ogni ceppo basato su Colonia morfologia19 utilizzando un microscopio per dissezione e striscia su un piatto GCK nuovo.
  3. Incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 16-18 h prima dell'uso.

2. quantificazione di attuabilità delle aggregazioni di GC

  1. Raccogliere GC utilizzando un applicatore sterile. Tampone di GC dalla piastra e risospendere GC in brodo pre-riscaldato (GCP, tabella 3) completati con 4,2% NaHCO3 e 1% Kellogg soluzioni18. Utilizzare spettrofotometria ad una lunghezza d'onda di 650 nm (un OD650 di 1 = ~ 1 x 109 CFU/mL) per determinare la concentrazione di batteri sospesi.
  2. Regolare la concentrazione di GC a ~ 1 x 108 UFC/mL.
  3. Aggiungere 99 µ l della sospensione di GC regolata nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
  4. Incubare la piastra per 6 h a 37 ° C con 5% CO2 per consentire i batteri da aggregare.
  5. Aggiungere 1 µ l di ceftriaxone diluito seriale (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µ g/mL) in ciascun pozzetto. Lasciare alcuni pozzi non trattate per servire come controlli.
  6. Incubare la piastra per 24 h a 37 ° C con 5% CO2.
  7. Sonicare la sospensione 3 volte in ogni pozzetto per 5 s a 144 W e 20 kHz.
  8. Aggiungere 100 µ l di reagente di bagliore utilizzazione ATP disponibile in commercio in tutti i pozzetti, Pipettare fino- e giù per 3 volte e incubare per 15 min a 37 ° C con 5% CO2.
  9. Attentamente trasferire 150 µ l di miscela da ogni pozzetto in un nuovo pozzo in una micropiastra 96 pozzetti nero ed evitare di introdurre bolle.
  10. Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 560 nm utilizzando il lettore di piastra.
  11. Calcolare il tasso di sopravvivenza dal rapporto tra la lettura ottenuta dopo il trattamento di ceftriaxone seriale alla lettura da pozzi non trattati.

3. analisi microscopiche fluorescenza di Live/Dead degli aggregati di GC

  1. Raccogliere GC utilizzando un applicatore sterile. GC di tampone dalla piastra e risospendere GC in media GCP plus 1% pre-riscaldato Kellogg integratori.
  2. Determinare il numero di batteri mediante spettrofotometria ad una lunghezza d'onda di 650 nm e regolare la concentrazione di GC a ~ 1 x 107 CFU/mL.
  3. Aggiungere 198 µ l della sospensione di GC nelle camere a 8 pozzetti vetrino coprioggetti-fondo.
  4. Incubare la camera per 6 h a 37 ° C con 5% CO2 per permettere la formazione di aggregazione.
  5. Aggiungere 2 µ l di ceftriaxone (100 µ g/mL o varie diluizioni) in ogni pozzetto all'interno di ogni condizione di aggregazione. Incubare per il tempo desiderato a 37 ° C con 5% CO2.
  6. Aggiungere 0,6 µ l di miscela di soluzione colorante live/dead in ogni pozzetto e incubare per 20 min a 37 ° C con 5% CO2.
  7. Acquisire immagini di Z-serie utilizzando un microscopio confocale (può essere utilizzato un microscopio equivalente).
  8. Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ per la misura delle dimensioni degli aggregati di GC e il rapporto di intensità di fluorescenza (FIR) di vivere-a-morti macchiatura in ogni funzione di aggregazione.

