יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ca מקודדים גנטית2 + מחוונים (GECIs) השתנו באופן קיצוני איך באתרו Ca2 + הדמיה מבוצעת. כדי למקסם את שחזור נתונים מהקלטות אלו, נדרש ניתוח הולם של Ca2 + אותות. הפרוטוקולים נייר זה להקל על כימות של Ca2 + מאותת הקליט באתרו באמצעות מיפוי ייתכן וניתוח מבוסס חלקיק.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ. J. Vis. Exp. (143), e58989, doi:10.3791/58989 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ca2 + הדמיה של תאים בודדים או סוגים ספציפיים של תאים בתוך הרקמות שלמים לעיתים קרובות חושף דפוסים מורכבים של Ca2 + איתות. פעילות זו מחייבת ניתוח זהיר ומעמיק כימות ללכוד כמה שיותר מידע על האירועים כבסיס ככל האפשר. Spatial, זמני ופרמטרים בעוצמה מהותי Ca2 + אותות כגון תדירות, משך, הפצת, מהירות, משרעת עשוי לספק מידע ביולוגי הדרושים עבור איתות תאיים. ברזולוציה גבוהה Ca2 + הדמיה בדרך כלל תוצאות ברכש של קובצי נתונים גדולים שנמצאים זמן רב כדי תהליך מבחינת לתרגם את המידע ההדמיה לתוך מידע כמיתים, תהליך זה יכול להיות רגישים הטיה של טעות אנוש. ניתוח של Ca2 + אותות התאים באתרו בדרך כלל מסתמך על מדידות בעוצמה פשוטה אזורים שנבחרו באופן שרירותי של הריבית (ROI) בתוך שדה ראייה (FOV). גישה זו מתעלמת הרבה של המידע איתות חשוב FOV. לכן, על מנת למקסם את השחזור של מידע מתוך הקלטות כאלו ברזולוציה גבוהה שהושג עם Ca2 +צבע או optogenetic Ca2 + ניתוח יכולות הדמיה, המתאים של Ca2 + האותות נדרש. הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה יתאר כיצד ניתן להשיג כמות גדולה של נתונים Ca הקלטות2 + הדמיה כדי להקל על ניתוח מפורט יותר, כימות של Ca2 + אותות הקליט מתאי באמצעות שילוב של ייתכן מפה (STM)-המבוסס על ניתוח וניתוח מבוסס חלקיק. הפרוטוקולים מתארים גם כמה שונה על ידי דפוסי Ca2 + איתות שנצפה בתא אחר אוכלוסיות באתרו ניתן לנתח אותם כראוי. להמחשה, השיטה יבחנו Ca2 + איתות אוכלוסיה מיוחדות של תאים במעי הדק, תאים ביניים של קחאל (ICC), באמצעות GECIs.

Introduction

Ca2 + הוא שליח תאיים בכל מקום אשר שולטת מגוון רחב של תהליכים תאיים, כגון שריר התכווצות1,2, חילוף החומרים3, תא התפשטות3,4, 5, גירוי של שחרור נוירוטרנסמיטר עצב מסופי6,7, והפעלה של שעתוק גורמים בגרעין. 7 Ca תאיים2 + מאותת לעיתים קרובות ללבוש הצורה של הגבהים חולף ב Ca cytosolic2 +, אלה יכולים להיות ספונטני או נובעים אגוניסט גירוי בהתאם סוג התא8. Spatial, זמני ופרמטרים בעוצמה מהותי Ca2 + אותות כגון תדירות, משך, הפצת, מהירות, משרעת לספק את המידע הביולוגי הדרושות האיתות תאיים5, 7 , 9. cytoplasmic Ca2 + אותות יכול לנבוע זרם של Ca2 + מן המרחב חוץ-תאית או באמצעות Ca2 + שחרור תוך-פלזמית (ER) באמצעות Ca2 + ערוצי הפצה כגון קולטנים ryanodine (RyRs) ו קולטנים אינוזיטול-tri-פוספט (IP3ר')10. RyRs ו- IP3ר' עשוי גם לתרום הדור של Ca2 + אותות, הפתח מתואמת של הערוצים הללו, אשר בשילוב עם Ca2 + זרם מנגנונים שונים יכולים לגרום מספר עצום של Ca2 + איתות דפוסים אשר עוצבו על ידי המספרים ולפתוח את ההסתברות של Ca2 + ערוצי זרימה, לפרופיל ביטוי של Ca2 + ערוצי הפצה, הקרבה בין Ca2 + זרם, ערוצי פרסום, ואת הביטוי והפצה של Ca2 + חלבונים ספיגה חוזרת של הבלטה. Ca2 + אותות עשוי ללבוש הצורה של מדים, ארוך טווח, תנודות הכללית בעוצמה גבוהה זה עשוי להימשך מספר שניות או דקות אפילו, הפצת תאיים המערכת Ca2 + גלים זה יכול לחצות מרחקים תאיים מעל 100 מיקרומטר10,11,12,13,14,15,16או יותר קצרה, במרחב מקומי אירועים כגון Ca2 + ניצוצות ו- Ca2 + פחזניות זה להתרחש על עשרות צירי זמן של אלפיות השנייה והתפשטה פחות מ- 5 מיקרומטר17,18,19,20.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי כבר בשימוש נרחב כדי לפקח Ca2 + איתות בתאים בתרבית מבודדים, ברקמות ללא פגע. באופן מסורתי, ניסויים אלו כרוך בשימוש פלורסנט Ca2 + אינדיקטורים, רציומטרי, רציומטרי שאינו צבענים כמו Fura2, Fluo3/4 או Rhod2, בין היתר 21,22,23. אינדיקטורים אלה נועדו להיות חדיר אל קרום התא, ואז הופכים לכוד בתוך תאים על-ידי המחשוף של קבוצת אסתר ויה esterases אנדוגני. איגוד של Ca2 + כדי האינדיקטורים זיקה גבוהה כתוצאה שינויים בזריחה תאים ורקמות היה מואר על ידי המתאים אורכי הגל של האור. השימוש תא חדיר Ca2 + מחוונים שיפור משמעותי ההבנה שלנו של Ca2 + איתות בתאים חיים, מותר רזולוציה מרחבית, כימות של אותות אלה היתה בלתי אפשרית על-ידי assaying Ca2 + אותות באמצעים אחרים, כגון אלקטרופיזיולוגיה. אולם, Ca מסורתי2 + מחוונים יש מספר מגבלות, כגון photobleaching המתרחשת על פני תקופות הקלטה מורחבת24. בעוד רשות אישורים חדשים2 + מחוון צבענים כמו Cal520/590 יש אות משופר מאוד רעש יחסי ואת היכולת לזהות המקומית Ca2 + אותות25, בעיות עם photobleaching ונעלמות דאגה כמה חוקרים 26,27,28. Photobleaching התלול גם מגבילה את ההגדלה, קצב רכישת התמונה, והגדילה רזולוציה שיכול לשמש עבור הקלטות, כפי כוח אובייקטיבי מוגברת שיעור גבוה יותר של ייבוא תמונות דורשים עוצמת האור עירור זה מגדילה את photobleaching.

מגבלות אלו של Ca מסורתי2 + מחוון צבע הם החמירו בעת הקלטת Ca2 + אותות באתרו, לדוגמה בעת ההקלטה תאיים Ca2 + אותות רקמות ללא פגע. בשל הבעיות שלעיל, יש ויזואליזציה של Ca2 + אותות בחיי עיר באמצעות תא חדיר Ca2 + אינדיקטורים הוגבל ההגדלה צריכת חשמל נמוכה, מופחת של לכידת תמונה, המגביל את היכולת של חוקרים כדי להקליט ו לכמת חנותם או במרחב מוגבל subcellular Ca2 + אותות. לפיכך, עבר קשה ללכוד, לנתח, להעריך את המורכבות יכולות של Ca2 + אותות, אשר יכול להיות חשובים בדורו של תגובות ביולוגיות הרצוי, כפי שתואר לעיל. ניתוח של Ca2 + אותות התאים באתרו בדרך כלל מסתמך על מדידות בעוצמה פשוטה אזורים שנבחרו עניין (ROI) בתוך שדה ראייה (FOV). הבחירה שרירותית המספר, הגודל והמיקום של ROIs, תלויים הגחמה של החוקרת, יכול קשות הטיה התוצאות המתקבלות. כמו גם הטיה הגלום עם ניתוח ROI, גישה זו מתעלמת הרבה החשובים איתות המידע הכלול של FOV, כמו דינמי Ca2 + אירועים בתוך שבחרת שרירותית רועי נבחרו לניתוח. יתר על כן, ניתוח של ROIs נכשלת לספק מידע אודות המאפיינים המרחביים של Ca2 + האותות שנצפו. לדוגמה, זה לא ייתכן שניתן להבחין בין עלייה Ca2 + הנובע הפצת Ca2 + גל ואני מאוד מקומי Ca2 + לשחרר את האירוע tabulations של Ca2 + אותות בתוך רועי.

כניסתו של Ca מקודדים גנטית2 + (GECIs) אינדיקטורים השתנה באופן קיצוני איך Ca2 + הדמיה יכול להיות שבוצעו ב באתרו29,30,31,32,33 . ישנם מספר יתרונות לשימוש GECIs על צבע. הוא אולי החשוב ביותר כי הביטוי של GECI יכול להתבצע באופן תא ספציפיים, אשר מפחית את זיהום הרקע הבלתי רצויים מתאי לא עניין. יתרון נוסף של GECIs מעל Ca מסורתי2 + מחוונים הוא photobleaching הזה מצטמצם (כמו זריחה, consequentially photobleaching מתרחשת רק כאשר תאים פעילים), לעומת דגימות צבע טעון, במיוחד בתיכון ההגדלה ואת שיעור גבוה של התמונה ללכוד34. לפיכך, הדמיה עם GECIs, כמו הסדרה GCaMP של חיישנים optogenetic, מעניקה חוקרים את היכולת להקליט לתדרך, שעברה לוקליזציה תת הסלולר Ca2 + מאותת בחיי עיר ולחקור Ca2 + איתות בתאים בתוך שלהם סביבות מקורי זה לא היה אפשרי בעבר. כדי ששחזור מידע מתוך הקלטות כאלו ברזולוציה גבוהה, נדרש ניתוח יכולות המתאים של Ca2 + האותות. יצוין כי בעוד GECIs יכולים להציע שלנקות כמה יתרונות, מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו כי ניתן לבצע בהצלחה Ca2 + הדמיה של אוכלוסיות גדולות של מחלקות שונות עצבית של נוירונים בו זמנית באמצעות קונבנציונלי Ca2 + אינדיקטורים לא מקודדים גנטית לתוך החיות35. גישה זו בשימוש אימונוהיסטוכימיה לאחר הוק לחשוף מספר מחלקות שונות של נוירונים שנשרפים בתדר גבוה ואינו מסונכרן, ונמנע את הפוטנציאל שינויים גנטיים החיה אולי הפרעת פיזיולוגיים התנהגות החוקר מבקש להבין35,36.

הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה להקל על ניתוח מפורט יותר ואותות כימות של Ca2 + נרשם מתאי באתרו באמצעות שילוב של מפת ייתכן (STM)-המבוסס על ניתוח וניתוח מבוסס חלקיק. הפרוטוקולים מתארים גם כמה שונה על ידי דפוסי Ca2 + איתות שנצפה בתא אחר אוכלוסיות באתרו ניתן לנתח אותם כראוי. להמחשה, השיטה יבחנו Ca2 + איתות אוכלוסיה מיוחדות של תאים במעי הדק, תאים ביניים של קחאל (ICC). ICC נמצאים תאים מיוחדים במערכת העיכול (GI) כי התערוכה דינמי תאיים Ca2 + איתות, כפי visualized באמצעות עכברים המבטאים GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Ca2 + תופעות מעבר ב- ICC מקושרים הפעלה של Ca2 +-מופעל Cl ערוצים (מקודד על-ידי Ano1) חשובים בוויסות של דעתנית של שריר חלק המעי תאים (SMCs)43, 44,45. לפיכך, המחקר של Ca2 + איתות ב- ICC הוא יסוד להבנת תנועתיות מעיים. המעי הדק מאתר ומציע דוגמה מצוינת לצורך ההדגמה, שכן ישנם שני סוגים של ICC מופרדים מבחינה אנטומית, ניתן לאבחן באופן עצמאי: אני) ICC ממוקמים באזור שבין שריר חלק מעגלי האורך והרוחב שכבות, המקיפים את מקלעת myenteric (ICC-שלי). תאים אלה משמשים כתאים קוצב לב ולהפיק את הפעילות החשמלית המכונה גלים איטיים46,47,48,49; ii) ICC נמצאים גם בקרב מקלעת עשיר המסופים של מוטורי לגלוקוז (מקלעת עמוק שרירים, ובכך DMP-ICC). תאים אלה לשמש כמתווכים של התגובות עצבית מנוע המעית37,39,40,50. ICC-מיי ICC-DMP נפרדים מורפולוגית, Ca2 + איתות והתנהגותם שונה באופן קיצוני להשלים את משימותיהם ספציפיים. ICC-מיי stellate בכושר, יוצרים רשת של תאים מחוברים באמצעות פער צמתי51,52. Ca2 + מאותת במניפסט ICC-מיי כמו קצר ומקומי, במרחב Ca2 + שחרור אירועים המתרחשים באתרים מרובים באופן אסינכרוני דרך הרשת ICC-מיי כמו מטמיעים בתוך FOV (עם תמונה עם יעד X 60)38. אותות אסינכרוני אלה מאורגנות חנותם לשנייה אחת אשכולות זה, כאשר ייערכו יחד, בסכום נטו 1 s הסלולר עלייה Ca2 +. אותות אלה מפיצות מתא לתא בתוך הרשת ICC, ולכן לארגן Ca2 + איתות, שנוצר מתוך אתרי משנה הסלולר, לתוך רקמות רחב Ca2 + גל. קיבוץ באשכולות הטמפורלי, סיכום של Ca2 + אותות ב- ICC-שלי יש כבר שנקרא Ca2 + אשכולות ארעי (CTCs)38. CTCs להתרחש בקצב אחיד (למשל די דומה ולקשרים תקופות דומות בין CTCs) 30 פעמים בדקה העכבר. לעומת זאת, ICC-DMP פלך בצורת התאים, חלקם עם תהליכים משניים, להפיץ בין SMCs לבין תהליכים עצב דליות. ואינם באופן עצמאי טופס51,רשת52. ICC-DMP טופס צמתי הפער עם SMCs, עם זאת, פונקציה בתוך זה syncytium גדול יותר, המכונה של syncytium SIP53. Ca2 + אותות להתרחש באתרים מרובים לאורך האורכים של תאים, אך אלה תופעות מעבר לא entrained או חנותם מקובצים באשכולות, כפי שנצפה ב- ICC-מיי37. Ca2 + אותות ב- ICC-DMP להתרחש בצורה סטוכסטי, עם עוצמות משתנה, משכים, המאפיינים המרחביים. הפרוטוקולים להלן, לפי הדוגמה של Ca2 + איתות ב- ICC-מיי, ICC-DMP, לתאר את שיטות לניתוח מורכב איתות בסוגים ספציפיים של תאים באתרו. אנחנו מנוצל מערכת p Cre-לקס inducible לבטא GCaMP6f באופן בלעדי ב- ICC, לאחר גרימת ההפעלה של Cre-Recombinase (Cre) מונע על ידי יזם ספציפי ICC (קיט).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל בעלי החיים שבהם משתמשים הפרוטוקולים ביצעו במחקר זה היו לפי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. כל ההליכים אושרו על-ידי שימוש חיה מוסדיים ו טיפול ועד האוניברסיטה של נבאדה, רינו.

1. דור של KitGCaMP6f עכברים

  1. קרוס Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (עכברים GCaMP6f) ו- c-Kit/ Cre-ERT2 (קיט-Cre עכברים) כדי ליצור ICC ספציפי GCaMP6f לביטוי בעלי חיים (עכברים קיט-Cre-GCaMP6f).
    הערה: GCaMP6f שימש בשל ביעילותה שדווחה בדיווח מקומי, קצר תאיים Ca2 + מאותת באתרו ו ויוו54.
  2. להזריק קיט-Cre-GCaMP6f עכברים עם טמוקסיפן בגילאים 6-8 שבועות לזירוז ההפעלה Cre Recombinase ו- GCaMP6f עוקבות, ביטוי ICC (איור 1).
    1. כדי ליצור את הפתרון טמוקסיפן, להמיס 80 מ ג של טמוקסיפן (ראה טבלה של חומרים) ב- 800 μL של אתנול (ראה טבלה של חומרים) cuvette ו מערבולת במשך 20 דקות.
    2. הוסף 3.2 מ של שמן חריע (כללי) כדי ליצור פתרונות של 20 מ"ג/מ"ל ולאחר מכן sonicate במשך 30 דקות לפני הזרקת.
    3. להזריק עכברים (הזרקת בקרום הבטן; IP) עם 0.1 מ"ל של פתרון טמוקסיפן (טמוקסיפן 2 מ ג) במשך שלושה ימים רצופים. לאשר את הביטוי GCaMP6f genotyping ולהשתמש עכברים 10 ימים לאחר הזריקה הראשונה.
      1. גנוטיפ עכברים על ידי חיתוך חתיכה קטנה של האוזן של כל בעל חיים. לאחר מכן השתמש בשיטה שוויצר55 לבידוד דנ א גנומי מאת המקננת האוזן קליפים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ב- 75 מ של NaOH ונטרול ואז על ידי 75 מ של מאגר טריס. השתמש PCR סטנדרטי כדי לקבוע גנוטיפ של כל בעל חיים, 2 מ של ה-DNA בתגובה 20 מ עם GCaMP6f תחל ספציפי56. לרוץ 10 מ"ל של מוצר ה-PCR על 2% agarose ג'ל כדי לקבוע את סוג בר (297 bp), מוטציה (~ 450 bp) להקות.

2. הכנה של רקמות Ca2 + הדמיה

  1. להרדים עכברים באמצעות אינהלציה עם איזופלוריין (4%, ראה טבלה של חומרים) הוד מאוורר ולאחר מכן קורבן על ידי נקע בצוואר הרחם.
  2. באמצעות מספריים חדות פתח בבטן של עכברים, להסיר את המעי הדק ולמקם בפתרון ביקרבונט קרבס-צלצול (KRB). פתח המעי הדק לאורך הגבול מצע המעי העליון, לשטוף את כל תוכן intraluminal עם KRB. באמצעות ניתוח חד, להסיר את השכבות רירית ורירית תת.
    הערה: KRB פתרון כולל את ההרכב הבא (במ מ): NaCl 118.5, אשלגן כלורי 4.7, CaCl2 2.5, MgCl2 1.2, NaHCO3 23.8, ח'2PO4 1.2, דקסטרוז 11.0. פתרון זה יש pH של 7.4-37 מעלות צלזיוס, כאשר מבעבע על שיווי משקל עם O 95%2- 5% CO2.
  3. באמצעות סיכות קטנות, להצמיד את רקמת המעי הדק אל הבסיס של אמצעי אחסון 5 מ"ל, 60 מ מ קוטר מצופים Sylgard תבשיל עם השכבה שריר חלק עגול פונה כלפי מעלה. Perfuse ההכנה עם פתרון ומחוממת KRB ב 37 מעלות צלזיוס במשך תקופה equilibration 1שעות לפני הניסויים.
  4. לאחר תקופת הסתגלות זו equilibration, לבצע הדמיה2 + Ca באתרו של קטן המעי ICC-מיי, ICC-DMP באמצעות קונפוקלית (התמונות בפרוטוקול זה נרכשו עם מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד ספינינג-דיסק). בשל היתרונות של GECIs המתוארים לעיל, להשתמש תמונות בצילום מואץ ברזולוציה גבוהה (> 30 מסגרות לשנייה, FPS) בשילוב עם מטרות מתח גבוה (60 – 100 x) כדי לרכוש סרטים של Ca2 + אותות דינמי ב- ICC.
    הערה: כדי לצמצם את רקמת תנועה, החל nicardipine (0.1 – 1 μM) במהלך הקלטות כפי שתואר לעיל37,38,39,40,41.
  5. להבדיל ICC-מיי, ICC-DMP במעי הדק באמצעות מיקום אנטומי שונות שלהם, מורפולוגיה הבזליים Ca2 + דפוסי הפעילות.
    1. אתר ICC-מיי ברמה של מקלעת myenteric, בין שכבות שריר חלק מעגלי האורך והרוחב של המעי הדק. הם stellate בצורת, ויוצרים מחובר לרשת (איור 3 א). CTCs (המתוארים לעיל) להפיץ דרך הרשת של ICC-מיי עם רגיל אצלו ~ 30 מחזורים לכל מין.
    2. לעומת זאת, אתר ICC-DMP מטוס בודד ברמה של מקלעת עמוק שרירים, בין השכבה מעגלית שריר חלק של מקלעת submucosal. ICC-DMP לא יוצרים רשת, פלך בצורת התאים (איור 2 א) התערוכה אין אירועים כציוד רגיל ואש במקום סטוכסטי, המותאמות לשפות אחרות תאיים Ca2 + תופעות מעבר.
  6. ללא קשר התוכנה רכישת מנוצל, לשמור סרטים כמו ערימת תמונות TIFF.

3. ניתוח של רשות סטוכסטי2 + אותות ב- ICC-DMP באמצעות מיפוי-עתיים (STM)

  1. לנתח ICC-DMP באמצעות מיפוי-עתיים עם שילוב של ImageJ (NIH, ארה"ב, חינם להורדה-http://imagej.nih.jov/ij) ותוכנות מותאמות אישית תוצרת (Volumetry, גירסה G8d, GWH, מפורמט ב- Mac OS, פנה גרנט Hennig grant.hennig@ med.uvm.edu בנוגע מברר עבור גישה חופשית Volumetry)
    הערה: גישה חלופית לנתח באופן מלא המפות-עתיים אלה עם ImageJ לבד מסופק גם בסעיפים (תחילת שלב 3.9).
  2. פתח Volumetry ולהשתמש לחיצות העכבר הימני כדי לפתוח תיקיות המכילות קבצי סרט. לחץ משמאל על קובץ הסרט כדי להיות מנותח כדי לפתוח אותו ב- Volumetry (חייב להיות בתבנית TIFF לא דחוסה). ברגע שנפתח, הסרט להיות כלולים הגובלת כחול חלון (חלון הסרט) יקיף שטח גדול של יד ימיני מסך. בצד שמאל של המסך יכיל את החלון מגרש (העליון 4/5ths) לבין החלון עקבות (נמוך יותר 1/5ה).
  3. להתאים את הממדים של הסרט על-ידי החזקת מקש shift לחוץ בעת ובעונה אחת נגלל עם לחצן העכבר האמצעי (מקש MMB, מפחית את גודל) או גלילה למטה עם מקש MMB (הגדלת גודל). ליזום או להפסיק את ההפעלה על ידי לחיצה על 'A'; ניתן להתאים את מהירות ההפעלה על ידי לחיצה על המעלה ולמטה במקשי החצים.
  4. כדי ליצור את ה-STM באמצעות Volumetry, ציירו רועי מעל תא כולו על-ידי החזקת מקש shift לחוץ תוך לחיצה וגרירה על לחצן העכבר השמאלי. התאם את הכיוון של רועי באמצעות גלילת MMB בפינות של רועי. כאשר רועי הוא במקום על התא כדי להיות מנותח (איור 2 א), שימוש נכון לוחץ בחלון הסרט כדי לגשת ' רועי STMs-STMyAvg > xRow' והשאיר לחץ כדי ליצור של STM של פעילות התא בחלון מגרש (קיימת גם אפשרות לבחירת ' STMxAvg > yRo w ', מי שנבחר יהיה תלוי אם הכיוון של התא יותר מיושר עם x או ציר y, לדוגמה התא הדגיש דמות 2A חוקיים הוא יותר על ציר y').
  5. לחץ משמאל על ה-STM בחלון מגרש ולחץ על 'P' כדי להפחית רעשי רקע הממוצע והקש 'H' כדי להגדיל את החדות של ה-STM. שמור את ה-STM על-ידי לחיצה ימנית על אותו כדי לקבל גישה 'ה-STM עומס שמור - להציל את ה-STM כמו. tif' ולחיצה נשאר לשמור כקובץ TIFF.
  6. השארית של הניתוח של ICC-DMP יבוצע ב- ImageJ. ImageJ מורכב משני חלקים עיקריים, סרגל כלים עם משרה קבועה בראש המסך, ממשק משתמש סלולרי. שימוש ImageJ, פתח את קובץ ה-STM TIFF של ICC-DMP Ca2 + פעילות (קובץ-פתח בסרגל הכלים תמונה J).
  7. פתח Volumetry נוצר ה-STM, אשר יהיה זמן אנכית חוקיים. ImageJ יפתח אוטומטית קובצי TIFF RGB או תמונות של 16 סיביות. כדי לשפר את איכות התמונה, עזב לחץ '' תמונה בסרגל הכלים ImageJ. גלילה על האפשרות הראשונה ' סוג 'כדי לחשוף את התפריט של תבניות תמונה שונים הנפתח, גללו ' 32 סיביות', עזב לחץ כדי לשנות.
  8. כדי להפוך את ה-STM לקריא נגד הזמן משמאל לימין, עזב לחץ בסרגל הכלים ImageJ על הנתיב הבא: "תמונה-שינוי צורה-לסובב 90 מעלות שמאלה". זה גם אפשר ליצור STMs של Ca באתרו2 + פעילות באמצעות linescans עם ImageJ לבד בלי Volumetry ובלי זה מפורט להלן.
    הערה: לאחר STMs נוצרו, ניתוחם באופן זהה ללא תלות היה להשתמש בתוכנה כדי ליצור אותם. כדי לדלג על שיטה חלופית זו ליצירת STMs ImageJ, דלג לשלב 3.19.
  9. כדי ליצור STMs עם ImageJ, פתח את ערימת קובצי TIFF המרכיבות את ההקלטה של ICC-DMP Ca2 + פעילות (קובץ-פתח בסרגל הכלים ImageJ). ImageJ יפתח אוטומטית קובצי TIFF RGB או תמונות של 16 סיביות. כדי לשפר את איכות התמונה, עזב לחץ '' תמונה בסרגל הכלים ImageJ. גלילה על האפשרות הראשונה ' סוג 'כדי לחשוף את התפריט של תבניות תמונה שונים הנפתח, גללו ' 32 סיביות', עזב לחץ כדי לשנות.
  10. עכשיו צריך להיות מופחתים רעשי רקע (כתוצאה מרעש זריחה או מצלמה אוטומטית) מתוך הסרט. שמאל לחץ על הפונקציה 'בחירה מלבנית' בממשק ImageJ וצייר רועי (על ידי עזב לחיצה וגרירה כדי בצורה ובגודל הרצויים) מעל זריחה הרקע של הסרט.
  11. לאחר בחירת רועי, השמאלי לחץ על 'ניתוח' בסרגל הכלים ' ImageJ ', ולאחר מכן עזב לחץ 'היסטוגרמה' מהתפריט הנפתח וכתוצאה מכך. תיבה המוקפץ יופיע החוקרת על ערכי הפיקסלים טווח לחישוב; ImageJ יש את הערכים של רועי שנבחרו מראש אז מימין לחץ על "טוב".
  12. לאחר לחיצה על 'אישור', תופיע תיבת מוקפץ חדשה המכילה היסטוגרמה ומציגות את חלוקת הערכים עבור הרעש פיקסל של הרקע בתוך רועי. שימו לב הערך הממוצע המפורטים להלן ההיסטוגרמה ולאחר מכן סגור את תיבת מוקפץ.
  13. לחץ על הקודם כדי הסרט 32 סיביות ובחר את FOV כולו על ידי לחיצה שמאלה 'עריכה' בסרגל הכלים ImageJ, גלילה על 'בחירה', לחיצה שמאלה על 'בחר הכל' מהתפריט הנפתח חשף.
  14. שמאל לחץ על 'תהליך' בסרגל הכלים ImageJ, גלול אל 'מתמטיקה', עזב לחץ 'הפחת' מתוך התפריט הנפתח חשף.
  15. תיבה מוקפצת תופיע שבו ניתן להוסיף ערך כדי להיות המופחת של FOV. הזן את הערך הממוצע שנרכש ההיסטוגרמה בשלב 3.12 לעיל ולחץ על 'אישור'. ImageJ יבקש לעבד כל המסגרות במחסנית TIFF (, לא רק את המסגרת יחיד הסרט וכיום הוא על). לחץ על 'כן'.
  16. לאחר לחיצה על 'כן', הסרט ישחיר. כדי לתקן זאת, עזב לחץ על 'תמונה' סרגל הכלים של ImageJ וגלילה על 'התאם'. לחץ משמאל על האפשרות הראשונה חשף עבור 'בהירות/ניגוד' (B & C). זה תביא לפתיחת תיבת שבו ניתן לשנות היבטים שונים של הבהירות והניגודיות. שמאל לחץ על האפשרות 'אוטומטי' פעם אחת כדי לחשוף את איכות מוגברת בסרט. להשאיר את B & C פופ קופסה פתוחה לשימוש עתידי.
  17. כדי ליצור linescan, תחילה הימני, לחץ על הכלי בחירת קו בממשק של ImageJ ' כדי לחשוף את אפשרויות עבור קווים שונים; לחץ משמאל על 'קו מקוטע' כדי לבחור אותו מתוך הרשימה. באמצעות הכלי 'קו מקוטע' נבחרה, לשימוש יחיד עזב לוחץ כדי לצייר קו לאורך הציר באמצע של ICC-DMP בודדים. כל לחיצה שמאלה יחיד יהיה לתקן את הקו בשלב מסוים זה, הקו ואז ניתנים להעברה הלאה בכל זווית רצויה. הקו יושלם, כפול עזב לחץ כדי לתקן את הקו במקום.
  18. שמאל לחץ '' תמונה בסרגל הכלים ImageJ ולאחר גלילה על פני 'אוספים', עזב לחץ על האפשרות 'Reslice'. תיבה מוקפצת תופיע; לחץ משמאל על האפשרות 'סובב ב- 90 מעלות', זה להתמצא linescan משמאל לימין, כך שזה יכול להיות מכויל לקרוא נגד הזמן בציר ה-x, עם שטח בציר ה-y. לחץ על 'אישור' כדי ליצור את ה-STM.
  19. עוצמת ה-STM ייווצר על סולם גוני אפור בעוצמה גבוהה Ca2 + אותות כמוצג בדרגות שונות של לבן, אפור בהיר או לבן בהתאם עצמתם. בדרך כלל, הניגוד בין linescan שנוצר צריך להשתפר. לעשות זאת על ידי לחיצה על 'אוטומטי' ב- B & C הפופ קופסה.
  20. האינטנסיביות של זריחה של linescan זה הציג את ה-STM ב ערכי הפיקסלים שרירותי. כדי למדוד במדויק את משרעת של Ca2 + אותות ה-STM, הערכים זריחה של ה-STM (נ) עכשיו צריך להיות מנורמל. שימוש בפונקציה 'בחירה מלבנית' בממשק של ImageJ, ציירו רועי על שטח של STM מציגה אזור אחיד הכי פחות אינטנסיבי של קרינה פלואורסצנטית (F0).
  21. חזור על הצעדים שננקטו ב- 3.11-3.12 כדי לקבל ערך רשע (F0) של עוצמת בתוך רועי שנבחר ולאחר מכן בחר את ה-STM כולו על-ידי לחיצה שמאלה על 'כל עריכה-בחירה-בחר' מסרגל הכלים ImageJ.
  22. שמאל לחץ על 'תהליך' בסרגל הכלים ImageJ ולאחר הגלילה כדי 'מתמטיקה'; משמאל לחץ 'לחלק' מתוך האפשרויות חשף. בתיבה מוקפצת עוקבות, הזן את הערך הממוצע (F0) המתקבל שלב 3.21. בעת חלוקת את ה-STM כולו (F0) ה-STM ישחיר; תקן זה על ידי לחיצה על 'אוטומטי' ב- B & C צצים תיבת. Linescan עכשיו מכויל עבור משרעת, עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית מבוטא כ- F/F0.
  23. ה-STM תציג כעת מספר המסגרות במחסנית TIFF בציר ה-x ואת מספר הפיקסלים המייצגים את האורך של התא בציר ה-y. על מנת לכמת מידע זמני המרחבי מהמודיעין2 + Ca, לכייל את ה-STM במשך הזמן והמרחב. שמאל לחץ על 'תמונה' בסרגל הכלים ImageJ, עזב לחץ על 'מאפיינים'. תיבה מוקפצת תופיע. בתוך חלון זה, הזן את הערכים המתאימים לכייל באופן מלא את ה-STM.
  24. עבור 'רוחב פיקסלים', הזן את משך הזמן שנדרש כדי לכידת מסגרת אחת בשניות. לקבלת דוגמאות, ב 5 FPS, הזינו ערך של 0.2, עבור 50 FPS להזין ערך של 0.02, עבור 33 FPS ותזין את הערך 0.033 ועוד. עבור 'פיקסל גובה', הזן מיקרון כמה כל פיקסל מייצג (תלוי המטרה בשימוש ואת המצלמה בשימוש עבור רכישת). 'Voxel עומק' נשאר 1 לפני שתלחץ על 'אישור'. אין פרמטרים אחרים צריכים להיות מותאמים לגודל החלון.
    הערה: לאחר לחיצה על 'אישור', ה-STM מלא סלסלות משרעת, מרחב וזמן. משרעת-ה-STM יתבטא בזמן0, F/F בציר ה-x יתבטא בשניות, שטח על ציר ה-y יתבטא ב μm (איור 2B). Ca2 + אירועים על ה-STM מוכנים. כעת ניתן למדידה, ניתן גם לשמור את ה-STM מכוילת כתמונה TIFF בודדת כדי לנתח במועד מאוחר יותר.
  25. ImageJ יש מספר נבנה ב טבלת בדיקת מידע צבע מקודד (LUTs) זה יכול לשמש כדי לקדד לפי צבעים ה-STM. להחיל מובנה ב LUT על-ידי לחיצה שמאלה על הכלים ImageJ על השביל 'תמונת בדיקה Tables' ובחרו LUT כדי להחיל. ניתן גם לייבא מותאמות אישית שנעשו LUTs ל STM על ידי לחיצה שמאלה על הכלים ImageJ על השביל 'קובץ-ייבוא-LUT' ולאחר מכן בחירה של LUT לייבוא. לדוגמה ה-STM שמוצג באיור 2C יש לו את LUT מותאם אישית 'QUBPallete' (Belfast אוניברסיטת קווינס, בריטניה) חל עליו, כדי קוד בצבעים חמים (אדום, כתום) כאזורים של Ca אינטנסיבי2 + זריחה וצבעים קרים (שחור, כחול) כאזורים של Ca נמוך2 + קרינה פלואורסצנטית.
  26. כדי להוסיף בר כיול משרעת כדי לציין את טווח amplitudes מיוצג על ידי הצבעים השונים, עזב לחץ 'נתח' מסרגל הכלים ImageJ, לגלול כדי 'כלים', ובחר "כיול בר" מתוך תפריט חשף. אפשרויות ניתנות עבור גודל, זום, טווח. עמדתו ה-STM עבור שורת כיול; לכוונן הגדרות אלה הרצויה ולחץ על 'אישור'. שים לב כי כאשר הבר כיול מוכנס, ImageJ יוצר STM חדשה המכילה אותו, עוזב את הגירסה המקורית ללא שורת כיול שלמים ולא נפרד.
    הערה: אם התיבה 'כיסוי' הוא תיקתק בעת הוספת הבר כיול, STM חדש לא ייווצר.
  27. כדי להתחיל בניתוח Ca2 + אירועים בודדים, עזב לחץ על בורר "קו ישר" על הממשק ImageJ. מאת בתחילה לחיצה שמאלה על ה-STM, צייר קו אופקי ישר דרך מרכז אירוע2 + Ca, במקביל ציר ה-x (נגד הזמן). להשלים את הקו על-ידי לחיצה שמאלה בפעם השנייה (איור דו-ממדי).
  28. לחץ על 'ניתוח' בסרגל הכלים ImageJ ולאחר לחץ משמאל על 'מגרש פרופיל'. תיבה חדשה תופיע עם הפרופיל מגרש של Ca2 + האירוע (2E איור).
    הערה: האפשרות 'רשימת' בתוך תיבה זו תיצור רשימה של ערכים XY של העלילה שנוצר, אשר יכול להיות מועתק לתוכנית של גליון נתונים כדי ליצור עקבות, אם כל כך השתוקקה.
  29. כדי למדוד את משרעת של האירוע2 + Ca ייצג שהפרופיל מגרש, עזב לחץ על בורר "קו ישר" על הממשק ImageJ. לאחר מכן, צייר קו אנכי מקו הבסיס של שהפרופיל מגרש את שיא האירוע2 + Ca; אורך הקו (מוצג בממשק ImageJ) ייצגו את משרעת של האירוע המבוטא ΔF/F0 (2E איור).
  30. באמצעות הערך משרעת הנרכש, משך האירוע2 + Ca נמדד על ידי ציור קו ישר לרוחב של האירוע בנקודת משרעת מקסימלית של 50% (מלא משך-חצי משרעת המרבי, FDHM) או מלא משך האירוע ייתכן נמדד במידת הצורך (איור 2E).
    הערה: ניסויים יהיה צורך לעצב קריטריון ספציפי לאירועים סף בתוקף Ca2 + ההקלטות כאלו. בניסויים שלנו, Ca2 + אירועים נקבעו כבלתי חוקית עבור ניתוח אם שלה משרעת > 15% של האירוע משרעת המרבית בסעיף שליטה של הקלטה. עם זאת, ספי אלה תלויות רקמות ספציפיות, התאים תחת ללמוד והם רק שרירותי הנחיות המחייבות אופטימיזציה ספציפיות עבור כל סוג של רקמה של תאים.
  31. על ידי ציור קו לאורך upstroke או הנפת הכנפיים של Ca2 + אירוע מגרש פרופיל, קצב עליית או נפילה יכול לחשב בהתאם. אחרי הקו נמשך, ניתן להעביר את סמן העכבר לנקודה היכן הקו מתחיל והיכן הוא מסתיים. כאשר הסמן נמצא נייח על נקודות אלה, x, y קואורדינטות עבור מיקום זה יוצגו בצד השמאלי התחתון של הממשק ImageJ. לפיכך, על ידי רכישת x, ערכי y עבור מתחילה השורה (x1, y1) ומסתיים (x2, y2), ניתן לחשב את קצב עליית או סתיו (ΔF/s) כמו השיפוע של הקו, y2 - y1 / x2 - x1 (איור 2F ).
  32. על מנת לחשב את הפצת או ההתפשטות המרחבית של אירוע2 + Ca, עזב לחץ על בורר "קו ישר" על הממשק ImageJ. לאחר מכן, צייר קו ישר אנכי לאורכו של האירוע2 + Ca לאורך ציר ה-y. אורך הקו (מוצג בממשק ImageJ) מייצגות ההתפשטות המרחבית של האירוע המבוטא μm (איור 2G).
  33. לקבוע את המהירות של אירוע2 + Ca כציוד על ידי ציור קו לאורך החזית כציוד של האירוע, לחשב את השיפוע של הקו. זה יכול להתבצע באופן ידני באופן דומה שמתואר בשלב 3:32 אם כן על-ידי קביעת x, ערכי y עבור מתחילה השורה (x1, y1) ומסתיים (x2, y2); ערכים אלה יוצגו בצד השמאלי התחתון של הממשק ImageJ כאשר סמן העכבר ממוקם על ה-STM.
  34. על אוסף הפרמטרים הרצויים עבור Ca2 + אירוע כמת, בריכה אלה ממוצע הערכים לשם יצירת ערכי כלומר עבור כל פרמטר על בסיס לכל תא; לחלופין, מקם את כל הערכים raw בהיסטוגרמה הפצה כדי להציג טווח שלהם (איור 2 H).

4. כימות של CTCs ב- ICC-מיי באמצעות חלקיקים מבוססי ניתוח

  1. לפני ניתוח סרטים Volumetry עם PTCLs, יכולות הכיול של הסרט יהיה עליך להוסיף את שם הקובץ. לערוך כל הקבצים שינותח ב Volumetry להכיל בתוך הכותרת מספר שניות שווה לכל מסגרת, גם המספר של מיקרון כל פיקסל שווה המופרדים באמצעות מקף יחיד, עם הערכים עטוף בסוגריים מרובעים. לדוגמה, סרט רכשה ב 33 FPS עם יעד 60 x (512 x 512) צריך [0.22-0.033] מוכנס לתוך שם הקובץ שלו.
  2. פתח Volumetry ולהשתמש לחיצות העכבר הימני כדי לפתוח תיקיות המכילות קבצי סרט. לחץ משמאל על קובץ הסרט כדי להיות מנותח כדי לפתוח אותו ב- Volumetry (איור 3 א, חייב להיות בתבנית TIFF לא דחוסה).
  3. על מנת לחשב במדויק Ca2 + אותות FOV כולו, הסרט יעבור תחילה בידול והחלקת הסרת רעש רקע (המצלמה רעש, קרינה פלואורסצנטית אוטומטי וכדומה) ולהגדיל את האות לרעש יחס. חלון הסרט, קליק ימני כדי להעלות תפריט באמצעות לחיצות נכון גישה ' STK מסנן-להבדיל ', לחץ שוב כדי להזין ערך להבדיל, הקש ENTER, עזב לחץ כדי להחיל (עבור סרטים רכשה ב 33 FPS ערך של 2 (∆t = ± msec 66-70) עובד. הערך הוא גדל כמו קצב עליות לכידת התמונה).
    הערה: בידול בהקשר זה יהיה להפחית את עוצמת תחומי הקלטה (פיקסלים) להראות שום פעילות דינמית על מספר המסגרות שצוין. לפיכך, אם הוכנס ערך של '2', כל פיקסל בכל מסגרת של ההקלטה ניתוח, אם בתוך מסגרת זו אין שינוי דינאמי בתוך מסגרת פלורסצנטיות 1 פיקסל לפני ומסגרת 1 לאחר, העוצמה בתוך פיקסלים אלה המופחת את ההקלטה. לפיכך, רעש רקע שאינם דינאמיים יוסר ולא אות רעש הוא גדל.
  4. להחליק את הסרט הבדיל על-ידי החלת מסנן לפי עקומת גאוס. לחץ לחיצה ימנית בחלון סרט שאני מעלה תפריט ואת באמצעות לחיצות נכון גישה 'STK מסנן-גאוס KRNL', הזכות לחץ שוב כדי להוסיף ערך (השתמש תמיד מספר אי-זוגי, סרטים רכשה ב 33 FPS, ערך של 5 עובד היטב, 1.5 x 1.5 מיקרומטר סטיית תקן 1.0) להזין ערך, הקש ENTER, לחץ על שמאל כדי להחיל (איור 3B).
  5. להתחיל ליצור PTCLs תקופה של הסרט בו כולל תקופה השבתה הדרגתית (20-40 מסגרות) ואחריו את המופע של CTC ומסגרות 20 – 40 גם לאחר CTC תבחר תחילה. כדי לעשות זאת, לגלול הסרט על-ידי שימוש את מקש MMB לגלילה מימין לשמאל בסרגל הצהוב.
  6. עם הבחירה שנעשתה, שימוש נכון לוחץ בחלון הסרט כדי לגשת 'STK Ops – שיפוע DS PTCLinfo' שמאל לחץ כדי להחיל. פונקציה זו פועלת PTCL ניתוח שגרתי זה בהדרגה רמפות הסף מן העוצמה המקסימלית על עוצמת מינימום. זה יוצג באופן גרפי בחלון מגרש כמו מגרש של רעש וגם בחלון עקבות כמו שלושה עקבות צבעוניים, עם המעקב ירוקה מראה את המספר של PTCLs, הסימן האדום מציג גודל ממוצע של PTCL, הסימן הכחול מציג את עוצמת מוחלטת הסף.
    הערה: מספר, ממוצע בגודל של PTCLs על הסף כל מחושב באופן אוטומטי ומוחל ואז סף חצי ידנית באמצעות העוצמה שבה-הגודל הממוצע של PTCLs שמתחיל לרדת, אשר מתרחשת נקודת פיתול של המעקב אדום ב חלון מעקב (איור 3D, קרי בשל מספר גדול של רעש במרחב מוגבל PTCLs להקטין את גודל ממוצע של PTCLs).
  7. בתוך חלון מגרש, הקש H' לאיזון היסטוגרמה העלילה המוצגת של רעש PTCL. מחזור באמצעות ערכות צבעים על ידי לחיצה על ' [' עד הרקע בצבע לבן עם שאריות צבעוניים על גבי.
  8. הקש 'F' כדי להעלות בכלי מדידה שמאל לחץ על העלילה בצומת איפה להעביר החלקות צבעוני בצד ימין. זה יסמן קו אנכי יחיד על פס הגלילה של החלון עקבות להלן.
  9. בתוך חלון מעקב, גלול שמאלה מקש MMB לימין של נקודת פיתול של המעקב אדום עד הקו האנכי מסומן הלבן שנוצר בשלב 4.10 מוודא כי הסימן הכחול נבחרה על ידי לחיצה ימנית על זה, קרא את 'yAVG' אשר יוצג ב- t . תוריד הוא בצד שמאל של החלון עקבות... בטל את הבחירה על ידי לחיצה על מקש MMB פעם אחת בתוך חלון עקבות.
  10. בתוך חלון הסרט, לחץ 'C' להעלות גלגל צבעים ולאחר מכן הקש ' כדי להתאים את הסף. PTCLs חוקית כעת יוצג כשייך אדום חלון הסרט (איור 3C) ואלה אשר רוויה יהיה לבן. להסיר את השטחים הלבנים על ידי גלילה למעלה עם לחצן העכבר השמאלי.
  11. גלילה למעלה או למטה עם MMB להתאים את הערך המספרי צהוב בגלגל צבע, להתאים את הערך לערך yAVG שנלקחו שלב 4.11. זה יקצה הכל אדום פעיל Ca2 + PTCL ארעי על נקודת הסף שנקבע. כדי לשמור את זה כקובץ חלקיקים מבוסס קואורדינטות, שימוש נכון לוחץ כדי לגשת אל ' STK 3D-שמור PTCLS 0' ושמאלה לחץ כדי לשמור את הקובץ.
  12. להפסיק Volumetry ולפתוח מחדש. פתח את הקובץ PTCL (קובץ .gpf) שנוצר בשלב 4.13. בסוג קובץ זה, נשמרות כל פעיל Ca2 + תופעות מעבר PTCL כחול אחיד (איור 3E). כמו כל PTCL הוא ישות בודדים עם מזהה משלו, אזור, ההיקף קואורדינטות, דגלי המדינה (ראה להלן) כתוצאה מערכים, הניתוח של המאפיינים-עתיים של PTCLs, או בין PTCLs הוא יעיל יותר.
  13. כדי להתחיל בניתוח PTCLs, להסיר רעש PTCL הנותרים (קטנה PTCLs לא חוקי שנוצר כאשר נוצר קובץ .gpf) באמצעות לחיצות נכון בחלון הסרט כדי לגשת ' ptcls PTCL STKOPS-דגל > Min =-70, עזב לחץ כדי להחיל. פעולה זו יסמן PTCLs גדול מ מיקרומטר 62 (~ קוטר > 2µm) Volumetry להקצות אותם לבחירה 'דגל 1'. כאשר זו תושלם, PTCLs כי הם מעל הסף הזה (דגל 1) תופיע בצבע סגול בהיר בחלון ' סרט ', ואילו כל PTCLs מתחת לסף יישאר צבע כחול הבסיסי שלהם (איור 3F).
  14. ליצור חום ייצוגים מפה של פעילות PTCL באמצעות לחיצות נכון בחלון הסרט כדי לגשת ' הדגל STKops-StatMap PTCL ='. על ידי לחיצה ימנית על השביל הסופי, ניתן להזין הקצאת דגל כדי לנתח. לפיכך, אם המבקשים לכמת את PTCLs שהוקצו סמן ארגוני1, פשוט להזין '1', הקש ENTER ולאחר מכן עזב לחץ כדי להחיל. פעולה זו תיצור מפת החום המציגה את PTCLs הכולל עבור לכל אורכה של הקלטה, עם צבעים שונים המייצג מופע (%) במהלך ההקלטה (איור 3G, צבעים חמים לציין מופע מוגברת במיקום זה).
  15. לשמור מפות חום על-ידי לחיצה ימנית על להם גישה 'ה-STM עומס שמור - להציל את ה-STM כמו. tif' ולחיצה נשאר לשמור כקובץ TIFF.
  16. לכמת פעילות PTCL באמצעות לחיצות נכון בחלון הסרט כדי לגשת ' STK מידה-PTCLStats PTCL =', על ידי לחיצה ימנית על השביל הסופי, ניתן להזין הקצאת דגל כדי לנתח. לפיכך, אם המבקשים לכמת את PTCLs שהוקצו סמן ארגוני1, פשוט להזין '1', הקש ENTER ולאחר מכן עזב לחץ כדי להחיל. פעולה זו תיצור סדרת איתורים בחלון עקיבה.
  17. Volumetry כברירת מחדל להרכיב את עקבות PTCL שנוצר בשלב 4.17 אחד על גבי השני. להפריד ביניהם באמצעות ממש לוחץ בחלון עקיבה כדי לגשת 'יישור נפרדת מעקב' שמאל לחץ כדי להחיל. זה יחשפו ארבעה שונים PTCL עקבות זה לכמת Ca2 + פעילות PTCL בסרט מציג אזור PTCL (ירוק), רוזן PTCL (אדום), PTCL (ציאן) בגודל סטיית תקן גודל PTCL (כחול) להתוות נגד הזמן (איור 3 H).
  18. עקבות אלה ייתכן יישמר כקובץ טקסט שניתן לייבא לתוך תוכנית גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. להציל את עקבות, החזק את מקש SHIFT ולהשתמש נכון לוחץ בחלון עקיבה כדי לגשת 'רועי Assorted-דאמפ כטקסט' שמאל לחץ כדי לשמור את הקובץ. מידע זה הוא לאחר מכן נאסף, מאויר היסטוגרמות או ייצוגים גרפיים המתאימים אחרים (איור 3 H).
  19. על מנת מסתכלים על המופע ההתחלתי של PTCLs (קרי, להסתכל על ירי אתרים), אלה PTCLs הראשוני מקבלים הקצאת דגל שונה. כדי בידוד טוב יותר ירי אתרי המתרחשים בתוך הרשת, רק אלו PTCLs אשר אינם חופפים עם כל חלקיקי המסגרת הקודמת, אבל חפיפה עם חלקיקים ב- ms 70 הבא נחשבים ירי אתרים.
  20. כדי להחיל את הסף הזה, שימוש נכון לוחץ בחלון הסרט כדי לגשת ' PTCL התנהגות-F1 InitSites > F = 3' ועזב ללחוץ עליהם כדי להחיל. זה להקצות ייזום PTCLs בשם 'דגל 3', ו PTCLs העונים על קריטריונים אלה יופיעו כעת כצבע ירוק ליים בסרט (איור 4A).
  21. Volumetry מעניק גם את היכולת לכמת מגרש מספר האתרים ירי PTCL של FOV נתון, כמו גם התוויית שלהם ההסתברות של ירי במהלך CTC. כדי לנתח פרמטרים אלה, ליצור מפת החום של ייזום PTCLs (דגל 3) כפי שמתואר בשלב 4.16 (איור 4B).
  22. שמאל לחץ בחלון מגרש, ואז היה העיתונות 'C' להעלות את גלגל הצבעים ולחץ על ' לסף. המפה חום של ייזום PTCLs וויל ואז להפוך אפור ולבן. הסר הכל לבן על-ידי גלילה למעלה עם לחצן העכבר השמאלי, סף את PTCLs במפה חום כך רק חוקי PTCLs מכוסים גריי (להתאים את הסף על-ידי גלילה למעלה ולמטה עם מקש MMB).
  23. שימוש נכון לוחץ על-גבי המפה חום בחלון להתוות כדי לגשת STM, למצוא PTCLs PTCLs 70' שמאל לחץ כדי להחיל. זה להקצות כל PTCLs אפור למפת שגדולים מ 70 פיקסלים2 בגודל יוקצו בתור חניכה צבע נפרד מקודד PTCL או PTCL ירי האתר (איור 4C).
  24. להתוות את הפעילות של כל אחד מאתרים אלה ירי נגד הזמן על-ידי לחיצה ימנית על PTCL ירי מפה ואת הגישה 'PTCL PTCLs-יצירת ה-STM rois' לחיצה שמאלה כדי להחיל. פעולה זו תיצור תמונה חדשה בחלון סרט עם כל נפרד צבעוניים PTCL ירי האתרים המוצגים עם רועי סביבם.
  25. שימוש נכון לוחץ בחלון הסרט כדי לגשת ' PTCL מידה-PTCLpixROIBM > = 1', לחץ על שמאל כדי להחיל. זה יזהה ROIs כל חלון הסרט מכיל PTCL אחד לפחות, להתוות את כל הפעילות בתוך אלה ROIs בחלון עקבות. כברירת מחדל, העקבות האלה להיות על גבי אחד את השני. להפריד ביניהם, שימוש נכון לוחץ בחלון עקיבה כדי לגשת 'יישור נפרדת מעקב' שמאל לחץ כדי להחיל. להציל את עקבות, החזק את מקש SHIFT ולהשתמש נכון לוחץ בחלון עקיבה כדי לגשת 'רועי Assorted-דאמפ כטקסט' שמאל לחץ כדי לשמור את הקובץ.
  26. ניתן להתוות את הפעילות של כל אתר ירי גם כמו מפה של המופע. כדי לעשות זאת, שימוש נכון לוחץ בחלון הסרט כדי לגשת ' PTCL מידה-רועי Pianola = 10', לחץ על שמאל כדי להחיל. פעולה זו תיצור מגרש של כל האתרים ירי נגד הזמן בחלון עלילה. כל אתר ירי תוצג כישות בנפרד צבעוניים, כל אחד משלו 'ליין' על חלקות אלה שיתאימו Ca2 + PTCLs ייזום במהלך CTCs (איור 4DE) שמור מפות מופע אלה על-ידי לחיצה ימנית על להם גישה ' ה-STM עומס שמור - להציל את ה-STM כמו. tif ' ולחיצה על נשאר לשמור כקובץ TIFF.
  27. כדי לכמת את ההסתברות של ירי על כל אתר ירי במהלך CTC, שימוש נכון לוחץ בחלון הסרט כדי לגשת ' PTCL התנהגות-מארק הוא = 1', לחץ על שמאל כדי להחיל. זה יזהה את כל המסגרות בסרט המכילים PTCLs מעל הסף, אלה יסומן בחלק התחתון של חלון הסרט קווים אנכיים כחול.
  28. CTCs המתבטאים התקבצות מהירה של ירי אסינכרוני מאתרים ירי מרובים בתוך FOV עם ~ 1 s פערים בין כל מחזור CTC. זה בהתמדה ובהחלטיות, פער זמן של לא PTCLs פעיל בין CTCs משמש הגדרה נוספת של CTC לניתוח.
  29. שימוש נכון לוחץ בחלון הסרט כדי לגשת ' PTCL התנהגות-בלוק הוא הפער < =', להשתמש לחץ לחיצה ימנית על הנקודה הסופית כדי להזין מספרים. פקודה זו יקבץ המסגרות PTCL פעיל המזוהה בשלב 4.28 רחובות, רחובות מבוססים על מספר המסגרות המפרידים בין PTCLs פעיל. להקלטות של 33 FPS לדוגמה, ערך של 10 עובד היטב. אם PTCLS פעיל פחות מ 10 מסגרות לגזרים (330 ms) הם מקובצים מגוש אחד לניתוח (הבלוקים ואז מוצגים כמלבנים ורוד על הקוים הכחולים אנכי בחלק התחתון של חלון הסרט, עם כל מלבן ורוד עכשיו המציין CTC).
  30. שימוש נכון לוחץ בחלון הסרט כדי לגשת 'PTCL מידה-PTCL אירוע Prob'. פעולה זו תיצור קובץ טקסט שניתן לייבא לתוכנית של גליון נתונים. קובץ טקסט זה יספק כמות עצומה של נתונים על טיב האתרים חניכה הוגדרו מן השלבים 4.16-4.23 ותרומתם כדי CTCs.
    הערה: קובץ הטקסט יציג מספר האתרים חניכה (המכונה 'תחומים'), גודל האתר פיקסלים ו μm2, ההסתברות של כל אתר חניכה ירי או פעם אחת או פעמים רבות במהלך כל CTC (מוענקת כמו %), משך הזמן הממוצע ואת גודל PTCLs המתרחשים האתר החניכה, את מספר מחזורי CTC (כפי שהוגדרו בשלב 4.23) האחוז של אתרים אש שנורתה במהלך כל מחזור CTC. מידע זה נאסף, מאויר היסטוגרמות או ייצוגים גרפיים המתאימים אחרים (איור 4F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ערכת-Cre-GCaMP6F עכברים (איור 1), דינמי Ca2 + איתות התנהגויות של ICC במערכת העיכול יכולים לדימות באתרו. עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של אוכלוסיות ספציפיות של ICC בלי לזהם אותות אחרים אוכלוסיות של ICC בתוך רקמת אותו אבל במישורים שונים מבחינה אנטומית של המוקד (איור 2 א)37 , 39 , 40 , 41. ניתן לרשומה קצרה (< 100 ms), לוקליזציה Ca2 + אירועים שלא היו אפשריים עם קרום חדיר Ca2 + מחוונים. מיפוי-עתיים עם תוכנת Volumetry או ImageJ יכול לשמש כדי ליצור STMs של כל האירועים2 + Ca בתוך התאים באתרו. באמצעות גישה זו, Ca2 + אירועים FOV כולו ניתן לאבחן, ממופה (איור 2Bג), ולא רק להקליט את פעילות מוגבלת רועי יחיד. שיטות אלה ניתן להרחיב בכל תא בטווח FOV נתון, הבטחת איסוף נתונים נציג מכל תאים, מתן מידע כמותי על amplitudes היחסית, משכי הזמן חולף, קצב עלייתו ונפילתו של תופעות מעבר, וכו (איור 2E , F). ניתוח ה-STM, לעומת העוצמה מבוססי-רועי חלקות, מספקים גם היכולת צג, הרשומה המאפיינים המרחביים של Ca2 + איתות, כגון התפשטות מרחבית ומהירות ההפצה, כפי שמוצג באיור 2G. מידע זה יכול להיות צבר כדי לספק תצוגה מלאה למדי של Ca2 + איתות התנהגויות בתאים בסביבות מקורי שלהם (איור 2 H).

PTCL ניתוח ניתן לכמת מורכבים יותר Ca2 + איתות התנהגויות, כגון אלה המתרחשים בתוך רשתות הסלולר מחוברות. דוגמה של יישום זה מסופק על ידי הניתוח לבצע ב- ICC-מיי (איור 3 א). בדרך כלל בהכנות מורכבות, רעש רקע אות רעש יכול להיות בעיה. עם זאת, באמצעות תוכנת Volumetry כדי להחיל מסננים דיפרנציאלית המחליק על סרטים של Ca2 + פעילות ויישום ואז הרעש פרוטוקולים הסף לסינון רעשי רקע רעש (איור 3B-D) ניתן להסיר מורכבים הקלטות של פעילות דינאמית. באמצעות ניתוח PTCL כמו אלה המוצגים באיור 3E-G, מידע כמותי אודות Ca2 + איתות יכול להיות מחושב על ידי מדידת את אזור PTCL, הרוזן PTCL וגודל PTCL אשר מצביעים על מרחבי טווחי הפעלה של Ca2 + אותות ב FOV. נתונים אלה יכולים להיות הידור כמוצג באיור 3 H וניתח מבחינה סטטיסטית, לפי הצורך. איור 4 מדגימה איך PTCL ניתוח מאפשרת כימות עומק של תת הסלולר Ca2 + איתות על ידי בחינת המיקום וירי הסתברויות של Ca2 + ירי אתרים. על-ידי הקצאת PTCLs לתוך דגלים שונים בהתבסס על מאפייני הזמני שלהם, ייזום PTCLs ניתנת במדויק למיפוי כפי שמוצג באיור 4C-E ושפע של נתונים על מספר האתרים חניכה (המכונה ' תחומים), גודל האתר פיקסלים ומיקרומטר2, ההסתברות של כל חניכה באתר ירי בכל פעם או פעמים רבות במהלך כל CTC (מוענקת כמו %), משך הזמן הממוצע והגודל של PTCLs המתרחשים באתר החניכה, המספר של CTC מחזורי (כמו המוגדר בשלב 4.23) ואת האחוזים של אתרים אש שנורתה במהלך כל מחזור CTC. שיטות אלה מאפשרות רמה גבוהה של כריית נתונים, כימות באתרו Ca2 + אותות המתרחשים בתוך רשת סלולארית ללא פגע אינן אפשריות עם ניתוחים מבוסס-ROI.

Figure 1
איור 1: דור של עכברים KitGCaMP6f. תרשים סכמטי של איך Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (עכברים GCaMP6f) היו שלובות עם c-Kit/ Cre-ERT2 (קיט-Cre עכברים) כדי ליצור ערכת-Cre-GCaMP6f עכברים. אלו עכברים מוזרקים עם טמוקסיפן בגילאים 6-8 שבועות כדי לגרום Cre Recombinase וביטוי GCaMP6f הבאים באופן בלעדי ב- ICC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח של רשות סטוכסטי2 + מאותת ב- ICC-DMP באמצעות מיפוי-עתיים (STM). (א) תמונה ייצוגית של מספר ICC-DMP מן המעי הדק של עכבר קיט-Cre-GCaMP6F באתרו. רועי ירוק מציין את הגודל והכיוון של רועי לצייר סביב DMP-ICC יחיד בתוך FOV כדי ליצור את ה-STM ב- Volumetry. (B) ה-STM של Ca2 + פעילות ב- ICC-DMP מודגשים בלוח A אחריו כוילה כראוי עבור משרעת, המרחב והזמן. (ג) ה-STM באותו שמוצג בחלונית B אחרי זה כבר צבע מקודד עם טבלת בדיקת מידע (QUBPallete). (ד) מורחב תמונה של ICC-DMP Ca2 + שנחשולי המוצג על צבע מקודד ה-STM, המציין היכן לצייר קו באמצעות אירוע2 + Ca על פני ציר זמן (x) כדי ליצור פרופיל מגרש של פעילותה ב- ImageJ. מגרש (E) פרופיל של האירוע2 + Ca מסומן על פנל D, המציין היכן קווים שמוצג להיות נמשך למדוד במדויק את משרעת והמשך של האירוע. מגרש (F) פרופיל של האירוע2 + Ca מסומן על פנל D, המציין היכן קווים שמוצג להיות נמשך במדויק למדוד קצב עליית ושיעור של נפילת של האירוע. (G) מורחב תמונה של ICC-DMP Ca2 + שנחשולי המוצג על צבע מקודד ה-STM, המציין היכן לצייר קו באמצעות אירוע Ca2 + על פני ציר המרחב (y) כדי למדוד במדויק את התפשטותה המרחבית. (ח) היסטוגרמות נציג של נתונים במאגר ICC-DMP הממחישות כיצד להציג בצורה גרפית את משרעת, משך וערכים ההתפשטות המרחבית שנרכשה מן השלבים הנ ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: כימות של CTCs ICC-מיי באמצעות חלקיקים מבוססי ניתוח. (א) תמונת הנציגה של רשת ICC-מיי מן המעי הדק של עכבר קיט-Cre-GCaMP6F באתרו. (B) התמונה נלקחה מן ההקלטה שמוצג בחלונית A אחרי זה עבר סינון דיפרנציאלית של Δt = ms ±66 – 70 ועם סינון לפי עקומת גאוס של 1.5 x 1.5 מיקרומטר, סטיית תקן 1.0. (ג) התמונה נלקחה מהסרט ב' לאחר קביעת סף הושלמה PTCLs מעל הסף מוצגים בצבע אדום. (ד) עקבות של PTCL לספור ואני מתכוון PTCL גודל סף פרוטוקול כדי למנוע רעש בתוך הסרט שמוצג בחלונית B. PTCLs נוצרו תוך שימוש באלגוריתם מבול מילוי שסימן את המבנה של כל הפיקסלים הסמוכים שהיו עוצמות מעל הסף, Ca 2 + PTCLs ארעי היו גדולים יותר מאשר הרעש PTCLs. הסף שבו מספרים גדולים של רעש בגודל קטן PTCLs בקע והחל להקטין את הגודל הממוצע של PTCLs יכול לשמש סף נפוצות עבור כל הקלטות. (E) נציג תמונה מקובץ מבוסס קואורדינטות Ca2 + PTCL שנוצרו בהקלטה thresholded בתמונה ייצוגית ג (F) שנלקחו קובץ PTCL של E אחרי קריטריון סינון של > 6 מיקרומטר2 (קוטר ~ 2 מיקרומטר או קטן יותר) הוחל; PTCLs לעיל הם מגבלה זו מסומן (דגל 1) חלקיקים סגול בהיר והוא נחשב חוקי PTCLs. (G) חום מפה המציגה את PTCLs הכולל (דגל 1) עבור ההקלטה כולו של וידאו שמוצג בחלונית F, עם PTCLs כוללת summated בצבעים המייצגים מופע לכל אורך ההקלטה (צבעים חמים לציין מופע מוגברת במיקום זה). עקבות נציג (H) של אזור PTCL (כחול), רוזן PTCL (אדום) נגזר מתוך קובץ ה-PTCL שנוצרו בלוח A-G... היסטוגרמות נציג של נתונים במאגר מספר ניסויים מוצגים להלן העקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: ניתוח של Ca2 + ירי אתרים ב- ICC-מיי באמצעות חלקיקים מבוססי ניתוח. (א) תמונת הנציגה שנלקחו קובץ PTCL של דמות 3E אחרי דגל 1 PTCLS הם עוד יותר מעודן לתוך הדגל 3, מצב דגל עבור Ca2 + ירי אתרים. דגל 3 PTCLs מוצגים ירוק-לימון (רק PTCLs הללו זה אינם חופפים עם כל חלקיקי המסגרת הקודמת, אבל חפיפה עם חלקיקים ב- ms 70 הבא נחשבו ירי אתרים). (B) חום מפה המציגה את PTCLs הכולל (דגל 3) עבור ההקלטה כולו של וידאו שמוצג בחלונית A, עם סך PTCLs לסכם עם צבעים המייצג התרחשות במהלך ההקלטה (צבעים חמים לציין מופע מוגברת במיקום זה). (ג) מפה נציג של Ca2 + ירי אתרים המוצגים בחלונית ש-b, עם כל אתר ירי שונים מוקצה מזהה צבע שונה. (ד) נציג עקבות של אזור PTCL (כחול) PTCL לספור (אדום) נגזר מתוך קובץ ה-PTCL שנוצרו ב- 3A איור-G. (ה) על מפת התרחשות הפעילות של אתרי ירי בודדים. כל אתר ירי בתוך FOV מוצגת כמשבצת בצבע משלו 'ליין' נגד הזמן. היסטוגרמות נציג (F) של נתונים במאגר מספר ניסויים מוצגים הממחישות ערכים המצטבר עבור Ca2 + ירי האתר ירי הסתברות / CTC ואת המספר של Ca2 + אתרים FOV ירי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca2 + הדמיה של סוגי תאים בתוך הרקמות שלמים או רשתות של תאים ספציפיים לעיתים קרובות חושף דפוסים מורכבים של Ca2 + תופעות מעבר. פעילות זו מחייבת ניתוח זהיר ומעמיק כימות ללכוד כמה שיותר מידע אודות אירועים הבסיסית וקינטיקה של אירועים אלה ככל האפשר. ה-STM וניתוח PTCL לספק הזדמנות כדי למקסם את כמות נתונים כמותיים הניבו הקלטות מסוג זה.

הצרים, פלך בצורת המורפולוגיה של ICC-DMP להפוך אותם גם מתאים לניתוח STM נגזר על STMs שפורטו לעיל. עם זאת, ניתוח זה אינה מתאימה ל ICC-מיי כי הם stellate בצורת ומחוברים ברשת (איור 3 א). יתר על כן, Ca2 + איתות הדפוסים ב- ICC-מיי הם מורכבים יותר, מפגין כמו הפצת CTCs מאתרים מרובים ממוצא ברחבי הרשת ICC-מיי. לכן, על מנת לכמת את הפעילות המתרחשים הרשת שלי ICC בתוך FOV, ניתוח חלקיקים (PTCL) בוצעה באמצעות תוכנות מותאמות אישית תוצרת (Volumetry, גירסה G8d, GWH, מפורמט ב- Mac OS, פנה גרנט Hennig grant.hennig@med.uvm.edu לגבי מברר עבור גישה חופשית Volumetry).

ניתוח ה-STM מאפשר כל Ca2 + אירועים בתוך תאים בודדים ובתוך כל התאים של FOV כדי להיות מנותח באופן ביקורתי על פני מגוון של יכולות פרמטרים. הפרוטוקול המתואר ממחיש כמה שיטות אלה ניתן להחיל ICC-DMP של המעי הדק העכבר. מאת מלא לכימות Ca2 + איתות ב- ICC-DMP, כפי שמוצג באיור 2B-G, Ca2 + איתות דפוסי אפיינו ב פירוט37. ניתוחים אלה הוחלו על הקלטות איפה ICC-DMP עוברים התערבויות דק לכמת את ההשפעות של חסימה או מגרה Ca2 + שחרור / Ca2 + זרם / עצבית מסלולים37,39 , 40 , 41. שיטות אלה ניתן להחיל בקלות על תכשירים אחרים רקמות ללא פגע. לדוגמה, ניתוח ה-STM כפי שמתואר כאן יש כבר מנוצל כדי לזהות חיבורים חדשים מכניסטית מעורב הדור של תאיים Ca2 + גלים טלקוה השופכה שריר חלק ב באתרו57.

הכנת STMs ב Volumetry דורש קצת זהירות, כמו פונקציית Volumetry שיוצר את ה-STM מ רועי מצוירות (איור 2 א) הוא ערך הממוצע של עוצמה. לפיכך, פוטנציאל יכול להיות מדולל את משרעת של Ca2 + אותות אם רועי משורטט לרחב או ארוך יותר מאשר Ca2 + האירוע או תא עניין. לפיכך, משתמשים צריך להיות זהיר לצייר ROIs כי הם כמו הולם בחוזקה ככל האפשר Ca2 + אותות או לתא מסוים כי הם מנתחים כדי להקל על בעיה זו. באופן דומה, יצירת STMS באמצעות linescans פיקסל בודד ב- ImageJ אומר כי מדויק מיפוי של Ca2 + אירועים יהיה נתון הקרבה של Ca2 + האותות אל קו שצויר. דאגות שכאלו הן משניות בדק פלך בצורת תאים כמו ICC-DMP, אולם תא שני סוגי עם מורפולוגיה stellate או עגולים יותר עלולה להפוך סוג זה של ניתוח הולם למפות כל Ca2 + אותות במדויק. בעת הכנת STMs לניתוח, ללא קשר אם הם נעשו ב- Volumetry או עם ImageJ linescans, ישנם כמה אזורים יודגשו לצורך פתרון בעיות. חשוב לשנות את איכות התמונה 32 סיביות לפני ביצוע כיול כל כישלון STMs. כדי לעשות זאת, או לעשות זאת לאחר כיול עבור F/F0 יכול להוביל מדידות לא עקביים על-פני ניסויים. תמיד לבדוק את איכות התמונה של ה-STM, אשר צוין באזור העליון של גבול לבן ה-STM עצמו נפתח עם ImageJ. עוד תחום אפשרי של חוסר עקביות הוא בחירת הערך0 F כאשר כיול עבור משרעת. זה חיוני כי לבחירת האזור עבור F0, שזה מכסה שטח של התא הוא אחיד ולא בפוקוס. מסיבה זו, אזורים של התא זה. יש ידי קרינה פלואורסצנטית הבזליים לא יציב או לשנות תנועה או חפצים אחרים אינם אידיאליים, פרוטוקולים מייצב תנועה קפדני צריך להיות מועסק במקרים אלה.

במסגרת ההכנות באתרו או תרבותי המכיל בינהם רשתות הסלולר, כגון ICC-מיי בניתוח PTCL במעי, קטן מספק שיטה יעילה כדי לכמת מורכבים, subcellular Ca2 + אירועים המתרחשים ברשת. יתר על כן, הוא גם מאפשר כל Ca2 + אירועים ברשת בתוך FOV נתון כדי להיות מנותח, במקום שימוש ROIs שרירותי, אשר רק לספק מידע על תדירות ועוצמה בתוך רועי. יתרון של ניתוח PTCL המתוארים כאן הוא כי על-ידי החלת דיפרנציאלית ו גאוסיאנית החלקת מסננים בהקלטות, כמות גדולה של רעש ניתן להסיר סרטים שעשויים להכיל מזהמים אור מתאי לא עניין או עקב שאינם דינאמיים נקודות האור או הכללות. חשוב לציין כי הסכום של בידול חלה על הקלטות יהיה תלוי במידה רבה קצב רכישת בשימוש על ידי הנסיין. להבדיל סרטים כמפורט בפרוטוקול מספק אמצעים של החלת מסנן על הסרט כדי להסיר רעשים בתדר גבוה מן הקלטות. החלת ערך בידול של '2' בעת רכישת ב 33FPS עובד היטב כדי להסיר את רעשי הרקע תוך שמירה על איתות טוב רעש (אם הערך הוא נמוך מדי, רעש ייאסף אך אות רעש יסוכל אם הערך גבוה מדי). הערך בידול חלה צריך להיות מוגברת במחירים רכישה מהירה יותר, לדוגמה ב 100 FPS, ערך בידול של '7' נותן לאותו האות לרעש יחס כאל ערך של '2' להקלטה 33FPS. ניסויים יזדקק למטב את הגדרות אלה בהתאם על ההכנות ותנאים ההקלטה שלהם.

פרוטוקול סף המתואר באיור 3D מאפשר הליך קביעת סף עקבי שיוחל הקלטות שונות שנעשו במערכות שונות עם תוכנה רכישה שונות. גמישות זו מאפשרת נתונים מרובים החוקרים עובדים על מערכות שונות כדי לקמפל את הקלטות שלהם לתוך datasets אותו. באמצעות מערכת הדגל Volumetry, ניתוח PTCL מאפשר הדמיה כימות של הפרט Ca2 + ירי אתרים בתוך רשת בפירוט. שניתן לאסוף מידע על מספר אתרי החניכה, את הגודל של אתר פיקסלים ומיקרומטר2, ואת משך הזמן הממוצע של PTCLs המתרחשים באתר הזה. ניתוח PTCL זה מותר אפיון פעילות CTC הראשון במעי הדק ברמה התאית תת, ו, באמצעות דגלים שונים בתוכנה Volumetry, PTCLs-שניהם הרשת ואת ירי בודדים באתר רמת היו לכמת ברקמת ללא פגע גלמי קיט-Cre-GCaMP3 עכברים38. מתוך תצפיות ראשוניות אלה, ניתוח זה יש נוספת נעזרו ללמוד הרומן Ca2 + זרם מסלולים ב- GI ICC-מיי כגון חנות-מופעל-Ca2 +-כניסה42 ואת התפקיד של מיטוכונדריאלי Ca2 + איתות על קצב GI 41. יותר כמו ניתוח ה-STM שתוארו לעיל, ניתוח PTCL ניתן בקלות להתאים ההכנות שלם שונה מזו המתוארת בעלון פרוטוקול זה. למשל, מחקר שנערך לאחרונה המשמשות PTCL ניתוח ללימוד הרומן קצבית Ca2 + אירועים המתרחשים בתוך רשתות הסלולר שלם של פרופריה. מוסקולריס של עכברוש שלפוחית השתן58,59 , ובכך יכול בקלות לחול על מורכבות, ללא פגע הסלולר מערכות אחרות כגון מערכות עצביים. בעוד נייר זה התמקד Ca2 + הדמיה ברקמות שלם עם GECIs, ניתן להפעיל טכניקות ניתוח אלה גם על תאים מבודדים ורקמות נטען עם Ca מסורתי2 + מחוון צבע. ניתוח ה-STM מבוסס שימש בהצלחה לכמת Ca מקומי2 + אותות ו- Ca2 + גלים של פלך בצורת תאים interstitial ותאי שריר חלק ממגוון רחב של תכשירים11,60 , 61 , 62 , 63. יתר על כן, רוטינות ניתוח PTCL המתוארים כאן גם הוחלו על ההכנות רשת באתרו דמיינו קאל 52058,59. עם זאת, מחקרים אלה גם שומרים על החסרונות של צבע כזה טעינת פרוטוקולים כגון זיהוי תא רב-משמעי ובעיות עם אות רעש.

הדוגמאות המודגם לעיל מדגימות כי ניתוח ה-STM והן PTCL הן טכניקות מאוד נזיל יכול לשמש כדי לכמת מורכבים Ca2 + איתות ב מגוון רחב של תכשירים רקמות ללא פגע. הגישות מציעות יתרונות רבים על רועי מסורתי המבוסס על מגרשים בעוצמה באופן שגרתי שימשו בעבר, צריך לספק חוקרים יקר יותר מידע כמותי על Ca2 + איתות ממה יכולה להיות מושגת בעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מימון סופק על ידי NIDDK, דרך P01 DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ImageJ software NIH 1.5a ImageJ software
Volumetry GWH Volumetry 8Gd Custom made analysis software
Isoflurane Baxter, Deerfield, IL, USA NDC 10019-360-60
Tamoxifen Sigma T5648
GCaMP6F mice Jackson Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice Gifted From Dr. Dieter Saur c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol Pharmco-Aaper SDA 2B-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34, (3), 211-229 (2003).
  2. Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20, (2), 153-160 (1996).
  3. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793, (6), 933-940 (2009).
  4. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9, (5), R157-R159 (1999).
  5. Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12, (1), 3-10 (2001).
  6. Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502, (3), 521-536 (1997).
  7. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1, (1), 11-21 (2000).
  8. Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14, (7), 485-493 (1992).
  9. Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83, (5), 675-678 (1995).
  10. Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6, (2), 267-274 (1994).
  11. Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593, (15), 3333-3350 (2015).
  12. Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588, (22), 4453-4474 (2010).
  13. Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56, (3), 181-187 (2014).
  14. Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267, (25), 18118-18121 (1992).
  15. Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116, (4), 547-560 (2000).
  16. Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85, (3), 1392-1405 (2003).
  17. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278, (2), C235-C256 (2000).
  18. Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, (5236), 633-637 (1995).
  19. Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262, (5134), 740-744 (1993).
  20. Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20, (2), 105-121 (1996).
  21. Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
  22. Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19, (4), 337-349 (1996).
  23. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31, (1), 1-10 (1994).
  24. Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28, (4), 213-223 (2000).
  25. Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58, (6), 638-648 (2015).
  26. Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56, (27), 7750-7754 (2017).
  27. Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35, (2), 843-852 (2015).
  28. Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. 590 (2014).
  29. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32, (40), 13819-13840 (2012).
  30. Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5, (2016JULY), (2016).
  31. Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10, (11), 1105-1109 (2013).
  32. Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114, (10), 1623-1639 (2014).
  33. Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
  34. Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12, (2), 1-24 (2017).
  35. Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. 3489 (2018).
  36. Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
  37. Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594, (12), 3317-3338 (2016).
  38. Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149, (7), 703-725 (2017).
  39. Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9, (April), 1-24 (2018).
  40. Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5, (2), (2018).
  41. Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
  42. Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11, (June), (2018).
  43. Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587, (20), 4905-4918 (2009).
  44. Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308, (8), C608-C620 (2015).
  45. Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589, (Pt 18), 4565-4582 (2011).
  46. Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480, (Pt 1), 91-97 (1994).
  47. Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, (6512), 347-349 (1995).
  48. Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518, (1), 257-269 (1999).
  49. Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94, (3), 859-907 (2014).
  50. Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573, (1), 147-159 (2006).
  51. Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576, (3), 653-658 (2006).
  52. Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47, (4), 267-285 (1999).
  53. Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94, (3), 859-907 (2014).
  54. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12, (7), e0181113 (2017).
  55. Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29, (52), 54 (2000).
  56. The Jackson Laboratory. Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
  57. Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596, (8), 1433-1466 (2018).
  58. Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, (December), 1-16 (2017).
  59. Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
  60. Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196, (6), 1796-1808 (2016).
  61. Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6, (4), 958-966 (2009).
  62. Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183, (2), 801-811 (2010).
  63. Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2, (1), e00203 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics