利用体外荧光共振能量转移研究毫秒时间尺度蛋白质配合物的动力学

Biochemistry

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Summary

蛋白质-蛋白质相互作用对生物系统至关重要, 对结合动力学的研究为蛋白质复合物的动力学和功能提供了见解。我们描述了一种利用荧光共振能量转移和停止流动技术量化蛋白质复合物动力学参数的方法。

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Garsamo, M., Zhou, Y., Liu, X. Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale. J. Vis. Exp. (145), e59038, doi:10.3791/59038 (2019).

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Abstract

蛋白质是生物系统的主要操作人员, 它们通常与其他大分子或小分子相互作用, 以发挥其生物功能。这种相互作用可以是高度动态的, 这意味着相互作用的子单位以一定的速度不断地联系和分离。虽然使用定量下拉式等技术测量结合亲和力可以揭示相互作用的强度, 但研究结合动力学可以提供有关相互作用发生的速度以及每个复合物存在多长时间的见解。此外, 在存在蛋白质交换因子或药物等附加因素的情况下测量相互作用的动力学, 有助于揭示相互作用受另一个因素调节的机制, 为生物和医学研究的进步。在这里, 我们描述了一个协议, 用于测量具有高内在关联率并可由另一种蛋白质快速分离的蛋白质复合体的结合动力学。该方法利用荧光共振能量转移报告蛋白质复合物的体外形成, 并能实时监测停止流动的荧光仪上的蛋白质复合物的快速关联和离解。利用该方法, 对蛋白质复合物的关联和离解速率常数进行了定量。

Introduction

生物活动最终是由蛋白质进行的, 其中大部分蛋白质与其他蛋白质相互作用, 以获得适当的生物功能。使用计算方法, 人类蛋白质相互作用的总量估计为约 650, 000,1, 而这些相互作用的中断往往导致疾病2。由于其在控制细胞和组织过程中的重要作用, 研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法已被开发出来, 如酵母-双杂交, 双分子荧光互补, 分裂荧光酶互补, 联合免疫沉淀检测3。虽然这些方法善于发现和确认蛋白质-蛋白质相互作用, 但它们通常是非定量的, 因此提供的相互作用的蛋白质伙伴之间的亲和力有限。定量拉下可以用来测量结合亲和力 (例如, 离解常数kd), 但它不测量结合的动力学, 也不能在 k d 由于不足而非常低的情况下应用信噪比4。表面等离子体共振 (spr) 光谱量化了结合动力学, 但它需要一个特定的表面和在表面的一个反应物的固定, 这可能会改变反应物5的结合性能。此外, spr 很难测量快速关联和离解率5, 使用 spr 来表征蛋白质复合体中交换蛋白质亚基的事件是不合适的。在这里, 我们描述了一种方法, 允许测量在毫秒时间尺度上的蛋白质复杂组装和拆卸速率。该方法对于确定 c ullin-a ssociated-edd8-d 同体蛋白 1 (cand1) 作为 f- 盒蛋白交换因子6,7的作用至关重要.

cand1 调节 Skp1•Cul1•F 盒蛋白 (scf) e3 脂类的动态, e3 配体属于库林-岭泛素脂质的大家族。scfs 由结合 ing 域蛋白 rbx1 的 cullin cullin 和一种可互换的 f-箱蛋白组成, 后者通过适配器蛋白 skp18 招募基质并将 cullin 结合。作为 e3 连接酶, scf 催化泛素与底物的结合, 当底物被 f-盒蛋白吸收, 当 cul1 被泛素样蛋白 nedd89 修饰时, 它就会被激活。cand1 结合未经修饰的 cul1, 在结合时, 它破坏了 Skp1•F 盒蛋白与 cul1 的联系, 以及 ned8 与 cul1111213的结合。因此, cand1 似乎是体外 scf 活性的抑制剂, 但体内的 cand1 缺乏引起了缺陷, 表明 cand1 在调节体内 scf 活性方面发挥了积极作用 141516,17. 这一悖论最终通过一项定量研究得到了解释, 该研究揭示了 cul1、cand1 和 Skp1•F 盒蛋白之间的动态相互作用。利用荧光共振能量传递 (fret) 检测 scf 和 Cul1•Cand1 配合物的形成, 分别检测出关联和离解速率常数 (分别为 kon k)。单独测量。测量结果表明, cand1 和 Skp1•F 盒蛋白与 cul1 的复合体极其紧密, 但 scf 的k含量因 cand1 而急剧增加, Cul1•Cand1 的k含量大幅增加由 Skp1•F 盒蛋白6,7。这些结果为定义 cand1 作为蛋白质交换因子的作用提供了初步和关键的支持, 该因子通过从旧的 scf 复合物中回收 cul1 来催化新的 scf 复合物的形成。

