Produktion af Pseudotyped partikler at studere højpatogen coronavirus i biosikkerhed niveau 2 omgivelser

Immunology and Infection
 

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til at generere pseudotyped partikler i BSL-2 omgivelser indarbejde spike protein af højpatogene virus Mellemøsten respiratorisk syndrom og svær Akut respiratorisk syndrom coronavirus. Disse pseudotyped partikler indeholder et luciferase reporter gen giver mulighed for kvantificering af virus ibrugtagning vært målceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H. L., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protokollen har til formål at generere coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped partikler med en murine leukæmi virus (MLV) kerne og luciferase reporter, ved hjælp af en simpel Transfektion procedure i den alment tilgængelige HEK-293T celle linje. Når dannet og frigivet fra producent celler, indarbejde disse pseudovirions et luciferase reporter gen. Da de kun indeholder de heterolog coronavirus spike protein på deres overflade, partikler opfører sig som deres indfødte coronavirus modstykker for post trin. Som sådan, er de fremragende surrogater af indfødte virioner for at studere viral indrejse i værtsceller. Ved succesfuld løsning og infektion i target-cellerne, luciferase reporter bliver integreret i vært celle genom og udtrykkes. Ved hjælp af en simpel luciferase assay, kan transduced celler nemt kvantificeres. En vigtig fordel af proceduren er, at det kan udføres i biosikkerhed niveau 2 (BSL-2) faciliteter i stedet for BSL-3 faciliteter, der kræves for arbejde med højpatogen coronavirus som Mellemøsten luftvejssyndrom coronavirus (MERS-CoV) og Svær akut respiratorisk syndrom coronavirus (SARS-CoV). En anden fordel kommer fra sin alsidighed, så det kan anvendes til kuvert proteiner tilhører alle tre klasser af viral fusion proteiner, som klassen jeg influenza hemagglutinin (HA) og Ebola virus glycoprotein (GP), klasse II Semliki skov virus E1 protein, eller klasse III vesikulær stomatitis-virus G glycoprotein. En begrænsning af metoden er, at det kun kan sammenfatte virus post trin medieret af kuvert protein undersøges. For at studere andre virale livscyklus trin, er andre metoder nødvendige. Eksempler på de mange applikationer disse pseudotype partikler kan bruges i undersøgelse af vært celle modtagelighed og tropisme og test virkningerne af virus løsning hæmmere at dissekere viral entry veje anvendes.

Introduction

Værten celleindtastning udgør de indledende skridt viral smitsomme livscyklus. For kappebærende virus indebærer dette binding til en enkelt vært celle receptoren eller flere receptorer, efterfulgt af fusion af viral og cellulær membraner. Disse væsentlige funktioner udføres af virale kuvert glykoproteiner1,2. Coronavirus kuvert glycoprotein kaldes spike (S) protein og er medlem af klassen jeg viral fusion proteiner2,3,4,5,6. At studere virale kuvert glykoproteiner er afgørende for at forstå mange vigtige egenskaber af en given virus, såsom: livscyklus indledning, sin vært og cellulære tropisme, interspecies transmission, viral patogenese, samt vært celle løsning veje. Pseudotyped viruspartikler, også kaldet pseudovirions, er stærke værktøjer, der gør det muligt at nemt studere funktionen af viral fusion proteiner. Pseudotyped partikler eller pseudovirions er kimære virioner, der består af en surrogat viral kerne med en heterolog virale kuvert protein på deres overflade. Den protokol hovedformål er at vise, hvordan du anskaffer coronavirus spike pseudotyped partikler, der er baseret på en murine leukæmi virus (MLV) kerne og indeholder et luciferase reporter gen. Som eksempler, metoden til at producere pseudotyped partikler med spike proteiner af højpatogen svær Akut respiratorisk syndrom (SARS) og Mellemøsten luftvejssyndrom (MERS) coronavirus præsenteres. Protokollen beskriver proceduren Transfektion involveret, hvordan at inficere modtagelige target-celler, og smitteevne kvantificering af luciferase assay.

Da post trinene i pseudovirions er underlagt coronavirus S på deres overflade, Angiv de celler i en lignende måde til native modparter. Som sådan, er de fremragende surrogater af funktionelle smitteevne assays. Pseudotyped partikler er sædvanligvis udvundet fra forældrenes model vira som retrovira (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 og lentivirus human immundefektvirus – HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) eller rhabdoviruses (vesikulær stomatitis-virus-VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). når det bruges i pseudotyping, den parental virus genomer er blevet ændret for at fjerne væsentlige gener, gør dem defekte for varetagelse af en komplet replikering cyklus. Denne funktion tillader dem at blive brugt i mellemliggende biosikkerhed niveau faciliteter (BSL-2) og er en vigtig fordel over ved hjælp af højpatogen indfødte vira, der kræver højere biosikkerhed faciliteter (BSL-3, BSL-4, som ikke er så let tilgængelige) når gennemførelse af virus løsning undersøgelser. Her, S proteiner af risiko gruppe 3 patogener SARS-CoV og MERS-CoV bruges som eksempler på virale kuvert proteiner integreres i MLV pseudotyped partikler, generering af SARS-CoV S og MERS-CoV S pseudovirions (SARS-Spp og MERS-Spp, henholdsvis). Disse pseudovirions har held været anvendt i studier med fokus på post begivenheder af disse vira48,49,50,51. En anden fordel er at den teknik beskrevet her ikke er begrænset til pseudotyping coronavirus S proteiner: det er meget fleksibel og kan bruges til at inddrage repræsentanter for alle tre klasser af viral fusion proteiner. Eksempler kan nævnes influenza hemagglutinin (HA, klasse I)52, Ebola virus glycoprotein (GP klasse I), E1 protein alphavirus Semliki skov virus (SFV, klasse II), og VSV glycoprotein (G, klasse III)53. Derudover mere end en form for viral glycoprotein kan være co indarbejdet i en pseudotyped partikel, som i tilfælde af influenza HA- og NA - pseudotyped partikler51.

Baseret på arbejde udført af Bartosch et al.20, denne protokol beskriver generation af MLV pseudotyped partikler med en tre-plasmid Co Transfektion strategi ved hjælp af den alment tilgængelige og yderst Transfektion-kompetente HEK-293T celle linje 54. den første plasmid koder MLV core gener gag og pol men mangler MLV kuvert env genet. Den anden plasmid er en transfer vektor, der koder en firefly luciferase reporter gen, en MLV Ψ-RNA emballage signal, sammen med 5'- og 3'-flankerende MLV længe terminal repeat (LTR) regioner. Den tredje plasmid koder fusion protein af interesse, i dette tilfælde enten SARS-CoV S eller MERS-CoV S proteinet. Ved co Transfektion af de tre plasmider ved hjælp af en Transfektion reagens, får viral RNA og proteiner udtrykt i transfekteret celler giver generation af pseudotyped partikler. Da MLV bruges som pseudovirion rygrad, dette sker på plasmamembran: RNA'er indeholdende luciferase gen reporter og emballage signal få indkapslet i spirende partikler, der også omfatter plasma membran-udtrykt coronavirus spike proteiner. De partikler, der bud ud fra celler indeholder coronavirus S-protein på deres overflade og høstes til brug i smitteevne assays. Fordi pseudotyped partikler havnen coronavirus S protein og ikke MLV kuvert proteiner, når det bruges til at inficere celler, de opfører sig som deres indfødte coronavirus modstykker for post trin. Viral RNA indeholdende luciferase reporter og flankerende LTRs er derefter frigivet i cellen og retroviral polymerase aktiviteter aktiverer sin reverse transkription i DNA og integration i vært celle genom. Kvantificering af smitteevne af pseudotyped viruspartikler i inficerede celler er derefter udført med en simpel luciferase aktivitet assay. Fordi den DNA-sekvens, der bliver integreret i vært celle genom indeholder kun luciferase-genet, og ingen af MLV eller coronavirus protein-kodning gener, er de i sagens natur sikrere at bruge end replikationskompetente indfødte vira.

Ud over at være sikrere surrogater og meget fleksibel at tillade indarbejdelse af forskellige slags kuvert glykoproteiner, de pseudotyped partikler beskrevet her er også meget alsidige og kan bruges til at studere mange aspekter af virus løsning. Dette omfatter, men er ikke begrænset til: test vært celle modtagelighed over for virusinfektion, analysere den cellulære post veje et kappebærende virus bruger, at studere virkningerne af farmakologiske hæmmere og narkotika screeninger, gennemføre neutralisering antistof assays, kendetegner vært celleindtastning kappebærende virus, der ikke kan være kulturperler, og generere virale vektorer for gen levering, stabil cellulære udtryk af gener af interesse, eller genhæmning.

Protocol

1. celle Seeding for Pseudotyped partikel produktion

Bemærk: Udføre dette trin i biosikkerhed kabinet.

  1. Standard celle kultur teknikker, opnår en 80-90% sammenflydende 75 cm2 kolbe af HEK-293T/17 celler passaged i komplette Dulbecco er ændret Eagle's Medium (DMEM-C) med 10% (vol/vol) føtal bovin serum (FBS), 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 100 IE/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Forberede DMEM-T medium for transfections (dens sammensætning er den samme som DMEM-C men uden antibiotika).
  2. Vaske cellerne med 10 mL af pre varmede (37 ° C) Dulbecco phosphat bufferet saltvand (DPBS) to gange.
    Bemærk: Håndtere HEK293T/17 celler med omhu, da de nemt løsne.
  3. Opsug supernatanten og frigør celler med 1 mL 0,25% trypsin løsning pre varmes ved 37 ° C. Kolben celler ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 3−5 min, eller indtil celler begynder at afmonterer.
    Bemærk: Undgå inkubere celler med trypsin i mere end 5 min, da dette typisk fører til celle sammenklumpning.
  4. Deaktivere trypsin ved tilsætning af 4 mL af DMEM-C medium og tælle celler ved hjælp af en celle tælle dias og lysmikroskop.
    Bemærk: For at undgå at skulle tælle for mange celler, en yderligere fortynding skridt kan være påkrævet på forhånd. Husk at faktor i denne fortynding ved beregningen af den faktiske celle tæthed af trypsinized celler.
  5. Fortynd celler til 5 x 105 celler/mL med DMEM-C.
  6. Seed 6-godt vævskultur plade med 2 mL af celle løsning pr. brønd og forsigtigt flytte pladen frem og tilbage og side til side for at jævnt distribuere celler, undgå cirkelbevægelser.
    Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Jævnt fordelte celler vil sikre, at cellerne ikke klump i midten af brønde. Igen, dette sikrer god Transfektion effektivitetsgevinster og pseudotyped partikel produktion.
  7. Inkuber plade natten (16 – 18 h) i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator.

2. tre-plasmid Co Transfektion

Bemærk: Udføre dette trin i biosikkerhed kabinet.

