Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

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Summary

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

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Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S., Grüneboom, A., Neufert, C., Wirtz, S., Neurath, M. F., Atreya, I. Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59043, doi:10.3791/59043 (2019).

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Abstract

Acumulación de tejido de células inmunitarias altamente activadas representa un sello de varias enfermedades inflamatorias crónicas y surgió como una diana terapéutica atractiva en el manejo clínico de los pacientes afectados. Para optimizar aún más estrategias con el objetivo de la regulación terapéutica de infiltración de tejido patológicamente desequilibrada de células inmunológicas inflamatorias, será de particular importancia para el logro de mejores perspectivas en enfermedades órgano-específicas y propiedades homing de linfocitos periféricos. El protocolo experimental descrito aquí permite para vigilar acumulación pulmonar de fluorescencia etiquetadas y eventualmente transferidos los linfocitos humanos en el contexto de la inflamación pulmonar inducida por la papaína. En contraste con estudios in vitro estándar utilizadas para el análisis de la migración de células inmunes y quimiotaxis, la configuración en vivo ahora introducida tiene en cuenta los aspectos pulmonar específico de organización tejido y la influencia del complejo inflamatorio escenario tiene lugar en el organismo murino vivo. Por otra parte, la proyección de imagen microscópica tridimensional transversal hoja de luz fluorescencia no sólo proporciona datos cuantitativos sobre las células inmunes de la infiltración, pero también representa el patrón de localización de células inmunitarias en el pulmón inflamado. En general, somos capaces de introducir una técnica innovadora de alto valor para la investigación inmunológica en el campo de enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas, que pueden aplicarse fácilmente siguiendo el protocolo paso a paso siempre.

Introduction

Trastornos inflamatorios clásicos del pulmón, como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), son bien conocidos para ser conducido por un mayor reclutamiento de linfocitos activados en el tejido pulmonar1,2. Publicado por linfocitos citoquinas (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ y TNF-α) promover aún más la Quimiotaxis de las células inmunes innatas y adaptativas, inducen remodelación fibrótica de la vía aérea o directamente dañar el parénquima de pulmón2. Hasta ahora, los mecanismos subyacentes responsables de la acumulación patológica de linfocitos en el tejido pulmonar no se entiende todavía completamente. En analogía a impresión selectiva para el tejido T cell descrita homing de intestino y piel, pulmonares células dendríticas (DCs) son obviamente capaces de cebar células de T periféricas para infiltración de pulmón preferenciales, al menos en parte mediante la inducción de la expresión de CCR4 en la superficie de los linfocitos3. Además de CCR4, las células T infiltrantes en las vías respiratorias también se caracterizan por un especial incremento en la expresión de los receptores del chemokine CCR5 y CXCR3 en comparación con las células de T en la sangre periférica1,4,5. En generales, los datos son consistentes con el concepto que autoguiado hacia el blanco de los linfocitos T en condiciones fisiológicas o inflamatorias del pulmón consiste en un número de diferentes chemokine receptores y sus ligandos respectivos y así crucial depende de una estrecha colaboración control de colaboración entre las células inmunes innata y adaptativa1. Especialmente, durante la fase inicial de la exposición de patógenos o alérgenos, células del sistema inmune innato responden al estímulo de TLR o IgE-mediada del cross-linking de la liberación inmediata de los diferentes atrayentes, como el LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 y PGD21,6,7. Como un ejemplo, la interacción entre PGD2 y el receptor chemoattractant CRTh2 es conocido por ser de particular importancia para el quimiotactismo de las células Th2 y así apareció como prometedora diana terapéutica en el manejo clínico del asma. De hecho, pacientes con asma moderada mostraron una mejoría de los síntomas y un aumento significativo del volumen espiratorio forzado en un segundo (VEF1) después del tratamiento con un antagonista selectivo de CRTh2 en comparación con el placebo grupo8 ,9. En un estado más progresado de la respuesta inflamatoria, ya reclutado de las células T son capaces de amplificar más acumulación de linfocitos pulmonares mediante la liberación de IL-4 y IL-13 como potentes estímulos para DCs pulmonares. Posteriormente, estas células mieloides derivados de innatas para arriba-regulan la expresión de CCL17 y CCL22 en un dependiente de STAT6 forma1,10,11.  Aunque la complejidad de la situación descrita todavía impide una comprensión completa del pulmón de la célula de T autoguiado hacia el blanco, ofrece una gran cantidad de dianas moleculares para un control terapéutico potencialmente optimizado de enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de innovadoras técnicas experimentales, que son capaces de profundizar y complementar nuestro conocimiento en el campo de la Quimiotaxis de células T y homing de pulmón.