本文介绍了利用 fret 法研究 Cul1•Cand1 复合物7动力学的方法, 并将同样的原理应用于各种生物分子的动力学研究。当供体被适当的波长激发, 而具有激发谱重叠供体发射光谱的受体存在于10-100 的距离内时, 就会发生 fret。激发态转移到受体, 从而降低供体强度, 增加受体强度18。fret (e) 的效率取决于 förster 半径 (r0) 和供体与受体荧光 (r) 之间的距离, 定义为: e = r0 6/(r0 )6 + r6)。förster 半径 (r0) 取决于几个因素, 包括偶极子角方向、供体受体对的光谱重叠和使用的解 19.为了将 fret 检测应用于停止流式荧光仪上, 该方法实时监测供体排放的变化, 并能够测量快速k,有必要建立高效的 fret, 以实现从而显著减少了捐助方的排放。因此, 通过选择合适的对荧光染料和在目标蛋白上的位点来连接染料来设计高效的 fret 是非常重要的, 将在本方案中进行讨论。

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Protocol

1. 设计 fret 检测。

  1. 从蛋白质数据库 (文件 1u6g) 下载 Cul1•Cand1 复合体的结构文件。
  2. 查看 pymol 中 Cul1•Cand1 复合体的结构。
  3. 使用 pymol 向导菜单下的测量功能来估计 cand1 的第一个氨基酸和 cul1 的最后一个氨基酸之间的距离 (图 1)。
  4. 加载在线光谱查看器 (见材料表), 同时查看 7-氨基-4-甲基香豆素 (amc) 和 flash 的激发和发射光谱 (图 2)。请注意, amc 是 fret 供体, flash 是 fret 受体。

Figure 1
图 1: Cul1•Cand1 的晶体结构和测量潜在标记位点之间的距离.晶体结构文件是从蛋白质数据库 (文件 1u6g) 下载的, 并在 pymol 中查看。选定原子之间的测量是用 pymol 进行的。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: fret 用荧光染料的激发和发射光谱.显示了 amc (7-氨基-4-甲基香豆素) 和 flash 的光谱。虚线表示激发谱, 实线表示发射光谱。该图像最初是由荧光光谱查看器生成的, 并进行了修改以提高清晰度。请点击这里查看此图的较大版本.

2. camc·rbx1 培养细胞的制备, fret 供体蛋白

  1. 构建粒, 表达大肠杆菌细胞中人的能力1山梨·rbx1。请注意, 在大肠杆菌细胞中共同表达人类 Cul1•Rbx1 的两个质粒在上一份报告20中进行了详细描述。
    1. 通过标准 pcr 和克隆方法 21, 22, 在 cul1 编码序列的 3 ' 结尾添加 dna 序列编码 "lpetghhhhhhh" (sorase-he-6个标记)。
    2. 序列新的质粒, 以确认基因插入是准确的。
  2. 大肠杆菌细胞中的聚合酶1 肌胶酶· rbx1. 该方法来自以前的报告20
    1. 使用热冲击法23将两种质粒中的每一种混合 100 ng 与 bl21 (de3) 化学辅助细胞进行共转化。在37°c 隔夜生长在 lb 琼脂板上, 含有100μgml 氨匹西林和34μgml 氯霉素。
    2. 用新鲜转化的菌落接种50毫升, 在37°c 下生长, 每分钟晃动250转。这就给了一个首发文化。
    3. 接种6个烧瓶, 每个瓶有1升 lb 介质, 每个5毫升发酵剂培养, 在37°c 生长, 250 转分晃动, 直到 od600是 ~ 1.0。将培养物冷却至 16°c, 并将异丙基β-d-硫代唑酮苷 (iptg) 添加至 0.4 mm。保持培养在16°c 过夜, 每小时250转。
    4. 通过离心收集大肠杆菌细胞, 以 5, 000 x 克的速度 15分钟, 并在50毫升锥形管中收集细胞颗粒。
      注: 细胞颗粒可以进行蛋白质纯化加工, 也可以在-80°c 下冷冻, 然后再进入蛋白质纯化步骤。
  3. 纯化培养 1的肌酸酶·rbx1 复合物。此方法来自以前的报告20
    1. 在表达 cle1 肌酶的大肠杆菌细胞颗粒中加入50毫升的裂解缓冲液 (30 mm Tris-HCl、200 mm nocl、5 mL sortase、10% 甘油、1片蛋白酶抑制剂鸡尾酒、ph 7.6 ).
    2. 将细胞在冰上以50% 的振幅进行超声检查。在1秒开到1秒关闭之间交替, 运行3分钟。
    3. 重复步骤 2.3.2 2-3x。
    4. 将细胞裂解液转移到50毫升的离心管中, 以 25, 000 x 克的离心去除细胞碎片, 时间为45分钟。
    5. 在4°c 条件下, 用5毫升谷胱甘肽珠培养透明细胞裂解液2小时。
    6. 在4°c 条件下, 以 1, 500 x 克离心珠状裂解混合物2分钟。取出上清液。
    7. 用5毫升的裂解缓冲液 (无蛋白酶抑制剂) 清洗珠子, 在4°c 离心后在 1, 500 x 克下取出上清液2分钟。
    8. 重复步骤 2.3.7 2x。
    9. 在洗涤的珠子中加入3毫升的裂解缓冲液, 并将珠子浆料转移到空柱中。
    10. 在色谱柱中加入5毫升洗脱缓冲液 (50 mm Tris-HCl, 200 mm ncl, 10 mm 还原谷胱甘肽, ph 8.0)。孵化 10分钟, 收集洗脱液。
    11. 重复步骤 2.3.10 3-4 x。
    12. 在谷胱甘肽珠的洗脱液中加入200μl 的 5 mgml 凝血酶 (见材料表), 并在4°c 下孵育过夜。
      注: 协议可以在此处暂停。
    13. 用缓冲液 a 稀释蛋白质样品 (25 mm hepes, 1 mm dtt, 5% 甘油, ph 6.5) 三倍。
    14. 在带有缓冲区 a 的 fplc 系统上建立阳离子交换色谱柱 (见材料表)。
    15. 以 0.5 mL/min 的流速将蛋白质样品加载到平衡的阳离子交换色谱柱上。
    16. 在 40 ml 中, 通过混合缓冲液 a 和0至50% 缓冲 b (25 mm hepes, 1 m ncl, 1 mL dtt, 5% 甘油, ph 6.5), 以 1 ml/min 的流速排出氯化钠梯度的蛋白质。
    17. 使用 sds-page24检查不同组分的洗脱蛋白。
      注: 协议可以在此处暂停。
    18. 将含有 cul1山梨酸甲的洗脱分数池。
    19. 通过超滤膜 (30 kda 截止) 将浓缩的cul1 山梨糖层酶·rbx1 样品浓缩至 2.5 ml。
  4. 通过排序酶介导的转位 21,22,amc 添加到 cl-终止物
    1. 使用脱盐柱将 c4:rbx1样品中的缓冲液改为色氨酸酶缓冲液 (50 mm Tris-HCl、150 mm nacl、10 mm cacl2、ph 7.5) (见材料表)。
      1. 平衡具有25毫升的沙质酶缓冲液的脱盐柱。
      2. 将2.5 毫升的cul1 肌酸酶·rbx1 样品加载到色谱柱中。放弃流通。
      3. 用3.5 毫升的山梨酶缓冲液对样品进行洗脱。收集流经。
    2. 在100μl 的cul1 山梨酶中, 在酶缓冲液中加入100μl 的600μm 纯化山梨酶 a 溶液和10μl 的 25mm gggggggac 肽.在黑暗中隔夜将反应混合物在30°c 下培养。请注意, 此步骤将生成 cul1 amc·rbx1.
      注意: 荧光染料对光敏感, 因此在蛋白质和样品制备过程中, 避免将其暴露在环境光中。
      注: 协议可以在此处暂停。
    3. 在反应混合物中加入50μl 的 ni-nta 琼脂糖珠, 在室温下孵育30分钟。
    4. 将 ni-nta 琼脂糖珠颗粒在 5, 000 x 克离心 2分钟, 并收集上清液。
    5. 在 fplc 系统上平衡带有缓冲液 (30 mm tris-hcl, 100 mm 氯化萘, 1 mm dtt, 10% 甘油) 的尺寸排除色谱柱 (见材料表)。
    6. 将所有 cul1 amc·rbx1 样品加载到尺寸排除色谱柱上.具有1.5倍柱体积的缓冲液。
    7. 用 sds-page24检查洗脱分数。
    8. 将包含 cul1amc·rbx1 的洗脱分数集中起来.
    9. 用分光光度计测量蛋白质浓度, 使用其在280纳米的吸收率。
    10. 在-80°c 下, 将蛋白质溶液倾斜。
      注: 协议可以在此处暂停。

3. flashcand1 的制备, fret 受体蛋白

注: 此部分中的大多数步骤与步骤2相同。下面将详细介绍不同的条件。

  1. 构建粒, 表达大肠杆菌细胞中的人的四联坎托1。
    1. 通过常规 pcr25 (引物序列) 在 cand1的第15氨基酸之前添加编码为 "ccpgccggsg" (四胞氨酸标记) 的 dna 序列: tgtggctgcgcgcagcacacacaccaccagttag;(ccatgtccattgattccag)。
    2. 将 pcr 产物插入 pgex-4t-2 载体中。序列质粒, 以确认基因插入是准确的, 在框架内。
  2. 以与步骤2.2 相同的方式表达氯化器cand1 e. e. e. e. e. e. e. e. e。
  3. 大肠杆菌细胞中纯化四氯化萘蜡烛1。
    1. 用谷胱甘肽珠裂解大肠杆菌和提取四氯化枝蜡烛。这些步骤与 2.3.1 2.3.12 的步骤相同。
    2. 用缓冲液 c (50 mm tris-hcl, 1 mm dtt, 5% 甘油, ph 7.5) 稀释谷胱甘肽珠中的蛋白质洗脱。在带有缓冲区 c 的 fplc 系统上平衡阴离子交换色谱柱 (见材料表), 并以 0.5 mL/min 流速加载稀释的蛋白质样品。
    3. 通过混合缓冲液 c 和0至50% 缓冲 d (50 mm Tris-HCl, 1 m 氯化碳, 1 mL dtt, 5% 甘油, ph 7.5), 以 1 mlmin 流量在 40 ml 中使用氯化碳梯度 (50 mm Tris-HCl, 1 mm 氯化萘, 1% dtt, 5% 甘油, ph 7.5), 以氯化钠梯度排出蛋白。使用 sds-page24检查不同分数中的洗脱蛋白, 并将含有ttrecyscand1 的组分相列。请注意,与免费商品及服务税相比, 电话产品的保留量更大。
    4. 通过超滤膜 (30 kda 截止) 传递缓冲液, 将浓缩的四氯化萘cand1 样品。
    5. 在 fplc 系统上平衡带有标记缓冲液 (20 mm tris-hcl、100 mm 氯化钠、2 mm tcep、1 mm edta、5% 甘油) 的尺寸排除色谱柱。加载四氯化萘蜡烛1样品 (每次 500μl), 并通过 sds-page24检查洗脱分数。
    6. 通过超滤膜 (30 kda 截止) 将含有t龙奇坎德1 的所有组分集中在 ~ 40μm 中。使用其吸收度为280纳米来估计蛋白质浓度。将蛋白质作为50μl 的脂肪储存在-80°c。
      注: 协议可以在此处暂停。
  4. flashcand1 的制备。
    1. 在50μl 条约蜡烛1溶液中加入 1μl的 flash溶液 (见材料表)。
    2. 在室温下在室温下混合, 孵育 1-2小时, 得到flashcand1。
      注: 协议可以在此处暂停。

4. 蜡烛1的制备, fret 追逐蛋白

注: 蛋白质制备协议类似于步骤 3, 但有以下修改。

  1. 将全长 cand1 的编码序列插入 pgex-4t-2 矢量。
  2. 将步骤3.3.5 中使用的缓冲液改为含有 30 mm Tris-HCl、100 mm 氯化钠、1毫米 dtt、10% 甘油的缓冲液。
  3. 消除3.3.7 和3.3.8 的步骤。

5. 测试并确认 fret 检测

  1. 制备含有 30 mm Tris-HCl、100 mm 氯化钠、0.5 mm dtt、1 mg/ml 卵白蛋白、ph 7.6 的 fret 缓冲液, 并在室温下使用。
  2. 在荧光仪上测试 camc·rbx1 和flashcand1 之间的 fret.
    1. 在300μl 的 fret 缓冲液中, 将camc·rbx1 (fret 供体) 添加到最终浓度为 70 nm 的浓度中。将解决方案转换为 cuvette。
    2. 将立方体放入荧光灯的样品支架中。用350纳米激发光激发样品, 并以1纳米增量扫描400纳米至 600 nm 的发射信号。
    3. 重复步骤 5.2.1,但将 camc·rbx1 改为flashcand1 (fret 受体)。使用与步骤5.2.2 相同的方法扫描 flash cand1 样本。
    4. (可选)用 510 nm 激发光激发 flashcand1, 并扫描从500纳米到 650 nm 的发射信号。
    5. 在 300μl fret 缓冲液中, 将 cul1 amc·rbx1 和flashcand1 添加到 70 nm 的最终浓度中.以与步骤5.2.2 相同的方式分析示例。
  3. 通过添加追逐 (未标记的cand1) 蛋白质 (图 3c), 确认 camc·rbx1 和flashcand1 之间的 fret。
    1. 在300μl 的 fret 缓冲液中, 加入 70 nmcul1amc·rbx1 和 700 nm cand1。扫描样品发射, 如步骤5.2.2。
    2. 在300μl 的 fret 缓冲液中, 加入 70 nm flash cand1 和 700 nm cand1。扫描样品发射, 如步骤5.2.2。
    3. 在300μl 的 fret 缓冲液中, 加入 70 nmcul1 amc·rbx1 和 70 nm flashcand1, 并在室温下孵育样品5分钟。然后添加 700 nm cand1, 并在添加后立即扫描样品发射, 如步骤 5.2.2)。请注意, 此步骤类似于步骤5.2.5。
    4. 在 300μl fret 缓冲液中, 依次添加 70 nm cul1 amc·rbx1、700 nm cand1 和 70 nm flash cand1.在室温下对样品进行5分钟的孵化, 并按照5.2.2 的步骤扫描样品的排放。请注意, 这是追逐示例 (图 3c中的绿线)。

6. 测量 Cul1•Cand1 的关联速率常数 (k打开)

注: 操作停止流式荧光灯的详细信息已在上一份报告26中说明。

  1. 准备用于测量的塞流荧光灯。
    1. 根据制造商的说明打开停止流荧光灯。
    2. 将激发光设置为 350 nm, 并使用带通滤波器, 允许 450 nm 发射光通过, 并阻止 500-650 nm 发射光。
    3. 将样品阀放在填充位置, 并连接装满水的3毫升注射器。用水清洗两个样品注射器 (a 和 b), 方法是将样品注射器驱动器上下移动几次。丢弃此步骤中使用的所有水。
    4. 将样品阀保持在填充位置, 并连接装有 fret 缓冲器的3毫升注射器。用 fret 缓冲液清洗两个样品注射器, 方法是多次上下移动样品注射器驱动器。放弃此步骤中使用的所有 fret 缓冲区。
  2. 进行控制测量 (图 4c)。
    1. 连接3毫升注射器, 并在 fret 缓冲液中加载带有 100 nmcul1amc·rbx1 的注射器 a。将样品阀转到驱动位置。
    2. 连接3毫升注射器, 并使用 fret 缓冲液加载注射器 b。将样品阀转到驱动位置。
    3. 使用 "在软件中获取" 下的 "控制面板" 在停止流荧光仪上拍摄五张照片 (混合相同数量的注射器 a 和注射器 b 样本), 而无需记录结果。
    4. 打开 "在软件获取" 下的 "控制面板", 并通过程序记录6零60秒以上的 c法1 amc 排放量.然后打一枪。
    5. 重复步骤 6.2.4 2x。
    6. 将样品阀转到填充位置。清空注射器 b, 用 fret 缓冲液清洗。
  3. 测量观察到的 Cul1•Cand1 关联速率常数 (kbs) (图 4b)。
    1. 将注射器 a 中的样品保持在步骤6.2.1 相同的地方。
    2. 连接一个3毫升注射器, 并加载注射器 b100 nm flash cand1 在 fret 缓冲液。将样品阀转到驱动位置。
    3. 使用 "在软件中获取" 下"控制面板" 拍摄五张照片, 而无需记录结果。
    4. 打开 "在软件获取" 下的 "控制面板", 并通过程序记录6零60秒以上的 c法1 amc 排放量.然后打一枪。
    5. 重复步骤 6.3.4 2x。
    6. 清空注射器 b, 用 fret 缓冲液清洗。
    7. 重复步骤 6.3.1-6.3.6 几次, 在 fret 缓冲液中的 flashcand1 浓度不断增加。
    8. 将随着时间的推移, 从每次拍摄测量到的荧光信号的变化 (减少) 调整为一个指数曲线。这将在每次测量中给k 点, 并且单位为s-1。请注意, 上一份报告27已很好地讨论了这一计算的基础。
  4. 计算所使用的每个flashcand1 浓度的 k 的平均值和标准偏差。绘制平均k个小块对cand1 浓度 (图 4d), 线的斜率表示 Cul1•Cand1 的k, 单位为m-1 s-1

7. 在存在 Skp1•F 盒蛋白的情况下测量 Cul1•Cand1 的离解率常数 (k)。

注: 此步骤类似于步骤 6, 但进行了以下修改。

  1. 在注射器 a 中, 在填充位置下, 在 fret 缓冲区中加载 100 nm cul1amc·rbx1 和 100 nm flash cand1的解决方案。将样品阀转到 "驱动" 位置。
  2. 在注射器 b 中, 在"填充"位置下加载 Skp1•Skp2 的解决方案 (在上一次报告20之后准备)。将样品阀转到 "驱动" 位置。
  3. 打开 "在软件获取" 下的 "控制面板", 并通过程序记录 cal1 amc 超过30秒的排放.然后打一枪。混合注射器 a 和注射器 b 溶液后, 荧光信号会随着时间的推移而增加 (图 5)。

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Representative Results

为了测试 cul1amc 和 flashcand1 之间的 fret, 我们首先分别确定了 70 nm cul1 amc (供体) 和 70 nm flashcand1 (受体) 的排放强度 (图 3a-c, 蓝线)。在每次分析中, 只存在一个发射峰值,而 flashcand1 (受体) 的排放量较低。当每个 cul1amc 和 flashcand1 混合 70 nm 生成 fret 时, 发射光谱中存在两个发射峰, cul1 amc 峰变低, flash cand1峰升高 ( 图 3 a) -c, 红线)。当使用全长 cand1 用于 fret 时, 供体峰值的强度降低了 10% (图 3 a, 红线), 当使用第一螺旋截断的 cand1 时, 供体峰值强度的降低增加到 30% (图 3A)-d, 红线), 建议更高的 fret 效率。为了确认信号的变化是由 cul1amc 和 flashcand1 之间的 fret 引起的, 70 nm cul1amc (供体) 与 700 nm 未标记的 cand1 (追逐) 和 70 nm flash cand1 (受体) 混合在一起. 结果, 供体峰完全恢复, 受体峰减少 (图 3c, 绿线), 这证实观察到的 fret取决于cul1 amc·ffash cand1 复合物的形成.在 70 nm cul1 amc·ffashcand1添加 700 nm Skp1•Skp2 也完全恢复了供体峰值 (图 3d, 绿线), 这表明 Cul1•Cand1 复合体完全被 Skp1•Skp2 平衡所破坏。

Figure 3
图 3: Cul1•Cand1 复杂地层的代表性 fret 分析.fret 缓冲液 (30 mm Tris-HCl, 100 mm 氯化碳, 0.5 mm dtt, 1 mgml 卵白蛋白, ph 7.6) 中的样品在350纳米激发, 并从 400 nm 到 650 nm 扫描排放。(a) 70 nm cul1 amc、70 nm flashcand1 (全) 的发射光谱, 以及两者的混合物 (fret)。cand1 (完整) 代表全长 cand1。(b) 70 nm cul1 amc、70 nm flashcand1 的发射光谱和两者的混合物 (fret)。cand1 与它的第一个螺旋被删除在这个实验中使用, 然后。(c) 70 nmcul1 amc、70 nm flashcand1 的发射光谱, 两者的混合物 (fret), 以及 fret (chase) 的追逐控制。追逐样本中含有 70 nm cul1amc、700 nm cand1 和 70 nm flashcand1。(d) 70 nm cul1amc 的发射光谱, 由 70 nm cul1 amc 和 70 nm flash cand1(fret) 的混合物和 700 nm Skp1•Skp2 添加到 70 nm cul1 amc·ffash cand1 复合体中.在每个图中, 发射信号被归化为 450 nm 的 70 nmcul1 amc的发射。请点击这里查看此图的较大版本.

为了利用建立 fret 检测方法, 通过监测停止流荧光仪上供体信号随时间的减少情况, 首先测试并确定了所使用的蛋白质浓度。当每个c法1 amc 和 flashcand1 的 5 nm 被使用时, 观察到的信号变化很小 (图 4a), 而当每个蛋白质的浓度增加到 50 nm 时, 信号随时间的推移会被观察到减少 (如果添加了没有flashcand1 的缓冲区, 则废除了此更改 (图 4B)。因此, 采用 50 nmcul1 amc 进行进一步分析, 并通过将 50 nm cul1 amc 与不断增加的 flashcand1浓度混合, 测量了一系列观测到的关联速率常数 (kobs)。通过将点拟合到单个指数曲线来计算每个实验的k , 并对从相同flashcand1 浓度获得的k形于进行了平均计算。通过绘制具有 cand1 浓度的平均kbos 并执行线性回归 (图 4d),确定了 k的 7, 27

Figure 4
图 4: 关联速率常数的代表性度量。(a)在加入 5 nm flash cand1, 用停止流荧光仪对 5 nm cul1 amc 的荧光进行了一段时间的监测。(b)在添加 50 nm flash cand1, 用停止流荧光仪对 50 nm cul1 amc 的荧光进行了一段时间的监测。(c)加入 fret 缓冲液后, 用停止流荧光仪对 50 nmcul1 amc的荧光进行了一段时间的监测。(d) c培养1的蜡烛1进行绑定。绘制不同浓度的cand1 的 Cul1•Cand1. 线性斜率给出 k 1.8 x 10 7m-1.误差条表示± sem; 错误条表示± sem。n = 4。所有样品均在 fret 缓冲液中制备, 并在350纳米处激发。采用带通滤波器从 amc 收集信号, 并排除来自 flash 的信号。未对数据进行规范化。请点击这里查看此图的较大版本.

kon的测量类似, 我们通过监测停止流荧光仪上的供体信号随时间的增加 (恢复) 来测量 Cul1•Cand1 的观测离解率常数。首先将 cul1amcflashcand1 混合, 然后在停止流动的荧光仪上加入 Skp1•Skp2.捐献者的信号迅速增加, 它揭示了一个 0.4秒-1k b s ( 图 5)。相反, 当缓冲添加到预装的 camc·ffashcand1 中时, 没有观察到信号增加, 这表明 Skp1•Skp2 引发了 Cul1•Cand1 的快速离解.

Figure 5
图 5: 离解率常数的代表性测量.在将 150 nm Skp1•Skp2 或 fret 缓冲液添加到 50 nm cul1amc·ffash cand1 复合物后, 测量了供体荧光随时间的变化。信号变化适合于单个指数曲线, 并给出观察到的离解速率常数为 0.4s-1。实验条件与图 4中描述的条件相似。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

fret 是一种物理现象, 对研究和理解生物系统非常感兴趣。在这里, 我们提出了一个测试和使用 fret 研究两种相互作用的蛋白质的结合动力学的方案。在设计 fret 时, 我们考虑了三个主要因素: 供体发射和受体激励之间的光谱重叠、两个荧光体之间的距离以及荧光的偶极子方向 28.为了选择 fret 的荧光体, 我们对荧光的激发和发射光谱进行了叠加, 并寻找了其发射峰分离良好而供体的发射光谱与激发明显重叠的荧光。(图 2)。为了优化荧光间的距离和方向, 我们使用晶体结构作为辅助, 我们主要考虑将荧光剂附着在蛋白质末端, 主要是由于破坏蛋白质结构和活性的风险较低。由于 cand1 (cand1ntd) 的 n 终点与 cpl1 (cul1 ctd) c 终点 (ctd) 之间的距离短于 cand1 c 端和 cul1 的 n 终点之间的距离 (图 1), 因此我们决定给 cand1ntd 贴上标签和 ctd.因为我们已经能够实现 80%-90% 的标记效率的 n 终点的蛋白质使用四甲酯标记 25, 我们选择了标签蜡烛 1ntd与 flash 通过四甲酯标记.我们最初给 cm1标记为青色荧光蛋白 (cfp), 它比 amc 有一些优势。首先, 它是一个基因编码的荧光标签, 所以它不需要额外的标记过程, 也不需要从其未标记的前体净化标记荧光蛋白的步骤。其次, cfp 比 amc 更亮, 因此, 它提供了更高的检测灵敏度 (见下文讨论)。第三, cfp 与 flash 有较大的频谱重叠, 有可能产生更有效的 fret 与 flash。然而, 尽管有这些优点, cfp 蛋白是远远大于 amc 标签, 这可能会干扰蛋白质构象和分子间的相互作用。事实上, 我们没有观察到 fret 之间的 cul1cfp 和 flashcand1 在我们的测试, 这可能是由于不充分的偶极子方向, 或中断 cul1-cand1 互动的 cfp 标签。然后, 我们用 amc 标记了ctd,并观察到了 cul1 amcflashcand1 之间的 fret。最初使用全长 cand1 的 fret 导致供体排放减少了 10% (图 3 a)。我们进一步发现, 通过删除 cand1 的第一个螺旋, cul1 和 cand1 之间的距离从26.8 到 15.5 (图 1) 缩短, 而 cand1 缺少第一个螺旋产生了更强的 fret 与 cul1, 显示了30% 的捐赠者排放减少30%峰值 (图 3b)。此外, 可以通过选择量子产率较高的供体荧光体和消光系数较大的受体荧光粉来提高 fret 效率。

fret 的一个特点是, 当 fret 发生时, 供体的排放量减少, 受体的发射量增加 (图 3b)。然而, 荧光可能对其环境表现出敏感性, 因此, 当存在另一种蛋白质时, 即使在没有 fret29情况下, 发射强度也可能发生变化。为了确认我们观察到的排放变化是由于 cul1amcflashcand1 之间的 fret, 我们添加了10倍的未标记受体蛋白 (cand1) 作为追逐。追逐将供体和受体的排放转换回正常水平 (图 3c), 这支持了 cul1amcflashcand1 的变化排放依赖于蛋白质-蛋白质相互作用, 因此, 这一结果证实了我们建立了一个 fret 检测, 报告 Cul1•Cand1 的关联和离解。此外, 我们还在预装的 cul1amc·ffash cand1 复合体中添加了 Skp1•Skp2, 已知 Skp1•Skp2 能够破坏 cul1-cand1 交互6.我们发现 cul1amc 和 flashcand1 之间的 fret 消失了 (图 3C, 绿线), 发射光谱变得类似于追逐样本的发射光谱 (图 3c, 绿线), 暗示cul1amc·ffash cand1 由 Skp1•Skp2 分离, cul1amc 在存在 Skp1•Skp2 时不会显示异常发射.

通过监测供体排放的变化, 我们可以直接观察 cul1amc·ffashcand1 在停止流荧光灯片上的关联和离解。停止流动系统的工作原理是将反应物注射到混合室, 以快速混合反应物, 并在混合反应物进入观察室5后停止流动。信号检测通常在混合后开始1-2 毫秒 (ms), 从而能够研究在毫秒时间刻度上发生的相互作用。然而, 当观察到的反应的半衰期短于在特定装置上混合反应物所需的时间时, 这种方法不够敏感, 不再适合30。停止流分析用于确定一阶反应的速率常数为 10-6-10- 6s-1 , 二阶反应1-10 9 m-1-1. 为了获得使用停止流荧光仪的动力学参数的可靠测量, 启动点和平衡点之间的荧光信号必须发生重大变化。我们使用flashcand1 缺乏第一螺旋作为受体, 因为它产生更好的 fret 与 cul1amc,我们测试了用于测量的蛋白质的浓度。当每个 cul1amc 和 flashcand1 5 nm 混合在一起时, cul1amc信号没有变化 (图 4a), 这表明这种浓度不足以测量。当蛋白质浓度增加到 50 nm 时, cul1amc信号随着时间的推移会明显下降 (图 4b), 当受体蛋白不存在时, 不会发生这种变化 (图 4B)。基于这一结果, 我们在 50 nm 协调中使用 cul1 amc 来测量Cul1•Cand1 的 k .当使用不同的荧光剂时, 用于测量的供体蛋白的浓度可能会有所不同。例如, 当 cul1 被标记为 cfp 时, 5 nm 的cfpcul1 足以测量6上的k.因此, 应测试每个 fret 对的最佳浓度, 原则上, 更亮的荧光允许使用较低的蛋白质浓度, 并提供更好的信噪比31

要研究 fret 的蛋白质-蛋白质相互作用, 需要在适当的位置将荧光剂附着在蛋白质上, 而不会破坏蛋白质的结构和活性, 这可能会限制 fret 的使用。在这个协议中, 我们用四甲酯标记标记了 cand1 的 n-末端, 它专门结合了 flash 染料, flash 染料只有在将目标蛋白32结合后才会变成荧光。我们用山梨介导的转肽标记了 cul1, 它将携带荧光体的短肽连接到 ckseke21,22的 c 端的软质酶标记上。标记效率 > 80% 与四色氨酸标签, 和几乎100% 与排序器他的6个标签后, 删除未反应的蛋白质使用 ni-nta 珠子 (步骤2.4.3 – 2.4.4)。这两种方法都为目标蛋白添加了一些氨基酸, 从而使蛋白质结构发生了最小的变化。类似的方法, 如转谷氨酰胺酶识别序列 (q-标记)33和 ybbR标记 34, 也可用于标记目标蛋白的特定地点的方式。此外, 荧光染料的光稳定性也会限制 fret 的使用。重复或长时间暴露在激发光下会导致荧光体的光浸, 从而导致不准确的定量结果35。因此, 在制备和储存过程中, 应保护供体和受体蛋白不受光线照射。当使用 fret 测量缓慢发生的事件时, 与其不断监测供体排放随时间的变化, 不如在更长的时间间隔内对供体排放进行简短的读数, 并在整个时间内将样品保持在黑暗中。实验6

由于 fret 具有敏感性和定量性, 已成为研究大分子相互作用的重要工具。该协议提供了一个使用 fret 研究溶液中蛋白质复合物动力学的例子。fret 还与活细胞成像一起用于研究活细胞36中的分子相互作用, 这在揭示生理条件下蛋白质复合物的动态是很有力量的。此外, fret 还可用于单分子水平, 研究大分子复合物实时动力学 37,38, 为复杂物的构象变化提供了真知灼见。为了提高 fret 的效率和检测效率, 对具有增强亮度和光稳定性的荧光和生物传感器进行了积极的设计和研究, 对28,39进行了积极的设计和研究。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢加州理工学院 (shu-ou shan) 就 fret 检测的发展进行了富有见地的讨论。硕士、y. z. 和 x. l. 由普渡大学向 y. z. 提供的创业资金资助 X.L.This 工作部分由普渡大学植物生物学中心的种子赠款提供。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anion exchange chromatography column GE Healthcare 17505301 HiTrap Q FF anion exchange chromatography column
Benchtop refrigerated centrifuge Eppendorf 2231000511
BL21 (DE3) Competent Cells ThermoFisher Scientific C600003
Calcium Chloride Fisher Scientific C78-500
Cation exchange chromatography column GE Healthcare 17505401 HiTrap SP Sepharose FF
Desalting Column GE Healthcare 17085101
Floor model centrifuge (high speed) Beckman Coulter J2-MC
Floor model centrifuge (low speed) Beckman Coulter J6-MI
Fluorescence SpectraViewer ThermoFisher Scientific https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
FluoroMax fluorimeter HORIBA FluoroMax-3
FPLC GE Healthcare 29018224
GGGGAMC peptide New England Peptide custom synthesis
Glutathione beads GE Healthcare 17075605
Glycerol Fisher Scientific G33-500
HEPES Fisher Scientific BP310-100
Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) Fisher Scientific 15-529-019
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Ovalbumin MilliporeSigma A2512
pGEX-4T-2 vector GE Healthcare 28954550
Protease inhibitor cocktail MilliporeSigma 4693132001
Reduced glutathione Fisher Scientific BP25211
Refrigerated shaker Eppendorf M1282-0004
Rosetta Competent Cells MilliporeSigma 70953-3
Size exclusion chromatography column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 10/300 GL column
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Stopped-flow fluorimeter Hi-Tech Scientific SF-61 DX2
TCEP·HCl Fisher Scientific PI20490
Thrombin MilliporeSigma T4648
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Ultrafiltration membrane MilliporeSigma UFC903008 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL

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References

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