  1. Observere celler under en inverteret lysmikroskop hen til indskrive nemlig den celle morfologi og tæthed.
    Bemærk: Ideelt set bør celle tæthed i rækken 40 – 60% confluency. Det er afgørende, at cellerne er hverken for sammenflydende (80−90% sammenflydende) heller ikke alt for tyndt fordelt (20−30% sammenflydende) i hver brønd. En celle tæthed af 40−60% confluency vil sikre en god pseudotyped partikler produktion.
  2. Plasmider mix
    1. Beregne plasmid blanding for hver konvolut glycoprotein efter mængder for et godt af en 6-godt plade vist i tabel 1. Multiplicer mængder, hvis transfecting flere brønde og inkluderer en ekstra godt for at undgå at køre af mix.
      Bemærk: SARS-CoV S og MERS-CoV S kodning plasmider, omfatter Tom vektor kontrol for generation af negativ kontrol partikler, som mangler virale kuvert glykoproteiner (Δenv partikler) sammen med en positiv kontrol glykoprotein som vesikulære stomatitis-virus (VSV) G glykoprotein, der vides at håndfast inficere en meget bred vifte af celler (VSV-Gpp). Plasmider er tilgængelige efter anmodning.
    2. Bland beregnede mængder af plasmider og reducerede serum cellekulturmedium (Se Tabel af materialer) i et microcentrifuge rør.
  3. Lipid-baserede Transfektion reagens blandes (Se Tabel af materialer)
    1. Beregne diskenheder for Transfektion reagens mix fra de mængder, der er vist i tabel 2 for et godt (1:3 Transfektion ratio, Multiplicer mængder efter behov). Omfatte ekstra wells for at undgå at køre af Transfektion reagens mix.
    2. Bland beregnede mængder af lipid-baserede Transfektion reagens (3 µL pr. brønd) og nedsat serum cellekulturmedium (47 µL pr. brønd) i et microcentrifuge rør, og sørg for at tilføje Transfektion reagens i nedsat serum cellekulturmedium og ikke anden vej i nærheden af.
  4. Inkuber begge blandinger (for et godt: 50 µL af plasmider mix og 50 µL af lipid-baserede Transfektion reagens blandes) særskilt for 5 min ved stuetemperatur.
  5. Tilsæt indholdet af Transfektion reagens mix til plasmider blandes i forholdet 1:1 (for 1 godt: 50 µL af hver mix)
  6. Udføre grundig op-ned Pipettering af den resulterende blanding.
  7. Inkuber mix i mindst 20 min. ved stuetemperatur.
  8. Opsug brugt mediet af celler.
  9. Tilføj forsigtigt 1 mL af pre varmede (37 ° C) reducerede serum cellekulturmedium pr. brønd.
  10. Tilføje dråbevis 100 µL af Transfektion mix til hver brønd.
    Bemærk: Udvise omhu, når du tilføjer Transfektion mix til wells af HEK-293T som de frigøre nemt.
  11. Inkuber celler i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator for 4-6 h.
  12. Der tilsættes 1 mL pr. brønd af pre varmede (37 ° C) DMEM-T medium, som ikke indeholder antibiotika
    Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Transfektion reagenser øge celle permeabilitet og øge følsomhed over for antibiotika. For at sikre god Transfektion effektivitet og pseudotyped partikel produktion, er det vigtigt at undgå at bruge cellekulturmedium indeholdende antibiotika
  13. Inkuber celler i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator for 48 h.

3. pseudotyped partikler samling

Bemærk: Udføre dette trin i biosikkerhed kabinet.

  1. Observere celler under inverteret lysmikroskop at tjekke for celle morfologi og almentilstand. Også kontrollere farven på det medie, der skal være lys pink/lidt orange.
    Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Hvis der er for meget celledød, tilknyttet Transfektion eller medium farve vendte orange/gul (sure pH), vil det typisk være forbundet med lavere udbytter i smitsomme pseudotyped partikler
  2. Overfør supernatanter af transfekteret celler til 50 mL konisk centrifugeglas.
  3. Der centrifugeres rør på 290 x g i 7 min til at fjerne celle debris.
  4. Filtrer klarede analysere gennem et filter, sterile 0,45 µm pore-størrelse.
  5. Gøre lille volumen delprøver (e.g., 500 µL eller 1 mL) af pseudotyped virus løsning i cryovials.
  6. Opbevares ved-80 ° C.
    Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt her. Pseudotyped partikler er stabile ved-80 ° C for mange måneder men når optøet, undgå re frysning dem som de vil miste smitteevne

4. pseudotyped partikel smitte af modtagelige celler

Bemærk: Udføre dette trin i biosikkerhed kabinet.

  1. Celle såning af følsomme celler i 24-godt plade
    1. Få af standard celle kultur teknikker 80−90% sammenflydende 75 cm2 kolbe af følsomme celler: Vero-E6 celler for SARS-CoV pseudotyped partikler (SARS-Spp) og Huh-7 celler for MERS-CoV S pseudotyped partikler (MERS-Spp).
      Bemærk: For at bekræfte, om de pseudotyped partikler, der er blevet produceret er smitsom, det er vigtigt at omhyggeligt vælge et passende modtagelige cellelinie for pseudovirion smitteevne assays. Ved hjælp af dårligt permissive celler vil føre til lavt smitteevne.
    2. Vaske cellerne to gange med 10 mL af pre varmede (37 ° C) DPBS.
    3. Opsug supernatanten og frigør celler med 1 mL 0,25% trypsin løsning pre varmes ved 37 ° C. Kolben celler ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 3−5 min, eller indtil celler begynder at afmonterer.
      Bemærk: Undgå inkubere celler med trypsin i mere end 5 minutter, da dette typisk fører til celle sammenklumpning. Huh-7 celler er særligt følsomme over for denne effekt.
    4. Deaktivere trypsin ved at tilføje DMEM-C medium og tælle celler ved hjælp af en celle tælle dias og lysmikroskop.
    5. Fortynd celler til 5 x 105 celler/mL med DMEM-C.
    6. Froe wells af en 24-godt plade med 0,5 mL af celle løsning pr. brønd og forsigtigt flytte pladen frem og tilbage og side til side for at jævnt distribuere celler, undgå cirkelbevægelser
      Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Jævnt fordelte celler vil sikre, at cellerne ikke klump i midten af brønde. Dette vil til gengæld sikre god smitteevne assays. For hver pseudotyped partikel (SARS-Spp, MERS-Spp) og betingelse, forberede tre brønde tre eksperimentelle replikater. Omfatte brønde for ikke-inficerede (ni), Tom vektor Δenv partikler og positiv kontrol partikler såsom VSV-Gpp
    7. Inkuber plade natten over (16−18 h) i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator
  2. Pseudotyped partikel infektion
    1. Observere celler under lysmikroskop og visuelt bekræfte at der er en sammenflydende tæppe af celler.
    2. Bringe cryovials af pseudotyped virus at tø på is.
    3. Vask celler tre gange med 0,5 mL pre varmede (37 ° C) DPBS
      Bemærk: Dette er et vigtigt skridt. Celler, ikke der ordentligt skylles forud for infektion typisk føre til dårlig smitteevne udlæsninger
    4. Opsug analysere af celler.
    5. Podes celler med 200 µL af optøede pseudotyped partikel løsning.
    6. Inkuber celler i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator for 1−2 h.
    7. Tilsæt 300 µL af pre varmede (37 ° C) DMEM-C medium.
    8. Inkuber celler i et 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator i 72 timer.