4. analisi di immagine

  1. Stima delle dimensioni degli aggregati batterici.
    1. Aprire ImageJ e aprire un'immagine trascinando un file di immagine raw alla barra dei menu di ImageJ.
    2. Fare clic su Linee a mano libera nella barra dei menu di ImageJ e l'area di ogni aggregazione nell'immagine del cerchio.
    3. Fare clic su analisi | Misura nella barra dei menu di ImageJ.
    4. Ottenere il numero in una nuova finestra sotto la colonna di zona .
  2. Quantificazione del rapporto vive-di-morte di aggregazioni
    1. Aprire ImageJ e aprire un'immagine trascinando un file di immagine raw alla barra dei menu di ImageJ.
    2. Fare clic su analisi | Impostare misure nella barra dei menu di ImageJ.
    3. Controllare la densità integrata nella finestra a comparsa e fare clic su OK.
    4. Fare clic su immagine di | Colore | Canali strumento nella barra dei menu e selezionare il colore.
    5. Controllo canale 1 come la fluorescenza per batteri vivi che macchia.
    6. Fare clic su Linee a mano libera nella barra dei menu di ImageJ e l'area di ogni aggregazione del cerchio.
    7. Fare clic su analisi | Misura nella barra dei menu di ImageJ.
    8. Ottenere il numero nella colonna IntDen .
    9. Verifica canale 2 come la fluorescenza per la macchiatura morto batterica. Ripetere i passaggi 4.2.6-4.2.8.
    10. Ottenere il rapporto di vive-di-morte dividendo il numero di passaggio 4.2.8 di numero dal passaggio 4.2.9.
  3. Analisi statistica
    1. Aprire GraphPad Prism e immettere i numeri ottenuti da ImageJ per la colonna desiderata.
    2. Fare clic su analizza e seleziona t test sotto analisi colonna.
    3. Controllare la colonna desiderata per il confronto e fare clic su OK.
    4. Ottenere il P-valore sotto la finestra di analisi .
    5. Selezionare la Regressione lineare sotto analisi XY dal passaggio 4.3.3
    6. Ottenere la R-quadrato e il P-valore sotto la finestra di analisi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Due metodi sono stati impiegati: un'analisi di utilizzo di ATP e un saggio di colorazione live/dead. I risultati possono essere combinati o usati individualmente per l'esame di sopravvivenza batterica all'interno di aggregazioni dopo il trattamento antibiotico. Il dosaggio di utilizzazione di ATP è stato indicato per misurare con precisione praticabile batteri Staphylococcus aureus biofilm20,21. Qui, MS11Opa + Pil + ceppo è stato utilizzato per esaminare il ruolo di aggregazione di GC nella suscettibilità agli antibiotici. Dati aggregati non MS11Opa + Pil +, MS11Opa + Pil aggregato +, o aggregati e poi interrotto da sonicazione MS11Opa + Pil + sono stati trattati con diluizioni seriali del ceftriaxone e l'ATP livello misurato (Figura 1A). Nel confrontare la sopravvivenza per cento con e senza trattamento antibiotico, GC pre-aggregati hanno avuti sopravvivenza significativamente più alta che GC non aggregati o aggregazione-perturbato con uguale a o superiore a 0,015 µ g/mL di ceftriaxone (MIC da test di diluizione agar ( Tabella 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa o MS11ΔLgtE, che hanno la stessa diluizione agar MIC (tabella 4), ma formare aggregati più piccoli, è stato esaminato e rispetto a MS11Opa + Pil + (Figura 1B). MS11Opa + Pil +, formando aggregati più grandi, avevano il livello di ATP superiore con ceftriaxone trattamento di ceppi mutanti.

Live/dead macchiatura è stata utilizzata in diversi studi relativi a biofilm/aggregazione22,23. Per determinare l'effetto dell'aggregazione, pre-aggregati MS11Opa + Pil + è stata trattata con o senza ceftriaxone e ripreso. Questo consente sia di visualizzazione (che può essere quantificata) e la distribuzione di GC dal vivo e morto dopo il trattamento antibiotico (Figura 2A- due pannelli a sinistra). I batteri morti (rosso) erano in gran parte situati presso gli strati più esterni, mentre live GC (verde) sono stati situati principalmente nel nucleo di ceftriaxone trattati aggregati. Questa procedura è stata eseguita con MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa o MS11ΔLgtE, per esaminare il tasso di sopravvivenza e dimensioni di aggregazione (Figura 2A). MS11Opa + Pil + è stato indicato per formare il più grande e MS11Opa + Pil-gli aggregati più piccoli (Figura 2A, B). MS11Opa + Pil + aggregati erano ancora vivi nel livello principale mentre GC nella piccole inerti sfusi di MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, e MS11ΔLgtEPil + erano morti (Figura 2A, C). In base alle dimensioni e alla sopravvivenza, un grafico di correlazione possa essere tracciato per esaminare la relazione tra dimensioni di aggregazione e sopravvivenza antibiotico (Figura 2D).

Table 1
Tabella 1: Ricetta per 1 L di GCK piastra di Agar.

Table 2
Tabella 2: Ricetta per 1 L di 100 x supplemento di Kellogg.

Table 3
Tabella 3: Ricetta per 1 L di GCP crescita batterica Media.

Table 4
Tabella 4: concentrazione inibitoria minima di ceppi di GC trattati con ceftriaxone. MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE e MS11Opa + Pil - erano cresciuti e sospeso in GCP. Test di diluizione agar è stata quindi effettuata con seriale concentrazione di ceftriaxone da 0.0016 - 0,25 µ g/mL.

Figure 1
Figura 1 : Dati rappresentativi del tasso di sopravvivenza di GC aggregato nell'ambito del trattamento di ceftriaxone dall'analisi di ATP-utilizzo. Tasso di sopravvivenza di (A) confronto di MS11Opa + Pil + sospensione senza pre-aggregare, pre-aggregare per 6 h o interrompere dopo pre-aggregare per confronto tra tassi di sopravvivenza h. 6 (B) di 6 h aggregati MS11Opa + Pil + con MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + PIL-, o MS11ΔLgtEPil +. Indicati sono valori medi (± DS) ottenuti da tre esperimenti indipendenti. p < 0,001; p < 0.01; p < 0.05. Questa cifra era precedentemente pubblicati 24 ed è usata con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Dati rappresentativi della distribuzione live/dead batteri all'interno di aggregati nell'ambito del trattamento di ceftriaxone. (A) pre-aggregate MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpaPil +, MS11Opa + Pil-, o MS11ΔLgtEPil + era sia incubate in presenza o assenza di 1 µ g/mL ceftriaxone per 2 h. aggregati erano quindi macchiati per visualizzare praticabile (verde) e morti (rosso) GC e visualizzati con microscopio a fluorescenza confocale. Barra della scala: 50 µm. immagini quindi sono state analizzate per dimensioni di aggregazione (B) e (C) rapporto di GC (D), un grafico di correlazione e vive-di-morte quindi è stato creato. Indicati sono valori medi (SD) ottenuti da > 40 immagini di tre esperimenti indipendenti. p < 0,001; p < 0.01; p < 0.05. Questa cifra era precedentemente pubblicati 24ed è usata con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I batteri possono formare biofilm durante l'infezione del corpo umano. Test di MIC tradizionale potrebbe non riflettere la concentrazione necessaria per sradicare i batteri nel biofilm. Per verificare gli effetti antimicrobici su un biofilm, metodi basati sulla biomassa di biofilm, nonché CFUs di placcatura possono essere errati a causa dell'impatto della struttura del biofilm. Ad esempio, il metodo di placcatura funziona solo se il biofilm può essere interrotta. Quindi, il CFU ottenuto può essere inferiore rispetto al numero effettivo di batteri vitali. Visualizzazione batteri morti e vivere all'interno del biofilm sono stati stabiliti per la sopravvivenza di batteri all'interno del biofilm di misura, tuttavia, a seconda della struttura e la densità del biofilm, la colorazione può riuscire a penetrare i biofilm e provocare un tasso di sopravvivenza imprecise e sottovalutata.

Il metodo qui utilizza un quantitativo e un'analisi di visualizzazione per misurare la sopravvivenza batterica dopo trattamento di aggregati. Il vantaggio di questo metodo è che esso misura la sopravvivenza batterica in un ambiente che è più vicino a ciò che si vede in una vera e propria infezione. Le differenze del tasso di sopravvivenza tra batteri aggregati e non aggregati ci permetterà di determinare se il MIC in vitro correla con il MIC in vivo.

L'analisi di utilizzo di ATP, che misura la produzione di ATP, è in grado di misurare quantitativamente la sopravvivenza degli aggregati. Il test è più sensibile e può differenziare sopravvivenza tra piccole differenze nella concentrazione di antibiotico, rispetto ad altri dosaggi simili. Tuttavia, dovuto l'alta sensibilità di questo test, garanzia di lisi delle cellule batteriche è critico. Di conseguenza, veniva utilizzata un'istruzione di sonicazione. Inoltre, questo metodo non può essere utilizzato per misurare la sopravvivenza batterica in vivo a causa della grande quantità di ATP che producono cellule dell'ospite che può mascherare il livello di ATP batterico. Inoltre, l'interazione delle cellule dell'ospite con i batteri può influenzare la produzione batterica di ATP. Usando questa analisi sui batteri con pigmenti può essere limitante come i pigmenti possono interferire con la lettura.

La macchia di live/dead è stato ampiamente usata negli studi di biofilm. Tuttavia, la penetrazione dei coloranti colorazione può macchiare solo i batteri più esterno, mentre il nucleo non può essere macchiato. Pertanto, utilizzabile solo per la visualizzazione ma non quantificazione, a causa della distribuzione irregolare del colorante. Abbiamo usato piccoli aggregati per la macchiatura e dimostrato che questa analisi può essere usata per quantificare la sopravvivenza complessiva batterica all'interno degli aggregati. Inoltre, controlli positivi e negativi sono necessari per regolare la concentrazione del colorante per diversi tipi di batteri.

In combinazione con il protocollo MIC, la macchia di dosaggio e live/dead utilizzazione di ATP può servire come un metodo efficace per analizzare quantitativamente e visivamente N.gonorrhoeae , come pure altre aggregazioni batteriche25,26. L'applicazione del protocollo combinato potrebbe fornire una migliore comprensione della formazione di malattia insieme al suo impiego versatile in screening di farmaci basato su biofilm di batteri. Questo metodo può riflettere più accuratamente l' in vivo MIC di un antibiotico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal National Institute of Health D.C.S e W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., ed E.N. sono stati sostenuti in parte/partecipare al programma "Il primo anno l'innovazione & ricerca Experience" finanziato dall'Università del Maryland. I finanziatori non avevano alcun ruolo in studio progettazione, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Riconosciamo l'UMD CBMG Imaging Core per tutti gli esperimenti di microscopia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
  2. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17, (1), (2017).
  3. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90, (4), 634-635 (1977).
  4. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43, (10), 608-616 (2016).
  5. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. accessed Oct 5 (2011).
  6. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86, (10), 931-938 (2012).
  7. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14, (7), (2017).
  8. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  9. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), (2018).
  10. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14, (7), 1002344 (2017).
  11. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  12. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73, (4), 1964-1970 (2005).
  13. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10, (8), 0134342 (2015).
  15. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194, (23), 6468-6478 (2012).
  16. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
  17. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72, (2), 157-165 (2008).
  18. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  19. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134, (4), 886-906 (1971).
  20. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  21. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14, (1), 23-31 (1999).
  22. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185, (15), 4585-4592 (2003).
  23. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  24. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7, (2), (2018).
  25. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78, (3), 510-543 (2014).
  26. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65, (2), 127-145 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics