अनुदैर्ध्य रूपात्मक और तीन आयामी ट्यूमर की शारीरिक निगरानी Spheroids ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग

Cancer Research

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Summary

ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT), एक तीन आयामी इमेजिंग प्रौद्योगिकी, पर नजर रखने और कोशिकीय ट्यूमर spheroids के विकास कैनेटीक्स विशेषताएं इस्तेमाल किया गया था । ट्यूमर spheroids का सटीक volumetric ठहराव एक voxel गिनती दृष्टिकोण का उपयोग कर, और spheroids में लेबल से मुक्त मृत ऊतक का पता लगाने आंतरिक ऑप्टिकल क्षीणन कंट्रास्ट के आधार पर, प्रदर्शन किया गया ।

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Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).

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Abstract

ट्यूमर spheroids एक तीन आयामी (3 डी) कैंसर अनुसंधान और विरोधी कैंसर दवा खोज में सेल संस्कृति मॉडल के रूप में विकसित किया गया है । हालांकि, वर्तमान में, उच्च प्रवाह इमेजिंग मोडलें उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति डिटेक्शन का उपयोग, सीमित प्रकाश प्रवेश के कारण ट्यूमर अंडाकार आकृति के समग्र 3d संरचना को हल करने में असमर्थ हैं, फ्लोरोसेंट रंगों का प्रसार और गहराई-संपति । हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT), एक लेबल मुक्त और गैर विनाशकारी 3 डी इमेजिंग रूपरेखा, एक ९६-अच्छी तरह से थाली में कोशिकीय ट्यूमर spheroids के अनुदैर्ध्य लक्षण वर्णन प्रदर्शन के उपयोग का प्रदर्शन किया । OCT 3d रूपात्मक और ट्यूमर की शारीरिक जानकारी प्राप्त करने में सक्षम था spheroids ऊंचाई में लगभग ६०० µm तक बढ़ रहा है । इस अनुच्छेद में, हम एक उच्च प्रवाह oct (एचटी-अक्टूबर) इमेजिंग प्रणाली है कि पूरी बहु अच्छी तरह से प्लेट स्कैन और 3 डी ट्यूमर spheroids के अक्टूबर डेटा स्वचालित रूप से प्राप्त करता है प्रदर्शन । हम प्रोटोकॉल में एचटी-OCT प्रणाली और निर्माण दिशानिर्देशों के विवरण का वर्णन करते हैं । 3 डी अक्टूबर डेटा से, एक 3 डी गाया और ओर्थोगोनल स्लाइस के साथ अंडाकार आकृति की समग्र संरचना कल्पना कर सकते हैं, आकार और मात्रा की रूपात्मक जानकारी के आधार पर ट्यूमर अंडाकार आकृति के अनुदैर्ध्य वृद्धि वक्र विशेषताएं, और के विकास की निगरानी मृत-ट्यूमर अंडाकार आकृति में सेल क्षेत्रों ऑप्टिकल आंतरिक क्षीणन कंट्रास्ट के आधार पर । हम बताते है कि एचटी-अक्टूबर एक उच्च प्रवाह के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इमेजिंग दवा स्क्रीनिंग के लिए साधन के रूप में अच्छी तरह के रूप में निस्र्पक पूर्वनिर्मित नमूने ।

Introduction

कैंसर दुनिया में मौत का दूसरा प्रमुख कारण है1. कैंसर लक्ष्यीकरण दवाओं के विकास के रोगियों के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है । हालांकि, यह अनुमान है कि नए विरोधी कैंसर दवाओं की अधिक से अधिक ९०% विकास के चरण में विफल क्योंकि नैदानिक परीक्षण में प्रभावकारिता और अप्रत्याशित विषाक्तता की कमी2. कारण का हिस्सा यौगिक स्क्रीनिंग के लिए सरल दो आयामी (2d) सेल संस्कृति मॉडल के उपयोग के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, जो दवा डिस्कवरी2 के निंनलिखित चरणों के लिए यौगिक प्रभावकारिता और विषाक्तता के सीमित पूर्वानुमानित मूल्यों के साथ परिणाम प्रदान , 3 , 4. हाल ही में, तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर अंडाकार आकृति मॉडल विरोधी कैंसर दवा डिस्कवरी3,4,5 के लिए नैदानिक प्रासंगिक शारीरिक और औषधीय डेटा प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. चूंकि इन spheroids के ऊतकों में ट्यूमर के विशिष्ट गुणों की नकल कर सकते है vivo, जैसे पोषक तत्व और ऑक्सीजन ढाल, hypoxic कोर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दवा प्रतिरोध19, इन मॉडलों के उपयोग के संभावित रूप से कम कर सकते है दवा डिस्कवरी समयरेखा, निवेश की लागत को कम करने, और रोगियों को और अधिक प्रभावी ढंग से नई दवाएं ले आओ । 3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति विकास में यौगिक प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण9,26उपचार के तहत अंडाकार आकृति वृद्धि और पुनरावृत्ति की निगरानी करने के लिए है । ऐसा करने के लिए, मात्रात्मक characterizations ट्यूमर आकृति विज्ञान, इसके व्यास और मात्रा को शामिल, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग मोडल के साथ, आवश्यक हैं ।

इस तरह के उज्ज्वल के रूप में पारंपरिक इमेजिंग रूपरेखा, क्षेत्र, चरण कंट्रास्ट7,9,22,24, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी8,9,16, 18,22 अंडाकार आकृति के व्यास का माप प्रदान कर सकते हैं, लेकिन 3 डी अंतरिक्ष में अंडाकार आकृति की समग्र संरचना को हल नहीं कर सकता । कई कारकों अंडाकार आकृति में जांच प्रकाश के प्रवेश सहित इन सीमाओं के लिए योगदान; अंडाकार आकृति में फ्लोरोसेंट रंगों का प्रसार; अंदर या मजबूत अवशोषण और तितर बितर करने के लिए कारण अंडाकार आकृति के विपरीत सतह पर उत्तेजित फ्लोरोसेंट रंजक से फ्लोरोसेंट संकेतों उत्सर्जित; और इन इमेजिंग मोडलों की गहराई-संपति । यह अक्सर एक गलत मात्रा माप की ओर जाता है । spheroids में गल कोर के विकास में vivo ट्यूमर6,10,15,19,25में परिगलन नकल करते हैं । इस रोग की सुविधा की संभावना नहीं 2d सेल संस्कृतियों19,25,27,28में reproduced है । व्यास में ५०० µm से बड़ा एक अंडाकार आकृति आकार के साथ, proliferating कोशिकाओं की बाहरी परत, quiescent कोशिकाओं की एक मध्यम परत, और एक गल कोर सहित एक तीन परत गाढ़ा संरचना, अंडाकार आकृति6,10 में मनाया जा सकता है ,15,19,25, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की कमी के कारण । लाइव और डेड सेल प्रतिदीप्ति इमेजिंग, गल कोर की सीमा को लेबल करने के लिए मानक दृष्टिकोण है । हालांकि, फिर से, दोनों इन फ्लोरोसेंट रंजक और दृश्यमान प्रकाश के पेनेट्रेशन को अपने वास्तविक आकार में अपने विकास की निगरानी के लिए गल कोर में जांच करने की क्षमता में बाधा ।

एक वैकल्पिक 3 डी इमेजिंग रूपरेखा, ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) के लिए ट्यूमर spheroids विशेषताएं शुरू की है । अक्टूबर एक जैव चिकित्सा इमेजिंग तकनीक है कि लेबल से मुक्त, गैर विनाशकारी 3 डी डेटा प्राप्त करने में सक्षम है जैविक ऊतकों में 1-2 mm गहराई तक29,30,31,३२,३३ ,३४. OCT कम जुटना interferometry को रोजगार के नमूने के विभिंन गहराई से वापस बिखरे संकेतों का पता लगाने और दोनों पार्श्व और ऊर्ध्वाधर दिशाओं में माइक्रोन स्तर के स्थानिक प्रस्तावों पर गहराई से हल छवियों को खंगाला प्रदान करता है । OCT व्यापक रूप से नेत्र विज्ञान३५,३६,३७ और एंजियोग्राफी३८,३९में अपनाया गया है । पिछले अध्ययन में इन विट्रो ट्यूमर spheroids में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के आकृति विज्ञान का पालन करने के लिए OCT का उपयोग किया है (जैसे, Matrigel) और photodynamic थेरेपी के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन४०,४१. हाल ही में, हमारे समूह एक उच्च प्रवाह OCT इमेजिंग मंच की स्थापना के लिए व्यवस्थित निगरानी और बहु में 3 डी ट्यूमर spheroids के विकास कैनेटीक्स मात्रा ठीक४२प्लेटें । 3 डी ट्यूमर spheroids का सटीक volumetric ठहराव आंतरिक ऑप्टिकल क्षीणन विपरीत पर आधारित spheroids में एक voxel गिनती दृष्टिकोण और लेबल-नि: शुल्क गल ऊतक का पता लगाने का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । यह कागज कैसे अक्टूबर इमेजिंग मंच का निर्माण किया गया था और उच्च संकल्प ट्यूमर spheroids के 3 डी छवियों को प्राप्त करने के लिए कार्यरत का ब्यौरा वर्णन करता है । अंडाकार आकृति व्यास और वॉल्यूंस की सटीक माप सहित 3डी ट्यूमर spheroids के ग्रोथ कैनेटीक्स के स्टेप-बाय-स्टेप मात्रात्मक विश्लेषणों का वर्णन किया गया है । इसके अलावा, गैर-विनाशकारी का पता लगाने की विधि अक्टूबर का उपयोग करते हुए ऊतक क्षेत्रों, आंतरिक ऑप्टिकल क्षीणन कंट्रास्ट के आधार पर प्रस्तुत किया गया है ।

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Protocol

1. कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक योग्य आपूर्तिकर्ता से सेल लाइनों प्राप्त करें ।
    नोट: सत्यापित करें कि कक्ष पंक्तियों से ब्याज की सेल संस्कृति मीडिया में या एक सब्सट्रेट (Matrigel की तरह तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) की मदद से अंडाकार आकृति फार्म कर सकते हैं । साहित्य9 में देखो या एक पूर्व के एक दौर की जांच के लिए प्रयोग करते हैं ।
  2. गल सेल लाइन आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान की विशिष्ट प्रक्रिया का पालन जमे हुए कोशिकाओं । एक सामांय प्रक्रिया४३कहीं और पाया जा सकता है ।
  3. संस्कृति 25 सेमी2 संस्कृति कुप्पी में 1-2 मार्ग के लिए कोशिकाओं । कोशिकाओं तो 3 डी सेल संस्कृति के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं ।
  4. हर दिन कोशिकाओं की स्वास्थ्य स्थिति की निगरानी और मानक शर्तों के तहत एक मशीन में उन्हें बनाए रखने (३७ ° c, 5% CO2, ९५% आर्द्रता). मीडिया को आवश्यकतानुसार ताज़ा करें ।
    नोट: संस्कृति माध्यम DMEM (४.५ g/L ग्लूकोज), 1% एंटीबायोटिक-antimycotic, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम शामिल हैं । उपसंस्कृति कोशिकाओं से पहले वे संस्कृति कुप्पी में संगम तक पहुँचती हैं. आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान की सेल संस्कृति दिशानिर्देश का पालन करें । एक सामांय प्रक्रिया४४elsehwhere पाया जा सकता है ।
  5. 3 डी सेल संस्कृति में मल्टी-वेल प्लेट्स के आधार पर निम्न सामान्य प्रोटोकॉल9निष्पादित करें ।
    1. संस्कृति कुप्पी से संस्कृति मीडिया निकालें और यह निष्फल फास्फेट के साथ धो खारा (पंजाब, ३७ ° c करने के लिए गरम) बफर ।
    2. 3 मिनट के लिए कुप्पी में trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, ०.५%) की 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं resuspend । फिर, trypsin को पतला करने के लिए कल्चर मीडिया जोड़ें ।
    3. एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण और ५०० x जी और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    4. पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के 4 मिलीलीटर के साथ supernatant और resuspend कोशिकाओं को हटा दें । कोशिका एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए सेल की गिनती के लिए एक hemocytometer पर नमूना की एक बूंद पिपेट । बीज बोने के लिए उचित एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को पतला (जैसे, ३,००० कोशिकाओं/
      नोट: प्रत्येक सेल लाइन और बहु के प्रत्येक प्रकार के लिए अंडाकार आकृति के प्रारंभिक कोशिका एकाग्रता का अनुकूलन अच्छी तरह से प्लेट (९६-well, ३८४-अच्छी तरह से या १५३६-अच्छी तरह से) ।
    5. एक अल्ट्रा कम लगाव में बीज कोशिकाओं (उला) गोल तली हुई बहु अच्छी तरह से थाली । प्रत्येक अच्छी तरह से ६०० कोशिकाओं के बारे में है कि ३,००० कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर एक अच्छी तरह से में २०० µ एल कोशिकाओं का निलंबन जोड़ें ।
    6. RT पर, पूरी थाली 7 मिनट के लिए एक थाली अनुकूलक का उपयोग कर, सही बोने के बाद, ३५० x g या सबसे कम उपलब्ध गति की गति से केंद्रापसारक ।
      नोट: केंद्रापसारक अच्छी तरह से एक एकल, वर्दी अंडाकार आकृति बनाने की सुविधा के केंद्र के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने में मदद करता है । इस केंद्रापसारक कदम केवल एक बार शुरुआत में ट्यूमर spheroids फार्म का प्रदर्शन किया है । यह नहीं दोहराया जाएगा जब ट्यूमर spheroids शुरू हो रही है ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 में एक संस्कृति मशीन में बहु अच्छी तरह से थाली बनाए रखने और संस्कृति मीडिया हर 3 दिन ताज़ा ।
      नोट: वृद्धि समय अलग 3d संस्कृति की स्थिति के लिए भिन्न हो सकते हैं. हमारे अध्ययन में, ३,००० कक्ष/एमएल दोनों U-८७ मिलीग्राम और HCT ११६ सेल लाइनों के लिए ९६-well प्लेट्स में उपयोग किया जाता है, ताकि अंडाकार आकृति 4 में ~ ५०० माइक्रोन के लिए विकसित कर सकते हैं \ u20127 दिन HCT ११६ कोशिकाओं के लिए. मीडिया की खुराक और विभिंन अंडाकार आकृति मॉडल के लिए विकास कारकों, सामांय 3d संस्कृति प्रोटोकॉल पर आधारित जोड़ने पर विचार करें ।
    8. प्रदर्शन अक्टूबर ट्यूमर spheroids की इमेजिंग हर 3 \ u20124 दिन उनके विकास के एक अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए ।
      नोट: अक्टूबर इमेजिंग के लिए अनुशंसित समय अंक 4 दिन, दिन 7, 11 दिन, 14 दिन, 18 दिन और 21 दिन होगा ।

2. उच्च प्रवाह OCT इमेजिंग मंच

नोट: संदर्भित कार्य29,30,31,३२,३३,३४ सिद्धांतों और OCT के अनुप्रयोगों की एक गहन समीक्षा के लिए देखें । चित्रा 1 और हुआंग एट अल देखें । ४२ इस अध्ययन में प्रयुक्त कस्टम OCT इमेजिंग प्रणाली के विवरण के लिए ।

  1. ट्यूमर अंडाकार आकृति इमेजिंग के लिए OCT सिस्टम के लिए एक उपयुक्त ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोत चुनें ।
    नोट: यहां, एक superluminescent डायोड (SLD, 1a आंकड़ा,बी) के एक केंद्रीय तरंग दैर्ध्य के साथ ~ १,३२० एनएम और ~ ११० एनएम बैंडविड्थ एक ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।
  2. निर्माण संदर्भ हाथ और अक्टूबर प्रणाली के नमूना हाथ योजनाबद्ध ( चित्र 1aदेखें,बी विवरण के लिए) के बाद । ऑप्टिकल घटकों की एक सूची के लिए सामग्री की तालिका के लिए अक्टूबर प्रणाली का निर्माण देखें । सुनिश्चित करें कि संदर्भ हाथ और नमूना हाथ की ऑप्टिकल पथ लंबाई बारीकी से मिलान कर रहे हैं ।
  3. निर्माण स्पेक्ट्रोमीटर, एक संधानक, एक कद्दूकस कर, एक एफ थीटा लेंस और एक लाइन स्कैन कैमरा सहित (३४सेटअप के लिए चित्र 1C देखें) अक्टूबर के स्पेक्ट्रोमीटर डिजाइन की जानकारी के लिए वैकल्पिक रूप से, एक वाणिज्यिक स्पेक्ट्रोमीटर का चयन करें कि मैच केंद्र प्रकाश स्रोत के तरंग दैर्ध्य । सुनिश्चित करें कि स्पेक्ट्रोमीटर सही ढंग से पूरे लेजर बैंडविड्थ को कवर करने के लिए गठबंधन किया है, उच्च फोटॉन संग्रह दक्षता प्राप्त करने के लिए और धीमी गति से धोने के हस्तक्षेप पैटर्न के बाहर प्रदान करने के लिए ।
  4. OCT सिस्टम के प्रदर्शन की विशेषता है, जिसमें निंन मीट्रिक्स जैसे नमूना आर्म पावर, कुल इमेजिंग गहराई, गहराई-निर्भर संवेदनशीलता, अक्षीय रिज़ॉल्यूशन, फ़ोकस की गहराई और पार्श्व रिज़ॉल्यूशन शामिल हैं । गहराई से निर्भर संवेदनशीलता, अक्षीय संकल्प, और ध्यान की गहराई को मापने के लिए एक नमूना के रूप में एक कमजोर रिफ्लेक्टर (उदाहरणके लिए, एक तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ एक दर्पण) प्लेस । पार्श्व रिज़ॉल्यूशन की जांच करने के लिए नमूना के रूप में USAF रिज़ॉल्यूशन परीक्षण चार्ट लक्ष्य रखें ।
    नोट: इन मीट्रिक४५की विशेषता के लिए OCT प्रदर्शन और प्रोटोकॉल की मीट्रिक की परिभाषा के लिए संदर्भ३४,४५ देखें. हमारे अध्ययन में प्रयुक्त कस्टम OCT सिस्टम के लिए मापा मापदंडों की एक सूची के लिए 1 तालिका देखें ।
  5. विभिन्न कुओं में छवि ट्यूमर spheroids के लिए बहु-खैर प्लेट की क्षैतिज आंदोलन प्रदान करने के लिए एक मोटर अनुवाद मंच का चयन करें ( चित्र 1bदेखें) । बहु-खैर प्लेट के सभी कुओं की एक पूरी स्कैनिंग सुनिश्चित करने के लिए १०८ mm x ७२ mm से बड़ी यात्रा रेंज के साथ एक मंच का प्रयोग करें । उच्च प्रवाह इमेजिंग के लिए एक अच्छी तरह से और अक्टूबर प्रणाली के स्वचालन के सटीक स्थान को सक्षम करने के लिए सॉफ्टवेयर नियंत्रण के साथ एक 2d या 3 डी मोटर अनुवाद चरण का उपयोग करें ।
  6. एक प्लेट अनुकूलक का प्रयोग करें या एक प्लेट धारक डिजाइन (3 डी मुद्रण द्वारा) के लिए एक निश्चित स्थिति में बहु अच्छी तरह से थाली पकड़ ।
  7. झुकने और बहु के रोटेशन ठीक प्लेट एक 2d झुकाव मंच और एक रोटेशन चरण का उपयोग कर अनुवाद मंच पर घुड़सवार ( चित्र 1 d), किसी भी अक्टूबर इमेजिंग आयोजित करने से पहले विभिंन कुओं से ध्यान विमान की भिंनता को कम करने के लिए । अक्टूबर छवियों (आंकड़ा 1a) में अपने रिश्तेदार पदों की निगरानी जब मार्गदर्शक कुओं के रूप में D2, D11, बी-6, D6, G6 का प्रयोग करें ।
  8. थाली के रोटेशन को समायोजित करने के लिए थाली के किनारों को सुनिश्चित करने के लिए मंच आंदोलन की दिशा के साथ समानांतर रहे है ताकि कुओं OCT छवियों (चित्रा 1E) में एक ही क्षैतिज स्थिति में रहते हैं । प्लेट के झुकाव को ऑप्टिकल टेबल के समानांतर समायोजित करें ताकि कुओं अक्टूबर इमेजिंग (चित्रा 1F) के लिए एक ही ऊर्ध्वाधर स्थानों पर रहते हैं ।
    नोट: झुकाव कोण का समायोजन और ध्यान केंद्रित मदद सभी कुओं के लिए OCT छवि गुणवत्ता का अनुकूलन । हालांकि, विभिंन कुओं में संस्कृति मीडिया की ऊंचाई के रूपांतरों ऑप्टिकल रास्तों जो अंडाकार आकृति छवि का ध्यान केंद्रित करने के लिए नेतृत्व कर सकते है में परिवर्तन हो सकता है । ऑटो फोकस OCT इमेजिंग के फोकल विमान को नियंत्रित करने के लिए अनुकूलित छवि गुणवत्ता को प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है । समायोजन चरण में निंनलिखित मुद्दों के कारण ट्यूमर अंडाकार आकृति के गरीब OCT छवि गुणवत्ता का समाधान नहीं: अंडाकार आकृति प्रारंभिक सीडिंग स्थान के कारण विकेंद्रीकरण; अंडाकार आकृति उंनयन जब पूर्वनिर्मित extracellular मैट्रिक्स में एंबेडेड; अच्छी तरह से नीचे की ऊंचाई के बड़े बदलाव के साथ गरीब प्लेट गुणवत्ता । ऑटो फोकस या स्व-संरेखण कार्यों के साथ अतिरिक्त सॉफ्टवेयर नियंत्रण OCT इमेजिंग सिस्टम के प्रदर्शन का अनुकूलन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
  9. एक कस्टम कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए अक्टूबर छवि अधिग्रहण और मंच आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए एक अच्छी तरह से क्रमिक रूप से डेटा इकट्ठा ।

3. अक्टूबर स्कैनिंग और ट्यूमर Spheroids के प्रसंस्करण

  1. ट्यूमर spheroids के अक्टूबर इमेजिंग के दिन, मशीन से बहु अच्छी तरह से थाली ले । OCT इमेजिंग सिस्टम के तहत मल्टी वेल प्लेट को ट्रांसफर कर दीजिये । यह प्लेट एडाप्टर के शीर्ष पर रखें ।
    नोट: ट्यूमर spheroids के अक्टूबर इमेजिंग पर या बंद polystyrene प्लेट ढक्कन के साथ किया जा सकता है । हालांकि, कुओं से वाष्पीकरण के कारण ढक्कन पर पानी संघनित्र प्रकाश संचरण को प्रभावित कर सकते हैं और प्रकाश पथ को विकृत, spheroids से कम इष्टतम अक्टूबर छवियों उपज.
  2. अनुवाद चरण की z-दिशा के साथ चलती द्वारा प्लेट की ऊंचाई को समायोजित करें । एक अंडाकार आकृति के शीर्ष सतह के नीचे ~ 100-200 माइक्रोन पर फोकल विमान की स्थिति को बनाए रखने, गैर समान गहराई से वार फोकल प्रोफ़ाइल के प्रभाव को कम करने के लिए ।
  3. एक उचित OCT स्कैनिंग रेंज सेट करें (उदा, 1 मिमी x 1 मिमी) कस्टम सॉफ्टवेयर में अपने विकास के चरणों के अनुसार पूरे ट्यूमर अंडाकार आकृति को कवर करने के लिए । सेटिंग सहेजने के लिए पैरामीटर्स सहेजें क्लिक करें ।
  4. spheroids युक्त प्लेट के सभी कुओं के लिए एक एक करके 3 डी ट्यूमर spheroids के अक्टूबर छवियों को प्राप्त करने के लिए कस्टम सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । पूर्वावलोकन छवि देखने के लिए पूर्वावलोकन बटन क्लिक करें, और OCT छवि प्राप्त करने के लिए प्राप्त करें बटन क्लिक करे ।
    नोट: चरण गति में नहीं है जब सुनिश्चित करें कि OCT अंडाकार आकृति डेटा एकत्र कर रहे हैं । अंडाकार आकृति आमतौर पर यू नीचे के केंद्र में अच्छी तरह से स्थित है । हालांकि कल्चरल मीडिया में अंडाकार आकृति की जड़ता के कारण स्टेज को तेज करने या decelerating होने पर कल्चर मीडिया में अंडाकार आकृति शिफ्ट किया जा सकता है ।
  5. एक कस्टम C++ प्रसंस्करण कोड के साथ oct संरचनात्मक छवियों को उत्पन्न करने के लिए ट्यूमर spheroids की प्रक्रिया 3 डी अक्टूबर डेटासेट । OCT डेटा के पोस्ट-प्रोसेसिंग के फ़्लोचार्ट के लिए चित्र 2a देखें ।
    नोट: उत्पंन 3 डी अक्टूबर संरचनात्मक छवियों के लिए चित्रा 4a देखें ।
    1. ड्रेक्स्लर और Fujimoto३४ और जीआईपी एट अल के अध्याय 5 देखें । ४६ OCT डेटा के पोस्ट-प्रोसेसिंग चरणों के विवरण विवरण के लिए । सभी तीन आयामों में पिक्सेल आकार जांचना । पुनः सही तराजू पर OCT संरचनात्मक छवियों पैमाने ।
      नोट: अक्टूबर छवियों के अक्षीय दिशा (जेड दिशा) में दूरी संदर्भ हाथ और नमूना हाथ के बीच ऑप्टिकल पथ के अंतर का एक उपाय है । इस प्रकार, नमूना (n) के अपवर्तन सूचकांक को पुनः स्केलिंग के लिए अक्षीय दिशा में पिक्सेल आकार को जांचते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए । हमारे अध्ययन में, हम n = १.३७ ट्यूमर अंडाकार आकृति४२के अपवर्तन सूचकांक के रूप में उपयोग करें ।
  6. अंडाकार आकृति के केन्द्रक भर में तीन पार अनुभागीय XY, XZ, और YZ विमानों में 2 डी अक्टूबर छवियों का उपयोग कर अंडाकार आकृति छवियों का कोलाज उत्पन्न करें । अंडाकार आकृति छवियों के कोलाज के प्रतिनिधि निर्गम के लिए 3 सी चित्रा- देखें. सभी spheroids के लिए छवि पंजीकरण करते हैं, MATLAB समारोह dftregistration४७का उपयोग कर, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी अंडाकार आकृति के centroids लगभग एक ही स्थान पर स्थित हैं ।
  7. एक वाणिज्यिक या कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अंडाकार आकृति के 3 डी प्रतिपादन प्राप्त करें ।
    नोट: निम्नलिखित चरणों में एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ट्यूमर spheroids के 3 डी प्रतिपादन प्राप्त करने के लिए कैसे दिखा.
    1. सॉफ्टवेयर में 3 डी OCT डेटा लोड ।
    2. पार पैनल पर क्लिक करें । उसके बाद, नया वॉल्यूम जोड़ेंक्लिककरें । 3d रेंडरिंग के लिए उपयोग करने के लिए ब्लेंड मोड चुनें ।
    3. माउस सूचक का उपयोग करके छवि को खींचकर देखने वाले कोण को समायोजित करें ।

4. 3डी ट्यूमर Spheroids के रूपात्मक ठहराव

नोट: MATLAB में एक कस्टम लिखा कोड इस ठहराव प्रक्रियाओं । प्रक्रिया आरंभ करने के लिए चलाएँ बटन पर क्लिक करें. spheroids के रूपात्मक ठहराव के चरणों के फ़्लोचार्ट के लिए आरेख b देखें ।

  1. अंडाकार आकृति व्यास, ऊंचाई, और व्यास आधारित मात्रा यों तो ।
    1. तीन पार अनुभागीय XY, XZ, और YZ विमानों कि अंडाकार आकृति के केन्द्रक पार में 2 डी अक्टूबर छवियों का चयन करें ।
    2. XY और XZ विमानों में अंडाकार आकृति के व्यास और ऊंचाई को मापने के लिए क्रमशः ।
    3. का उपयोग कर व्यास आधारित अंडाकार आकृति मात्रा की Equation 1 गणना:, ट्यूमर के गोलाकार आकार की एक धारणा के साथ.
  2. voxel-आधारित अंडाकार आकृति वॉल्यूम को बढ़ाता है ।
    1. speckles निकालने के लिए अंडाकार आकृति के OCT संरचनात्मक डेटा पर एक 3d औसत फ़िल्टर लागू करें ।
    2. सेगमेंट ट्यूमर अच्छी तरह से नीचे से ट्यूमर अंडाकार आकृति क्षेत्र को अलग करने के साथ एक उचित सीमा के साथ, डिब्बाबंद एज डिटेक्शन४८ फिल्टर, फ्रेम का उपयोग कर spheroids ।
    3. 3d डेटा के लिए समूह संयोजी voxels (अंतर्निहित फ़ंक्शन: bwconncomp) देखें ।
    4. प्रत्येक समूह के लिए समूह में प्रत्येक संयोजी voxel और अंडाकार आकृति केन्द्रक (मैन्युअल रूप से चुना) के बीच माध्य दूरी की गणना करें. न्यूनतम माध्य दूरी के साथ समूह के रूप में अंडाकार आकृति क्षेत्र की पहचान करें ।
    5. अंडाकार आकृति क्षेत्र के भीतर voxels की संख्या गिनती और फिर एक व्यक्ति voxel (volume/voxel) की वास्तविक मात्रा से गुणा, अंडाकार आकृति की कुल मात्रा उपज ।

5. मृत-3 डी ट्यूमर Spheroids के सेल क्षेत्र का पता लगाने

नोट: एक सजातीय माध्यम में, अक्टूबर वापस-बिखरे हुए तीव्रता गहराई के एक समारोह के रूप में पता चला (मैं(जेड)) बियर द्वारा वर्णित किया जा सकता है-Lambert कानून४९: Equation 2 , जहां जेड गहराई का प्रतिनिधित्व करता है, μ ऑप्टिकल क्षीणन है गुणांक, और मैं0 नमूना के लिए घटना तीव्रता है । इसलिए व्युत्पंन ऑप्टिकल क्षीणन गुणांक के रूप में व्यक्त किया जा Equation 3 सकता है: । के बाद से अक्टूबर छवियों अक्सर एक लघुगणक पैमाने पर रची गई हैं, oct तीव्रता प्रोफ़ाइल की ढलान को ऑप्टिकल क्षीणन गुणांक प्राप्त किया जा सकता है । ऑप्टिकल क्षीणन नक्शे की पीढ़ी के एक फ़्लोचार्ट के लिए चित्रा 2c देखें ।

  1. अंडाकार आकृति के बाहर अवांछित क्षेत्रों को हटाने के लिए फॉल्ट को पूरा करें । बिंदु शोर है कि अक्टूबर छवियों में निहित है को दबाने के लिए 3 डी औसत फिल्टर प्रदर्शन ।
  2. एक निश्चित गहराई रेंज (चलती खिड़की) से अधिक रैखिक फिटिंग लॉग-स्केल OCT तीव्रता प्रोफ़ाइल द्वारा पिक्सेल-वार ऑप्टिकल क्षीणन गुणांक प्राप्त करें, अपनी ढाल निकालने, और-1/2 द्वारा ढलान गुणा ।
    नोट: खंड अंडाकार आकृति क्षेत्र के भीतर प्रत्येक voxel में क्षीणन गुणांक एक 10-voxel गहराई विंडो में OCT तीव्रता प्रोफ़ाइल की ढलान के आधार पर गणना की है (~ ४० माइक्रोन में), खिड़की के बीच में स्थित voxel के साथ.
  3. ऊपर दिए गए तरीकों को लागू करें (चरण ५.१ और ५.२) प्रत्येक अक्षीय स्कैन करने के लिए एक फ़्रेम में और प्रत्येक फ़्रेम में एक 3d dataset से युक्त अंडाकार आकृति क्षेत्र खंड अंडाकार आकृति क्षेत्र के सभी voxels के लिए ऑप्टिकल क्षीणन गुणांक परिकलित हैं ।
  4. उच्च क्षीणन क्षेत्र को हाइलाइट करने के लिए बाइनरी थ्रेशोल्ड निष्पादित करें ।
    नोट: हुआंग एट अल देखें । हिस्टोग्राम विश्लेषण का उपयोग कर उच्च क्षीणन क्षेत्र की दहलीज के निर्धारण के लिए ४२
  5. मृत-कोशिका क्षेत्र (सम्मिश्रण) को लेबल करने के लिए मूल छवि पर बायनेरिज़ ऑप्टिकल क्षीणन मानचित्र हाइलाइट करें । मृत-कोशिका क्षेत्र के 3d वितरण कल्पना करने के लिए मिश्रित क्षीणन नक्शे के 3 डी प्रदान की छवि उत्पन्न करते हैं ।

6. प्रोटोकॉल और Immunohistochemistry

नोट: प्रोटोकॉल और immunohistochemistry (आइएचसी) ट्यूमर spheroids के दाग छवियों इसी OCT परिणाम के साथ सहसंबंधी करने के लिए प्राप्त कर रहे हैं ।

  1. चयनित समय बिंदुओं पर, प्रोटोकॉल और आइएचसी धुंधला के लिए मल्टी-वेल प्लेट से 1-2 ट्यूमर spheroids का चयन करें । 1 मिलीलीटर पिपेट युक्तियों के साथ एक पिपेट का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से एक १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब से अंडाकार आकृति हस्तांतरण ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि टिप के उद्घाटन ट्यूमर अंडाकार आकृति के आकार से बड़ा है अंडाकार आकृति की संरचना को नुकसान से बचने के लिए स्थानांतरण से पहले 1 मिलीलीटर पिपेट टिप में कटौती ।
  2. एक एकल १.५ मिलीलीटर microcentrifuge 10% formaldehyde से भरा ट्यूब और ४८ एच के लिए फिक्स में प्रत्येक ट्यूमर अंडाकार आकृति लीजिए ।
  3. प्रत्येक अंडाकार आकृति के लिए प्रोटोकॉल और आइएचसी प्रक्रियाओं प्रदर्शन, मानक तेल embedding तकनीक का उपयोग कर ।
    नोट: hematoxylin और eosin (एच & ई) और टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ dUTP निक एंड लेबलिंग (TUNEL) apoptosis डिटेक्शन के लिए ट्यूमर spheroids के 5 माइक्रोन मोटी वर्गों दाग । TUNEL करने के लिए hematoxylin का एक counterstaining लागू है । सना हुआ नमूना स्कैन करने और उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऊतकवैज्ञानिक और आइएचसी छवियों को प्राप्त करने के लिए एक डिजिटल स्लाइड स्कैनर का उपयोग किया गया था ।

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Representative Results

एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट में Spheroids के उच्च प्रवाह ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी इमेजिंग

चित्रा 3 2 दिन पर HCT ११६ ट्यूमर spheroids के साथ एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट की एचटी-OCT स्कैनिंग के परिणाम प्रदर्शित । पूरी प्लेट के अनुक्रमिक स्कैन नीचे सही अच्छी तरह से (H12) से शुरू होता है । चित्र बी एच टी-OCT प्रणाली के सॉफ्टवेयर कार्यांवयन के प्रवाह चार्ट से पता चलता है । एक अंडाकार आकृति डेटा के बाद एकत्र और संसाधित किया गया, प्लेट अगले अच्छी तरह से करने के लिए कदम होगा, ~ 2 s के लिए प्रतीक्षा करने के लिए अंडाकार आकृति आराम करने की अनुमति है, और अगले अंडाकार आकृति डेटा इकट्ठा । प्रत्येक OCT डेटा ४०० x ४०० x १०२४ voxels से मिलकर बनता है, जो १.० x ०.८४ x २.३ mm3की वास्तविक मात्रा से संबंधित है । चित्रा 3 सी HCT ११६ spheroids के एन चेहरा अक्टूबर छवियों के एक महाविद्यालय से पता चलता है संसाधित डेटा से उत्पंन । परिणाम अंय 2d उच्च-प्रवाह इमेजिंग प्रणाली22से छवियों के साथ तुलनीय है । अक्टूबर की 3 डी इमेजिंग क्षमता को देखते हुए, हम भी ९६ वेल्स (चित्रा 3 डी) से 2d क्रॉस-अनुभागीय अंडाकार आकृति छवियों के महाविद्यालय उत्पंन करने के लिए अंडाकार आकृति हाइट्स की निगरानी और ऊर्ध्वाधर दिशा में अंडाकार आकृति सजातीय कल्पना सकता है । 3d गाया अंडाकार आकृति छवियों का एक महाविद्यालय समग्र 3 डी आकार कल्पना और अंडाकार आकृति के दौर का मूल्यांकन करने के लिए किसी भी पूर्वनिर्धारित कोण (चित्रा 3E) से भी व्यवहार्य है । ध्यान दें कि समग्र OCT इमेजिंग और पूरे ९६ के लिए प्रक्रिया समय-अच्छी तरह से थाली ~ 21 मिनट और ~ 25 मिनट होगा जब लाइन-स्कैन कैमरा ९२ khz और ४७ khz, क्रमशः की गति से चल रहा है । एक उदाहरण के लिए वीडियो 1 देखें ।

अनुदैर्ध्य रूपात्मक और ट्यूमर अंडाकार आकृति की शारीरिक निगरानी

के बाद हम एकाधिक समय अंक के लिए थाली से spheroids ट्यूमर के अक्टूबर संरचनात्मक छवियों प्राप्त की, हम आगे रूपात्मक और ट्यूमर spheroids के शारीरिक जानकारी को बढ़ाता द्वारा इन आंकड़ों का विश्लेषण कर सकता है । चित्रा 4 ट्यूमर spheroids की विशेषता और उन से अनुदैर्ध्य रूपात्मक और शारीरिक जानकारी प्राप्त करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण से पता चलता है.

चित्रा 4B ट्यूमर अंडाकार आकृति कल्पना करने के लिए विभिन्न तरीकों से पता चलता है. या तो वाणिज्यिक या मुफ्त सॉफ्टवेयर की सहायता के साथ, हम सॉफ्टवेयर में 3 डी डेटा लोड और ट्यूमर अंडाकार आकृति (3 डी प्रतिपादन) है, जो 3 डी अंतरिक्ष में ट्यूमर अंडाकार आकृति की समग्र संरचना से पता चलता है की एक "मात्रा" बना सकते हैं । उचित थ्रेसहोल्ड के साथ, हम ट्यूमर अंडाकार आकृति (चित्रा 4B), जो अंडाकार आकृति खंड और माप मात्रा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक सतह भूखंड उत्पंन कर सकता है । हम अलग-अलग ओरिएंटेशन (फिगर 4B, XZ, YZ, और XY) में विभिन्न क्रॉस-सेक्शन विमानों से ओर्थोगोनल स्लाइड (ऑर्थो स्लाइड) भी जेनरेट कर सकते हैं और इन अंडाकार आकृति स्लाइड्स से ट्यूमर ऑर्थो के व्यास और ऊँचाई को मापने के लिए ।

एकाधिक समय बिंदु से एक ही अंडाकार आकृति के OCT डेटा सभा, हम रूपात्मक जानकारी यों तो और अंडाकार आकृति के विकास वक्र उत्पंन करने के लिए अपनी अनुदैर्ध्य परिवर्तन दिखा सकता है । चित्र 4c एक HCT ११६ ट्यूमर के प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है अंडाकार आकृति 21 दिनों के लिए निगरानी की जा रही है । खंड डेटा और ऑर्थो स्लाइड से, हम सभी समय बिंदु है, जो तालिका में सूचीबद्ध थे के लिए अंडाकार आकृति के व्यास, ऊंचाई और voxel-आधारित मात्रा मापा । हम भी एक तुलना के लिए व्यास आधारित मात्रा की गणना । आकार और मात्रा में वृद्धि curves, क्रमशः साजिश रची गई । विकास घटता से, हम देख सकते है कि इस HCT ११६ ट्यूमर अंडाकार आकृति 11 दिन से पहले मात्रा में एक रैखिक विकास पैटर्न पीछा किया । इस समय से पहले, अंडाकार आकृति बढ़ रही है और एक अपेक्षाकृत समान आकार बनाए रखा । हालांकि, 11 दिन के बाद, अंडाकार आकृति बाधित हो गया, समतल और पूरी तरह से 21 दिन पर ढह गई । voxel-आधारित खंड के विकास वक्र स्पष्ट रूप से 11 दिन के बाद एक धीरे से कम मात्रा के साथ रुझान, दिखाता है ।

OCT डेटा के आधार पर, हम भी 2d क्रॉस-अनुभागीय छवियों से पिक्सेल-द्वारा-पिक्सेल ऑप्टिकल क्षीणन का विश्लेषण करके ट्यूमर spheroids के भीतर मृत कोशिकाओं के वितरण के शारीरिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं । चित्रा 2 और प्रोटोकॉल 5 में सचित्र तरीकों के बाद, हम मात्रात्मक मृत सेल क्षेत्रों का निर्धारण और समय के एक समारोह के रूप में इन क्षेत्रों के विकास की निगरानी सकता है । चित्रा 4d मृत-ट्यूमर अंडाकार आकृति में सेल क्षेत्रों की वृद्धि की अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग के एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है । लाल रंग में प्रकाश डाला क्षेत्रों, जो उच्च ऑप्टिकल क्षीणन था, लेबल गल क्षेत्रों दिखाओ । 14 दिन के विकास के दौरान 3 डी गाया ऑप्टिकल क्षीणन नक्शे से, हम लाल क्षेत्र का विस्तार देख सकते हैं, गल क्षेत्रों की वृद्धि का संकेत है । के रूप में गल क्षेत्रों का प्रतिशत बढ़ गया, ट्यूमर अंडाकार आकृति अपनी सही आकार बनाए रखने नहीं कर सका । इसलिए, वे बाधित और पतन, जो चित्रा 4cमें ट्यूमर आकृति विज्ञान के अनुदैर्ध्य निगरानी में देखा गया करते हैं ।

प्रस्तावित विनाशकारी मृत ऊतक क्षेत्र का पता लगाने तकनीक प्रोटोकॉल और आइएचसी द्वारा प्राप्त इसी छवियों के साथ HCT ११६ ट्यूमर अंडाकार आकृति के OCT ऑप्टिकल क्षीणन नक्शे की तुलना द्वारा सत्यापित किया गया था । चित्रा 4d एक दिन 14 HCT ११६ अंडाकार आकृति के साथ ऐसी तुलना प्रस्तुत करता है । अक्टूबर क्षीणन नक्शा और इसी एच & ई और TUNEL स्लाइस के बीच एक अच्छा मैच पाया गया, जो एच & ई और TUNEL में क्षेत्रों के भीतर सुविधाओं का विश्लेषण द्वारा संकेत दिया गया था डैश अक्टूबर उच्च क्षीणन के समोच्च से व्युत्पंन लाइनों द्वारा चिह्नित क्षेत्रों. एच & ई स्लाइस में, मृत ऊतक क्षेत्रों डैश्ड लाइन क्षेत्र के भीतर स्थित कम घने और एकत्रित संरचना द्वारा संकेत दिया गया था । TUNEL स्लाइस में, एक अच्छा मैच उच्च क्षीणन क्षेत्र और TUNEL-लेबल अपोप्तोटिक सेलुलर क्षेत्र के बीच मनाया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: ट्यूमर अंडाकार आकृति इमेजिंग के लिए एक उच्च प्रवाह ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एचटी-OCT) प्रणाली का निर्माण । () एचटी-OCT सिस्टम की योजनाबद्धता । ९६-well थाली का एक आरेख अक्टूबर प्रणाली के बगल में रची गई है । पीले रंग में लेबल पांच कुओं (D2, D11, बी-6, D6, G6) में चरणों के ठीक समायोजन के लिए उपयोग किया जाता है (D) । () एचटी-OCT प्रणाली का वास्तविक विन्यास । सिस्टम के प्रत्येक भाग के लिए उपयोग किए गए ऑप्टिकल घटकों के लिए सामग्री तालिका देखें । () एचटी-OCT प्रणाली के लिए स्पेक्ट्रोमीटर डिजाइन । () एचटी-OCT प्रणाली के लिए स्टेज सेटअप । 6 धुरी चरण और अक्टूबर अधिग्रहण और मंच आंदोलन के बीच तुल्यकालन के उचित संरेखण उच्च प्रवाह इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं । () और () रोटेशन के प्रभाव दिखाने के लिए और विभिंन कुओं की अंतिम छवि पर झुका । रोटेशन अलग कुओं के OCT छवियों को क्षैतिज बदलाव का कारण बनता है जबकि झुकने के लिए विभिंन कुओं के ऊर्ध्वाधर स्थानांतरण का नेतृत्व करेंगे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ट्यूमर spheroids के अक्टूबर छवियों के लिए डेटा प्रोसेसिंग । (A) OCT डेटा के लिए सामांय पोस्ट-प्रोसेसिंग चरणों का फ़्लोचार्ट । () ट्यूमर अंडाकार आकृति के रूपात्मक ठहराव का फ़्लोचार्ट । () ट्यूमर अंडाकार आकृति के मृत कोशिका क्षेत्र का पता लगाने का प्रवाह । स्केल बार: १०० µm सभी उपआकृति के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: उच्च प्रवाह एक ९६ अच्छी तरह से युक्त प्लेट की स्कैनिंग अक्टूबर U-८७ मिलीग्राम ट्यूमर spheroids । () उद्देश्य के तहत ९६-well थाली के साथ वास्तविक सेटअप । () एचटी-OCT प्रणाली के सॉफ्टवेयर कार्यांवयन का प्रवाह चार्ट । ९६ en face (C) का कोलाज, क्रॉस-सेक्शनल (D) और 3d रेंडर किए गए अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन (MIP) (E) OCT छवियां दिन के 3 HCT ११६ spheroids संसाधित डेटा से जनरेट किया गया । स्केल बार: २०० µm सभी उपआकृति के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4:3 डी अक्टूबर डेटा के साथ ट्यूमर Spheroids के अनुदैर्ध्य रूपात्मक और शारीरिक ठहराव । (एक) प्राप्त 3 डी अक्टूबर सामांय के बाद एक ट्यूमर अंडाकार आकृति के संरचनात्मक छवियों के बाद प्रसंस्करण । OCT डेटा से, हम किसी भी दिशा (B) में ट्यूमर अंडाकार आकृति की संरचना को विज़ुअलाइज़ करने के लिए 3d surface प्लॉट और XZ, YZ और XY ओर्थोगोनल स्लाइस जेनरेट कर सकते हैं । हम एक एकल ट्यूमर अंडाकार आकृति (सी) के अनुदैर्ध्य निगरानी प्रदर्शन कर सकते हैं, निस्र्पक इसके व्यास, ऊंचाई और voxel-आधारित मात्रा ( सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध) और 21-दिन के दौरान आकार और मात्रा में विकास घटता की साजिश रचने विकास. उदाहरण में, के रूप में विकसित अंडाकार आकृति, यह दिन 11 पर बाधित हो गया और पूरी तरह से 21 दिन पर ढह गई । हम आगे ऑप्टिकल आंतरिक क्षीणन कंट्रास्ट (डी) के आधार पर एक ट्यूमर अंडाकार आकृति longitudinally की शारीरिक स्थिति की निगरानी कर सकते हैं । एक ट्यूमर अंडाकार आकृति के 3 डी गाया छवियों उपस्थिति और मृत-सेल क्षेत्रों के विकास के 7 दिन से 14 दिन के लिए दिखाया । उच्च क्षीणन-लेबल मृत-सेल क्षेत्रों में लाल ऊतकवैज्ञानिक और immunohistochemical (आइएचसी) परिणामों के साथ मिलान किया गया । अक्टूबर क्षीणन नक्शा, एच & ई, और चित्रा 4d में TUNEL परिणाम रेफरी. ४२ से संशोधित कर रहे हैं । पैमाने सलाखों: १०० µm सभी उपआकृति के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 1
वीडियो 1: ट्यूमर spheroids के उच्च प्रवाह OCT इमेजिंग । 3d oct इमेजिंग, बेसिक oct प्रोसेसिंग और स्टेज मूवमेंट का एक कार्यप्रवाह वीडियो में 5x स्पीड के साथ पेश किया गया । प्रोसेसेस की झलकियां OCT spheroids की संरचनात्मक छवियां भी प्रस्तुत की गई । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

ट्यूमर गतिविधि अपने रूपात्मक संरचना के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है । 2d सेल संस्कृतियों के लिए विशेषता वृद्धि वक्र निगरानी के लिए इसी तरह, 3 डी ट्यूमर spheroids के लिए विकास वक्र ट्रैकिंग भी एक पारंपरिक दृष्टिकोण के लिए विभिंन सेल लाइनों के लिए दीर्घकालिक अंडाकार आकृति विकास व्यवहार की विशेषता है । विशेष रूप से, हम ट्यूमर क्षरण या ट्यूमर regrowth सीधे वृद्धि वक्र में परिलक्षित विश्लेषण द्वारा दवा की प्रतिक्रिया को चिह्नित कर सकते हैं । इसलिए, आकार और मात्रा सहित 3 डी ट्यूमर spheroids के मात्रात्मक मूल्यांकन, विकास वक्र प्राप्त करने के लिए, ट्यूमर spheroids के लक्षण वर्णन और यौगिक प्रभाव के मूल्यांकन के लिए बहुत महत्व का है । वर्तमान में, उज्ज्वल क्षेत्र, चरण कंट्रास्ट या फ्लोरोसेंट इमेजिंग के आधार पर इमेजिंग प्लेटफार्मों नियमित इमेजिंग और आकृति विज्ञान या 3d ट्यूमर spheroids8,9,18के कार्यों के विश्लेषण के लिए स्थापित किया गया है, 22. हालांकि, वे सीमित गहराई पैठ के साथ ही कम संकल्प गहराई-संपति के कारण पूरे, बड़े ट्यूमर संरचना को हल करने में असमर्थ हैं । प्रतिनिधि परिणामों में, हम समय के साथ विकासशील अंडाकार आकृति ट्यूमर के पूरे 3 डी संरचना कल्पना करने के लिए अक्टूबर का प्रदर्शन किया है । 3 डी अक्टूबर इमेजिंग किसी भी अभिविंयास में अंडाकार आकृति के दृश्य प्रदान कर सकता है और उच्च संपति है, जो पारंपरिक इमेजिंग विधियों कि गहराई के साथ संकल्प की कमी में उपलब्ध नहीं था के साथ किसी भी पार अनुभाग । इसके अलावा, voxel आधारित मात्रा ठहराव 3 डी OCT डेटा पर आधारित उनके मूल आकार संभालने के बिना अंडाकार आकृति संस्करणों का एक सटीक ठहराव झुकेंगे । इसलिए, हम प्रदर्शन किया है कि अक्टूबर ट्यूमर spheroids की 3 डी आकृति विज्ञान विशेषता के लिए एक मजबूत इमेजिंग मोडल है, जो अलग सेल लाइनों के लिए विशिष्ट विकास पैटर्न के सटीक माप सुनिश्चित करता है और संभावित एक के रूप में सेवा कर सकते हैं दवा प्रतिक्रिया मूल्यांकन के लिए वैकल्पिक ।

व्यवहार्यता फ्लोरोसेंट धुंधला का उपयोग परीक्षण ट्यूमर spheroids के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक लोकप्रिय दृष्टिकोण रहते हैं, विशेष रूप से दवा स्क्रीनिंग18के लिए । हालांकि, फ्लोरोसेंट रंजक की विघटनकारी प्रकृति इंगित करता है कि इन परीक्षणों केवल अंत बिंदु अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं । हमारे प्रतिनिधि परिणामों में (चित्रा 4d), हम एक वैकल्पिक तरीका है कि पूरे अंडाकार आकृति के भीतर सेल व्यवहार्यता की विशेषताएं कर सकते है प्रदर्शन किया । हमारे परिणामों से पता चला है कि अक्टूबर मृत-आंतरिक ऑप्टिकल क्षीणन कंट्रास्ट के आधार पर अंडाकार आकृति में व्यवहार्य क्षेत्र से सेल क्षेत्र भेद सकता है । इसके अलावा, 3 डी इमेजिंग क्षमता और अक्टूबर प्रणाली की गैर विनाशकारी प्रकृति, मृत के मात्रात्मक मूल्यांकन-सेल वितरण और मृत-कोशिका क्षेत्रों की प्रगति की सीटू निगरानी में अंडाकार आकृति के भीतर संभव है, जो संभावित अंडाकार आकृति विकास पैटर्न की अधिक मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं । हालांकि, हमें ध्यान देना चाहिए कि, हमारे प्रतिनिधि परिणामों में, हम इस तरह के apoptosis और परिगलन के रूप में सेल मौत मोड के विभिन्न प्रकार के अंतर करने में सक्षम नहीं हैं, द्विआधारी अक्टूबर क्षीणन नक्शे में.

के बाद से एक दवा यौगिक पुस्तकालय व्यापक हो सकता है (> 10000), एक उच्च प्रवाह और मजबूत प्रणाली दवा स्क्रीनिंग के दौरान बहु-खैर प्लेटों में ट्यूमर spheroids को चिह्नित करने के लिए आवश्यक है । वर्तमान उच्च प्रवाह इमेजिंग प्रणाली 2 डी स्कैन मोड22में < 5 मिनट में पूरी ९६-अच्छी तरह से थाली की एक स्क्रीनिंग हासिल कर सकते हैं । OCT उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग उद्देश्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, एक मोटर चालित मंच की सहायता के साथ । एक भी एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध oct प्रणाली प्राप्त कर सकते है (वाणिज्यिक oct प्रणालियों की एक सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें) हमारे कस्टम अक्टूबर प्रणाली के लिए एक समान प्रदर्शन के साथ, और प्रणाली में एक मोटर की अवस्था को शामिल । हालांकि, प्रयासों को संशोधित करने के लिए किया जाना चाहिए वाणिज्यिक अक्टूबर प्रणाली के लिए मोटर के स्तर को एकीकृत । इसके अलावा, कस्टम सॉफ्टवेयर कार्यांवयन OCT अधिग्रहण ट्रिगर और मंच आंदोलन ट्रिगर के बीच तुल्यकालन का एहसास करने के लिए आवश्यक है । हमारे प्रोटोटाइप एचटी-अक्टूबर प्रणाली के लिए, यह 2-18 सेकंड के लिए एक एकल ट्यूमर अंडाकार आकृति से एक 3 डी अक्टूबर डेटा प्राप्त करने के लिए, कैमरा गति की पसंद पर निर्भर करता है । इस प्रकार, कुल अधिग्रहण समय के रूप में कम के रूप में ~ ३.२ मिनट के रूप में एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट एचटी-OCT प्रणाली का उपयोग कर सकते हैं । हालांकि, वर्तमान एचटी-अक्टूबर प्रणाली के लिए मध्यवर्ती कदम, डाटा प्रोसेसिंग सहित, पढ़ने और हार्ड ड्राइव पर डेटा लेखन, और मंच आंदोलनों, समय लेने वाली बनी रही । अतिरिक्त ~ 18 मिनट ~ ३.२ ंयूनतम डाटा अधिग्रहण समय के शीर्ष पर की जरूरत होगी । कुल इमेजिंग समय आगे कई पहलुओं में कम किया जा सकता है: का उपयोग राज्य के-कला OCT एक उच्च गति स्वरित्र लेजर स्रोत५०,५१के साथ सुसज्जित प्रणालियों; समानांतर में कार्य करने वाले महत्वपूर्ण चरणों (डेटा प्राप्ति, डेटा संसाधन, लेखन, चरण आंदोलन) की व्यवस्था करके वर्कफ़्लो को ऑप्टिमाइज़ किया गया; एक अंतरिक्ष के साथ एक समानांतर OCT इमेजिंग रोजगार-विभाजन division सेटअप५२। प्रणाली अनुकूलन के साथ, उच्च प्रवाह OCT प्रणाली कैंसर की दवा की खोज में उपयोग किया जा सकता है और साथ ही अंय 3 डी जैव गढ़े नमूनों के लक्षण वर्णन (जैसे, 3 डी ऊतक organoids) विभिंन बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा हित का खुलासा ।

Acknowledgments

यह काम NSF ग्रांट्स IDBR (DBI-१४५५६१३), PFI: एयर-टीटी (आईआईपी-१६४०७०७), NIH पलाश R21EY026380, R15EB019704 और R01EB025209, और Lehigh यूनिवर्सिटी स्टार्टअप फंड द्वारा सपोर्ट किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

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References

  1. WHO. Cancer. Available from: http://www.who.int/cancer/en/ (2018).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, (8), 711-716 (2004).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9, (9), 1115-1128 (2014).
  5. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, (4849), 177-184 (1988).
  6. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  7. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4, (3), 309-324 (2009).
  8. Tung, Y. -C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136, (3), 473-478 (2011).
  9. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
  10. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  11. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  12. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11, (7), 435-448 (2013).
  13. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323, (1), 131-143 (2014).
  14. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  15. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12, (4), 207-218 (2014).
  16. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10, (6), e0130348 (2015).
  17. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  18. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  19. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  20. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  21. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241, (9), 939-954 (2016).
  22. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. 2211068216652846 (2016).
  23. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
  24. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13, (11), 3724-3735 (2016).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118, (2), 95-106 (2015).
  27. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  28. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5, (9), 675-688 (2005).
  29. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, (5035), 1178-1181 (1991).
  30. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19, (7), 071412 (2014).
  31. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57, (9), OCT1-OCT13 (2016).
  32. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12, (5), 363-368 (2012).
  33. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49, (16), D30-D61 (2010).
  34. Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography: technology and applications. Springer Science, Business Media. (2008).
  35. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95, (2), 171 (2011).
  36. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve - a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37, (1), 90-99 (2009).
  37. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26, (1), 57-77 (2007).
  38. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  39. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1, (1), 5 (2015).
  40. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29, (2), 273-278 (2006).
  41. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52, (8-9), 728-744 (2012).
  42. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77, (21), 6011-6020 (2017).
  43. Spalteholz, W. Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. Verlag von S. Hirzel. (1911).
  44. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4, (4), 331 (2007).
  45. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11, (8), 889-894 (2003).
  46. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. International Society for Optics and Photonics. 85710Z (2013).
  47. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33, (2), 156-158 (2008).
  48. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  49. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5, (1), 322-337 (2014).
  50. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  51. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8, (2), 828-859 (2017).
  52. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

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