5. smitteevne kvantificering af Luciferase Assay udlæsning

Bemærk: Udføre indledende trin i biosikkerhed kabinet.

  1. Tø luciferin substrat (opbevares ved-80 ° C) og 5 x luciferase assay lysisbuffer (opbevares ved-20 ° C) indtil de nå stuetemperatur.
  2. Fortynd luciferase assay lysisbuffer til 1 x med sterilt vand.
  3. Opsug analysere af celler inficeret med pseudotyped partikler.
  4. Tilsæt 100 µL 1 x luciferase assay lysisbuffer til hver brønd.
  5. Pladen anbringes på en rocker og Inkuber i 15 min med vuggende ved stuetemperatur (fra dette punkt og fremefter, pladen kan håndteres uden for et kabinet biosikkerhed).
  6. Forberede microcentrifuge rør til hver brønd ved at tilføje 20 µL af luciferin substrat i hver tube.
  7. Tænd luminometrisk.
  8. Udføre luciferase aktivitet måling, et godt ad gangen ved at overføre 10 µL af lysate til et rør indeholdende 20 µL af luciferin substrat.
  9. Svirp rør forsigtigt for at blande indholdet, men undgå at fortrænge væske på væggene i røret.
  10. Røret anbringes i enheden, og luk låget.
  11. Måle værdien luminescence af røret ved hjælp af en luminometrisk.
  12. Optage den relative lette måleenhed.
  13. Gentag trin 5.8 – 5.12 indtil alle brønde er analyseret.
    Bemærk: Med det relevante udstyr såsom en plade læsning luminometrisk, kan denne proces udføres automatisk. Analysen skal skaleres til plade-format (f.eks., 96 brønde plade format).

6. dataanalyse

  1. Beregning og afbildning af relative luciferase enheder gennemsnit og standardafvigelser
    1. Bruge en graf plotte software til at beregne luciferase assay måling gennemsnit og standardafvigelser af eksperimentelle og biologiske replikater.
    2. Plotte data som liggende søjlediagram med standardafvigelser.
      Bemærk: Når du udfører statistiske analyser på data, Sørg for at medtage mindst tre biologiske replikater i datasæt.

Representative Results

Repræsentative resultater af smitteevne assays af SARS-CoV S og MERS-CoV pseudotyped partikler er vist i figur 1. Som forventet, for begge figur 1A og 1 b, VSV G pseudotyped positiv kontrol partikler (VSV-Gpp) gav meget høje gennemsnitlige infektivitetsniveauet i 106 107 relative luciferase enheder (RLU) spænder hhv. For SARS-CoV S pseudotyped partikler (fig. 1A) smitte af modtagelige Vero-E6 celler, en stærk gennemsnitlige smitteevne blev målt til omkring 9,8 x 104 RLU. Denne værdi er næsten 3 størrelsesordener højere end de værdier, der måles til ikke-inficerede kontrol (1,1 x 102 RLU), eller Δenv partiklerne (1.5 x 102 RLU), der ikke nærer nogen virale kuvert glykoproteiner på deres overflade. På samme måde for MERS-CoV S pseudotyped partikler (figur 1B) infektion af Huh-7 celler, en høj gennemsnitlig smitteevne blev målt til omkring 1,0 x 106 RLU. Det er næsten 4 størrelsesordener højere end de værdier, der måles til ikke-inficerede kontrol (0,8 x 102 RLU), eller Δenv partiklerne (2.0 x 102 RLU). En yderligere smitteevne analyse blev udført hvor den SARS-Spp MERS-Spp seriefremstillede fortyndet og blev brugt til at inficere Vero-E6 celler (fig. 2A). Denne analyse bekræfter, at den luciferase aktivitet målt afhænger af koncentrationen af partikler bruges til at inficere celler. For at bekræfte den rolle af angiotensin konvertering enzym 2 (ACE2) og dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), receptorer af SARS-CoV og MERS-CoV, henholdsvis i mægle vedhæftet fil og løsning af de pseudotyped partikler, brugte vi dårligt-eftergivende HEK-293T celler og transfekteret dem til at udtrykke enten ACE2 eller DPP4 (figur 2B). De transfected celler blev derefter brugt til en infektivitet assay. Denne analyse viser, at ved overekspression af ACE2 og DPP4, der er en ~ 4-log og ~ 2-log stigning for SARS-Spp og MERS-Spp infektivitet, henholdsvis, bekræfter denne receptor brugen af pseudovirions er svarer til native vira.

Eksemplerne her demonstrere vigtigheden af herunder negative (ikke-inficerede, Δenv partikler) samt positiv kontrol (VSV-Gpp) betingelser når producerer pseudotyped partikler. Positiv kontrol VSV-Gpp partikler, muligt at vurdere, om en bestemt batch af pseudotyped partikler lykkedes giver funktionelle og smitsom pseudovirions. Forventede resultater af typiske infektion af VSV-Gpp partikler i de fleste pattedyr celle linjer er i 106−107 RLU rækkevidde. Problemer med HEK-293T/17 producent celler (høj passage nummer, problemer med celle tætheder) eller dårlig Transfektion effektivitetsgevinster kan påvirke samlede pseudotyped partikel produktion og smitteevne. Negativ kontrol betingelser er desuden også vigtigt, da de gør det muligt at vurdere basislinjer RLU målinger i en bestemt cellelinje (ikke-inficerede tilstand) og ikke-specifik internalisering af partikler (Δenv infektion), som ikke er medieret af en viral kuvert protein. Ideelt, for en given type partikel pseudotyped virale kuvert protein af interesse anbefales det, at få de værdier, der er et par størrelsesordener højere end negative kontrolværdierne, som vist her i figur 1A, B. Men hvis for en given celletype et pseudotyped virusinfektion giver meget lidt smitteevne (dvs., tæt til negative kontroller sådan som i figur 2B i ikke-transfekteret N.T. betingelser) det betyder ikke nødvendigvis, at den pseudotyped partikel produktion var defekt. Det kan godt være, at den særlige cellelinie anvendes er ikke eller dårligt eftergivende til infektion. Det anbefales at kontrollere, om en given celletype forventes at være modtagelige over for infektion med virus ved at blive undersøgt. Transfecting dårligt permissive celler med plasmid(s) giver udtryk for den virale receptor(s) kan give mulighed for mere effektiv viral entry og infektion at forekomme, som vist i figur 2B, hvor efter Transfektion af ACE2 og DPP4 receptorer i målrette HEK-293T celler, der er en ~ 4- og ~ 2-log stigning i smitteevne, henholdsvis.

Plasmid/reagens Mængde
pCMV-MLVgagpol MLV gag og pol kodning plasmid 300 ng
pTG-Luc transfer vektor med luciferase reporter 400 ng
pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S eller tomme vektor 300 ng
Nedsat serum cellekulturmedium Til 50 µL

Tabel 1: mængder plasmider og reducerede serum celle næringssubstratet skal transfect et godt af en 6-godt plade af HEK-293T/17 celler til produktion af pseudotyped partikel. Koncentration af plasmid præparater, beregnes den krævede mængde for at nå den nødvendige mængde af plasmid DNA. Hvis mere end én brønd er transfekteret med de samme plasmider, formere mængder af nødvendige antal brønde til transfect, og inkluderer en ekstra godt i beregninger for at undgå at køre af mix på senere trin. Den samlede mængde DNA bliver transfekteret er 1 µg/godt. Plasmider kan bestilles til forfatterne.

Reagens Mængde
Transfektion reagens 3 ΜL
Nedsat serum cellekulturmedium 47 ΜL

Tabel 2: antal Transfektion reagens og reducerede serum celle næringssubstratet skal transfect et godt af en 6-godt plade af HEK-293T/17 celler til produktion af pseudotyped partikel. Formere mængder af nødvendige antal brønde til transfect og omfatter ekstra brønde i beregninger for at undgå at køre af mix på senere trin. Transfektion reagens: plasmid DNA forhold er 3:1.

Figure 1
Figur 1 : Coronavirus S-pseudotyped partikel smitteevne assays i modtagelige værtsceller ved hjælp af en murine leukæmi virus (MLV) rygraden og luciferase reporter gen. (A) SARS-CoV S pseudotyped partikel smitteevne assay i Vero-E6 celler. (B) MERS-CoV S pseudotyped partikel smitteevne assay i Huh-7 celler. For begge (A) og (B), plottede data svarer til de gennemsnitlige relative luciferase enheder fra tre uafhængige forsøg, med fejllinjer svarende til standardafvigelsen (s.d.). Data afbildes i log10 skala på y-aksen. Ni: ikke-inficerede kontrol; Δenv: infektion med pseudotyped partikler mangler virale kuvert glykoproteiner og VSV-Gpp: infektion med pseudotyped partikler forsynet med positiv kontrol VSV G kuvert glycoprotein. Andre forkortelse, der bruges, SARS-Spp: infektion med SARS-CoV S pseudotyped partikler, MERS-Spp: infektion med MERS-CoV S pseudotyped partikler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Koncentration-afhængighed af CoV S-pseudovirion smitteevne og rollen som ACE2 og DPP4 receptorer i SARS-Spp og MERS-Spp indrejse. (A) koncentration-afhængighed af SARS-Spp og MERS-Spp smitteevne målt ved luciferase aktivitet assay. Pseudovirions var seriefremstillede fortyndet og bruges til at inficere Vero-E6 celler. (B) smitteevne assay af SARS-Spp og MERS-Spp i dårligt eftergivende HEK-293T target-cellerne transfekteret at udtrykke ACE2, og DPP4 receptorer, henholdsvis. Data afbildet i log10 skala på y-aksen i figur 1 fra dublerede eksperimenter med fejllinjer svarende til standardafvigelsen (s.d.). N.T.: ikke-transfekteret kontrol HEK-293T celler; ACE2: angiotensin konverterende enzym 2 (SARS-CoV receptor) og DPP4: dipeptidyl peptidase 4 (MERS-CoV receptor). Andre forkortelser er de samme som i figur 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol beskriver en metode til at producere effektivt pseudotyped partikler forsynet med S protein af risiko gruppe 3 coronavirus, SARS-CoV og MERS-CoV, i BSL-2 omgivelser. Disse partikler, der inkorporerer en luciferase reporter gen, give os mulighed at nemt kvantificere coronavirus S-medieret post begivenheder af en relativt simpel luciferase assay48,49,50,51. I smitteevne assays bruger permissive celler, bekræfte vi, at den luciferase aktivitet målt er afhængig af koncentrationen af partikler. Hertil kommer, ACE2 og DPP4 receptor Transfektion giver mulighed for mere effektiv løsning i dårligt permissive celler linjer, såsom HEK-293T celler. Metoden er meget tilpasningsdygtige til andre virale kuvert glykoproteiner og har været brugt i udstrakt grad48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, ofte som supplement til andre assays som biokemiske analyser eller indfødte virusinfektioner.

