Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung

Immunology and Infection

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Summary

Eine einfache Messung der ATP Assay und lebenden/Toten Färbung Methode dienten zu quantifizieren und zu visualisieren, Neisseria Gonorrhoeae Überleben nach Behandlung mit Ceftriaxon. Dieses Protokoll kann verlängert werden, um die antimikrobielle Wirkung der jedes Antibiotikum zu untersuchen und kann verwendet werden, um die minimalen inhibitorischen Konzentration der Antibiotika bei bakteriellen Biofilmen definieren.

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Wang, L. C., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

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Abstract

Die Entstehung von Antibiotika-resistenten Neisseria Gonorrhoeae (GC) ist ein weltweit Gesundheitsrisiko dar und unterstreicht die Notwendigkeit, Personen zu identifizieren, die Behandlung nicht. Dieses gramnegatives Bakterium verursacht Gonorrhoe ausschließlich beim Menschen. Während der Infektion ist es in der Lage, Form Aggregate und/oder Biofilme. Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Test dient für Anfälligkeit gegen Antibiotika zu bestimmen und entsprechenden Behandlung zu definieren. Der Mechanismus der die Beseitigung der in-vivo und ihre Beziehung zur Laborergebnisse sind nicht bekannt. Eine Methode, die untersucht, wie GC Aggregation Antibiotikaempfindlichkeit beeinflusst und zeigt die Beziehung zwischen aggregierte Größe und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde entwickelt. Wenn GC Aggregat sie resistenter gegen Antibiotika töten sind, überleben mit Bakterien im Zentrum Ceftriaxon-Behandlung besser als in der Peripherie. Die Daten zeigen, dass N. Gonorrhoeae Aggregation seiner Anfälligkeit für Ceftriaxon, reduzieren kann, was nicht mit den standard Agar-Platte-basierte MIC Methoden widerspiegelt. In dieser Studie verwendete Methode ermöglicht es Forschern, bakterielle Anfälligkeit unter klinisch relevanten Bedingungen zu testen.

Introduction

Gonorrhoe ist eine gemeinsame sexuell übertragbare Infektionen (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), ein gramnegatives diplococcal Bakterium ist der Erreger dieser Krankheit. Symptome der genitalen Infektion führt zu Schmerzen beim Wasserlassen, generalisierte genitale Schmerzen und Harnröhre entladen. Infektion ist oft asymptomatisch2,3,4,5, und dies ermöglicht eine erweiterte Kolonisation. Diese unbehandelten Infektionen sind ein großes gesundheitliches Problem, da sie das Potenzial, die Übertragung des Organismus zu erleichtern und dies kann zu Komplikationen wie Adnexitis (PID) und verbreitet Gonokokken-Infektion (DGI)6. Antibiotika-resistenten Tripper ist eine Krise des öffentlichen Gesundheitswesens und eine zunehmende sozioökonomische Last7. Geringere Anfälligkeit für Cephalosporine führte Behandlung Therapie Wechsel von ein einziges Antibiotikum zur dualen Therapie verbindet Azithromycin oder Doxycyclin mit Ceftriaxon8. Das erhöhte Scheitern von Ceftriaxon und Azithromycin9,10, in Kombination mit asymptomatische Infektionen, unterstreicht die Notwendigkeit der Gonorrhoe Behandlungsversagen zu verstehen.

Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC)-Test, einschließlich der Agar-Verdünnung und Disc-Diffusion-Tests, wurde als der standard medizinischer Test zur Identifizierung von Widerstand gegen ein Antibiotikum eingesetzt. Es ist jedoch unklar, ob der MIC Test bakterielle Resistenz gegen Antibiotika in-vivo widerspiegelt. Die Entstehung von bakteriellen Biofilmen trägt für das Überleben der Bakterien im Beisein von bakterizide Konzentrationen des Antibiotikums: die MIC-Tests sind nicht in der Lage, diesen Effekt11zu erkennen. Weil GC auf Schleimhaut-Oberflächen12Biofilme bilden kann, wir stellen die Hypothese auf, dass Antibiotikum Anfälligkeit innerhalb Aggregate wäre anders als in einzelnen GC gesehen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass drei--Variable Oberflächenmoleküle, Pili, Deckkraft-assoziierten Protein (Opa Phasen) und Lipooligosaccharides (LOS), die Inter Bakterie Interaktionen regulieren, zu verschiedenen großen Aggregate13, führen 14 , 15. der Beitrag dieser Komponenten zu Antibiotika-Resistenz wurde nicht durch den Mangel an geeigneten Methoden geprüft.