Debido a que homing pulmón de linfocitos en el cuerpo humano está influenciada por varios parámetros celulares, humorales y física1, la mayoría de los métodos experimentales existentes no es capaces de modelar la entera complejidad de este proceso inmunológico. En cambio, muchos protocolos estándar para el análisis de pulmón homing selectivamente se centran en un aspecto específico en la cascada de linfocito atracción, adhesión, migración y retención. Además de una determinación puramente descriptiva del patrón de expresión de mRNA o proteínas de receptores de integrinas y quimioquinas en linfocitos periféricos o infiltración pulmonar y la medida complementaria de chemokine respectivos niveles en sangre, el lavado broncoalveolar (BAL) o tejido pulmonar12,13,14,15, celular in vitro bien establecida cultura ensayos permiten una caracterización funcional de linfocitos adherencia o quimiotaxis en definidas condiciones experimentales16,17,18. En principio, ensayos de adherencia in vitro estática monitorea la capacidad de unión de los linfocitos cultivados para un monocapa endotelial o portaobjetos de vidrio recubiertas de moléculas de adhesión endotelial recombinantes (por ejemplo, MAdCAM-1, VCAM-1), mientras el estándar in vitro ensayos de quimiotaxis se aplican generalmente para cuantificar la capacidad de los linfocitos que migran a lo largo de un gradiente de chemokine en un sistema de transwell19. Ambos parámetros in vitro permiten un ajuste controlado y la modulación de las condiciones experimentales, pero por otro lado carecen de variables importantes que críticamente impacto en vivo de quimiotaxis y adherencia de los linfocitos. Predominante, ensayos de cultura de célula estática ignoran la influencia de las fuerzas de corte causadas por el flujo de sangre permanente19 y potencialmente descuidan la participación del alrededor ambiente inmunológico e interactuando no linfocitos las células inmunes, presentes en un organismo vivo. Para superar estas limitaciones, la interpretación de los resultados adquiridos en ensayos de quimiotaxis o adherencia in vitro estática necesita validación en experimentos de adhesión dinámico bajo condiciones de flujo20,21 y en modelos de órgano inflamatoria patología19en vivo. De hecho, importantes estudios en animales podrían extraer conclusiones sobre la regulación del pulmón de la célula de T autoguiado hacia el blanco en condiciones inflamatorias o alérgicas analizar genéticamente modificado ratones en modelos definidos de diferentes enfermedades pulmonares3, 22 , 23. la comparación cuantitativa de pulmón infiltración linfocitos entre ratones de tipo salvaje y ratones con una deficiencia de un gen específico de interés representa una herramienta bien establecida y ampliamente usada para definir el impacto del celular particular vías o receptores en el patrón basados en la enfermedad de la distribución de la célula de T. Sin embargo, en contraste con antes de debate ensayos de cultivo celular in vitro, un diseño de estudio basado en modelos animales clásicos carece de la capacidad de análisis y control de las células T primarias humanas directamente derivadas de la sangre o de BAL de pacientes que sufren de una inflamación pulmonar de la enfermedad. Por lo tanto, sigue siendo difícil para validar funcionalmente si una enfermedad pulmonar diagnóstico especificado es capaz de imprimir los linfocitos humanos de tropismo preferencial de pulmón y hasta qué punto los parámetros clínicos puedan impactar en este escenario. Recientemente, un enfoque muy elegante en vivo fue introducido en el contexto de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que fue capaz de superar la mayoría de estas limitaciones y abre nuevos caminos para estudios traslacionales en intestinal linfocito autoguiado hacia el blanco24 . Tomando ventaja de los protocolos para el claro del tejido base solvente seguida por microscopia de fluorescencia de luz de hoja transversal como una poderosa herramienta de imagen, fue posible visualizar la infiltración y distribución de las células de T humanas eventualmente transferidas en el intestino de ratones inmunodeficientes colitic24. En particular, esta configuración experimental implementó dos innovaciones principales: las células inmunitarias humanas primarias (1) pueden ser analizado bajo condiciones en vivo experimentalmente definidas; (2) un área bastante grande del órgano enfermo (aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm) puede ser reflejada en la calidad de alta resolución, seguida de reconstrucción 3D. Por otra parte, varios estudios recientes establecieron con éxito el uso de tejido base solvente claro y microscopía de fluorescencia de la hoja de luz como herramientas importantes para25,26la proyección de imagen avanzada del pulmón. Para poder beneficiarse de este avance tecnológico en el campo de la inmunología pulmonar, ahora adoptamos el sistema de análisis de homing de pulmón.

El protocolo presentado aquí ofrece una introducción paso a paso cómo purificar y fluorescencia etiqueta T humanos primario de las células de transferencia en ratones con inflamación pulmonar inducida y, por otra parte, describe en detalle el proceso posterior de la hoja de luz imágenes microscópicas de fluorescencia, como órgano preparación y procesamiento de imágenes. En general, esperamos apoyar futuros estudios traslacionales en el campo de las enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas mediante la introducción de un sofisticado, pero sin embargo factible modelo experimental para el monitoreo de linfocitos humanos pulmón autoguiado hacia el blanco en condiciones in vivo.

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Protocol

Experimentos con animales se realizaron según los protocolos aprobados por las autoridades locales competentes en Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemania). Ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicas. La colección de la sangre humana fue aprobada por el Comité de ética local y la Junta de revisión institucional de la Universidad de Erlangen-Nuremberg. Cada paciente dio consentimiento de informado escrita.

1. inducir inflamación alérgica del pulmón en ratones

Nota: Como se ha descrito en estudios anteriores27, el siguiente procedimiento experimental permite inducir la inflamación alérgica de las vías respiratorias en ratones y, en consecuencia, provoca la acumulación de células inmunitarias innatas y adaptativas en el BAL. Se ha establecido el protocolo descrito en ratones C57BL/6J y adopción de otras cepas consanguíneas estándar debería ser posible.

Ver figura 1para un resumen del procedimiento experimental en vivo .

  1. Anestesiar ratones por inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina.
    Nota:
    sólo utiliza ratones C57BL/6J mayores de 6 semanas y con un peso corporal de al menos 16 g.
    1. Solución de ketamina/xilacina en PBS (12 mg/mL ketamina; 1,6 mg/mL xilacina) y determinar el peso exacto de los ratones.
    2. Inyectar por vía intraperitoneal el primer ratón con 8 μl/g peso corporal de solución de ketamina/xilacina y confirmar anestesia profunda a través de la ausencia del reflejo del pellizco de pata antes de proceder al paso 1.3.
  2. Recién preparar 5 mg/mL de la papaína en PBS. Lentamente pipetee 10 μl (50 μg) de la solución de papaína en la fosa nasal. Vigilar cuidadosamente el ratón hasta de despertar.
  3. Repita los pasos 1.1 y 1.2 para todos los ratones en el experimento. Realice los pasos 1.1 – 1.3 en tres días consecutivos.

2. purificar y etiqueta fluorescente CD4 de sangre periférica humana+ las células T

Nota: Células de proceso bajo condiciones estériles.

  1. Recopila 18 mL de sangre completa humana de una vena periférica. Para seleccionar la fracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) realizar la centrifugación gradiente de Ficoll-Hypaque.
    Nota: Recopilación y análisis de material humano primario tienen que ser aprobadas por las autoridades locales de la éticas. Sólo una persona con una calificación médica adecuada se permite recoger la sangre de una vena periférica.
    1. Recoja la sangre en ácido etilendiaminotetracético (EDTA)-que contiene monovettes (1,6 mg de EDTA/mL de sangre) para evitar la coagulación.
      Opcional: Uso de sangre de la capa anteada, un subproducto de la donación de sangre enriquecida en leucocitos, en lugar de sangre venosa completa.
    2. Transferencia de sangre en un tubo cónico de 50 mL y diluir 1:2 en tampón fosfato salino (PBS). Agregar cuidadosamente 10 mL de Ficoll-medio (densidad 1,077 g/mL) como una capa inferior bajo la sangre diluida. Centrifugue la muestra (800 x g durante 15 min a temperatura ambiente sin freno).
    3. Con cuidado retire el tubo de la centrífuga y transferencia a la interfase que contiene PBMC en un tubo cónico de 50 mL nuevo. Descartar la capa inferior y superior. Llena el tubo que contiene PBMC con PBS y centrífuga (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Eliminar el sobrenadante.
      Nota: Opcionalmente, si es necesario, realizar la lisis de los eritrocitos restantes. Cuidadosamente Agregue 3 mL de tampón de lisis (ACP) de amonio cloruro de potasio (cloruro de amonio de 155 mM; 19 mM potasio hidrógeno carbonato y 0,68 mM EDTA pH 7,27) el sedimento resuspendido celulares y vórtice de la muestra. Agitar los tubos durante 3 minutos. Para quitar el tampón de lisis de la ACP, añadir 40 mL de PBS y centrifugue (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Deseche el sobrenadante.
  2. Purificar el CD4+ T las células mediante microesferas de CD4.
    Nota: En general, hay varios distribuidores de microesferas magnéticas para la purificación de CD4 humano+ las células, que dará lugar a niveles comparables de la pureza de la célula. Elección del producto debe basarse en preferencias individuales. Los pasos del Protocolo (2.2.2–2.2.7) se ajustan a un definido producto del microbead de CD4 y las columnas de separación respectiva más indicado en la Tabla de materiales. Algunas modificaciones del protocolo podrían ser necesario en caso de que se ha seleccionado un producto alternativo del microbead de CD4.
    1. Resuspender el precipitado PBMC en un mínimo de 80 μl de PBS que contenga 0,5% de suero bovino fetal (FBS) y 2 mM EDTA (PBS/EDTA/FBS-buffer) por 107 PBMC. Uso de una población a partir de aproximadamente 30 x 106 PBMC para final a aproximadamente 3 x 106 a 6 x 106 purificada humana CD4+ T las células.
    2. Añadir 20 μl de microesferas de CD4 por 107 PBMC, mezclar suavemente e incubar por 20 min a 4 ° C. Llenar el tubo con PBS/FBS/EDTA-buffer (enfriado a 4 ° C) y centrífuga (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Eliminar el sobrenadante.
    3. Colocar una columna de separación en un campo magnético. Enjuagar la columna con 3 mL de PBS/FBS/EDTA-buffer. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de PBS/FBS/EDTA-tampón, (refrigerado a 4 ° C) y transferir la suspensión de células en la columna de lavado separación colocada dentro de un campo magnético.
    4. Enjuagar la columna de separación tres veces con 3 mL de PBS/FBS/EDTA-buffer (enfriado a 4 ° C) y desechar el efluente.
    5. Quitar la columna de la separación del campo magnético y lo coloca en un tubo de 15 mL. Eluir el CD4+ fracción de células en 5 mL de PBS, FBS, EDTA-tampón utilizando el émbolo.
    6. Llenar el tubo con PBS y centrífuga (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Eliminar el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces.
    7. Determinar el número de células rendidos por un método estándar de elección (p. ej., cámara de Neubauer).
  3. Etiqueta de CD4+ T las células con un colorante de la proliferación de célula fluorescente.
    1. Resuspender CD4+ T las células en PBS (hasta 107 células/mL; no use menos de 500 μl de PBS).
    2. Preparar una solución de 6 μm de una proliferación de célula excitable rojo tinte (véase Tabla de materiales) en PBS (previamente calentado a temperatura ambiente). Mezclar esta solución 1:2 con la antes preparado suspensión celular y agitar bien (concentración final de 3 μm).
    3. Incubar 10 min a 37 ° C (protegidos de la luz). Luego, añadir cinco volúmenes de Medio RPMI con 10% FBS e incubar por 5 min en hielo (protegido de la luz).
    4. Lavado etiquetado células tres veces en RPMI medio que contiene 10% FBS (centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C). Resuspender las células etiquetadas en PBS, almacenar en hielo y proteger de la luz hasta su uso.
      Nota: Prolongado almacenamiento de las células (> 60 min) podría impactar negativamente en la supervivencia de la célula.
      Opcional: Determinar la pureza de la CD4+ celular fracción y la eficacia del procedimiento de etiquetado mediante citometría de flujo. Resuspender 0,5 x 106 a 1 x 106 CD4+ células en 100 μl de buffer (1% de SFB, 2 mM EDTA en PBS) y añadir un anticuerpo anti-humana CD4 junto con un colorante fluorescente de elección. Incubar durante 30 min a 4 ° C. Añadir 1 mL de tampón y centrífuga (300 x g durante 10 min a 4 ° C). Deseche el sobrenadante. Proceder con la medición de citometría de flujo de la muestra (resultado representativo es mostrado en la figura 1B, C).

3. eventualmente transferencia humana CD4+ T células en Mmice receptor expuesto de papaína

Nota: Ver figura 1para un resumen del en vivo realizado el procedimiento experimental. Realizar a transferencia de células un día después de la última administración intranasal de la papaína.

  1. Ajustar la suspensión de fluorescencia etiquetada humana CD4+ T las células (paso 2.3.4) a una concentración de 1 x 107 células/mL en PBS. Llenar 100 μl de la suspensión de células en un 1 mL/30 G-jeringa.
  2. Coloque con cuidado el primer expuesto papaína C57BL/6J ratón (pasos 1.1 – 1.3) en un dispositivo de sujeción para la inyección de la vena de la cola. Utilice la jeringa preparada (paso 3.1) para pinchar la vena de la cola y lentamente inyectar 100 μl de la suspensión de células que contiene 1 x 106 etiqueta humana CD4+ las células. Inmediatamente hacia afuera la aguja después de la inyección, pero espere 5 segundos adicionales para prevenir la descarga de la suspensión de células.
  3. Suelte el ratón desde el dispositivo de sujeción y proceder con el siguiente animal. Mantener al menos un animal expuesto de la papaína, que no sufre transferencia con fluorescencia etiquetadas células para servir como control negativo para microscopía de fluorescencia de la hoja de luz.

4. preparar el tejido pulmonar para microscopía de fluorescencia de luz hoja

Nota: Los pasos siguientes se realizan 3 h después de transferencia de fluorescencia etiquetada células humanas (paso 3.2). Los procedimientos experimentales descritos incluyendo la cosecha de tejido pulmonar, tejido base solvente claro y fijación se adaptaron de protocolos actualmente descrito24,28.