Den protokol, vi beskriver her er baseret på retrovirus MLV, der inkorporerer en luciferase reporter. Det er imidlertid vigtigt at understrege, at der er en meget bred vifte af andre pseudotyping systemer, der har med held udviklet til emballage coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 og andre virale kuvert glykoproteiner10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. nogle af disse andre systemer er baseret på den almindeligt anvendte MLV retroviral core7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, eller baseret på den udbredte lentiviral HIV-1 pseudotyping system ved hjælp af forskellige strategier23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, eller med rhabdovirus vesikulær stomatitis-virus (VSV) som kernen, som giver mulighed for at inddrage en bred vifte kuvert glykoproteiner, og igen med forskellige ansat strategier37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. Derudover andre journalister såsom fluorescerende proteiner som normal god landbrugspraksis11,13 og RFP36eller enzymer end luciferase som β-galactosidase16,17 og udskilles alkalisk fosfatase (SEAP)42 er blevet med held ansat for målinger. Derudover i analysen præsenteret i denne protokol, blev en forbigående Transfektion brugt til at udtrykke MLV og CoV S gener og proteiner. Men der er andre strategier for udtryk, såsom generation af stabil cellelinjer til produktion af pseudotyped virus7,14. Hver af disse systemer har deres fordele og ulemper, er det vigtigt at overveje følgende vigtige parametre, når de beslutter hvilke pseudotyping system bedst passer en investigator behov: pseudovirion core (MLV, HIV-1, VSV eller andre), hvordan selektiv en bestemt pseudotyping kerne er indarbejde en specifik virale kuvert glykoprotein, reporter for assay udlæsning (normal god landbrugspraksis, luciferase, SEAP eller andre) og Transfektion strategi (antal plasmider involveret i co Transfektion, forbigående Transfektion eller generation af stabil cellelinjer).

Der er en række kritiske trin i metoden, der er vigtigt at understrege. Celle tæthed, især af HEK-293T/17 producent cellelinje er en kritisk faktor for at sikre vellykket Transfektion. En celle tæthed i rækken af 40 – 60% confluency fandtes for at være optimal. Højere tætheder typisk resultere i lav Transfektion effektivitet og lav partikel produktion. Det er også vigtigt at huske at HEK-293T/17 celler er mindre klæbende end andre cellelinjer. Bør udvises forsigtighed ved håndtering af dem for at undgå afmontering dem unødigt. En mulighed er at behandle celle kultur plastoverflader med poly-D-lysin til at forbedre overholdelsen. Desuden resulterer højere celle passage ofte i dårlig Transfektion priser. Efter tilføjer Transfektion reagens til HEK-293T/17 celler, er det også vigtigt at huske, at celle permeabilitet øger. Det er derfor på dette punkt er det bedst at undgå at bruge medium indeholdende antibiotika, da de kan øge cytotoksicitet. Før indsamling pseudotyped partikler, kontrollere farven på transfekteret HEK-293T/17 celle analysere. Typisk efter 48 h af Transfektion tager næringssubstrat cellefarve en orange-pink skær. Gul-farvet medium normalt oversætter til fattige pseudotyped partikler udbytter og er ofte et resultat af problemer med celle såning tæthed eller høj passage nummer.

I denne protokol udføres pseudotyped partikel produktion i en 6-godt plade format. For at øge mængden af producerede partikler, flere brønde i en 6-godt plade kan være transfekteret med den samme plasmider mix og analysere kan samles sammen. Swimmingpoolen kan derefter blive afklaret, filtreret og aliquoted. Alternativt, for at skalere produktionen op, andre former for fartøjer (f.eks. 25 eller 75 cm2 kolber) kan bruges. I dette tilfælde skal Transfektion betingelser skaleres i overensstemmelse hermed. I denne protokol, er smitteevne analysen udført ved hjælp af en 24-godt plade format og en luminometrisk, der kun tillader målinger en tube ad gangen. For høj overførselshastighed screeninger er andre formater også muligt, som 96-brønd plade format og en plade læser luminometrisk. Diskenheder og reagenser for luciferase assayet skal tilpasses i overensstemmelse hermed. Opbevaring af pseudotyped partikler i cryovials ved-80 ° C fastholder deres stabilitet i flere måneder uden mærkbar nedgang i smitteevne. Det anbefales ikke at udsætte dem for at fryse-tø cyklus som dette vil mindske deres smitteevne over tid. Derfor er det bedst at opbevare dem i små prøver som 0,5-1 mL og tø dem før en infektion.