Derzeit gibt es mehrere Methoden, um die Beseitigung der Biofilm zu messen. Die am weitesten verbreitete quantitative Methode ist durch Messung der Biomasse mit Kristallviolett16Färbung. Die Methode erfordert jedoch erhebliche experimentelle Manipulation, die möglicherweise Fehler im Experiment wiederholt17erzeugen kann. Die lebenden/Toten Färbung Methode hier ermöglicht die Visualisierung von lebenden und toten Bakterien und deren Verteilung innerhalb der Biofilm. Die Biofilm-Struktur kann jedoch als eine physikalische Barriere darstellen, die Farbstoff eindringen reduziert. Daher beschränkt sich um lebenden/Toten Bakterien innerhalb einer Gruppe zu quantifizieren, die Färbung auf kleine Biofilmen oder seine Vorläufer-Mikrokolonien oder Aggregationen. Andere Methoden, einschließlich der Agar Verdünnung und Disc Verbreitung Tests sind nicht in der Lage, die Auswirkungen der Aggregation zu messen. GC-Anfälligkeit in Aggregation nach antibiotische Belichtung, eine ideale Methode untersuchen brauchen haben beide ein quantitativen Assay, der messen kann lebende Bakterien und deren Verteilung zu visualisieren.

Das hier beschriebene Verfahren kombiniert eine ATP-Nutzung-Messung und einer lebenden/Toten Färbung quantitativ zu bestimmen und visuell prüfen GC Anfälligkeit innerhalb Aggregate in Anwesenheit von Antibiotika.

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Protocol

1. Allgemeine Wartung von GC-Stämme

  1. N. Gonorrhoeae Stämme Streifen auf GCK-Agar mit 1 % Kellogg ergänzt18 (Tabelle 1, Tabelle 2) aus den Beständen der Gefrierschrank und inkubieren Sie 37 ° C mit 5 % CO2 für 16-18 h Nutzung MS11 Ausdruck Phase-Variable Opa (MS11Opa +), keine Opa (MS11ΔOpa), oder einen abgeschnittenen LOS (MS11ΔLgtE).
  2. Wählen Sie sorgfältig Pili negative (Kolonie ohne dunkle Kante) oder positiv (Kolonie mit dunklen Rand) Kolonien aus jedem Stamm basierend auf Kolonie Morphologie19 mit einem sezierenden Lichtmikroskop und Streifen auf einen neuen GCK-Teller.
  3. Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 16-18 Uhr vor dem Gebrauch.

(2) Lebensfähigkeit Quantifizierung der GC Aggregationen

  1. GC mit einem sterilen Applikator zu sammeln. Tupfer GC aus der Platte und wieder auszusetzen GC in vorgewärmten Brühe (GCP, Tabelle 3) ergänzt mit 4,2 % Nahco33 und 1 % Kellogg Lösungen18. Verwenden Sie Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 650 nm (ein OD-650 1 = ~ 1 x 109 KBE/mL) zur Bestimmung der Konzentration von Bakterien ausgesetzt.
  2. Passen Sie die Konzentration der GC bis ~ 1 x 108 KBE/mL.
  3. Fügen Sie 99 µL bereinigte GC Suspension in Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
  4. Inkubieren Sie die Platte für 6 h bei 37 ° C mit 5 % CO2 , die Bakterien zu aggregieren.
  5. Fügen Sie 1 µL serielle verdünnten Ceftriaxon (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 µg/mL) in jede Vertiefung. Lassen Sie einige Brunnen unbehandelt als Kontrollen dienen.
  6. Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37 ° C mit 5 % CO2.
  7. Beschallen Sie die Suspension 3 Mal in jede Vertiefung für 5 s 144 W und 20 kHz.
  8. Fügen Sie 100 µL kommerziell verfügbare ATP Auslastung Glühen Reagenz in jede Vertiefung, pipette- und 3 Mal, und 15 min bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren.
  9. Vorsichtig 150 µL Gemisch aus jedem Brunnen in einen neuen Brunnen in einer 96-Well schwarz Mikrotestplatte übertragen und Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
  10. Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 560 nm mit dem Teller-Reader.
  11. Berechnen Sie die Überlebensrate nach dem Verhältnis der Lesung Lesung aus unbehandelten Brunnen nach seriellen Ceftriaxon-Behandlung erhalten.

(3) Fluoreszenz mikroskopische Analyse der Live/Dead GC Aggregate

  1. GC mit einem sterilen Applikator zu sammeln. Tupfer GC aus der Platte und wieder auszusetzen GC im vorgewärmten GCP Medien plus 1 % ergänzt Kellogg.
  2. Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien durch Spektralphotometrie bei einer Wellenlänge von 650 nm und passen Sie die Konzentration der GC bis ~ 1 x 107 KBE/mL.
  3. 198 µL GC Suspension in in 8-Brunnen Deckglas-unten Kammern hinzufügen.
  4. Inkubieren Sie die Kammer für 6 h bei 37 ° C mit 5 % CO2 Aggregation Bildung zu ermöglichen.
  5. Fügen Sie 2 µL Ceftriaxon (100 µg/mL oder verschiedenen Verdünnungen) in jede Vertiefung innerhalb jedes Aggregation Zustand. Die gewünschte Zeit bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren.
  6. Fügen Sie 0,6 µL lebenden/Toten Färbung Lösung Mischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 20 min bei 37 ° C mit 5 % CO2.
  7. Z-Serie-Bilder mit einem konfokalen Mikroskop (ein Äquivalent Mikroskop einsetzbar) zu erwerben.
  8. Analysieren Sie die Bilder mit ImageJ-Software zur Messung der Größe des GC-Aggregate und die Fluoreszenz Intensitätsverhältnis (FIR) der lebenden Toten Färbung in jedes Aggregat.

(4) Bildanalyse

  1. Abschätzung der Größe der bakteriellen Aggregate.
    1. Öffnen Sie ImageJ und öffnen Sie ein Bild, indem Sie eine raw-Bild-Datei auf ImageJ-Menü-Leiste ziehen.
    2. Klicken Sie Freihandlinien in der Menüleiste ImageJ und Kreis Bereich jede Aggregation im Bild.
    3. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme in der Menüleiste ImageJ.
    4. Erhalten Sie die Zahl in einem neuen Fenster unter der Spalte Fläche .
  2. Quantifizierung der lebenden Toten Verhältnis der Aggregationen
    1. Öffnen Sie ImageJ und öffnen Sie ein Bild, indem Sie eine raw-Bild-Datei auf ImageJ-Menü-Leiste ziehen.
    2. Klicken Sie auf analysieren | Legen Sie Messungen in der Menüleiste ImageJ.
    3. Überprüfen Sie die integrierte Dichte im Pop-up-Fenster und klicken Sie auf "OK".
    4. Klicken Sie auf Bild | Farbe | Werkzeug-Kanäle in der Menüleiste und wählen Sie Farbe.
    5. Aktivieren Sie Kanal 1 als die Fluoreszenz für lebende Bakterien Färbung.
    6. Klicken Sie Freihandlinien in der Menüleiste ImageJ und Kreis Bereich jede Aggregation.
    7. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme in der Menüleiste ImageJ.
    8. Ermittelt Anzahl unter IntDen Spalte.
    9. Kanal 2 als die Fluoreszenz für Tote bakterielle Verfärbungen zu überprüfen. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.6-4.2.8.
    10. Erhalten Sie das Verhältnis der lebenden Toten durch die Aufteilung der Zahl von Schritt 4.2.8 durch Zahl von Schritt 4.2.9.
  3. Statistische Analyse
    1. Öffnen Sie GraphPad Prism zu und geben Sie die Nummern auf die gewünschte Spalte von ImageJ erhalten.
    2. Klicken Sie auf analysieren , und wählen Sie t-Tests unter Spalte Analysen.
    3. Überprüfen Sie die gewünschte Spalte für einen Vergleich und klicken Sie auf "OK".
    4. Erhalten Sie den P-Wert unter Analyse -Fenster.
    5. Wählen Sie die Lineare Regression unter XY Analysen aus Schritt 4.3.3
    6. Erhalten Sie R-Quadrat und der P-Wert unter dem Analyse-Fenster.

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Representative Results

Zwei Methoden wurden eingesetzt: eine ATP-Nutzung-Assay und einen lebenden/Toten-Färbung-Assay. Die Ergebnisse können kombiniert oder einzeln verwendet für die Prüfung von bakteriellen überleben in Aggregate nach Behandlung mit Antibiotika. Der ATP-Nutzung-Test hat sich gezeigt, genau lebensfähige Bakterien in S. Aureus Biofilme20,21messen. Hier, wurde MS11Opa + Pil + Stamm verwendet, um die Rolle der GC Aggregation in Antibiotikaempfindlichkeit zu untersuchen. Nicht-aggregierte MS11Opa + Pil + aggregierte MS11Opa + Pil +, oder aggregiert und gestört durch Ultraschallbehandlung MS11Opa + Pil + mit Verdünnungsreihen von Ceftriaxon und die ATP Ebene gemessen (Abb. 1A) behandelt wurden. Bei einem Vergleich das prozentuale überleben mit und ohne Behandlung mit Antibiotika, hatte vorab aggregierten GC deutlich höhere Überlebensrate als nicht-aggregierte oder Aggregation gestört GC mit gleich bei oder über 0,015 µg/mL von Ceftriaxon (MIC aus Agar Verdünnung Test ( Tabelle 4)). MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa oder MS11ΔLgtE, die die gleichen Agar Verdünnung MIC (Tabelle 4), aber kleinere Aggregate Form, wurde untersucht und im Vergleich zu MS11Opa + Pil + (Abbildung 1B). MS11Opa + Pil + Bildung von größeren Aggregaten, hatte die höhere ATP mit Ceftriaxon-Behandlung als die mutierte Stämme.

Lebenden/Toten Färbung wurde in mehreren Biofilm/Aggregation-bezogenen Studien22,23verwendet. Bestimmen die Wirkung der Aggregation, vorab aggregiert MS11Opa + Pil + wurde mit oder ohne Ceftriaxon behandelt und abgebildet. Dies ermöglicht Visualisierung (die quantifiziert werden kann) und die Verteilung der lebenden und Toten GC nach antibiotischer Behandlung (Abbildung 2A- links zwei Platten). Tote Bakterien (rot) befanden sich weitgehend an den äußeren Schichten während live GC (grün) befanden sich hauptsächlich in den Kern von Ceftriaxon behandelt Aggregate. Dieser Vorgang wurde mit MS11Opa + Pil-, MS11ΔOpa oder MS11ΔLgtE, Aggregation Größe und überleben Rate (Abb. 2A) zu prüfen. MS11Opa + Pil + wurde gezeigt, dass die größte Form und MS11Opa + Pil-die kleinste Aggregate (Abbildung 2A, B). MS11Opa + Pil + Aggregate waren noch am Leben in der Kernschicht während GC in die kleine Lose Aggregate von MS11ΔOpaPil + MS11Opa + Pil-, und MS11ΔLgtEPil + waren tot (Abbildung 2A, C). Basierend auf die Größe und das Überleben, kann eine Korrelation Graph geplottet werden, untersuchen das Verhältnis der Größe der Aggregation und Antibiotika überleben (Abbildung 2D).

Table 1
Tabelle 1: Rezept für 1 L des GCK Nährbodenplatte.

Table 2
Tabelle 2: Rezept für 1 L 100 x Kelloggs Ergänzung.

Table 3
Tabelle 3: Rezept für 1 L des GCP Bakterienwachstum Medien.

Table 4
Tabelle 4: Minimum hemmende Konzentration von GC-Stämme mit Ceftriaxon behandelt. MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpa, MS11ΔLgtE und MS11Opa + Pil - gewachsen und in GCP ausgesetzt waren. Agar Verdünnung Test erfolgte dann mit seriellen Konzentration von Ceftriaxon von 0,0016 - 0,25 µg/mL.

Figure 1
Abbildung 1 : Repräsentative Daten der Überlebensrate von aggregierten GC unter Ceftriaxon-Behandlung durch ATP-Auslastung Assay. (A) Überlebensrate Vergleich der MS11Opa + Pil + Aufhängung ohne vorab aggregieren, Pre-Aggregation für 6 h oder Unterbrechung nach Pre-Aggregation für 6 h (B) überleben Preisvergleich von 6 h MS11Opa + Pil aggregiert + mit MS11ΔOpaPil + MS11Opa + PIL- oder MS11ΔLgtEPil +. Gezeigt werden die Mittelwerte (±SD) aus drei unabhängigen Experimenten gewonnen. p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05. Diese Zahl war zuvor veröffentlichten 24 und wird mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative Daten von lebenden/Toten Bakterien Verteilung innerhalb Aggregate unter Ceftriaxon Behandlung. (A) vor aggregiert MS11Opa + Pil +, MS11ΔOpaPil + MS11Opa + Pil-, oder MS11ΔLgtEPil + war entweder inkubiert in das Vorhandensein oder Fehlen von 1 µg/mL Ceftriaxon 2 h. Aggregate wurden dann gefärbt, um tragfähige (grün) und Toten (rot) GC zu visualisieren und visualisiert mit konfokale Fluoreszenzmikroskop. Maßstabsleiste: 50 µm. Bilder wurden dann analysiert für Aggregation-Größe (B) und (C) Verhältnis von lebenden Toten GC und (D) eine Korrelation Grafik entstand dann. Gezeigt sind die Mittelwerte (SD) von > 40 Bilder von drei unabhängigen Experimenten erhalten. p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05. Diese Zahl war zuvor veröffentlichten 24und wird mit Genehmigung verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Bakterien können Biofilme bilden, während der Infektion des menschlichen Körpers. Traditionelle kann MIC die Konzentration erforderlich, um die Beseitigung der Bakterien im Biofilm reflektieren nicht. Um Antibiotika Auswirkungen auf einen Biofilm zu testen, können Methoden auf Basis von Biofilm Biomasse sowie die Beschichtung KBE aufgrund der Auswirkungen der Biofilm Struktur fehlerhaft sein. Beispielsweise funktioniert die Beschichtung-Methode nur, wenn der Biofilm gestört werden kann. Daher kann die KBE erhalten niedriger als die tatsächliche Anzahl der lebensfähigen Bakterien sein. Visualisieren tot und Leben Bakterien innerhalb der Biofilm für das Überleben der Bakterien im Biofilm Messung festgelegt, je nach Struktur und Dichte des Biofilms, die Färbung kann jedoch fehlschlagen, tief in den Biofilm und führen zu einer ungenau und unterschätzte Überlebensrate.

Hier die Methode verwendet eine quantitative und eine Visualisierung-Assay, um bakterielle Überleben nach Behandlung der Aggregate zu messen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es das bakterielle überleben in einer Umgebung, die näher misst an das Gesehene in eine echte Infektion. Die überleben Rate Unterschiede zwischen nicht-aggregierte und aggregierten Bakterien erlauben uns zu bestimmen, ob die in-vitro-MIC mit dem in-vivo Mikrofon korreliert.

ATP Auslastung Assays, die ATP-Produktion misst, kann das Überleben der Aggregate quantitativ gemessen werden. Der Test ist empfindlicher und Überleben zwischen kleine Unterschiede in der antibiotischen Konzentration im Vergleich zu anderen ähnlichen Assays zu unterscheiden. Allerdings ist aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Assays, Sicherstellung der Bakterienzelle Lyse entscheidend. Daher wurde ein Beschallung Schritt verwendet. Darüber hinaus kann nicht diese Methode verwendet werden, um bakterielle überleben in-vivo aufgrund der großen Menge von ATP, die Wirtszellen zu produzieren messen, die bakterielle ATP-Ebene maskieren können. Darüber hinaus kann das Zusammenspiel von Wirtszellen mit Bakterien bakterielle ATP-Produktion beeinflussen. Mit diesem Test auf Bakterien mit Pigmenten kann limitierend sein, da die Pigmente mit der Lektüre stören können.

Die lebenden/Toten Fleck hat im Biofilm Studien verbreitet. Jedoch kann das Eindringen der Färbung Farbstoffe nur die äußersten Bakterien, Fleck, während der Kern nicht befleckt werden kann. Daher kann es nur für Visualisierung, aber keine Quantifizierung durch ungleichmäßige Verteilung des Farbstoffes verwendet werden. Wir nutzten kleine Aggregate für diese Färbung und gezeigt, dass dieser Assay verwendet werden, um die insgesamt bakterielle überleben innerhalb der Aggregate zu quantifizieren. Darüber hinaus werden negativ-und Positivkontrollen benötigt für die Anpassung der Konzentration des Farbstoffs für verschiedene Bakterien.

In Kombination mit dem MIC-Protokoll kann die ATP Auslastung Assay und lebenden/Toten Fleck als eine wirksame Methode zur Analyse von quantitativ und optisch N.gonorrhoeae sowie andere bakterielle Aggregationen25,26dienen. Die Anwendung des gemeinsamen Protokolls könnte ein besseres Verständnis der Krankheit Bildung zusammen mit seinen vielfältigen Einsatzmöglichkeiten in Drogen-Screening basierend auf Bakterien Biofilme bieten. Diese Methode kann die in Vivo MIC eines Antibiotikums besser widerspiegeln.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium des National Institute of Health, D.C.S. und w.s. AI123340. L.-c.w., j.w., A.C. und E.N wurden in Teil/Teilnahme an "The First Year Innovation & Forschung Experience"-Programm von der University of Maryland finanziert unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Studie Design, Datenerhebung und -Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. Wir anerkennen die UMD CBMG Imaging Core für alle Mikroskopie-Experimente.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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