Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Biology

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Summary

Indicatori di codificato geneticamente Ca2 + (GECIs) hanno cambiato radicalmente come in situ Ca2 + imaging viene eseguita. Per massimizzare il recupero dei dati da tali registrazioni, analisi appropriata di Ca2 + segnali è necessaria. I protocolli in questa carta facilitano la quantificazione di Ca2 + segnali registrati in situ utilizzando spatiotemporal mappatura e analisi delle particelle.

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Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ. J. Vis. Exp. (143), e58989, doi:10.3791/58989 (2019).

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Abstract

CA2 + imaging di cellule isolate o tipi specifici di cellule all'interno dei tessuti intatti spesso rivela modelli complessi di segnalazione di Ca2 + . Questa attività richiede un'attenta e approfondite analisi e quantificazione di catturare quante più informazioni possibili sugli eventi sottostanti. Spaziale, temporale e i parametri di intensità intrinseci di Ca2 + segnali quali frequenza, durata, propagazione, velocità e ampiezza possono fornire qualche informazione biologiche necessarie per la segnalazione intracellulare. Alta risoluzione Ca2 + imaging in genere comporta la successiva acquisizione di file di dati di grandi dimensioni che richiedono molto tempo al processo in termini di tradurre le informazioni di imaging in dati quantificabili e questo processo può essere suscettibile di pregiudizi e di errore umano. Analisi di Ca2 + segnali dalle cellule in situ in genere si basa su misure di intensità semplice da arbitrariamente selezionate regioni di interesse (ROI) all'interno di un campo visivo (FOV). Questo approccio ignora gran parte le informazioni di segnalazione importante contenute nel FOV. Quindi, al fine di massimizzare il recupero di informazioni da tali registrazioni ad alta risoluzione ottenute con Ca2 +coloranti o optogenetica Ca2 + imaging, appropriata analisi spaziale e temporale dei segnali Ca2 + è necessario. I protocolli illustrati in questo articolo descriverò come un volume elevato di dati possa essere ottenuto da Ca2 + imaging registrazioni per facilitare la più completa analisi e quantificazione del Ca2 + segnali registrati dalle celle usando una combinazione di Mappa spazio-temporale (STM)-basato su analisi e analisi basate su particelle. I protocolli descrivono anche come diversi modelli di Ca2 + segnalazione osservata in cellule diverse popolazioni in situ possono essere analizzati in modo appropriato. Per l'illustrazione, esaminerà il metodo Ca2 + segnalazione in una popolazione specializzata di cellule nel piccolo intestino, cellule interstiziali di Cajal (ICC), utilizzando GECIs.

Introduction

CA2 + è un messaggero intracellulare onnipresente che controlla una vasta gamma di processi cellulari, come muscolo contrazione1,2, metabolismo3, cella proliferazione3,4, 5, stimolazione del rilascio di neurotrasmettitore a nervo terminali6,7e l'attivazione della trascrizione fattori nel nucleo. 7 intracellulare Ca2 + segnali spesso assumere la forma di aumenti transitori in citosolico Ca2 +, e questi possono essere spontanee o derivano dalla stimolazione agonista a seconda il tipo di cella8. Spaziale, temporale e i parametri di intensità intrinseci di Ca2 + segnali come frequenza, durata, propagazione, velocità e ampiezza possono fornire le informazioni biologiche necessarie per segnalazione intracellulare5, 7 , 9. citoplasmatica Ca2 + segnali possono derivare dall'afflusso di Ca2 + dallo spazio extracellulare o tramite rilascio di Ca2 + dal reticolo endoplasmico (ER) tramite canali del Ca2 + rilascio come recettori della rianodina (RyRs) e recettori di inositolo-tri-fosfato (IP3Rs)10. RyRs e IP3Rs può contribuire alla generazione di Ca2 + segnali e l'apertura concertata di questi canali, che combinato con vari Ca2 + afflusso meccanismi può causare una miriade di Ca2 + modelli di segnalazione che sono modellati dai numeri e aprire la probabilità di canali del Ca2 + afflusso, il profilo di espressione di canali di rilascio di Ca2 + , la prossimità fra afflusso di Ca2 + e canali di rilascio ed espressione e la distribuzione di Ca2 + proteine della ricaptazione ed estrusione. CA2 + segnali possono assumere la forma di uniforme, di lunga durata, oscillazioni globali ad alta intensità che può durare per diversi secondi o addirittura minuti, moltiplicazione intracellulare e intercellulare Ca2 + onde che possono attraversare distanze intracellulare oltre 100 µm10,11,12,13,14,15,16, o più brevi, spazialmente localizzati eventi come Ca2 + scintille e Ca2 + sbuffi che si verificano su decine di millisecondi scale cronologiche e sviluppa meno di 5 µm17,18,19,20.

La microscopia fluorescente è stata utilizzata ampiamente per monitorare Ca2 + segnalazione in cellule isolate e coltivate e nei tessuti intatti. Tradizionalmente, questi esperimenti prevedevano l'utilizzo di indicatori fluorescenti per Ca2 + , raziometrici e non-raziometrici coloranti quali Fura2, Fluo3/4 o Rhod2, tra gli altri 21,22,23. Questi indicatori sono stati progettati per essere permeabile alle membrane delle cellule e quindi diventare intrappolati nelle cellule tramite la fenditura di un gruppo di estere tramite esterasi endogene. Associazione di Ca2 + per gli indicatori di alta affinità causato cambiamenti in fluorescenza quando le cellule e tessuti sono stati illuminati da adeguate lunghezze d'onda della luce. L'uso di cellulare permeabile Ca2 + indicatori notevolmente migliorato la nostra comprensione di Ca2 + segnalazione in cellule viventi e consentito la risoluzione spaziale e la quantificazione di questi segnali che non era possibile analizzando Ca2 + segnali attraverso altri mezzi, ad esempio di elettrofisiologia. Tuttavia, Ca2 + gli indicatori tradizionali presentano alcune limitazioni, ad esempio photobleaching che si verifica nel corso di periodi di registrazione estesa24. Mentre più recente2 + indicatore di Ca coloranti come Cal520/590 hanno notevolmente migliorato segnale ai rapporti di rumore e la capacità di rilevare locale Ca2 + segnali25, problemi con photobleaching possono ancora rimangono una preoccupazione per alcuni ricercatori 26,27,28. Precipitosa photobleaching limita anche l'ingrandimento, tasso di acquisizione dell'immagine, e la risoluzione che può essere utilizzata per le registrazioni, come richiedono maggiore potenza oggettiva e più alti tassi di acquisizione immagine aumentata intensità di luce di eccitazione che aumenta photobleaching.

Queste limitazioni di tradizionale Ca2 + indicatore coloranti sono esacerbati durante la registrazione di Ca2 + segnali in situ, ad esempio quando registrazione intracellulare di Ca2 + segnali dai tessuti intatti. A causa di problemi di cui sopra, visualizzazione di Ca2 + segnali in situ tramite cellulare permeabile Ca2 + indicatori è stato limitato a basso ingrandimento e ridotto i tassi di cattura delle immagini, vincolando la capacità degli investigatori per registrare e quantificare il Ca2 + segnali subcellulari temporalmente o spazialmente limitati. Così, è stato difficile catturare, analizzare e apprezzare la complessità spaziale e temporale di Ca2 + segnali, che può essere importante nella generazione di risposte biologiche desiderate, come indicato in precedenza. Analisi di Ca2 + segnali dalle cellule in situ in genere si basa su misure di intensità semplice da determinate regioni di interesse (ROI) all'interno di un campo visivo (FOV). Scelta arbitraria del numero, dimensione e posizione di ROIs, dipendente per il capriccio del ricercatore, gravemente può influenzare i risultati ottenuti. Così come intrinseca parzialità con analisi del ROI, questo approccio ignora gran parte delle importanti informazioni contenute nel FOV, come Ca2 + gli eventi dinamici all'interno di un arbitrariamente scelto di segnalazione ROI sono selezionati per l'analisi. Inoltre, analisi di ROIs non riesce a fornire informazioni circa le caratteristiche spaziali del Ca2 + segnali osservati. Ad esempio, potrebbe non essere possibile distinguere tra un aumento del Ca2 + risultanti da una moltiplicazione Ca2 + onda e altamente localizzata Ca2 + rilascio evento da tabulazioni di Ca2 + segnali all'interno di un ROI.

L'avvento di codificato geneticamente Ca2 + indicatori (GECIs) ha cambiato radicalmente come Ca2 + formazione immagine possa essere eseguite in situ29,30,31,32,33 . Ci sono molti vantaggi di utilizzare GECIs sopra coloranti. La più importante è forse che espressione di GECI possa essere eseguite in modo specifico delle cellule, che riduce la contaminazione di fondo indesiderati dalle cellule non di interesse. Un altro vantaggio di GECIs in Ca2 + gli indicatori tradizionali è che photobleaching è ridotta (come fluorescenza e conseguenza photobleaching si verifica solo quando le cellule sono attive), rispetto agli esemplari di tintura-caricato, particolarmente ad alta ingrandimento e alti tassi di immagine catturano34. Così, con GECIs, di imaging, come la serie GCaMP di sensori optogenetica, offre gli investigatori la capacità di registrare brevi, localizzato sub-cellulare Ca2 + segnali in situ e indagare Ca2 + segnalazione in cellule all'interno di loro ambienti nativi che non stato possibili in precedenza. Per massimizzare il recupero di informazioni da tali registrazioni ad alta risoluzione, opportune analisi spaziale e temporale dei segnali Ca2 + è necessario. Dovrebbe essere notato che mentre GECIs può offrire che alcuni vantaggi evidenti, recenti studi hanno rivelato che il Ca2 + formazione immagine può essere eseguita con successo da grandi popolazioni di neurochemical diverse classi di neuroni simultaneamente utilizzando convenzionali CA2 + indicatori che non sono geneticamente codificati nel animale35. Questo approccio utilizzato post-hoc immunohistochemistry per rivelare più diverse classi di neuroni sparando ad alta frequenza in modalità burst, sincronizzato ed evitato il potenziale che le modificazioni genetiche dell'animale possono interferire con il fisiologico comportamento l'investigatore cerca di comprendere35,36.

Quantificazione di Ca2 + segnali registrati dalle cellule in situ utilizzando una combinazione di spatiotemporal mappa (STM) e i protocolli illustrati in questo articolo facilitano l'analisi più completa-base analisi e analisi basate su particelle. I protocolli descrivono anche come diversi modelli di Ca2 + segnalazione osservata in cellule diverse popolazioni in situ possono essere analizzati in modo appropriato. Per l'illustrazione, esaminerà il metodo Ca2 + segnalazione in una popolazione specializzata di cellule nel piccolo intestino, cellule interstiziali di Cajal (ICC). ICC sono cellule specializzate nel tratto gastrointestinale (GI) che esibiscono dinamico intracellulare Ca2 + segnalazione, come visualizzato usando topi che esprimono GCaMPs37,38,39,40, 41,42. CA2 + transitori in ICC sono legati all'attivazione di Ca2 +-attivato Cl canali (codificati dal Ano1) che sono importanti nel regolare l'eccitabilità della muscolatura liscia intestinale cellule (SMCs)43, 44,45. Così, lo studio di Ca2 + segnalazione in ICC è fondamentale per comprendere la motilità intestinale. Il piccolo intestino murino offre un eccellente esempio per questa dimostrazione, come ci sono due classi di ICC che anatomicamente sono separate e possono essere visualizzate in modo indipendente: io) ICC si trovano nella zona tra la muscolatura liscia circolare e longitudinale strati, che circonda il plesso mioenterico (ICC-mio). Queste cellule fungono da cellule pacemaker e generano l'attività elettrica conosciuta come onde lente46,47,48,49; II) ICC si trovano tra un plesso ricco nei terminali dei motoneuroni (plesso muscolare profondo, così ICC-DMP). Queste cellule fungono da mediatori di risposte a enterico neurotrasmissione motore37,39,40,50. ICC-MY e ICC-DMP sono morfologicamente distinte, e i loro comportamenti segnalazione Ca2 + differiscono radicalmente per svolgere i loro compiti specifici. ICC-MY sono stellari in forma e formano una rete di cellule interconnesse tramite gap junctions51,52. CA2 + segnali nel ICC-MY manifesto come brevi e spazialmente localizzati Ca2 + rilascio eventi che si verificano in più siti in modo asincrono attraverso la rete ICC-MY come visualizzati all'interno di un FOV (imaged con un obiettivo 60x)38. Questi segnali asincroni sono organizzati temporaneamente in 1 secondo cluster che, quando tabulati insieme, ammontano ad un netto aumento di 1 s cellulare in Ca2 +. Questi segnali si propagano cellula--cellula all'interno della rete ICC e pertanto organizzano Ca2 + segnalazione, generati da siti sub-cellulare, in un tessuto largo Ca2 + dell'onda. Clustering temporale e la sommatoria di Ca2 + segnali ICC-MY è stato chiamato Ca2 + cluster transitoria (CTCs)38. CTCs verificarsi ritmicamente (ad es. abbastanza simili durate e periodi simili tra CTCs) 30 volte al minuto nel topo. Al contrario, ICC-DMP sono cellule fusiformi, alcuni con processi secondari, che distribuiscono tra SMC e processi del nervo varicose e non in modo indipendente formano una rete51,52. Giunzioni di gap di forma di ICC-DMP con paesi del Mediterraneo meridionale, tuttavia e funzione all'interno di questo maggiore del sincizio, conosciuto come il SIP del sincizio53. CA2 + segnali si verificano in più siti lungo le lunghezze delle cellule, ma questi transitori non sono trascinati o raggruppati temporaneamente, come osservato in ICC-MY37. CA2 + segnali in ICC-DMP si verificano in modo stocastico, con intensità variabile, durate e caratteristiche spaziali. I protocolli di seguito, utilizzando l'esempio di Ca2 + segnalazione in ICC-MY e ICC-DMP, descrivono le tecniche per analizzare segnali complessi in tipi specifici di cellule in situ. Abbiamo utilizzato il sistema inducibile di Cre-Lox p per esprimere GCaMP6f esclusivamente in ICC, dopo che inducono l'attivazione di Cre-Recombinase (Cre) guidato da un promotore di specifiche ICC (Kit).

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Protocol

Tutti gli animali utilizzati e i protocolli effettuati in questo studio erano in conformità con l'istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di cura presso la University of Nevada, Reno e uso animale istituzionale.

1. generazione di topi KitGCaMP6f

  1. Attraversare Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f topi) e c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre topi) per generare animali di GCaMP6f specifici ICC di espressione (topi Kit-Cre-GCaMP6f).
    Nota: GCaMP6f è stato utilizzato grazie alla sua efficienza segnalato nella segnalazione localizzato, brief intracellulare Ca2 + segnali in situ e in vivo54.
  2. Iniettare Kit-Cre-GCaMP6f topi con tamoxifene all'età di 6-8 settimane per indurre l'attivazione Cre ricombinasi e successive GCaMP6f espressione in ICC (Figura 1).
    1. Per creare la soluzione di tamoxifen, sciogliere 80 mg di tamoxifene (Vedi Tabella materiali) in 800 μL di etanolo (Vedi Tabella materiali) in una provetta e vortexare per 20 minuti.
    2. Aggiungere 3,2 mL di olio di cartamo (generico) per creare soluzioni di 20 mg/mL e poi trattare con ultrasuoni per 30 minuti prima dell'iniezione.
    3. Iniettare topi (iniezione intraperitoneale; IP) con 0,1 mL di soluzione di tamoxifene (2mg tamoxifen) per tre giorni consecutivi. Confermare GCaMP6f espressione di genotipizzazione e utilizzare topi 10 giorni dopo la prima iniezione.
      1. Topi di genotipo di ritaglio un piccolo pezzo di orecchio da ciascun animale. Quindi, utilizzare il metodo di HotSHOT55 per isolamento di DNA genomic incubando clip orecchio a 95 ° C per 60 min a 75 mL di NaOH e quindi neutralizzare da 75 mL di tampone Tris. Utilizzare standard di PCR per determinare il genotipo di ciascun animale, 2 mL di DNA in una reazione di 20ml con GCaMP6f primers specifici56. Eseguire 10 mL di prodotto di PCR su un gel di agarosio al 2% per determinare il tipo selvaggio (297 bp) e mutante (~ 450 bp) bande.

2. preparazione dei tessuti per Ca2 + Imaging

  1. Anestetizzare topi per inalazione con isoflurano (4%, Vedi Tabella materiali) in un cappuccio ventilato e quindi sacrificio di dislocazione cervicale.
  2. Usando forbici affilate aprire l'addome dei topi, rimuovere l'intestino tenue e nella soluzione del bicarbonato della Krebs-soneria (KRB). Aprire il piccolo intestino lungo il confine mesenterico e lavare via qualsiasi contenuto intraluminale con KRB. Utilizzando le dissezioni taglienti, rimuovere gli strati di mucosa e sotto-mucosa.
    Nota: Soluzione KRB ha la seguente composizione (in mM): 118.5 NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgCl2 1.2, NaHCO3 23,8, KH2PO4 1.2, destrosio 11.0. Questa soluzione ha un pH di 7,4 a 37 ° C quando gorgogliare all'equilibrio con 95% O2- 5% CO2.
  3. Con piccoli perni, perno del tessuto di piccolo intestino alla base di un volume di 5 mL, rivestite con Sylgard piatto diametro di 60mm con lo strato di muscolo liscio circolare rivolta verso l'alto. Irrorare la preparazione con soluzione KRB riscaldato a 37 ° C per un periodo di equilibrazione di 1hr prima sperimentazione.
  4. Dopo questo periodo di equilibrazione, eseguire in situ Ca2 + imaging del piccolo intestinale ICC-MY e ICC-DMP mediante microscopia confocale (le immagini in questo protocollo sono state acquisite con un microscopio confocale, dotato di un disco che gira-). Grazie ai benefici di GECIs sopra descritto, utilizzare immagini ad alta risoluzione di time-lapse (> 30 fotogrammi al secondo, FPS) combinato con obiettivi ad alta potenza (60 – 100 x) di acquisire filmati di Ca2 + segnali dinamici in ICC.
    Nota: Per ridurre il movimento del tessuto, applicare nicardipina (0,1 – 1 μM) durante le registrazioni come descritto in precedenza37,38,39,40,41.
  5. Distinguere ICC-MY e ICC-DMP nel piccolo intestino utilizzando la loro diversa posizione anatomica, la morfologia e il pattern di attività basale Ca2 + .
    1. Individuare ICC-MY a livello del plesso mioenterico, tra gli strati di muscolatura liscia circolare e longitudinale dell'intestino tenue. Sono stellari modellati, formando una rete connessa (Figura 3A). CTCs (descritto sopra) si propaga attraverso la rete di ICC-MY con un avvenimento regolare dei ~ 30 cicli al minuto.
    2. Al contrario, individuare ICC-DMP in un unico piano a livello del plesso muscolare profondo, tra il livello circolare del muscolo liscio e il plesso submucosal. ICC-DMP non formano una rete e sono cellule fusiformi (Figura 2A) che non esibiscono gli eventi moltiplicazione regolari e invece fuoco stocastici, localizzate intracellulare Ca2 + transitori.
  6. Indipendentemente dal software di acquisizione utilizzato, salvare i filmati come una pila di immagini TIFF.

3. analisi di stocastico Ca2 + segnali in ICC-DMP usando la mappatura spazio-temporale (STM)

  1. Analizzare la ICC-DMP usando la mappatura spazio-temporale con una combinazione di software ImageJ (NIH, USA, libero di scaricare in http://imagej.nih.jov/ij) e software personalizzato fatto (volumetria, versione G8d, GWH, operabile su Mac OS, contattare Grant Hennig grant.hennig@ Med.uvm.edu per quanto riguarda richieste per volumetria accesso e uso)
    Nota: Un approccio alternativo per analizzare completamente queste mappe spazio-temporali con ImageJ da solo è a disposizione nelle sezioni successive (inizio al punto 3.9).
  2. Volumetria di aprire e utilizzare il clic destro del mouse per aprire cartelle contenenti file di film. Click sinistro sul file film da analizzare per aprirlo in volumetria (deve essere in formato TIFF non compresso). Una volta aperto, il film sarà contenuto all'interno di una finestra blu-bordered (finestra del filmato) che comprenderà una grande area della schermata di destra. Lato sinistro dello schermo conterrà la finestra Plot (superiore 4/5ths) e la finestra di tracce (inferiore 1/5th).
  3. Regolare le dimensioni del filmato tenendo premuto MAIUSC e contemporaneamente scorrimento verso l'alto con il tasto centrale del mouse (MMB, riduce le dimensioni) o scorrendo verso il basso con il MMB (aumenta dimensione). Avviare o interrompere la riproduzione premendo 'A'; la velocità di riproduzione può essere regolata premendo il su e giù tasti freccia.
  4. Per creare un STM utilizzando Volumetry, disegnare un ROI sopra un'intera cella tenendo premuto MAIUSC e facendo clic e trascinando il tasto sinistro del mouse. Regolare l'orientamento del ROI scorrendo con il MMB agli angoli del ROI. Quando il ROI è in posto sopra la cella per essere analizzati (Figura 2A), uso facendo clic nella finestra del filmato per accedere a ' ROI STMs – STMyAvg > xRow' e click sinistro per creare un STM dell'attività delle cellule nella finestra Plot (c'è anche un'opzione per selezionare ' STMxAvg > yRo w ', che si è selezionato dipenderà se l'orientamento della cella è più allineato con la x o asse y, ad esempio la cella evidenziata nella Figura 2A è più orientato secondo l'asse y').
  5. Cliccare a sinistra su STM nella finestra Plot e premi 'P' per sottrarre il rumore di fondo medio e premere 'H' per aumentare il contrasto di STM. Salvare la STM facendo clic destro su di esso per accedere 'STM carico Salva - Salva STM come TIF' e quindi clic sinistro per salvare come TIFF.
  6. Il resto dell'analisi di ICC-DMP avverrà in ImageJ. ImageJ è costituito da due componenti principali, una barra degli strumenti con una posizione fissa nella parte superiore del monitor e un'interfaccia utente mobile. Utilizzando ImageJ, aprire il file TIFF STM di ICC-DMP Ca2 + attività (File-Apri sulla barra degli strumenti immagine J).
  7. Aprire la volumetria creato STM, che avrà tempo orientato verticalmente. ImageJ si aprirà automaticamente il file TIFF come RGB o immagini a 16 bit. Per migliorare la qualità dell'immagine, clicca 'Immagine' nella barra degli strumenti di ImageJ. Scorrimento sulla prima opzione ' digitare 'per rivelare una drop down menu di vari formati di immagine, scorre su 32-bit' e click sinistro per cambiare.
  8. Per rendere la STM leggibile contro il tempo da sinistra a destra, cliccare a sinistra sulla barra di ImageJ dal seguente percorso: 'Immagine-trasformazione-ruota 90 gradi a sinistra'. È anche possibile creare STMs di in situ Ca2 + attività utilizzando scansioni con ImageJ da solo senza volumetria e questo è descritto di seguito.
    Nota: Una volta creati i STMs, sono analizzati nello stesso modo indipendentemente da quale software è stato utilizzato per generarli. Per ignorare questo metodo alternativo per la creazione di STM in ImageJ, andare al passaggio 3.19.
  9. Per creare STMs con ImageJ, aprire lo stack di file TIFF che compongono la registrazione dell'ICC-DMP Ca2 + attività (File-Apri sulla barra degli strumenti ImageJ). ImageJ si aprirà automaticamente il file TIFF come RGB o immagini a 16 bit. Per migliorare la qualità dell'immagine, clicca 'Immagine' nella barra degli strumenti di ImageJ. Scorrimento sulla prima opzione ' digitare 'per rivelare una drop down menu di vari formati di immagine, scorre su 32-bit' e click sinistro per cambiare.
  10. Rumore di fondo (derivanti da rumore di fluorescenza o fotocamera auto) ora dovrebbe essere sottratto dal film. La funzione di "Selezione rettangolare" nell'interfaccia ImageJ cliccare a sinistra e disegnare un ROI (da sinistra cliccando e trascinando per forma e dimensione desiderata) sopra la fluorescenza di fondo del film.
  11. Dopo aver selezionato il ROI, cliccare a sinistra su 'Analyze' nella barra degli strumenti di ImageJ e poi a sinistra clicca "Istogramma" dal menu a discesa risultante. Una finestra pop-up apparirà quindi indagatore sui valori di intervallo di pixel per calcolare; ImageJ ha i valori del clic così sinistro preselezionato ROI 'OK'.
  12. Dopo aver cliccato su 'OK', una nuova finestra popup contenente un istogramma apparirà mostrando la distribuzione dei valori per il pixel di rumore dello sfondo all'interno il ROI. Prendere nota del valore medio elencato sotto l'istogramma e quindi chiudere la finestra di pop-up.
  13. Fare clic nuovamente per il film di 32-bit e selezionare il FOV intero da sinistra cliccando su 'Edit' sulla barra di ImageJ, scorrimento su 'Selezione' e sinistra cliccando su "Seleziona tutto" dal menu a discesa rivelata.
  14. 'Processo' cliccare a sinistra su ImageJ barra degli strumenti, scorrere fino a 'Matematica' e cliccare a sinistra 'Subtract' dal menu a discesa rivelata.
  15. Verrà visualizzata una finestra di popup dove può essere inserito un valore da sottrarre dal FOV. Immettere il valore medio acquisito dall'istogramma nel passaggio 3.12 sopra e fare clic su 'OK'. ImageJ poi chiederà per elaborare tutti i frame nello stack di TIFF (e non solo il singolo fotogramma del film è attualmente su). Fare clic su 'Sì'.
  16. Dopo aver cliccato su 'Sì', il film diventa nero. Per risolvere il problema, clicca 'Immagine' nella barra degli strumenti ImageJ e scorrimento sopra 'Regolare'. Click sinistro sulla rivelata prima opzione per 'Luminosità/contrasto' (B & C). Questo farà apparire una finestra pop up in cui vari aspetti di luminosità e contrasto possono essere modificati. Clicca sull'opzione 'Auto' una volta per rivelare l'incremento della qualità del film. Lasciare questa B & C pop finestra aperta per un utilizzo futuro.
  17. Per creare un linescan, in primo luogo fare clic destro sullo strumento di selezione di riga nell'interfaccia ImageJ per visualizzare opzioni per diverse linee; Clicca su 'Linea segmentata' sceglierlo dall'elenco. Con lo strumento '' linea segmentata selezionato, uso singola a sinistra click per disegnare una linea lungo l'asse di metà di un singolo ICC-DMP. Ogni singolo click sinistro risolverà la linea in quel particolare e la linea quindi può essere liberamente spostata ulteriormente a qualsiasi angolo desiderato. Quando la linea è completata, doppio click sinistro per fissare la linea al suo posto.
  18. Clicca 'Immagine' sulla barra degli strumenti ImageJ e scorrimento sopra 'Stack' e clicca sull'opzione 'Reslice'. Verrà visualizzata una finestra di popup; click sinistro sull'opzione per 'ruota di 90 gradi', questo sarà orientarsi linescan da sinistra a destra in modo che può essere calibrato e leggi contro il tempo sull'asse x, con spazio sull'asse y. Fare clic su 'OK' per creare la STM.
  19. L'intensità della STM verrà creata su una scala di grigi con Ca2 + segnali ad alta intensità mostrati come diversi gradi di bianco, grigio chiaro o bianco a seconda della loro intensità. Normalmente, il contrasto tra il linescan creato dovrà essere migliorato. Farlo cliccando su 'Auto' sul pop B & C casella.
  20. L'intensità della fluorescenza del linescan è presentato su STM dei valori dei pixel arbitrario. Al fine di misurare con precisione l'ampiezza del Ca2 + i segnali da STM, i valori di fluorescenza del STM (F) ora devono essere normalizzati. Utilizzando la funzione di "Selezione rettangolare" nell'interfaccia di ImageJ, disegnare un ROI su un'area di STM che Visualizza l'area più uniforme e meno intenso di fluorescenza (F0).
  21. Ripetere i passaggi presi a 3.11-3.12 per ottenere un valore medio (F0) dell'intensità entro il ROI selezionato e quindi selezionare l'intero STM da sinistra cliccando su 'Modifica-selezione-Seleziona tutti' dalla barra degli strumenti ImageJ.
  22. 'Processo' click sinistro sulla barra degli strumenti ImageJ e scorrere fino a 'Matematica'; cliccare a sinistra 'Divide' tra le opzioni rivelate. Nella finestra popup successiva, immettere il valore medio (F0) ottenuto dal passaggio 3.21. Al momento di dividere l'intero STM per (F0) la STM diventerà nero; risolvere il problema facendo clic su 'Auto' sulla B & C pop-up box. Il linescan è ora calibrato per ampiezza, con intensità di fluorescenza espressa come F/F0.
  23. La STM attualmente visualizzerà il numero di frame nello stack di TIFF sull'asse x e il numero di pixel che rappresentano la lunghezza della cella sull'asse y. Al fine di quantificare le informazioni spaziali e temporali da Ca2 + segnali, calibrare la STM per spazio e tempo. 'Image' cliccare a sinistra nella barra degli strumenti di ImageJ e sinistra fare clic su 'Proprietà'. Verrà visualizzata una finestra di popup. All'interno di questa finestra, immettere i valori appropriati per calibrare completamente la STM.
  24. Per 'Larghezza in Pixel', immettere la lunghezza del tempo che serve per catturare un singolo frame in pochi secondi. Per esempi, a 5 FPS, immettere un valore di 0,2, per 50 FPS immettere un valore di 0,02, per 33 FPS immettere un valore di 0,033 ecc. Per 'Altezza in Pixel', immettere quanti micron ogni rappresenta pixel (dipenderà l'obiettivo utilizzato e telecamera utilizzata per acquisizione). 'Voxel profondità' è lasciato a 1 prima di cliccare su 'OK'. Nessun altro parametro dovrà essere regolato all'interno della finestra.
    Nota: Dopo aver cliccato su 'OK', il STM sarà completamente calibrato per ampiezza, spazio e tempo. Ampiezza il STM si esprimerà come tempo0, F/F sull'asse x è espresso in secondi e spazio sull'asse y si esprimerà in μm (Figura 2B). Gli eventi di CA2 + su STM sono pronti per essere misurato, il STM calibrati possono anche essere salvati come immagine TIFF singola per analizzare in un secondo momento.
  25. ImageJ è un numero di costruito nella tabella di ricerca codice colore (LUTs) che può essere utilizzato per codice colore del STM. Applicare un costruito in LUT facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sulla barra di ImageJ sul percorso 'Immagine-Lookup Tables' e scegliere un LUT da applicare. LUTs su misura possa essere importato anche per la STM da sinistra cliccando sulla barra ImageJ sul percorso 'File-Import-LUT' e quindi selezionando il LUT per importare. Ad esempio la STM illustrato nella Figura 2 ha avuto il LUT personalizzato 'QUBPallete' (Queens University Belfast, UK) applicato ad esso, al codice dei colori caldi (rosso, arancione) come zone di Ca2 + fluorescenza intensa e colori freddi (nero, blu) come zone di basso Ca2 + fluorescenza.
  26. Per inserire una barra di calibrazione di ampiezza per indicare l'intervallo delle ampiezze rappresentato dai vari colori, a sinistra fare clic su 'Analizzare' dalla barra degli strumenti ImageJ, scorrere fino a 'Strumenti' e selezionare 'Barra di calibrazione' dal menu rivelato. Opzioni sono date per dimensioni, zoom, gamma e posizione su STM per la barra di calibrazione; regolare queste impostazioni come desiderato e fare clic su 'OK'. Si noti che quando viene inserita la barra di calibrazione, ImageJ crea un nuovo STM contenenti esso, lasciando la versione originale senza la barra di calibrazione intatta e separata.
    Nota: Se quando si inserisce la barra di calibrazione, è contrassegnare la casella 'Overlay', un nuovo STM non verrà generato.
  27. Per iniziare l'analisi di singoli Ca2 + eventi, click sinistro sul selettore della 'Linea retta' sull'interfaccia ImageJ. Da inizialmente sinistra cliccando sulla STM, disegnare una linea retta orizzontale attraverso il centro di un evento di Ca2 + parallela all'asse x (contro il tempo). Completano la linea facendo clic con il pulsante sinistro del mouse su una seconda volta (Figura 2D).
  28. Fare clic su 'Analizzare' sulla barra degli strumenti ImageJ e cliccare a sinistra su 'Tracciare il profilo'. Con il profilo di trama dell'evento Ca2 + (Figura 2E) verrà visualizzata una nuova finestra.
    Nota: L'opzione 'Lista' all'interno di questa casella verrà generato un elenco di valori XY della trama generato, che può essere copiato in un programma di foglio di calcolo per creare tracce se lo si desidera.
  29. Per misurare l'ampiezza dell'evento Ca2 + rappresentato nel profilo del terreno, click sinistro sul selettore della 'Linea retta' sull'interfaccia ImageJ. Quindi, disegnare una linea verticale dalla linea di base del profilo trama al picco dell'evento Ca2 + ; la lunghezza della linea (visualizzata nell'interfaccia di ImageJ) rappresenterà l'ampiezza dell'evento espressa come ΔF/F0 (Figura 2E).
  30. Utilizzando il valore di ampiezza acquisita, la durata dell'evento di Ca2 + può essere misurata disegnando una linea retta su tutta la larghezza dell'evento al punto di ampiezza massima del 50% (durata completa a metà ampiezza massima, FDHM) o l'intera durata dell'evento può essere misurato se desiderato (Figura 2E).
    Nota: Gli sperimentatori saranno necessario progettare un criterio specifico per soglia Ca2 + eventi validi in queste registrazioni. Nei nostri esperimenti, gli eventi di Ca2 + sono stati indicati come valide per l'analisi se la sua ampiezza era > 15% dell'evento ampiezza massima nella sezione controllo di registrazione. Tuttavia, queste soglie dipenderà molto specifici tessuti e cellule sotto studiano e sono solo linee guida arbitrarie che richiedono ottimizzazione specifica per ogni tipo di tessuti e cellule.
  31. Tracciando una linea lungo la salita o la discesa del Ca2 + evento trama profilo, il tasso di aumento o una diminuzione può essere calcolato di conseguenza. Dopo aver disegnata la linea, il cursore del mouse può essere spostato al punto dove la linea comincia e dove finisce. Quando il cursore è stazionario su questi punti, coordinate x e y per questa posizione apparirà in basso a sinistra dell'interfaccia ImageJ. Così, con l'acquisizione di x, y i valori per cui la linea comincia (x1, y1) e termina (x2, y2), il tasso di aumento o una diminuzione (ΔF/s) può essere calcolato come la pendenza della linea, y2 - y1 / x2 -1 (Figura 2F ).
  32. Al fine di calcolare la propagazione o la distribuzione spaziale di un evento di Ca2 + , click sinistro sul selettore della 'Linea retta' sull'interfaccia ImageJ. Quindi, disegnare una linea retta verticale lungo la lunghezza dell'evento Ca2 + lungo l'asse y. La lunghezza della linea (visualizzata nell'interfaccia di ImageJ) rappresenterà la diffusione spaziale dell'evento espresso in μm (Figura 2).
  33. Determinare la velocità di un evento di Ca2 + moltiplicazione disegna una linea lungo il fronte di propagazione dell'evento e calcolando la pendenza della retta. Questo può essere eseguito manualmente in modo simile descritto nel passaggio 3,32, determinando i valori di y per dove inizia la riga x, (x1, y1) e termina (x2, y2); questi valori apparirà in basso a sinistra dell'interfaccia ImageJ quando il cursore del mouse si trova sulla STM.
  34. Al momento della raccolta dei parametri desiderati per quantificazione Ca2 + evento, piscina questi media valori per generare i valori medi per ogni parametro su una base per cella; in alternativa, inserire tutti i valori non elaborati in un istogramma di distribuzione per mostrare la loro gamma (Figura 2 H).

4. quantificazione del CTCs in particelle utilizzando ICC-la mia base di analisi

  1. Prima di analizzare il film in volumetria con PTCLs, la calibrazione spaziale e temporale del film dovrà essere inserito il nome del file. Modificare tutti i file da analizzare nella volumetria per contenere all'interno del titolo, il numero di secondi che ogni fotogramma è uguale e anche il numero di micron che ogni pixel è uguale a separate da un trattino singolo, con i valori racchiusi tra parentesi quadre. Ad esempio, un filmato acquisito a 33 FPS con un obiettivo 60x (512x512) dovrebbe avere [0.22 – 0,033] inserito nel relativo nome file.
  2. Volumetria di aprire e utilizzare il clic destro del mouse per aprire cartelle contenenti file di film. Click sinistro sul file film da analizzare per aprirlo in volumetria (Figura 3A, deve essere in formato TIFF non compresso).
  3. Al fine di calcolare con precisione il Ca2 + segnali dal FOV intero, il film subirà prima differenziazione e levigante per rimuovere interferenze (rumore di macchina fotografica, fluorescenza auto ecc.) e aumentare il rapporto segnale-rumore. Nella finestra del filmato, fare clic destro per far apparire un menu e utilizzando accesso clic destro ' STK filtro-differenziano ', fare clic destro nuovamente per immettere un valore per differenziare, premere invio e click sinistro per applicare (per filmati acquisiti a 33 FPS un valore di 2 (∆ t = ± 66-70 msec) funziona bene, il valore è aumentato come il tasso di immagine acquisizione aumenta).
    Nota: Differenziazione in questo contesto ridurrà l'intensità delle zone di registrazione (pixel) che non mostrano alcuna attività dinamica sopra il numero di frame specificato. Così, se viene inserito un valore di '2', ogni pixel in ogni fotogramma della registrazione viene analizzato e se all'interno del riquadro non c'è nessun cambiamento dinamico in pixel fluorescenza 1 fotogramma prima e 1 dopo, l'intensità all'interno di quei pixel verrà sottratta dalla registrazione. Quindi, viene rimosso il rumore di fondo non dinamica e segnale al rumore è aumentato.
  4. Liscio il film differenziato applicando un filtro gaussiano. Fare clic con il pulsante destro nella finestra del filmato per far apparire un menu e utilizzando clic destro accesso 'STK filtro-Gauss KRNL', a destra clicca di nuovo per inserire un valore (utilizzare sempre un numero dispari, per i filmati acquisiti a 33 FPS, un valore di 5 funziona bene, 1,5 x 1,5 µm StdDev 1.0) un valore di input, premere invio e click sinistro per applicare (Figura 3B).
  5. Iniziare a creare PTCLs selezionando prima un periodo del filmato che include un periodo tranquillo (20 – 40 fotogrammi) seguito dalla comparsa di un CTC e anche 20 – 40 fotogrammi dopo il CTC. A tale scopo, scorrere il filmato utilizzando il MMB per scorrere verso sinistra a destra sulla barra gialla.
  6. Con la selezione effettuata, uso facendo clic nella finestra del filmato per accedere 'STK Ops – rampa DS PTCLinfo' e click sinistro per applicare. Questa funzione esegue una routine di analisi PTCL che rampe progressivamente la soglia da intensità massima alla minima intensità. Questo verrà visualizzato graficamente nella finestra del grafico, come un terreno di rumore e anche nella finestra tracce come tre tracce colorate, con la traccia verde mostrando il numero di PTCLs, la traccia di rossa con dimensione media PTCL e la traccia blu che mostra l'intensità assoluta soglia.
    Nota: Il numero e dimensione media del PTCLs ad ogni soglia viene calcolata automaticamente e quindi una soglia semi-manuale viene applicata utilizzando l'intensità con cui a che la dimensione media del PTCLs inizia a scendere, che si verifica nel punto di flesso della traccia rossa in la finestra di traccia (Figura 3D, ad esempio a causa di un numero elevato di spazialmente limitata rumorosità PTCLs riducendo le dimensioni medie di PTCLs).
  7. All'interno della finestra di stampa, premere 'H' per equilibrio istogramma il grafico mostrato di rumore PTCL. Ciclo attraverso combinazioni di colori premendo ' [' fino a quando lo sfondo è bianco colorato con tracce colorate sulla parte superiore.
  8. Premere 'F' per far apparire uno strumento di misura e click sinistro sulla trama all'incrocio dove le trame colorate spostano sul lato destro. Questo segnerà una singola linea verticale nella barra di scorrimento della finestra tracce qui sotto.
  9. All'interno della finestra di traccia, scorrere MMB sinistra a destra dal punto di flesso di rosso traccia fino a quando la linea verticale bianca tracciata creato nel passaggio 4.10 e assicurandosi che la traccia blu è selezionata facendo clic con il pulsante destro del mouse su di esso, leggere il 'yAVG' che verrà visualizzato in t Egli inferiore lato sinistro della finestra di tracce. Deselezionate la selezione premendo il MMB una volta all'interno della finestra di tracce.
  10. All'interno della finestra del filmato, premere 'c' per portare su una rotella di colore, quindi premere ' regolazione soglia. PTCLs valido verrà ora indicato come rosso nella finestra del filmato (Figura 3) e quelli che saturano sarà bianco. Rimuovere le aree bianche di scorrimento verso l'alto con il tasto sinistro del mouse.
  11. Scorrere verso l'alto o verso il basso con il MMB per regolare il valore numerico giallo nella ruota dei colori, regolare questo valore per il valore di yAVG preso da passo 4.11. Questo assegnerà tutto in rosso come un attivo Ca2 + transitoria PTCL presso il punto di soglia determinata. Per salvare questo come un file di coordinate della particella di base, destro del mouse, utilizzo di accesso ' STK 3D-Save PTCLS 0' e poi a sinistra clicca per salvare il file.
  12. Volumetria di chiudere e riaprire. Aprire il file PTCL (file. GPF) creato nel passaggio 4,13. In questo tipo di file, tutti attivi Ca2 + transienti vengono salvati come un PTCL blu uniforme (Figura 3E). Come ogni PTCL è un'entità individuale con il proprio ID, area e perimetro coordinate, flag di stato (Vedi sotto) e matrici di risultato, l'analisi delle caratteristiche spazio-temporali del PTCLs, o tra PTCLs è snella.
  13. Per iniziare l'analisi PTCLs, rimuovere qualsiasi rumore PTCL rimanenti (piccolo PTCLs non valido creato quando viene generato il file. GPF) utilizzando clic destro nella finestra del filmato per accedere ' PTCL STKOPS-bandiera ptcls > Min = 70' e click sinistro per applicare. Questa azione verrà flag PTCLs maggiore di 6 µm2 (~ diametro > 2 µm) e volumetria li assegnerà a 'Bandiera 1' selezione. Quando questo è completo, PTCLs che superano questa soglia (Bandiera 1) apparirà come un colore viola chiaro nella finestra del filmato, considerando che qualsiasi PTCLs sotto soglia rimarrà loro base colore blu (Figura 3F).
  14. Creare calore mappa rappresentazioni di attività PTCL utilizzando clic destro nella finestra del filmato per accedere ' PTCL STKops-StatMap Flag ='. Facendo clic destro su questo percorso finale, un'assegnazione di bandiera per analizzare possa essere inserita. Così, se desiderano quantificare i PTCLs assegnate a Contrassegno1, basta inserire '1', premere invio e poi a sinistra clicca per applicare. Questo genererà una mappa di calore mostrando la PTCLs totale per l'intera lunghezza della registrazione, con colori diversi che rappresentano occorrenza (%) in tutta la registrazione (Figura 3, colori caldi indicano caso aumentato in quella posizione).
  15. Salvare le mappe di calore facendo clic destro su di essi per accedere 'STM carico Salva - Salva STM come TIF' e quindi clic sinistro per salvare come TIFF.
  16. Quantificare i PTCL attività utilizzando clic destro nella finestra del filmato per accedere ' PTCL misura-PTCLStats STK =', facendo clic destro su questo percorso finale, può essere inserita un'assegnazione di bandiera per analizzare. Così, se desiderano quantificare i PTCLs assegnate a Contrassegno1, basta inserire '1', premere invio e poi a sinistra clicca per applicare. Questo genererà una serie di tracce nella finestra traccia.
  17. Volumetria per impostazione predefinita a sovrapporre le tracce PTCL generate nel passaggio 4,17 in cima a vicenda. Separarli utilizzando facendo clic nella finestra di traccia per accedere a 'Align-separi traccia' e click sinistro per applicare. Questo rivelerà le quattro diverse tracce PTCL che quantificano il Ca2 + attività PTCL nel film mostrando PTCL zona (verde), conte PTCL (rosso), dimensione PTCL (ciano) e PTCL dimensioni deviazione standard (blu) tramato contro il tempo (Figura 3 H).
  18. Queste tracce possono essere salvate come un file di testo che può essere importato in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Per salvare le tracce, tenete premuto MAIUSC e utilizzare facendo clic nella finestra di traccia per accedere 'Assortiti-Dump ROI come testo' e click sinistro per salvare il file. Queste informazioni sono quindi raccolti e illustrate in istogrammi o altre rappresentazioni grafiche adeguate (Figura 3 H).
  19. Al fine di guardare l'avvenimento iniziale di PTCLs (cioè, a guardare siti di infornamento), questi PTCLs iniziale è stato dato incarico una bandiera diversa. Per meglio isolare siti di infornamento che si verificano all'interno della rete, solo quelli PTCLs che non si sovrapponevano con eventuali particelle nel fotogramma precedente, ma si sovrappongono con particelle nel successivo 70 ms sono considerati siti di infornamento.
  20. Per applicare questa soglia, uso facendo clic nella finestra del filmato per accedere a ' PTCL comportamento-F1 InitSites > F = 3' e sinistra fare clic per applicare. Questo assegnerà avviando PTCLs come 'Bandiera 3' e PTCLs che soddisfano questo criterio verrà visualizzato come un colore verde lime nel film (Figura 4A).
  21. Volumetria offre anche la capacità di quantificare e tracciare il numero di siti di infornamento PTCL in un determinato FOV, nonché tracciare la loro probabilità di accendersi durante un CTC. Per analizzare questi parametri, creare una mappa di calore di inizio PTCLs (Bandiera 3) come descritto nel passaggio 4,16 (Figura 4B).
  22. Cliccare a sinistra nella finestra Stampa e poi premere "C" per far apparire una ruota dei colori e la stampa sarebbe ' alla soglia. La mappa di calore di inizio PTCLs volontà quindi Disabilita grigio e bianco. Rimuovi tutto bianco di scorrimento verso l'alto con il tasto sinistro del mouse e la soglia PTCLs nella mappa del calore così che solo valido PTCLs sono coperti in grigio (regolare la soglia mediante lo scorrimento su e giù con il MMB).
  23. Uso destro del mouse sopra la mappa di calore nella finestra Plot per accedere 'STM PTCLs-trovare PTCLs 70' e click sinistro per applicare. Questo assegna tutti i PTCLs grigio nella mappa che sono superiori ai 70 pixel2 dimensioni da destinare come un'iniziazione di diverso colore codificato PTCL o PTCL cottura sito (Figura 4).
  24. Tracciare l'attività di ciascuno di questi siti di infornamento contro tempo cliccando col tasto destro del mouse sui PTCL sparando mappa e l'accesso a 'STM PTCLs-creare PTCL rois' e tasto sinistro del mouse per applicare. Questo genererà una nuova immagine nella finestra del filmato con tutti il separato PTCL colorate sparando siti visualizzati con un ROI intorno a loro.
  25. Destro del mouse nella finestra del filmato per accedere, uso ' PTCL misura-PTCLpixROIBM > = 1' e click sinistro per applicare. Questo identificherà tutte le ROIs nella finestra del filmato che contengono almeno un PTCL e consente di tracciare tutte le attività all'interno di questi ROIs nella finestra tracce. Per impostazione predefinita, queste tracce verranno sovrapposti uno su altro. Per separarle, uso destro del mouse nella finestra di traccia per accedere a 'Align-separi traccia' e click sinistro per applicare. Per salvare le tracce, tenete premuto MAIUSC e utilizzare facendo clic nella finestra di traccia per accedere 'Assortiti-Dump ROI come testo' e click sinistro per salvare il file.
  26. L'attività di ogni sito di cottura possa essere tracciato anche come una mappa di ricorrenza. Per effettuare questa operazione, utilizzare facendo clic nella finestra del filmato per accedere a ' PTCL misura-ROI Pianola = 10' e click sinistro per applicare. Questo genererà un complotto di tutti i siti di infornamento contro il tempo nella finestra del grafico. Ogni sito di cottura verrà visualizzato come un'entità separatamente colorata, ciascuno in una propria 'lane' e queste trame corrispondono a Ca2 + PTCLs avvio durante CTCs (Figura 4E) risparmia queste mappe di occorrenza cliccando col tasto destro del mouse su di essi per accedere ' STM Carico Salva - STM di salvare come TIF ' e facendo clic a sinistra per salvare come TIFF.
  27. Per quantificare la probabilità di sparare a ogni sito di infornamento durante un CTC, uso facendo clic nella finestra del filmato per accedere a ' PTCL comportamento-Mark è = 1' e click sinistro per applicare. Questo identificherà tutti i fotogrammi del film che contengono PTCLs sopra soglia e questi saranno contrassegnati come linee blu verticali nella parte inferiore della finestra del filmato.
  28. CTCs si manifestano come clustering rapida di infornamento asincrona da più siti di cottura entro il campo visivo con le lacune di s ~ 1 tra ogni ciclo CTC. Questa regolarità e spacco lungo di nessun PTCLs attivo tra CTCs è usato più ulteriormente per definire un CTC per l'analisi.
  29. Uso destro del mouse nella finestra del filmato per accedere a ' Gap PTCL comportamento-Block è < =' e utilizzare un click destro sul punto finale per immettere un numero. Questo comando raggrupperà le cornici PTCL attive identificate nel passaggio 4,28 in blocchi e blocchi sono basati sul numero di fotogrammi che separano PTCLs attivo. Per le registrazioni di 33 FPS ad esempio, un valore di 10 funziona bene. Se attivo PTCLS sono meno di 10 fotogrammi a pezzi (330 ms) sono raggruppati in un unico blocco per l'analisi (i blocchi vengono visualizzati come rettangoli rosa sopra le linee blue verticali nella parte inferiore della finestra del filmato, con ogni rettangolo rosa ora che indica un CTC).
  30. Uso facendo clic nella finestra del filmato per accedere 'PTCL misura-PTCL evento Prob'. Questo genererà un file di testo che può essere importato in un foglio di calcolo. Questo file di testo fornirà una vasta quantità di dati sulla natura dei siti di iniziazione che sono stati definiti da passaggi 4,16 – 4,23 e il loro contributo per CTCs.
    Nota: Il file di testo mostrerà il numero di siti di iniziazione (denominato 'domini'), la dimensione del sito in pixel e μm2, probabilità di ogni sito di inizio della cottura sia una volta o più volte durante ogni CTC (dato un %), la durata media e dimensioni di PTCLs che si verificano in quel sito di iniziazione, il numero di cicli CTC (come definito nel passo 4,23) e la percentuale di siti di infornamento che licenziato durante ogni ciclo CTC. Queste informazioni sono raccolte e illustrate in istogrammi o altre rappresentazioni grafiche adeguate (Figura 4F).

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Representative Results

Utilizzando topi Kit-Cre-GCaMP6F (Figura 1), dinamica Ca2 + segnalazione di comportamenti di ICC nel tratto gastrointestinale possono essere imaged in situ. Con la microscopia confocale, immagini ad alta risoluzione di specifiche popolazioni di ICC possono essere acquisite senza contaminare i segnali provenienti da altre popolazioni di ICC all'interno del tessuto stesso, ma in anatomicamente distinti piani di messa a fuoco (Figura 2A)37 , 39 , 40 , 41. è possibile registrare brevi (< 100 ms), localizzato eventi Ca2 + che non erano possibili conmembrana permeabili Ca 2 + indicatori. Spazio-temporali mapping con volumetria o ImageJ software può essere utilizzato per generare STMs di tutti gli eventi all'interno delle cellule in situ Ca2 + . Utilizzando questo approccio, gli eventi di Ca2 + in un FOV intero possono essere fruiti e mappato (Figura 2BC), piuttosto che solo registrando l'attività limitata di un singolo ROI. Questi metodi possono essere estesa a ogni cella all'interno di un determinato FOV, assicurando raccolta di dati rappresentativi da tutte le cellule e fornire informazioni quantitative sulla relative ampiezze, durate transitorie, tasso di aumento e la caduta di transienti, ecc (Figura 2E , F). Analisi STM, al contrario di trame basate su ROI intensità, fornisce inoltre la possibilità di monitorare e registrare caratteristiche spaziali di Ca2 + segnalazione, come diffusione spaziale e velocità di propagazione, come mostrato in Figura 2. Questa informazione può essere accumulata per fornire una visione piuttosto completa di Ca2 + segnalazione di comportamenti in cellule nei loro ambienti nativi (Figura 2 H).

PTCL analisi può essere usata per quantificare più complesso Ca2 + segnalazione di comportamenti, come quelli che si verificano all'interno di reti cellulari interconnessione. Un esempio di questa applicazione è fornito dall'analisi eseguita su ICC-MY (Figura 3A). Di solito in tali preparazioni complesse, rumore di fondo e segnale di rumore può essere un problema. Tuttavia, utilizzando il software di volumetria per applicare filtri differenziali e levigante su film di attività di Ca2 + e quindi applicando protocolli di soglia di rumore per filtrare i rumori di fondo di rumore (Figura 3B-D) può essere rimosso dal complesso registrazioni di attività dinamica. Usando l'analisi di PTCL come quelli mostrati in Figura 3E-G, informazioni quantitative sulla Ca2 + segnalazione può essere calcolata misurando la zona PTCL, conteggio PTCL e dimensione PTCL che indicano gli intervalli spaziali dell'attivazione di Ca2 + segnali di un FOV. Questi dati possono essere compilati come illustrato nella Figura 3 H e analizzati statisticamente, come appropriato. La figura 4 illustra come PTCL analisi permette nella quantificazione di profondità di sub-cellulare Ca2 + segnalazione esaminando la posizione e le probabilità di Ca2 + siti di infornamento di infornamento. Allocando PTCLs in bandiere diverse in base alle loro caratteristiche temporali, avviando PTCLs possa essere accuratamente mappato come mostrato in Figura 4-E e una ricchezza di dati acquisiti sul numero di siti di iniziazione (indicato come ' domini), la dimensione del sito in pixel e µm2, probabilità di ogni iniziazione sito infornamento sia una volta o più volte durante ogni CTC (dato un %), la durata media e dimensioni di PTCLs che si verificano presso il sito di iniziazione, il numero di CTC cicli (come definito nel passaggio 4,23) e la % di siti di infornamento che licenziato durante ogni ciclo CTC. Queste tecniche permettono un elevato livello di data mining e quantificazione di in situ Ca2 + segnali che si verificano all'interno di una rete cellulare intatta che non sono possibili con analisi ROI-basate.

Figure 1
Figura 1: generazione di topi KitGCaMP6f. Diagramma schematico di come Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (topi GCaMP6f) furono incrociati con c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre topi) per generare topi Kit-Cre-GCaMP6f. Questi topi sono iniettati con tamoxifene all'età di 6-8 settimane per indurre la Cre ricombinasi e successive GCaMP6f espressione esclusivamente in ICC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi di stocastico Ca2 + segnali in ICC-DMP usando la mappatura spazio-temporale (STM). (A) immagine rappresentativa di ICC-DMP diversi dall'intestino tenue di un mouse Kit-Cre-GCaMP6F in situ. Un ROI verde indica la dimensione e l'orientamento del ROI per disegnare intorno un singolo ICC-DMP entro il campo visivo per creare un STM in volumetria. (B), STM del Ca2 + attività in ICC-DMP evidenziati in pannello A dopo che è stato calibrato correttamente per ampiezza, spazio e tempo. (C) la stessa STM mostrato nel pannello B dopo esso è stato colore codificato con una tabella di ricerca (QUBPallete). (D) immagine espansa di ICC-DMP Ca2 + transienti visualizzata su un colore codificato STM, che indica dove tracciare una linea attraverso un evento di Ca2 + attraverso il suo asse di tempo (x) per creare un profilo di trama della sua attività in ImageJ. Trama (E) profilo di evento di Ca2 + evidenziato nel pannello D, che indica dove linee mostrati essere disegnata per misurare con precisione l'ampiezza e la durata dell'evento. Trama (F) profilo di evento di Ca2 + evidenziato nel pannello D, che indica dove linee mostrati essere disegnata per misurare con precisione il tasso di aumento e tasso di caduta dell'evento. (G) immagine espansa di ICC-DMP Ca2 + transienti visualizzata su un colore codificato STM, che indica dove tracciare una linea attraverso un evento di Ca2 + attraverso il suo asse di spazio (y) per misurare con precisione la sua diffusione spaziale. (H) rappresentante istogrammi dei dati riuniti da ICC-DMP che illustra come visualizzare graficamente l'ampiezza, la durata e la diffusione spaziale valori acquisiti dalla procedura sopra riportata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: quantificazione del CTCs in ICC-MY utilizzando analisi basata sulla particella. (A) immagine rappresentativa di una rete ICC-MY dal piccolo intestino di un mouse Kit-Cre-GCaMP6F in situ. (B) immagine prelevati dalla registrazione mostrata nel pannello A dopo aver subito un filtro differenziale di Δt = ±66 – 70 ms e un filtro gaussiano di 1,5 x 1,5 µm, StdDev 1.0. (C) immagine tratta dal video in B dopo la soglia è stata completata con PTCLs sopra soglia indicata in rosso. (D) tracce di PTCL contare e dire dimensione PTCL in un protocollo di soglia per eliminare il rumore nel film mostrato nel pannello B. PTCLs sono stati creati utilizzando un algoritmo di riempimento che ha segnato la struttura di tutti i pixel adiacenti che hanno avute intensità sopra soglia, Ca 2 + PTCLs transitoria erano più grandi di rumore PTCLs. La soglia in cui un numero elevato di piccole dimensioni rumore PTCLs è emerso e ha cominciato a ridurre la dimensione media del PTCLs utilizzabile come una soglia comune per tutte le registrazioni. (E) immagine rappresentativa dal basati su coordinate Ca2 + PTCL file creato dalla registrazione con soglia in immagine rappresentativa di C. (F) tratto dal file PTCL di E dopo un test di verifica di screening di > 6 µm2 (diametro ~ 2 µm o più piccolo) è stato applicato; PTCLs sopra questo limite sono contrassegnati (Bandiera 1) come particelle di luce viola e considerato valido PTCLs. (G) calore mappa, mostrando la totale PTCLs (Bandiera 1) per l'intera registrazione del video mostrato nel pannello F, con totale PTCLs relazione al sommate con colori che rappresentano avvenimento in tutta la registrazione (colori caldi indicano caso aumentato in quella posizione). (H) tracce rappresentante di area PTCL (blu) e PTCL count (rosso) derivato dal file PTCL creato nel pannello A-G. Gli istogrammi rappresentativi dei dati riuniti da diversi esperimenti sono riportati di seguito le tracce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Analisi del Ca2 + cottura siti in ICC-MY utilizzando analisi basata sulla particella. (A) immagine rappresentativa prelevati dal file di PTCL di Figura 3E dopo bandiera 1 PTCLS ulteriormente raffinati in bandiera 3, lo stato di bandiera per Ca2 + siti di infornamento. Bandiera 3 PTCLs vengono visualizzati come verde lime (solo quelli PTCLs che non si sovrapponevano con eventuali particelle nel fotogramma precedente, ma si sovrappongono con particelle nel successivo 70 ms sono stati considerati siti di cottura). (B) calore mappa che mostra il totale PTCLs (Bandiera 3) per l'intera registrazione del video mostrato nel pannello A, con totale PTCLs ha riassunto con colori che rappresentano occorrenza durante la registrazione (colori caldi indicano caso aumentato in quella posizione). (C) mappa rappresentativa di Ca2 + cottura siti visualizzati nel pannello che b, con ogni sito di cottura differenti assegnati un colore di identificazione diverso. (D) tracce rappresentante di area PTCL (blu) e PTCL contano (rosse) derivato dal file PTCL creato in Figura 3A-G. (E) una mappa di ricorrenza dell'attività di cottura individuali siti. Ogni sito di cottura entro il campo visivo viene visualizzata come un blocco colorato in una propria 'lane' contro il tempo. (F) istogrammi rappresentativi dei dati riuniti da diversi esperimenti sono mostrati che illustrano valori accumulandosi per Ca2 + cottura probabilità di infornamento del sito / siti in un FOV di infornamento del CTC e il numero di Ca2 + . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

CA2 + imaging di tipi specifici di cellule all'interno dei tessuti intatti o all'interno di reti di cellule spesso rivela complessi pattern di transitori di Ca2 + . Questa attività richiede un'attenta e approfondite analisi e quantificazione di catturare quante più informazioni possibili sugli eventi sottostanti e la cinetica di questi eventi. STM e analisi PTCL offrono l'opportunità di massimizzare la quantità di dati quantitativi risultanti dalle registrazioni di questo tipo.

La stretta, morfologia fusiformi di ICC-DMP renderli adatto all'analisi STM derivato da STMs sopra indicate. Tuttavia, questa analisi non è adatta a ICC-MY che sono stellari a forma e collegati in rete (Figura 3A). Inoltre, i Ca2 + segnalazione modelli in ICC-MY sono più complessi, che si manifesta come moltiplicazione CTCs da più siti di origine in tutta la rete ICC-MY. Così, al fine di quantificare l'attività che si verificano nell'intera rete ICC-MY entro un FOV, analisi delle particelle (PTCL) è stato implementato utilizzando software personalizzato fatto (volumetria, versione G8d, GWH, operabile su Mac OS, contattare Grant Hennig grant.hennig@med.uvm.edu per quanto riguarda richieste per volumetria accesso e uso).

Analisi STM consente tutti Ca2 + gli eventi all'interno delle singole cellule e all'interno di tutte le celle in un FOV per essere analizzati criticamente tutta una serie di parametri spaziali e temporali. Il protocollo descritto di seguito viene illustrato come queste tecniche possono essere applicate a ICC-DMP dell'intestino tenue del mouse. Quantificando completamente Ca2 + segnalazione in ICC-DMP, come mostrato nella Figura 2B-G, Ca2 + segnalazione modelli sono state caratterizzate in dettaglio37. Queste analisi sono state applicate alle registrazioni dove ICC-DMP sottoposti a interventi di finemente quantificare gli effetti di blocco o stimolando il rilascio di Ca2 + / afflusso di Ca2 + / neurotrasmissione vie37,39 , 40 , 41. queste tecniche possono essere facilmente applicate ad altre preparazioni di tessuto intatto. Ad esempio, analisi STM come descritto qui sono stato utilizzato per identificare nuovi meccanicistico pathways coinvolti nella generazione di intracellulare Ca2 + onde registrata nel muscolo liscio uretra in situ57.

La preparazione di STM in volumetria richiede una certa cautela, come la funzione in volumetria che crea la STM dal ROI disegnato (Figura 2A) è un valore medio di intensità. Così, l'ampiezza del Ca2 + segnali potrebbe potenzialmente essere diluito se il ROI è disegnato più ampio o più a lungo il Ca2 + evento o cella di interesse. Così, gli utenti dovrebbero essere attenti a disegnare ROIs che sono come strettamente montaggio possibile a Ca2 + segnali o cella particolare che si sta analizzando per alleviare questo problema. Allo stesso modo, creando STMS utilizzando scansioni singolo pixel in ImageJ significa che accurata mappatura di eventi di Ca2 + è soggetto alla vicinanza del segnale Ca2 + alla linea disegnata. Tali preoccupazioni sono minori in cellule come ICC-DMP fusiformi sottile, tuttavia tipi di altre cellule con una morfologia più stellare o rotonda può rendere questo tipo di analisi inappropriato mappare tutti i Ca2 + segnali con precisione. Durante la preparazione STMs per analisi, indipendentemente dal fatto se sono state fatte in volumetria o con scansioni ImageJ, ci sono alcune aree da mettere in evidenza per la risoluzione dei problemi. È importante modificare la qualità dell'immagine a 32 bit prima di eseguire alcuna operazione di taratura sul STMs. fallimento di farlo, o farlo dopo calibrazione per F/F0 può portare a misurazioni incoerente attraverso esperimenti. Controllare sempre la qualità dell'immagine di STM, che è riportata nella parte superiore del bordo bianco di STM sé quando aperto con ImageJ. Un'altra area potenziale di incoerenza sta selezionando il valore di0 F durante la calibrazione per ampiezza. È fondamentale che per la selezione della regione per F0, che si estende su una superficie della cella che è uniforme e messo a fuoco. Per questo motivo, aree della cellula che hanno una fluorescenza basale instabile o che cambiare a causa di movimento o altri manufatti non sono ideali e rigoroso movimento stabilizzazione protocolli dovrebbero essere impiegati in questi casi.

All'interno di preparazioni in situ o coltivate contenenti interconnesse reti cellulari, come ICC-MY nell'analisi piccolo intestino, PTCL fornisce una tecnica semplificata per quantificare complessi, subcellulari Ca2 + eventi che si verificano nella rete. Inoltre, permette anche di tutti gli eventi Ca2 + nella rete all'interno di un determinato FOV per essere analizzati, piuttosto che utilizzando ROIs arbitrario, che solo fornire informazioni sulla frequenza e intensità all'interno il ROI. Un vantaggio dell'analisi PTCL descritto qui è che applicando differenziale e gaussiana levigante filtri alle registrazioni, una grande quantità di rumore può essere rimosso dai film che possono contenere contaminanti luce dalle cellule non di interesse o a causa di non-dinamica punti luminosi o inclusioni. È importante notare che la quantità di differenziazione applicata alle registrazioni dipenderà in gran parte il tasso di acquisizione utilizzato dallo sperimentatore. Differenziando i film come descritto nel protocollo consente di applicare un filtro al film per rimuovere il rumore ad alta frequenza da registrazioni. Applicare un valore di differenziazione di '2', quando l'acquisizione a 33FPS funziona bene per rimuovere il rumore di fondo pur mantenendo il buon segnale al rumore (se il valore è troppo basso, rumore sarà prelevati ma segnale di rumore sarà compromessa se il valore è troppo alto). Il valore di differenziazione applicato deve essere aumentato con tassi più veloci di acquisizione, ad esempio a 100 FPS, un valore di differenziazione di '7' dà circa lo stesso segnale / rumore come un valore di '2' per una registrazione di 33FPS. Gli sperimentatori saranno necessario ottimizzare le impostazioni di conseguenza per la loro preparazione e condizioni di registrazione.

Il protocollo di soglia descritto in Figura 3D consente una procedura coerente soglia da applicare a diverse registrazioni effettuate su diversi sistemi con software di acquisizione diversi. Questa flessibilità permette di dati da più ricercatori lavorando su sistemi diversi per compilare le loro registrazioni nel DataSet stesso. Utilizzando il sistema di bandiera in volumetria, PTCL analisi permette la visualizzazione e la quantificazione dei singoli Ca2 + cottura siti all'interno di una rete in dettaglio. Informazioni possono essere raccolte sul numero di siti di iniziazione, la dimensione del sito in pixel e µm2e la durata media del PTCLs che si verificano in quel sito. Questa analisi PTCL consentito la prima caratterizzazione dell'attività CTC nel piccolo intestino a livello sub-cellulare e, utilizzando i diversi contrassegni in volumetria, PTCLs sia a livello di rete e cottura individuali livello di sito sono stati quantificati in tessuto intatto preparati da topi di Kit-Cre-GCaMP338. Da queste osservazioni iniziali, questa analisi è stata ulteriormente utilizzata per studiare romanzo Ca2 + afflusso vie in GI ICC-MY come archivio-operati-Ca2 +-voce42 e il ruolo di mitocondriale Ca2 + segnalazione su GI pacemaking 41. molto come analisi STM sopra descritto, PTCL analisi può essere facilmente adattato a diverse preparazioni intatte diversi da quelli descritti nel presente protocollo. Ad esempio, un recente studio usato PTCL analisi per studiare romanzo ritmica Ca2 + eventi che si verificano nelle reti cellulari intatte della lamina propria del ratto della vescica urinaria58,59 e così potrebbe essere facilmente applicato ai altri sistemi cellulari complesse, intatti come sistemi neuronali. Mentre questa carta si focalizzata su Ca2 + imaging in tessuti intatti con GECIs, queste tecniche di analisi possono essere eseguite anche su cellule isolate e tessuti caricati con tradizionale Ca2 + indicatore coloranti. L'analisi STM basata è stato utilizzato per quantificare correttamente localizzata Ca2 + segnali e Ca2 + onde dal mandrino a forma di cellule interstiziali e cellule di muscolo liscio da una varietà di preparazioni11,60 , 61 , 62 , 63. Inoltre, le routine di analisi PTCL descritte qui sono state applicate anche ai preparati in situ rete visualizzati con 520 Cal58,59. Tuttavia, questi studi anche mantengono gli svantaggi di tali tinture per protocolli quali l'identificazione di cella ambiguo e problemi con il segnale al rumore di caricamento.

Esempi illustrati sopra dimostrano che sia STM e PTCL analisi sono tecniche altamente malleabile che possono essere utilizzate per quantificare il complesso Ca2 + segnalazione in una vasta gamma di preparati di tessuto intatto. Gli approcci offrono molti vantaggi sopra ROI tradizionale basato su trame di intensità che sono stati regolarmente utilizzati in precedenza e dovrebbero fornire gli investigatori più preziose informazioni quantitative su Ca2 + segnalazione di quello che potrebbe essere raggiunto in precedenza.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Finanziamento è stato fornito da NIDDK, via P01 DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ImageJ software NIH 1.5a ImageJ software
Volumetry GWH Volumetry 8Gd Custom made analysis software
Isoflurane Baxter, Deerfield, IL, USA NDC 10019-360-60
Tamoxifen Sigma T5648
GCaMP6F mice Jackson Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice Gifted From Dr. Dieter Saur c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol Pharmco-Aaper SDA 2B-6

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