  1. Sacrificar el ratón por la inhalación de dióxido de carbono (C02).
  2. Perfusión pulmonar in situ con PBS que contenga 5 mM EDTA.
    1. Abrir el tórax a través de corte a lo largo del esternón para exponer el corazón. Punteada del ventrículo derecho con una cánula de 21 G conectado a un catéter.
    2. Abrir el ventrículo izquierdo mediante la reducción y así permitir el fluido sanguíneo y la perfusión salir. Lentamente perfusión del pulmón con 20 mL de PBS helado con 5 mM EDTA a través del catéter.
  3. Para llevar a cabo in situ fijación del pulmón, no retire el catéter desde el ventrículo derecho. Lentamente perfusión del pulmón con 2 mL de helada 4% paraformaldehido (PFA) en PBS. Retire el catéter y la cánula.
    Nota: Fijación in situ basados en PFA de tejido pulmonar representa una técnica bien establecida para preparar tejido pulmonar murino para posterior análisis microscópico29,30.
    PRECAUCIÓN: PFA es tóxico y debe ser manejado bajo un capó con cuidado.
  4. Llenar el pulmón con 0,75% de agarosa en situ.
    1. Preparar agarosa al 0,75% en PBS y no sólido a 50 ° C en un termo agitador hasta su uso. Quitar las glándulas salivales del ratón, cortar el músculo esternocleidohioideo y exponer la tráquea deslizando un fórceps por debajo.
    2. Marcan la tráquea expuesta con una aguja de 30 G y reemplazarlo por un catéter de 30 G romos para evitar más daños de la tráquea, dando lugar a fugas no deseadas de agarosa. Sellar a la unión entre el catéter insertado y la tráquea usando un sostenedor de la aguja.
      Opcional: Combine el aquí descrito procedimiento con colección de BAL para analizar las células humanas infiltradas en BAL como recientemente descrito en detalle31 (vea la figura 2E para obtener resultados representativos).
    3. Llena con cuidado las vías respiratorias con 0,75% de agarosa (enfriado a la temperatura corporal) a través del catéter hasta el despliegue completo del pulmón; Espere hasta completa solidificación de la agarosa. Retirar el catéter y cosechar cuidadosamente el pulmón en un tubo de 2 mL oscura llenado de 4% PFA.
  5. Para la fijación adicional incubar la muestra en 4% PFA resuelto en PBS durante 2 h a 4 ° C bajo rotación continua (31 rpm).
  6. Deshidratar el tejido por posteriormente incubando la muestra en rotación continua (31 rpm) a 4 º C en etanol al 50% (pH 9), etanol al 70% (pH 9) y el 100% de etanol; cada paso para al menos 4 h. Al final, realizar una segunda incubación en fresco etanol al 100% durante 4 horas.
  7. Realizar limpieza basados en solventes del tejido con cinamato de etilo (ECi). Por lo tanto, transferir la muestra en ECi. Incubar una noche a temperatura ambiente (bajo rotación constante) aparezca el tejido translúcido (ver figura 1D para imágenes representativas).
    Nota: Las muestras almacenadas en ECi a temperatura ambiente (protegido de la luz) son estables durante varias semanas a meses.

5. realizar microscopía de fluorescencia de luz-hoja de Wwhole murino pulmón lóbulos

Nota: Consulte la Tabla de materiales para obtener más información sobre el microscopio de fluorescencia de luz de hoja y el software correspondiente, en que se basan los siguientes pasos. Los sistemas comparables de otros fabricantes, sin embargo, pueden utilizarse también con modificaciones específicas de desarrollador del siguiente protocolo. Antes de empezar, familiarizarse con el manual de instrucciones microscopio específico y seguir las instrucciones técnicas por la persona responsable en el sitio.

  1. Configurar el microscopio de luz de hoja.
    1. Abra en el microscopio de luz de hoja y la correspondiente imagen de software en el equipo. Llene la cámara de muestra con ECi filtrada (filtro de 100 μm) y colocarlo en su posición entre los rayos láser.
    2. Utilizar una pequeña gota de pegamento solvente estable orgánica para pegar el pulmón a lo portamuestras. Para mantener la profundidad de penetración necesaria de las hojas de luz tan pequeños como sea posible, coloque el lóbulo pulmonar en posición vertical. A continuación, coloque el portamuestras en su cámara.
    3. Ajuste el índice de refracción del objetivo a 3.5 cuando use ECi como compensación de reactivo.
  2. Ajuste en el hoja de luz microscopio para detectar células humanas en el contexto del órgano entero.
    1. Seleccione requiere láseres (filtro para medición > Activar casillas de verificación de rayos láser requiere) y elegir intensidades apropiadas en el software de control (control de la transmisión del laser > Utilice el control deslizante para establecer láser de intensidad > aplicar). Utilizar una longitud de onda de excitación de 488 nm (filtro de 525/50) para detectar tejido pulmonar de autofluorescent y 640 nm (filtro de 680/30) para excitar a las células humanas marcadas con un fluoróforo de emisión en el espectro rojo.
    2. Centrarse en la muestra emocionada al 488 nm y adaptar el enfoque a través de la herramienta 'corrección cromática' a la longitud de onda de excitación de 640 nm (Utilice el control deslizante para ajustar la corrección cromática > aplicar).
    3. Elegir un factor de zoom apropiado; utilizar un resumen de baja magnificación (por ejemplo, 6.3 x) para determinar la distribución general de las células etiquetadas dentro del tejido pulmonar y ampliadas imágenes (por ejemplo, 32 x) para la localización detallada.
    4. Seleccione un ancho de hoja uniformemente elucidar el órgano entero o una sección específica de interés (óptica > Utilice el control deslizante para ajustar el ancho de la hoja, generalmente entre 20 – 40%). Definir la apertura numérica (NA) de la hoja con mayor NA creación de imágenes más nítidas (óptica > Utilice el control deslizante para ajustar la hoja NA; para un lóbulo del pulmón murino ampliado a su tamaño fisiológico una NA de 0.025% a menudo puede ser utilizada).
    5. Seleccione el número de hojas de luz para ser utilizado en 'configuración de medición avanzada'. En el caso de iluminación bidireccional, combinar hojas de luz derecha e izquierdas para crear una imagen homogénea iluminada (avanzada > combinar lightsheets > seleccionar modo de mezcla > utilizar deslizadores para definir el solapamiento entre ambas hojas de luz).
      Nota: Se recomienda tomar ventaja de la iluminación bidireccional de la muestra con tres luz fichas cada uno.
      Opcional: Para aumentar aún más la calidad de imagen, utilice la operación de enfoque dinámico. Esto permite para mover el foco en dirección x en la adquisición de la imagen.
    6. Definir posiciones de inicio y final de la pila de z para medir y ajustar el tamaño de paso a 5 μm (mesa xyz Z > escanear rango).
      Nota: Posiciones de inicio y final de una pila de z dependen de tamaño y posicionamiento del lóbulo pulmonar dentro de la cámara de muestra. Sin embargo, alrededor de 300 a 800 z-pilas generalmente son adquiridas para un lóbulo de pulmón único (tamaño de paso de 5 μm).
    7. Guardar los archivos utilizando 'configuración de Autoguardar' y empezar a medida para capturar imágenes. Después de terminar de adquisición de datos, limpiar el sostenedor de la muestra contaminada de ECi y cámara bajo el agua.
      Nota: Utilizar los mismos ajustes a la imagen de varios lóbulos pulmonares que deben ser comparados posteriormente.

6. post-imagen procesamiento y cuantificación de células humanas de pulmón-acumulada

Nota: Por favor vea la Tabla de materiales para más detalles sobre el software de la proyección de imagen para análisis 3D, en que se basan los siguientes pasos. Sin embargo, alternativa post-imaging software se puede utilizar también.

  1. Carga la primera imagen de una pila de z (activar el botón surpass, archivo > Abrir > seleccionar imagen) para iniciar la apertura de todas las otras imágenes de la z-pila solicitada y su reconstrucción 3D automático.
  2. Para garantizar la correcta visualización de x, y y z dimensiones, compruebe el tamaño del voxel y ajustarlas si es necesario (Editar > Propiedades de la imagen > introducir manualmente tamaño de voxel). Por el tamaño del voxel de z, escriba el tamaño de paso elegido entre dos imágenes (aquí 5 μm).
  3. Visualizar cada canal en un color distinto (Editar > Mostrar pantalla de ajuste). Haga clic en cada canal uno después del otro para definir un color de elección (en la figura 2A, B, C, D la señal de la autofluorescencia se muestran en color gris y se etiqueta CD4 humano células+ en rojo).
  4. Ajustar la intensidad, nivel de negro y contraste para cada canal (Editar > Mostrar pantalla de ajuste) usando los triángulos en los bares de canal o entrar en números exactos en los ajustes del canal. Para el ajuste de intensidad, utilice el triángulo de la derecha. Para ajuste del nivel de negro, usar el triángulo de la izquierda y para ajuste de contraste, el triángulo medio.
    Nota: Uso el pulmón deriva el control del ratón sin transferencia de células (paso 3.3) para diferenciar entre señales específicas humanas mástil-célula-derivados y fondo inespecífica.
  5. Para cuantificar células etiquetadas dentro del tejido pulmonar usan 'agregar nuevos anuncios' en la barra de herramientas y seleccione 'omitir creación automática, editar manualmente' para el recuento manual de la célula.
    Nota:
    de forma alternativa, utilice la celda automática contando para debajo de 'spots'. Sin embargo, conteo manual permite diferenciar más precisamente señales inespecíficas y específicas.
    1. Para comparar la acumulación de las células humanas a través de diferentes muestras, definir un cubo de pulmón con un volumen específico utilizando la herramienta de corte 3D (Editar > Recortar 3D) (aquí 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
    2. Para contar células acumulados Seleccione el canal nm 640 y definir una 'escala de radio' de 10 μm. A continuación, haga clic en 'Editar', ver 'seleccionar' en el menú de puntero y marque cada célula con un punto mediante Mayús-clic con el botón izquierdo del ratón. Encontrar el número total de células contadas en las estadísticas.
      Nota: Es muy recomendable contar varios cubos por lóbulo pulmonar (aquí cinco) para garantizar la confiabilidad de los resultados y compensar para selección científico dependiente de la capacidad pulmonar contado (resultados de estrategia y representante de cuantificación son representados en Figura 2D).
  6. Capturar una imagen mediante la herramienta 'instantánea' o grabar un vídeo utilizando la herramienta de 'animación'. Guardar ajustar archivos como archivos .ims (archivo > exportación).
    Nota: Con fines representativos, mostrar u ocultar el cuadro de tildar o destildar el marco en la barra de herramientas. Además, visualiza imágenes como proyección de máxima intensidad (MIP) (barra de herramientas > volumen > modo > Compruebe MIP) o usar el modo' superficial' (barra de herramientas > Añadir nuevas superficies). El modo de' superficial' tiene que ser activado por separado para que cada canal resaltar la arquitectura de tejido o célula (imágenes representativas se muestran en la figura 2C).

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Representative Results

El protocolo presentado describe un modelo experimental de ratón, que permite monitoreo y cuantificación de la acumulación de linfocitos T humanos eventualmente transferidos en el pulmón mediante microscopía de fluorescencia de la hoja de luz. Figura 1 Proporciona un Resumen esquemático de los pasos en vivo del programa experimental . Para garantizar resultados confiables, se etiqueta de sustancial importancia para garantizar una buena calidad de los aislados y fluorescencia humana CD4+ T las células, que luego se transferirán en ratones. Como representativo representado en la figura 1B, C, el procedimiento descrito anteriormente para la célula base del microbead enriquecimiento y posterior fluorescencia-etiquetado generalmente resultados en un flujo cytometrically determinan CD4+ T cell pureza > 95% y fluorescencia-etiquetado exitoso de los CD4+ T las células. La profundidad de penetración y calidad de microscopía de fluorescencia de la hoja de luz depende críticamente un grado apropiado de limpieza del tejido. Como se muestra en la figura 1D, el protocolo aplicado aquí para tejido basado en ECi claro fue capaz de garantizar un alto nivel de transparencia del órgano, lo que indica una comparación acertada índice de refracción. Finalmente, un resultado general representante del protocolo experimental descrito en forma de imágenes de microscopía de fluorescencia de luz hoja completamente procesados se demuestra en la figura 2B, C, D y en el Video complementario. La señal de autofluorescent (aparece en gris) proporciona una herramienta útil para la proyección de imagen la estructura anatómica del pulmón. Señal roja representa pulmón acumulado humana CD4+ T las células. Cuantificación de imágenes de microscopía de fluorescencia de la hoja de luz permite determinar el total acumulado de número de pulmón humanos CD4+ T células por área definida del tejido pulmonar inflamado. Una estrategia para la cuantificación de la infiltración de células humanas se ilustra en la figura 2E. La detección de la citometría de flujo (opcional) de fluorescencia etiquetada células dentro el BAL de los ratones receptores, como se muestra en la figura 2F, se puede utilizar como una técnica complementaria para confirmar la migración de tejido exitosa de eventualmente transferido CD4+ T las células. Por otra parte, la preferencia de las células de T humanas transferidas para acumulación selectiva en el tejido de pulmón inflamado el aquí descrito de ajuste experimental fue más apoyado por el hecho de que CD4 humano+ T las células no se puede recuperar en la mucosa intestinal de los animales receptores como representado en la figura 2B (panel derecho).

Figure 1
Figura 1 : Descripción esquemática del flujo de trabajo experimental en vivo. Inflamación del pulmón alérgico (A) fue inducida en ratones C57BL/6J por inhalación de la papaína (50 μg/ratón) durante tres días consecutivos (d0, d1 y d2). Al día siguiente (d3), recién aislado y fluorescencia etiquetada CD4 humano+ T las células eventualmente fueron transferidas en ratones mediante la inyección de la vena de la cola. Después de otras tres horas, ratones fueron sacrificados, seguido de perfusión in situ y la fijación de los pulmones. Finalmente, los pulmones fueron explantados y más analizados ex vivo por microscopía de fluorescencia de luz-hoja. Opcionalmente, se puede recoger BAL antes de explantación de pulmón para realizar extendido ex vivo análisis de extravasated y migrados con éxito células humanas. (B) histograma representante confirma la pureza de la CD4 aislado+ fracción de la célula de T determinado por citometría de flujo. Células teñidas por un humano CD4 anticuerpo o isotipo de control se muestran en negro y gris, respectivamente. Histograma representación (C) confirma la eficacia de la fluorescencia de etiquetado de CD4 humano antes de la transferencia adoptiva de células+ . (D) imágenes representativas de un lóbulo del pulmón murino perfundidos antes y después de la tala con ECi. FI, intensidad de la fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Análisis representativo de la acumulación pulmonar de humanos CD4+ de las células en el contexto de la inflamación del pulmón en vivo. Humana CD4+ las células fueron aisladas de sangre periférica usando densidad gradiente centrifugación seguida por un paso de purificación del microbead base magnética. Humana CD4+ células eran etiquetadas usando un tinte de la proliferación de célula excitable a la luz roja e inyectadas por vía intravenosa en ratones C57BL/6J expuestos de papaína. Después de tres horas, ratones fueron sacrificados para recoger y analizar el tejido pulmonar mediante microscopía de fluorescencia de la hoja de luz. (A) Resumen representativo de una reconstrucción 3D del tejido del pulmón murino, expuestos de la papaína (gris) tres horas después de la inyección intravenosa de CD4 humano etiquetado microscopia (rojo) según lo registrado por hoja de luz de la fluorescencia de las células+ . (B) tejido pulmonar de un ratón receptor tres horas después de la transferencia de células se muestran como resumen o segmento de gran aumento (panel izquierdo). Obtenido humana CD4+ células podrían visualizarse como señales rojo y fueron bien representados en superposición con la señal de la autofluorescencia del tejido pulmonar o como imagen de un canal. Para confirmar la especificidad de la señal detectada, control tejido pulmonar sin transferencia de células intravenosa sirve como control negativo (panel central). En contraste con el tejido pulmonar, no etiquetados CD4 humano+ las células (rojo) se podían detectar en el íleon del mismo ratón receptor (panel derecho). (C) Post procesamiento de imágenes permite el análisis de solo trozos de tejido pulmonar, así como generación de reconstrucciones 3D del segmento de órgano entero que puede ser bien representado como proyección de máxima intensidad (MIP) o en modo de superficie. Se muestran imágenes representativas. (D) cuantificación estrategia se ilustra exemplarily en el pulmón mismo ya representado en la figura 2A. Cubos definidos del segmento pulmonar analizados fueron seleccionados y el número de CD4 humano+ las células (rojo) se cuantificó para cada cubo. Resultados de una cuantificación realizada posteriormente (eventos/813 μm x 813 μm x 1,000 μm cubo) están indicadas como media ± SEM. (E) como opción adicional, puede ser detección cytometric del flujo de células de T humanas fluorescencia marcadas en el BAL de los animales receptores para confirmar la migración de tejido exitosa de CD4 humano acumulado+ T las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Video
Video complementario: Mostrando secuencia de vídeo representativo acumulado humana CD4+ de las células dentro del tejido del pulmón murino. Reconstrucción 3D de la exhibición del pulmón murino acumulado humana CD4+ las células (rojo) en el contexto de los tejidos pulmonares (gris) tres horas después de la inyección intravenosa en la vena de la cola. Imágenes se muestran como MIP en principio y en el modo de superficie en el extremo. Imágenes adquiridas mediante microscopía de fluorescencia de luz-hoja y procesados por la proyección de imagen de software para análisis 3D. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

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Discussion

El nivel experimental descrito aquí proporciona la oportunidad de controlar la capacidad recalada de pulmón de células inmunes humanas primarias bajo condiciones inflamatorias in vivo y así relevante complementos clásico realiza quimiotaxis y adherencia in vitro ensayos. Para tener en las características de órgano anatómico específico de cuenta del pulmón, aspectos importantes de la célula inmune autoguiado hacia el blanco (incluyendo chemotaxis y célula de distribución dentro del órgano blanco) así como la relevancia clínica y posibilidad de transferencia de datos adquiridos, tomamos ventaja de tres características principales: (1) el análisis de las células primarias humanas dentro de una vida organismo murino; (2) la inducción mediada por la papaína de la inflamación pulmonar; y (3) microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar despejado.

Aunque los estudios funcionales de eventualmente transfieren humano células inmunes dentro de un organismo murino vivo pueden estar limitadas en algunos aspectos debido a las incompatibilidades potencialmente relevantes del receptor-ligand-interacciones entre ratones y hombres, el concepto general de modelos de ratón humanizado se ha establecido con éxito como una herramienta experimental importante en el campo de la medicina traslacional durante las últimas décadas24,32,33,34,35 . En comparación con modelos animales clásicos, estudios en ratones humanizados ofrecen la ventaja de analizar directamente las células inmunes derivadas de paciente en un escenario en vivo y de tal modo para identificar alteraciones funcionales impresos por la enfermedad32, 36,37. Con respecto a la relevancia de las posibles discrepancias entre definen los receptores en la superficie de las células inmunes humanas y sus respectivos ligandos murinos o viceversa, estudios anteriores ya se ha indicado que humanos CD4+ T las células son capaces de interactuar eficientemente con las moléculas de adhesión murino MAdCAM-1 y VCAM-1, que representan ligandos cruciales de homing de linfocitos mediada por la integrina32. Por consiguiente, migración de células inmunes humanas intravascularly transferidas en tejido murino gut podría correctamente bloqueada en vivo por tratamiento con los α4β7 clínico utiliza anticuerpo integrina vedolizumab32. Sin embargo, incluso en caso de que un específica receptor-ligando-interacción de relevancia podría mostrar un completo desajuste humano/murino, presumiblemente será posible superar esta limitación por ingeniería genética y, por ejemplo, por la sobreexpresión transgénica de la respectivo ligando humano, factor de crecimiento, citoquinas o receptor dentro de la organismo murino33,35.

Como una influencia significativa de la inflamación crónica en la secreción local de quimiocinas, la expresión endotelial de moléculas de adhesión y la posterior acumulación de linfocitos se ha descrito en numerosas publicaciones38,39 ,40, la elección de un modelo experimental adecuado de la inflamación pulmonar representa un paso crítico y establecer lo anterior describe el protocolo y puede ser adaptado a dependiente en el contexto clínico de cada estudio individual. El ajuste aquí de inflamación pulmonar alérgica inducida por la papaína representa un modelo experimental bien-descrito, que se basa en la capacidad de la papaína proteasa de cisteína localmente administrada a irritar el epitelio de las vías respiratorias y el gatillo el liberación de alarmins27,41,42. Curiosamente, exposición accidental a la papaína es conocido por causar el desarrollo de asma en seres humanos bien43. Dependiente de la dosis inhalada de la papaína, ratones expuestos mostrar una acumulación de células inmunitarias innatas y adaptativas y de niveles elevados de citoquinas de tipo 2 en el pulmón27. Mientras que la escalada de dosis resultó dan como resultado una ampliación de espacios aéreos (fenómeno histológico clásico de EPOC) y una destrucción de las paredes de los vasos sanguíneos con hemorragia subsecuente, horarios de dosificación moderada fue junto a un prominente eosinofilia pulmonar y por lo tanto mímico una característica histológica importante del asma humano27. Como nuestro propósito era utilizar este modelo experimental para generar un contexto inflamatorio para el análisis de célula inmune pulmonar autoguiado hacia el blanco, cuidadosamente tratamos de evitar el daño inducido por la papaína de vasos sanguíneos, que de lo contrario podría resultar en un unphysiological extravasación de células inmunes humanas debido a la integridad endotelial perturbado. Por consiguiente, hemos seleccionado una dosis intermedia de 50 μg de papaína por ratón por día en el protocolo descrito anteriormente. Aunque desarrollo de papaína-inducida por inflamación de las vías respiratorias también se produce en ausencia de B y los linfocitos T, pulmonar infiltran las células inmunitarias adaptativas son conocidos para impactar significativamente en el curso de la enfermedad27,42. Por ejemplo, las células T reguladoras podrían ser identificadas como reguladores de la potentes de papaína-inducida de la vía aérea eosinofília27. En perspectiva, la participación activa de los linfocitos pulmonares en la patogénesis inflamatoria de ratones expuestos a papaína implica que el protocolo descrito arriba puede permitir además analizar la capacidad funcional de eventualmente transferido y con éxito acumulado de pulmón humano las células inmunes para modular la patología pulmonar (por ejemplo, a través de adquisición de citometría de flujo de cuentas eosinófilas en el BAL). Además, podría permitir una administración intranasal además realiza de las quimiocinas humana enfermedad relevante justo antes de la transferencia de células intravasculares para analizar el impacto de estos mediadores humorales en el proceso de recalada de pulmón de humanos distintos poblaciones de células inmunitarias en un escenario en vivo. Asimismo, puede estudiarse el efecto de inhibidores sobre el proceso de regreso de pulmón y, posteriormente, en la patología pulmonar inflamatoria.

Una ventaja particular del procedimiento experimental introducido aquí es el preciso seguimiento y localización del pulmón infiltran las células inmunes humanas por la gama alta calidad imágenes de microscopía de fluorescencia de luz-hoja. Estudios recientes ya demostraron que la técnica de microscopía de fluorescencia de luz hoja representa una valiosa herramienta experimental para el análisis de célula inmune intestinal autoguiado hacia el blanco en investigación traslacional de la enfermedad inflamatoria intestinal y es capaz de superar las principales limitaciones de convencionales inmunofluorescencia microscopia y flujo cytometry24,32. Y análisis basados en la microscopía convencional están generalmente restringidos a una muy pequeña área potencialmente no representativa de la citometría de flujo y órgano no tiene en cuenta el aspecto de organización de tejidos, hoja de luz de microscopía de fluorescencia de tejido químicamente limpia permite una profundidad de penetración creciente sin gran pérdida de resolución y permite una reconstrucción 3D de las secciones del órgano más grande (hasta 1,5 cm x 1,5 cm)24,28,44. Seguramente, la calidad y validez de reconstrucciones 3D adquiridas críticamente dependen el rendimiento de remoción de tejido. En el escenario descrito aquí, se incluyeron una versión ligeramente adoptada del recientemente publicado protocolo para tejido basado en ECi claro44. En comparación con otras estrategias bien establecidas para el tejido de base solvente claro26,45,46, el protocolo basado en ECi combina las ventajas de claro excelente propiedades, toxicidad baja de usados reactivos y tiempo moderado requisito44. Como la capacidad de microscopía de fluorescencia de luz hoja estándar para resolver estructuras del tejido más finas como capilares alveolares es todavía limitada incluso en óptimas condiciones28, del claro de alguna manera sería difícil de distinguir de forma fiable entre las células inmunitarias intravasculares y ya extravasated. La inclusión de un adicional estándar basada en fluorescencia vascular tinción en el protocolo descrito aquí probablemente no sería capaz de superar completamente esta limitación. Así, los estudios con un enfoque particular en el comportamiento de las células inmunes en la microcirculación pulmonar o su diapedesis preferentemente tengan en cuenta un protocolo publicado recientemente y muy elegante para la proyección de imagen de pulmón intravital basado en 2-fotón microscopia de47. En este contexto experimental, una ventana torácica fue implantada en ratones anestesiados y ventilados, a través del cual puede controlarse el pulmón estabilizado escaneando un resonante-módulo 2-fotones microscopía, permitiendo alta resolución de imagen a lo largo de la ciclo respiratorio en conserva ventilación y perfusión47,48. Esta técnica se ha aplicado con éxito en diversos estudios y fue capaz de visualizar por ejemplo la biogénesis plaquetaria intrapulmonar y la entrada del pulmón de circulación tumor células49,50. Sin embargo, además de la exigencia de equipo sofisticado instrumental (p. ej., sistema de ventilación de ratón) y la necesidad de extensas manipulaciones invasivas en animales vivos (implantación de la ventana torácica y microscopia intravital), la principal limitación de este pulmón vivo sistema de microscopía es la penetración del eje z confinados. La proyección de imagen superficial de pulmón realizada sólo permite analizar el exterior 100 μm de subpleurales pulmonares tejido47,48. El dependiente en el contexto científico, podría ser una opción valiosa para implementar 2 fotones microscopía de los pulmones explanted como un procedimiento adicional en el protocolo descrito anteriormente. Analizar el pulmón mismo primero por 2 fotones microscopía y después por microscopía de fluorescencia de luz hoja podría representar una estrategia para obtener una descripción cuantitativa de la distribución y localización de células inmunes humanas dentro del pulmón murino ( Microscopía de fluorescencia de luz-hoja) y, al mismo tiempo, hacerse una idea más detallada en los procesos celulares o microvasculares (2 fotones microscopía). De hecho, 2 fotones microscopía de explantes traqueales murinos representa una imagen establecida de la herramienta para analizar el comportamiento de células inmunitarias en el contexto de inflamación de pulmón inducida experimentalmente51,52. En lugar de visualizar pequeños capilares pulmonares, la exitosa infiltración de tejido de extravasación y los pulmones de las células de T humanas transferidas en nuestro modelo experimental también puede ser probada mediante la detección de fluorescencia etiquetadas células humanas en el BAL del destinatario animales mediante citometría de flujo como exemplarily representado en la figura 2E. En general, análisis del compartimiento del BAL celular representan un método bien establecido para caracterizar el flujo pulmonar de la célula inmune en el contexto de las enfermedades respiratorias inflamatorias31. Finalmente, otra estrategia de citometría de flujo para cuantificar la extravasación de células inmunitarias eventualmente transferidas dentro de tejido pulmonar fue descrito por Galkina et al (2005)53 y potencialmente podría combinarse con el protocolo descrito aquí. En el estudio por Galkina et al., una sola inyección intravenosa de un anticuerpo anti-CD8 conjugado fluorescencia poco antes de la resección del pulmón resultó en un exclusivo y completo etiquetado de antes transfirió CD8+ T las células dentro del pulmón compartimiento vascular, mientras que los CD8 ya extravasated+ T las células dentro del intersticio pulmonar permanecido sin mancha. Análisis posterior de las células inmunes pulmonares marcadas en vivo fueron realizado flujo cytometrically después ex vivo digestión de tejido de pulmón53. Por supuesto, el proceso de digestión de tejido significa que la separación anatómica entre el intra y el compartimento extravascular pulmonar es derogada y, por lo tanto, existe un riesgo general de falsos positivos etiquetado de células inmunes intersticiales debido a la pérdida de anticuerpos entre ambos compartimientos. Este riesgo sólo se puede minimizar realizando la digestión del tejido en presencia de saturación cantidades de anticuerpo sin etiqueta53 o, potencialmente, sustituyendo el análisis cytometric del flujo por microscopía de fluorescencia de la hoja de luz, que hace posible para evitar la destrucción de la estructura del tejido por completo.

En Resumen, aquí presenta combinación de homing en vivo de fluorescencia etiquetadas células inmunes primarias y microscopía de fluorescencia de luz-hoja subsecuente es capaz confiablemente identificar, cuantificar y localizar las células inmunes humanas pulmón acumulado en un modelo experimental de ratón de la inflamación pulmonar.

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Disclosures

M.F. Neurath ha servido como asesor para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda y Boehringer. Los restantes autores no revelar cualquier conflicto.

Acknowledgments

Los autores reconocen con agradecimiento financiación por la DFG colaboración investigación centros SFB 1181 y 241 TRR. La óptica de imagen centro de Erlangen (OICE) y en particular Ralf Palmisano, Philipp Tripal y Tina Fraaß (proyecto Z2 de la DFG CRC 1181) son reconocidos por expertos asistencia técnica para la proyección de imagen microscópica hoja de luz de la fluorescencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose NEEO Ultra Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody BioLegend, San Diego, USA 304060
Ammonium chloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany K2981
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 301300
Cell proliferation dye eflour670 eBioscience Inc., San Diego, USA 65-0840-85
CD4 MicroBeads, human Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 21066001
Ethly cinnamate (ECi) Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany P40-47500
Filter 100 µm  VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany 732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 Bitplane AG, Zurich, Switzerland n.a.
ImspectorPro software Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany n.a.
Ketamin  Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany 3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany n.a.
MACS MultiStand Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-303
Multifly cannula 20 G Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 851638035
30 G needle B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9161502
Neubauer counting chamber neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany C-1003
Pattex Glue Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany PSK1C
LS column Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) anprotec AC-AF-0018
Papain Merck 1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) Biochrom GmbH, Berlin, Germany L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 BioLegend, San Diego, USA 317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl BioLegend, San Diego, USA 400337
PFA (paraformaldehyde) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 0335.1
Potassium hydrogen carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany P7481
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 86.1254.001 
Syringe 1 mL B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9166017V
Syringe 5 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260067
Syringe 20 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260069
Tube 1.5 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,706,400
Tube 2 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72.695.400 
Tube 2 mL, brown Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,695,001
Tube 15 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.554.502 
Tube 50 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.547.254 
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-090-976
Xylazin (Rompun 2%) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany KPOBD32

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