Metoden præsenteres her har flere begrænsninger. Vigtigt er det faktum, at pseudotyped partikler sammenfatte kun viral entry begivenheder. For at analysere andre trin i smitsomme livscyklus, er andre assays påkrævet. Desuden, som MLV partikler bud på plasma membranen, det er vigtigt at huske på sind, kuvert glycoprotein undersøgt behov at også trafikken til plasma membran til indbygning i pseudovirions under produktionen. Som sådan, er det vigtigt at vide, hvor i cellen en bestemt virale kuvert glycoprotein udtrykkes i Transfektion betingelser, såsom ved at visualisere subcellulært lokalisering med en immunofluorescens analyse og/eller ved at kontrollere for fastholdelse signaler inden for protein. Mens protokollen beskriver trin for at producere og teste smitteevne, sådan måler omsætning af virale kuvert glykoproteiner i pseudotyped partikler ikke detaljer. Én metode er at udføre vestlige skamplet assays på koncentrerede opløsninger af partikler, som tidligere beskrevet50,51 for MERS-CoV S vedtægter. I disse assays, er S kuvert glycoprotein af MERS-CoV aftestede sammen med kapsid (p30) protein af MLV, som tillader os at normalisere indarbejdelse af S protein i partikler. Andre eksempler på sådanne assays analysere virale kuvert glycoprotein indbygning i pseudovirions er blevet udført for SARS-CoV S indarbejdelse i en HIV-1 lentiviral pseudovirion system32 , Ebola glycoprotein (GP) i en anden MLV pseudotyped partikel system17, og influenza hemagglutinin (HA) og neuraminidasetypen (NA) i VSV pseudovirions38. En nyere udvikling i kendetegner pseudotyped partikel produktion er brugen af innovative billedenheder som Nanosight: det gør det muligt for os at direkte visualisere, kvantificere og størrelse viruspartikler50. Enheden indeholder detaljerede oplysninger om generelle partikel produktion; Det er dog vigtigt at huske på at det ikke indeholder oplysninger om kuvert glycoprotein indarbejdelse. En fremtidig retning for anvendelsen af disse alsidige pseudovirion partikler er at analysere enkelte viral fusion begivenheder ved hjælp af enkelt partikel tracking, mikrofluidik og total interne reflection Fluorescens mikroskopi60,61 ,62. Sådanne metoder blev anvendt med succes til influenzavirus samt feline coronavirus partikler og influenza HA - og NA-pseudotyped VSV-baserede pseudovirions63. Indsættelsen af sådanne teknikker, der anvendes til coronavirus S-pseudotyped MLV-baserede partikler er i øjeblikket ved at blive udviklet.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke alle medlemmer af Whittaker og Daniel labs for nyttige kommentarer. Forskningsmidler blev leveret af NIH tilskud R21 AI111085 og R01 AI135270. T.T. anerkender støtte fra præsidentens Life Science Fellowship i Cornell University og National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant nr. DGE-1650441. Larsen anerkender støtte fra en Samuel C. Fleming familie Graduate stipendium og National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant nr. DGE-1650441. Dette arbejde er også støttet af National Science Foundation 1504846 (til S.D. og G.R.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimitrov, D. S. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nature Reviews Microbiology. 2, (2), 109-122 (2004).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and Mechanisms of Viral Membrane Fusion Proteins: Multiple Variations on a Common Theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43, (3), 189-219 (2008).
  3. Bosch, B. J., van der Zee, R., de Haan, C. A. M., Rottier, P. J. M. The Coronavirus Spike Protein Is a Class I Virus Fusion Protein: Structural and Functional Characterization of the Fusion Core Complex. Journal of Virology. 77, (16), 8801-8811 (2003).
  4. Belouzard, S., Millet, J. K., Licitra, B. N., Whittaker, G. R. Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein. Viruses. 4, (6), 1011-1033 (2012).
  5. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Physiological and molecular triggers for SARS-CoV membrane fusion and entry into host cells. Virology. 517, 3-8 (2018).
  6. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. 202, (0), 120-134 (2015).
  7. Steidl, S., et al. Coreceptor Switch of [MLV(SIVagm)] Pseudotype Vectors by V3-Loop Exchange. Virology. 300, (2), 205-216 (2002).
  8. Höhne, M., Thaler, S., Dudda, J. C., Groner, B., Schnierle, B. S. Truncation of the Human Immunodeficiency Virus-Type-2 Envelope Glycoprotein Allows Efficient Pseudotyping of Murine Leukemia Virus Retroviral Vector Particles. Virology. 261, (1), 70-78 (1999).
  9. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. Journal of Virological Methods. 153, (2), 111-119 (2008).
  10. Wallerstrom, S., et al. Detection of antibodies against H5 and H7 strains in birds: evaluation of influenza pseudovirus particle neutralization tests. Infection Ecology, Epidemiology. 4, (2014).
  11. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, (7131), 92-96 (2007).
  12. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, (1), 140-149 (2004).
  13. Moore, M. J., et al. Retroviruses pseudotyped with the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein efficiently infect cells expressing angiotensin-converting enzyme 2. Journal of Virology. 78, (19), 10628-10635 (2004).
  14. Sharkey, C. M., North, C. L., Kuhn, R. J., Sanders, D. A. Ross River virus glycoprotein-pseudotyped retroviruses and stable cell lines for their production. Journal of Virology. 75, (6), 2653-2659 (2001).
  15. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. Journal of Virology. 75, (23), 11464-11473 (2001).
  16. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64, (1), 23-32 (1999).
  17. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72, (4), 3155-3160 (1998).
  18. Op De Beeck, A., et al. Characterization of Functional Hepatitis C Virus Envelope Glycoproteins. Journal of Virology. 78, (6), 2994-3002 (2004).
  19. Calland, N., et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate is a new inhibitor of hepatitis C virus entry. Hepatology. 55, (3), 720-729 (2012).
  20. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197, (5), 633-642 (2003).
  21. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. Journal of Virology. 78, (17), 9007-9015 (2004).
  22. Dye, C., Temperton, N., Siddell, S. G. Type I feline coronavirus spike glycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor on feline cell lines. Journal of General Virology. 88, (6), 1753-1760 (2007).
  23. Kobinger, G. P., Weiner, D. J., Yu, Q. -C., Wilson, J. M. Filovirus-pseudotyped lentiviral vector can efficiently and stably transduce airway epithelia in vivo. Nature Biotechnology. 19, 225 (2001).
  24. Salvador, B., Zhou, Y., Michault, A., Muench, M. O., Simmons, G. Characterization of Chikungunya pseudotyped viruses: Identification of refractory cell lines and demonstration of cellular tropism differences mediated by mutations in E1 glycoprotein. Virology. 393, (1), 33-41 (2009).
  25. Nie, Y., et al. Highly infectious SARS-CoV pseudotyped virus reveals the cell tropism and its correlation with receptor expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 321, (4), 994-1000 (2004).
  26. Grehan, K., Ferrara, F., Temperton, N. An optimised method for the production of MERS-CoV spike expressing viral pseudotypes. MethodsX. 2, 379-384 (2015).
  27. Bakri, Y., et al. The Maturation of Dendritic Cells Results in Postintegration Inhibition of HIV-1 Replication. The Journal of Immunology. 166, (6), 3780-3788 (2001).
  28. Hsu, M., et al. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, (12), 7271-7276 (2003).
  29. Simmons, G., et al. DC-SIGN and DC-SIGNR Bind Ebola Glycoproteins and Enhance Infection of Macrophages and Endothelial Cells. Virology. 305, (1), 115-123 (2003).
  30. Simmons, G., et al. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, (33), 11876-11881 (2005).
  31. Gierer, S., et al. The spike-protein of the emerging betacoronavirus EMC uses a novel coronavirus receptor for entry, can be activated by TMPRSS2 and is targeted by neutralizing antibodies. Journal of Virology. 87, (10), 5502-5511 (2013).
  32. Bertram, S., et al. Cleavage and activation of the SARS-coronavirus spike-protein by human airway trypsin-like protease. Journal of Virology. 85, (24), 13363-13372 (2011).
  33. Bertram, S., et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, (19), 10016-10025 (2010).
  34. Connor, R. I., Chen, B. K., Choe, S., Landau, N. R. Vpr Is Required for Efficient Replication of Human Immunodeficiency Virus Type-1 in Mononuclear Phagocytes. Virology. 206, (2), 935-944 (1995).
  35. Evans, M. J., et al. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature. 446, (7137), 801-805 (2007).
  36. Negrete, O. A., et al. EphrinB2 is the entry receptor for Nipah virus, an emergent deadly paramyxovirus. Nature. 436, (7049), 401-405 (2005).
  37. Suda, Y., et al. Analysis of the entry mechanism of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, using a vesicular stomatitis virus pseudotyping system. Archives of Virology. 161, (6), 1447-1454 (2016).
  38. Zimmer, G., Locher, S., Berger Rentsch, M., Halbherr, S. J. Pseudotyping of vesicular stomatitis virus with the envelope glycoproteins of highly pathogenic avian influenza viruses. Journal of General Virology. 95, Pt 8 1634-1639 (2014).
  39. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8, (9), (2016).
  40. Tong, W., Yin, X. X., Lee, B. J., Li, Y. G. Preparation of vesicular stomatitis virus pseudotype with Chikungunya virus envelope protein. Acta Virologica. 59, (02), 189-193 (2015).
  41. Tani, H., et al. Involvement of ceramide in the propagation of Japanese encephalitis virus. Journal of Virology. 84, (6), 2798-2807 (2010).
  42. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179, (1), 226-232 (2012).
  43. Tani, H., et al. Analysis of Lujo virus cell entry using pseudotype vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 88, (13), 7317-7330 (2014).
  44. Ogino, M., et al. Use of Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes Bearing Hantaan or Seoul Virus Envelope Proteins in a Rapid and Safe Neutralization Test. Clinical and Vaccine Immunology. 10, (1), 154-160 (2003).
  45. Logan, N., et al. Efficient generation of vesicular stomatitis virus (VSV)-pseudotypes bearing morbilliviral glycoproteins and their use in quantifying virus neutralising antibodies. Vaccine. 34, (6), 814-822 (2016).
  46. Takada, A., et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, (26), 14764-14769 (1997).
  47. Whitt, M. A. Generation of VSV pseudotypes using recombinant DeltaG-VSV for studies on virus entry, identification of entry inhibitors, and immune responses to vaccines. Journal of Virological Methods. 169, (2), 365-374 (2010).
  48. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429, (24), 3875-3892 (2017).
  49. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  50. Millet, J. K., et al. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging Microbes, Infections. 5, (12), 126 (2016).
  51. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell entry of Middle East respiratory syndrome coronavirus after two-step, furin-mediated activation of the spike protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (42), 15214-15219 (2014).
  52. Tse, L. V., Hamilton, A. M., Friling, T., Whittaker, G. R. A Novel Activation Mechanism of Avian Influenza Virus H9N2 by Furin. Journal of Virology. 88, (3), 1673-1683 (2014).
  53. Sun, X., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Molecular architecture of the bipartite fusion loops of vesicular stomatitis virus glycoprotein G, a class III viral fusion protein. Journal of Biological Chemistry. 283, (10), 6418-6427 (2008).
  54. Millet, J., Whittaker, G. Murine Leukemia Virus (MLV)-based Coronavirus Spike-pseudotyped Particle Production and Infection. Bio-Protocol. 6, (23), 2035 (2016).
  55. Bonnin, A., Danneels, A., Dubuisson, J., Goffard, A., Belouzard, S. HCoV-229E spike protein fusion activation by trypsin-like serine proteases is mediated by proteolytic processing in the S2' region. Journal of General Virology. (2018).
  56. Belouzard, S., Madu, I., Whittaker, G. R. Elastase-mediated activation of the SARS coronavirus spike protein at discrete sites within the S2 domain. Journal of Biological Chemistry. 285, (30), 22758-22763 (2010).
  57. Madu, I. G., Roth, S. L., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Characterization of a Highly Conserved Domain within the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein S2 Domain with Characteristics of a Viral Fusion Peptide. Journal of Virology. 83, (15), 7411-7421 (2009).
  58. Madu, I. G., Belouzard, S., Whittaker, G. R. SARS-coronavirus spike S2 domain flanked by cysteine residues C822 and C833 is important for activation of membrane fusion. Virology. 393, (2), 265-271 (2009).
  59. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (14), 5871-5876 (2009).
  60. Costello, D. A., Millet, J. K., Hsia, C. -Y., Whittaker, G. R., Daniel, S. Single particle assay of coronavirus membrane fusion with proteinaceous receptor-embedded supported bilayers. Biomaterials. 34, (32), 7895-7904 (2013).
  61. Costello, D. A., Hsia, C. -Y., Millet, J. K., Porri, T., Daniel, S. Membrane Fusion-Competent Virus-Like Proteoliposomes and Proteinaceous Supported Bilayers Made Directly from Cell Plasma Membranes. Langmuir. 29, (21), 6409-6419 (2013).
  62. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (40), 15382-15387 (2008).
  63. Hsu, H. -L., Millet, J. K., Costello, D. A., Whittaker, G. R., Daniel, S. Viral fusion efficacy of specific H3N2 influenza virus reassortant combinations at single-particle level. Scientific reports. 6, 35537 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics