Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S., Grüneboom, A., Neufert, C., Wirtz, S., Neurath, M. F., Atreya, I. Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59043, doi:10.3791/59043 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Accumulazione del tessuto delle cellule immuni altamente attivate in modo schiacciante rappresenta un segno distintivo di varie malattie infiammatorie croniche ed emerso come un obiettivo terapeutico attraente nella gestione clinica dei pazienti affetti. Al fine di ottimizzare ulteriormente le strategie finalizzate a regolamento terapeutico di infiltrazione del tessuto patologico squilibrata delle cellule immuni pro-infiammatorie, sarà di particolare importanza per il raggiungimento di migliori intuizioni in malattia organo-specifiche e Proprietà Homing dei linfociti periferici. Il protocollo sperimentale descritto qui permette di polmone accumulo di linfociti umani fluorescente contrassegnati e passivamente trasferiti nel contesto di infiammazione polmonare indotta da papaina. In contrasto con l'analisi in vitro standard si è frequentemente utilizzata per l'analisi di chemiotassi e migrazione delle cellule immuni, l'impostazione ora introdotto in vivo tiene conto di aspetti specifici del polmone dell'organizzazione del tessuto e l'influenza del complesso infiammatorio scenario che si svolgono nell'organismo vivente murino. Inoltre, imaging microscopica tridimensionale a sezione trasversale luce-foglio fluorescenza non fornisce solo dati quantitativi su infiltrazione di cellule immuni, ma raffigura anche il modello di localizzazione delle cellule immuni all'interno del polmone infiammato. Nel complesso, siamo in grado di introdurre una tecnica innovativa di alto valore per le ricerche immunologiche nel campo delle malattie polmonari croniche infiammatorie, che può essere facilmente applicato seguendo il protocollo fornito dettagliato.

Introduction

Classici disordini infiammatori del polmone, come l'asma allergica e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sono ben noti per essere guidato da un aumentato reclutamento di linfociti attivati nel tessuto polmonare1,2. Linfocita-rilasciato citochine (ad es., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ e TNF-α) promuovere ulteriormente la chemiotassi di cellule immuni innate ed adattabili, indurre fibrotica vie respiratorie che ritoccano o direttamente danneggiare il parenchima polmonare2. Finora, i meccanismi di fondo responsabili dell'accumulo patologico dei linfociti all'interno del tessuto polmonare ancora completamente non sono capiti. In analogia al tessuto-selettivo delle cellule di T imprinting descritto per homing intestinale e della pelle, polmonare cellule dendritiche (DCs) sono ovviamente in grado di prime cellule di T periferiche per infiltrazione polmonare preferenziale, almeno in parte tramite l'induzione dell'espressione di CCR4 sul superficie di linfociti3. Oltre CCR4, delle vie respiratorie-infiltrazione di cellule T sono anche caratterizzate da una particolare aumentata espressione dei recettori chemochinici CCR5 e CXCR3 rispetto alle cellule di T all'interno il sangue periferico1,4,5. Nel complesso, esistenti dati sono coerenti con il concetto che polmone homing dei linfociti T in condizioni fisiologiche o infiammatorie coinvolge un numero di recettori per le chemochine diversi e loro rispettivi ligandi e così fondamentalmente dipende un strettamente controllata la collaborazione tra le cellule immuni innate ed adattabili1. Soprattutto, durante la fase iniziale dell'esposizione dell'agente patogeno o allergene, cellule del sistema immunitario innato rispondono alla stimolazione dei TLR o di IgE-mediata reticolazione dell'immediato rilascio di chemioattrattanti differenti, come LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 e PGD21,6,7. Come un primo esempio, l'interazione tra PGD2 e il recettore chemoattractant CRTh2 è noto per essere di particolare importanza per chemiotassi di cellule Th2 e così è comparso come promettente bersaglio terapeutico nell'amministrazione clinica di asma. Infatti, i pazienti con asma moderata hanno mostrato un miglioramento dei sintomi e un aumento significativo del volume espiratorio forzato in un secondo (FEV1) dopo il trattamento con un antagonista selettivo CRTh2 rispetto al gruppo placebo8 ,9. In uno stato più progredito della risposta infiammatoria, già reclutato le cellule T sono in grado di amplificare ulteriormente accumulazione polmonare del linfocita tramite il rilascio di IL-4 e IL-13 come potenti stimoli per DCs polmonare. Successivamente, queste cellule innate mieloide-derivato in su-regolano l'espressione di CCL17 e CCL22 in un STAT6-dipendente modo1,10,11.  Anche se la complessità dello scenario descritto ancora ostacola una comprensione completa del polmone delle cellule T homing, offre una pletora di bersagli molecolari per un controllo terapeutico potenzialmente ottimizzato delle malattie polmonari infiammatorie o allergiche. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di tecniche sperimentali innovative, che sono in grado di approfondire e integrare la nostra conoscenza nel campo della cellula T chemiotassi e polmone homing ulteriormente.

Dovuto al fatto che homing polmonare dei linfociti all'interno del corpo umano è influenzata da molteplici parametri cellulari, umorale e fisica1, la maggior parte dei metodi sperimentali esistenti non sono in grado di modellare tutta la complessità di questo processo immunologico. Invece, molti protocolli standard per l'analisi del polmone homing selettivamente concentrano su un aspetto specifico coinvolto nella cascata di attrazione del linfocita, adesione, migrazione e ritenzione. Oltre ad una determinazione puramente descrittiva del pattern di espressione di mRNA o proteina delle integrine e chemochine recettori sui linfociti periferici o polmone-infiltrazione e la misura complementare di chemokine rispettivi livelli nel sangue, il lavaggio broncoalveolare (BAL) o tessuto polmonare12,13,14,15, saggi di cultura consolidata in vitro delle cellule consentono una caratterizzazione funzionale di adesione dei linfociti o chemiotassi al momento definito condizioni sperimentali16,17,18. In linea di principio, saggi di adesione statica in vitro monitorare la capacità legante di linfociti coltivati per un monostrato endoteliale o diapositive di vetro rivestiti con molecole di adesione endoteliali ricombinante (ad es., MAdCAM-1, VCAM-1), mentre in vitro standard chemiotassi sono solitamente applicati al fine di quantificare la capacità dei linfociti di migrano lungo un gradiente di chemokine in un sistema di transwell19. Entrambe le impostazioni in vitro permettono una regolazione controllata e la modulazione delle condizioni sperimentali, ma d'altra parte mancano importanti variabili note criticamente l'impatto sulla chemiotassi in vivo e l'adesione dei linfociti. Principalmente, saggi di cultura statica cellulare ignorare l'influenza delle forze di taglio causate dal flusso di sangue permanente19 e potenzialmente trascurano il coinvolgimento del milieu immunologica circostante e interagenti non-linfocita cellule immunitarie, entrambi presenti in un organismo vivente. Per superare queste limitazioni, l'interpretazione dei risultati acquisiti nelle analisi in vitro statiche di chemiotassi o aderenza bisogno ulteriore convalida negli esperimenti di adesione dinamico sotto flusso condizioni20,21 e in vivo modelli di infiammatorio organo patologia19. Infatti, importanti studi sugli animali potrebbero trarre conclusioni sulla regolamentazione del polmone delle cellule T homing in condizioni infiammatorie o allergiche analizzare geneticamente topi modificati in modelli definiti di diverse malattie polmonari3, 22 , 23. il confronto quantitativo del polmone infiltrazione di linfociti tra topi selvatici e topi con un deficit per un gene specifico di interesse rappresenta uno strumento ben consolidato e largamente usato per definire l'impatto del cellulare particolare percorsi o recettori sul modello di malattia basato di distribuzione delle cellule T. Tuttavia, contrariamente a prima discusso saggi di cultura in vitro delle cellule, un disegno di studio basato su modelli animali classici manca la capacità di analizzare e monitorare le cellule T umane primarie direttamente derivate dal sangue o BAL di pazienti affetti da un infiammatorio del polmone malattia. Così, rimane ancora impegnativo per convalidare funzionalmente se una malattia polmonare diagnosticamente specificato è in grado di imprimere i linfociti umani per tropismo preferenziale del polmone e fino a che punto i parametri clinici potrebbero avere un impatto su questo scenario. Recentemente, un approccio molto elegante in vivo è stato introdotto nel contesto delle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD), che era in grado di superare la maggior parte di queste limitazioni e aperto nuove strade per studi avanzati traslazionali su linfociti intestinali homing24 . Approfittando dei protocolli per schiarimento del tessuto solvente seguita da microscopia di fluorescenza di luce-foglio trasversale come un potente strumento di imaging, è stato possibile visualizzare l'infiltrazione e la distribuzione delle cellule T umane passivamente trasferite nell'intestino dei topi immunodeficienti colitic24. In particolare, questa impostazione sperimentale implementato due innovazioni principali: (1) cellule immuni umane primarie possono essere analizzati in condizioni in vivo sperimentalmente definite; (2) una zona piuttosto grande di organo malato (circa 1,5 x 1,5 cm) può essere imaged in qualità ad alta risoluzione, seguita da ricostruzione 3D. Inoltre, parecchi studi recenti stabilito con successo l'uso del tessuto a base di solvente di compensazione e microscopia a fluorescenza di luce-foglio come strumenti importanti per polmonare avanzato imaging25,26. Al fine di beneficiare di questo progresso tecnologico nel campo dell'immunologia polmonare, abbiamo ora adottato il sistema per analisi di homing polmonare.

Il protocollo qui presentato fornisce un'introduzione passo passo come purificare e fluorescente etichetta primaria umana T cellule per trasferimento in topi con infiammazione polmonare indotta e, inoltre, descrive in dettaglio il processo successivo di luce-foglio imaging al microscopio di fluorescenza, tra cui organo preparazione ed elaborazione di immagini. Nel complesso, ci auguriamo sostenere gli studi traslazionali futuri nel campo delle malattie polmonari infiammatorie o allergiche introducendo un sofisticato, ma modello tuttavia fattibile, sperimentale per il monitoraggio di homing polmonare del linfocita umano su condizioni in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalle autorità locali competenti a Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germania). Topi sono stati alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche. La raccolta di sangue umano è stata approvata dal comitato etico locale e il Comitato di revisione istituzionale dell'Università di Erlangen-Norimberga. Ogni paziente ha dato il consenso informato scritto.

1. indurre infiammazione allergica polmonare in topi

Nota: Come descritto in precedenti studi27, la seguente procedura sperimentale permette che inducono l'infiammazione allergica della via aerea in topi e, di conseguenza, innesca l'accumulo delle cellule immuni innate ed adattabili nel BAL. Il protocollo descritto è stato stabilito nei topi C57BL/6J, ma l'adozione di altri ceppi inbred standard dovrebbe essere possibile.

Vedere la Figura 1A per un riepilogo delle procedure sperimentali in vivo.

  1. Anestetizzare topi tramite l'iniezione intraperitoneale di chetamina/xilazina.
    Nota:
    utilizzare solo più di 6 settimane e con un peso corporeo di almeno 16 g i topi C57BL/6J.
    1. Preparare la soluzione di chetamina/xilazina in PBS (12 mg/mL ketamina; xilazina 1,6 mg/mL) e determinare il peso esatto dei topi.
    2. Iniettare il primo mouse con 8 µ l/kg di peso corporeo di chetamina/xilazina soluzione intraperitonealmente e confermare l'anestesia profonda tramite l'assenza del riflesso del pizzico di zampa prima di procedere al punto 1.3.
  2. Appena preparare 5 mg/mL di papaina in PBS. Pipettare lentamente 10 µ l (50 µ g) della soluzione papaina nella narice. Monitorare attentamente il mouse fino al risveglio.
  3. Ripetere i passaggi da 1.1 e 1.2 per tutti i mouse inclusi nell'esperimento. Eseguire passaggi 1.1 – 1.3 in tre giorni consecutivi.

2. purificare ed etichettare fluorescente CD4 di sangue periferico umano+ le cellule di T

Nota: Processo delle cellule in condizioni sterili.

  1. Raccogliere 18 mL di sangue intero umano da una vena periferica. Eseguire centrifugazione in gradiente di Ficoll-Hypaque al fine di selezionare la frazione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC).
    Nota: Raccolta e analisi di materiale umano primario devono essere approvati dalle autorità locali etica. Solo una persona con un'adeguata qualificazione medica è consentita prelevare il sangue da una vena periferica.
    1. Raccogliere il sangue in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-che contiene monovettes (1,6 mg di EDTA/mL di sangue) al fine di evitare la coagulazione.
      Opzionale: Utilizzare il sangue di buffy-coat, un sottoprodotto della donazione di sangue arricchito nei leucociti, invece di sangue venoso completa.
    2. Trasferimento di sangue in una provetta conica 50 mL e diluire 1:2 in tampone fosfato salino (PBS). Con attenzione aggiungere 10 mL di Ficoll-medio (densità 1,077 g/mL) come uno strato di fondo sotto il sangue diluito. Centrifugare il campione (800 x g per 15 min a temperatura ambiente senza freno).
    3. Con attenzione rimuovere il tubo da centrifuga e trasferire l'interfase di PBMC-contenenti in una nuova provetta conica 50 mL. Scartare il superiore e inferiore. Riempire la provetta contenente PBMC con PBS e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Eliminare il surnatante.
      Nota: Facoltativamente, se necessario, eseguire la lisi degli eritrociti rimanenti. Il pellet cellulare sedimento e vortexare il campione attentamente aggiungere 3 mL di tampone di lisi (ACP) ammonio-cloruro-potassio (cloruro di ammonio 155mm; 19mm potassio idrogeno carbonato e 0.68 mM EDTA pH 7,27). Agitare le provette per 3 min. Per rimuovere il tampone di lisi ACP, aggiungere 40 mL di PBS e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Gettare il surnatante.
  2. Purificare il CD4+ T cellule via CD4 microsfere.
    Nota: In generale, ci sono diversi distributori di microperle magnetiche per purificazione di CD4 umana+ cellule, che dovrebbero provocare livelli comparabili di purezza delle cellule. Scelta del prodotto dovrebbe essere basata su preferenze individuali. I seguenti passaggi del protocollo (2.2.2–2.2.7) sono regolati per un prodotto di Microperlina CD4 definiti e colonne di separazione rispettivi ulteriormente indicato nella Tabella materiali. Alcune modifiche del protocollo possono essere richieste nel caso che un prodotto alternativo di Microperlina CD4 è selezionato.
    1. Risospendere il pellet PBMC in un minimo di 80 µ l di PBS contenente 0.5% siero bovino fetale (FBS) e 2 mM EDTA (FBS/EDTA-tampone, PBS) ogni 107 PBMC. Uso una popolazione di partenza di circa 30 x 106 PBMC per finire con circa 3 x 106 a 6 x 106 purificato umano CD4+ T cellule.
    2. Aggiungere 20 µ l di microsfere di CD4 ogni 107 PBMC, mescolare delicatamente e incubare per 20 min a 4 ° C. Riempire il tubo con PBS/FB/EDTA-buffer (raffreddato fino a 4 ° C) e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Rimuovere il surnatante.
    3. Inserire una colonna di separazione in un campo magnetico. Lavare la colonna con 3 mL di PBS/FB /-soluzione tampone dell'EDTA. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di PBS/FB /-soluzione tampone dell'EDTA (raffreddato fino a 4 ° C) e trasferire la sospensione cellulare sulla colonna risciacquata separazione collocata all'interno di un campo magnetico.
    4. Lavare la colonna di separazione tre volte con 3 mL di PBS/FB /-soluzione tampone dell'EDTA (raffreddato fino a 4 ° C) e scartare l'effluente.
    5. Rimuovere la colonna di separazione dal campo magnetico e metterlo in una provetta da 15 mL. Eluire il CD4+ frazione di cellule in 5 mL di PBS/FB/EDTA-buffer utilizzando lo stantuffo.
    6. Riempire il tubo con PBS e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
    7. Determinare il numero delle cellule ha prodotto con un metodo standard di scelta (ad es., camera di Neubauer).
  3. Etichetta CD4+ T cellule con una tintura di proliferazione delle cellule fluorescenti.
    1. Risospendere CD4+ T cells in PBS (fino a 107 cellule/mL; non utilizzare meno di 500 µ l di PBS).
    2. Preparare una soluzione di 6 µM di una proliferazione delle cellule eccitabili luce rossa colorante (Vedi Tabella materiali) in PBS (pre-riscaldato a temperatura ambiente). Mescolare questa soluzione 1:2 con la prima preparato accuratamente sospensione cellulare e vortice (concentrazione finale di 3 µM).
    3. Incubare per 10 min a 37 ° C (protetto dalla luce). In seguito, aggiungere cinque volumi di mezzo RPMI contenente 10% FBS e incubare per 5 minuti sul ghiaccio (riparo dalla luce).
    4. Lavare con etichetta cellule tre volte in RPMI medium contenente 10% FBS (Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C). Risospendere le cellule con etichettate in PBS, memorizzare sul ghiaccio e proteggere dalla luce fino all'utilizzo.
      Nota: Prolungata conservazione delle cellule (> 60 min) potrebbe avere un impatto negativo sulla sopravvivenza delle cellule.
      Opzionale: Determinare la purezza del CD4+ frazione e l'efficacia della procedura d'etichettatura delle cellule tramite flusso cytometry. Risospendere 0,5 x 106 a 1 x 106 CD4+ cellule in 100 µ l di tampone (1% FBS, 2 mM EDTA in PBS) e aggiungere un anticorpo anti-umane CD4 accoppiato con un colorante fluorescente di scelta. Incubare per 30 min a 4 ° C. Aggiungere 1 mL di tampone e centrifugare (300 x g per 10 min a 4 ° C). Gettare il surnatante. Procedere con la misurazione di cytometric di flusso del campione (rappresentativo risultato è raffigurato in Figura 1B, C).

3. passivamente trasferimento umano CD4+ T Cells in papaina-esposti destinatario Mmice

Nota: Vedere la Figura 1A per un riepilogo di in vivo eseguito Procedura sperimentale. Eseguire trasferimento di cellule un giorno dopo l'ultima somministrazione intranasale di papaina.

  1. Regolare le sospensioni di fluorescente contrassegnati CD4 umana+ T cellule (passo 2.3.4) ad una concentrazione di 1 x 107 cellule/mL in PBS. Riempire 100 µ l di sospensione cellulare in un 1 mL/30 G-siringa.
  2. Posizionare con attenzione il primo mouse C57BL/6J papaina-esposti (punti 1.1-1.3) in un dispositivo di ritenuta per iniezione della vena della coda. Utilizzare la siringa preparata (punto 3.1) per forare la vena caudale e iniettare lentamente 100 µ l di sospensione cellulare contenente 1 x 106 etichettato CD4 umana+ cellule. Non estrarre immediatamente l'ago dopo l'iniezione, ma attendere altri 5 secondi al fine di impedire lo scarico della sospensione delle cellule.
  3. Rilasciare il mouse dal dispositivo di ritenuta e procedere con il prossimo animale. Mantenere almeno un animale papaina-esposti, che non subisce trasferimento con cellule fluorescente contrassegnate per servire come controllo negativo per microscopia di fluorescenza di luce-foglio.

4. preparare il tessuto polmonare per microscopia di fluorescenza di luce-foglio

Nota: Le seguenti operazioni vengono eseguite 3 h dopo trasferimento di fluorescente etichettati cellule umane (punto 3.2). Le procedure sperimentali descritte tra cui raccolta di tessuto polmonare, fissazione e tessuto a base di solvente di compensazione sono stati adattati da protocolli attualmente descritti24,28.

  1. Sacrificare il mouse per inalazione di anidride carbonica (C02).
  2. Irrorare il polmone in situ con PBS contenente 5mm EDTA.
    1. Aprire il torace tramite taglio lungo lo sterno per esporre il cuore. Punctate ventricolo di destra con una cannula di 21 G collegato ad un catetere.
    2. Aprire il ventricolo sinistro dal taglio e quindi consentire il sangue e l'aspersione fluido uscire. Irrorare lentamente il polmone con 20 mL di PBS ghiacciata contenente 5mm EDTA tramite catetere.
  3. Al fine di eseguire in loco fissazione del polmone, non rimuovere il catetere dal ventricolo destro. Irrorare lentamente il polmone con 2 mL di gelida paraformaldeide al 4% (PFA) risolto in PBS. Rimuovere il catetere e la cannula.
    Nota: PFA-basato in situ fissazione del tessuto polmonare rappresenta una consolidata tecnica al fine di preparare il tessuto polmonare murino per successive analisi microscopiche29,30.
    Attenzione: PFA è tossico e deve essere gestito sotto una cappa con cura.
  4. Riempire il polmone con 0,75% agarosio in situ.
    1. Preparare dell'agarosi 0,75% in PBS e mantenerlo solido a 50 ° C in un termo-agitatore fino all'utilizzo. Rimuovere le ghiandole salivari del mouse, tagliare il muscolo sternohyoid ed esporre la trachea facendo scorrere un forcipe sotto.
    2. Punteggiano la trachea esposta con un ago 30g e sostituirlo con un catetere di 30g smussato per prevenire ulteriori danni della trachea con conseguente perdite indesiderate di agarosio. Sigillare la giunzione tra il catetere inserito e la trachea utilizzando un porta-aghi.
      Opzionale: Combinare il qui descritto procedura con collezione di BAL per analizzare le cellule umane infiltrate in BAL come recentemente descritto in dettaglio31 (Vedi Figura 2,E per risultati rappresentativi).
    3. Riempire attentamente le vie aeree con 0,75% agarosio (raffreddato alla temperatura corporea) tramite il catetere fino al completo dispiegamento del polmone; attendere fino a solidificazione completa di agarosio. Rimuovere il catetere e accuratamente raccolto polmone in una provetta da 2 mL buia riempito con 4% PFA.
  5. Per ulteriore fissaggio Incubare il campione in 4% PFA risolto in PBS per 2 h a 4 ° C sotto rotazione continua (31 giri).
  6. Disidratare tessuto incubando successivamente campione in rotazione continua (31 giri) a 4 ° C in 50% di etanolo (pH 9), etanolo al 70% (pH 9) ed etanolo 100%; ogni passaggio per almeno 4 ore. Alla fine, è necessario eseguire una seconda incubazione in etanolo al 100% per 4 h.
  7. Eseguire solvente schiarimento del tessuto utilizzando etile cinnamato (ECi). Di conseguenza, è possibile trasferire il campione in ECi. Incubare per una notte a temperatura ambiente (in costante rotazione) fino a quando il tessuto appare traslucido (Vedi Figura 1D per immagini rappresentative).
    Nota: I campioni conservati in ECi a temperatura ambiente (riparo dalla luce) sono stabili sopra parecchie settimane ai mesi.

5. eseguire la microscopia di fluorescenza di luce-foglio dei lobi del polmone murino Wwhole

Nota: Il microscopio di fluorescenza di luce-foglio e il software corrispondente, su cui si basano i passaggi seguenti, vedere la Tabella materiali particolari. Sistemi analoghi di altri produttori, tuttavia, possono essere utilizzati anche con sviluppatore specifiche modifiche del protocollo seguente. Prima di iniziare, prendere confidenza con il manuale di istruzioni specifiche del microscopio e seguire le istruzioni tecniche dalla persona responsabile in loco.

  1. Impostare il microscopio di luce-foglio.
    1. Accendere il microscopio di luce-foglio e aprire il relativo imaging software sul computer. Riempire la camera del campione con ECi filtrata (filtro 100 µm) e collocarlo nella sua posizione tra i raggi laser.
    2. Utilizzare una piccola goccia di organico stabile al solvente colla per attaccare il polmone a supporto del campione. Per mantenere la profondità di penetrazione necessaria di luce-fogli più piccolo possibile, impostare il lobo del polmone in posizione verticale. Successivamente, inserire il supporto del campione nella sua camera.
    3. Impostare l'indice di rifrazione dell'obiettivo a 3.5 utilizzando ECi reagente di compensazione.
  2. Regolare le impostazioni al microscopio luce-foglio per rilevare cellule umane nel contesto dell'intero organo.
    1. Selezionare laser richiesto (filtro per misura > attivare le caselle di controllo dei laser richiesto) e scegliere intensità appropriata del software di controllo (trasmissione controllo laser > utilizzare il cursore per impostare intensità del laser > applicare). Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm (525/50 filtro) per rilevare il tessuto polmonare autofluorescent e 640 nm (680/30 filtro) per eccitare le cellule umane etichettate con un fluoroforo che emette nello spettro del rosso.
    2. Concentrarsi sul campione eccitato a 488 nm e adattare la messa a fuoco tramite lo strumento di 'correzione cromatica' la lunghezza d'onda di eccitazione di 640 nm (usare il cursore per impostare la correzione cromatica > applicare).
    3. Scegliere un fattore di zoom appropriato; Cenni preliminari su un ingrandimento basso (ad es., 6.3 x) per determinare la distribuzione complessiva delle cellule con etichettate all'interno del tessuto polmonare e immagini ingrandite (ad es., 32x) per la localizzazione dettagliata.
    4. Selezionare una larghezza di foglio delucidamento uniformemente l'intero organo o una sezione specifica di interesse (ottica > usare il cursore per impostare la larghezza del foglio; solitamente fra 20 – 40%). Definire l'apertura numerica (NA) di foglio con NA superiore creando immagini più nitide (ottica > utilizzare il dispositivo di scorrimento per impostare il foglio NA; per un lobo del polmone murino espanso alle dimensioni fisiologiche un NA di 0.025% può essere spesso utilizzato).
    5. Selezionare il numero di luce-fogli da utilizzare sotto 'impostazioni avanzate misura'. In caso di illuminazione bidirezionale, unire fogli di luce sinistra e destra per creare un'immagine omogeneamente illuminata (Avanzate > unire lightsheets > selezionare la modalità di fusione > cursori consentono di definire la sovrapposizione tra due fogli di luce).
      Nota: Si consiglia di sfruttare l'illuminazione bidirezionale del campione con tre luce-fogli ciascuno.
      Opzionale: Per aumentare ulteriormente la qualità dell'immagine, utilizzare l'operazione di messa a fuoco dinamica. Questo permette di spostare lo stato attivo nella direzione x durante l'acquisizione di immagini.
    6. Definire le posizioni di inizio e di fine dello z-stack per essere misurata e impostare la dimensione del passo a 5 µm (xyz-tabella Z > intervallo di scansione).
      Nota: Posizioni iniziale e finale di uno z-stack dipendono dalla dimensione e posizionamento del lobo del polmone all'interno del pozzetto. Tuttavia, circa 300-800 z-stack sono solitamente acquisito per un lobo del polmone singolo (dimensione del passaggio di 5 µm).
    7. Salvare i file utilizzando "impostazioni di salvataggio automatico" e avviare la misurazione per catturare immagini. Dopo la rifinitura di acquisizione dati, pulire il portacampioni ECi-contaminato e vaschetta sotto l'acqua corrente.
      Nota: Utilizzare le stesse impostazioni all'immagine diversi lobi del polmone che si suppone possano essere confrontati in seguito.

6. post-elaborazione di immagini e quantificazione delle cellule umane del polmone-accumulata

Nota: Per dettagli sul post-formazione immagine software per l'analisi 3D, su cui si basano i passaggi seguenti, vedere Tabella materiali . Tuttavia, alternativa post-imaging software può essere utilizzato come bene.

  1. Caricare la prima immagine di uno z-stack (attivare il pulsante di superare, il file > Apri > Seleziona immagine) al fine di avviare l'apertura di tutte le altre immagini dello z-stack selezionate e loro ricostruzione 3D automatico.
  2. Per garantire la corretta visualizzazione di x, y e z dimensioni, controllare i formati di voxel e regolarle se necessario (Modifica > Proprietà immagine > immettere la dimensione del voxel manualmente). Per la dimensione del voxel di z, immettere la dimensione scelta di passaggio tra due immagini (qui 5 µm).
  3. Visualizzare ogni canale in un colore distinto (modificare > Visualizza regolazione del display). Clicca su ogni canale uno dopo l'altro per definire un colore di scelta (in Figura 2A, B, C, D il segnale di autofluorescenza è visualizzato in grigio ed etichettato CD4 umana+ cellule in rosso).
  4. Regolare l'intensità, livello del nero e contrasto per ogni canale (modificare > Visualizza regolazione del display) usando i triangoli nei bar canale o immettendo i numeri esatti nelle impostazioni del canale. Per la regolazione dell'intensità, utilizzare il triangolo di destra. Per la regolazione del livello di nero, usare il triangolo di sinistro e per la regolazione del contrasto, utilizzare il triangolo centrale.
    Nota: Utilizzare il polmone derivata dal mouse controllo senza trasferimento di cellule (punto 3.3) per differenziare tra segnali cellula-derivati umani specifici e aspecifiche sfondo.
  5. Per quantificare con etichettate cellule all'interno del tessuto polmonare utilizzano 'Aggiungi il nuovo spot' nella barra degli strumenti e selezionare 'saltare la creazione automatica, modificare manualmente' per il conteggio manuale delle cellule.
    Nota:
    in alternativa, utilizzare la cella automatica Conteggio strumento sotto 'punti'. Tuttavia, conteggio manuale permette di distinguere più precisamente tra segnali specifici e non specifici.
    1. Per confrontare l'accumulo di cellule umane attraverso diversi campioni, definire un cubo del polmone con un volume specifico utilizzando lo strumento di taglio 3D (modificare > ritagliare 3D) (qui 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
    2. Per contare le cellule accumulate selezionare il canale 640 nm e definire una 'scala di raggio' di 10 µm. Quindi, fare clic su 'modifica', controllare 'selezionare' nel menu di puntatore e segnare ogni cella con un punto tramite Maiusc + clic con il pulsante sinistro del mouse. Trovare il numero complessivo delle cellule contate mostrate nelle statistiche.
      Nota: È consigliabile contare diversi cubetti per lobo del polmone (qui cinque) per garantire l'affidabilità dei risultati e compensare per la selezione di scienziato-dipendente del volume polmonare contati (risultati di strategia e rappresentante di quantificazione sono raffigurati in Figura 2D).
  6. Acquisire un'immagine usando lo strumento 'istantanea' e/o registrare un video utilizzando lo strumento 'animazione'. Risparmia il regolato dei file come IMS (file > Esporta).
    Nota: Per gli scopi rappresentativi, mostrare o nascondere la cornice selezionando o deselezionando la cornice sulla barra degli strumenti. Inoltre, visualizzazione immagini sia come proiezione di massima intensità (MIP) (barra degli strumenti > volume > modalità > Verifica MIP) oppure utilizzare la modalità' superficie' (barra degli strumenti > Aggiungi nuove superfici). La modalità di' superficie' deve essere attivato separatamente per ogni canale evidenziare l'architettura del tessuto e/o corpi cellulari (immagini rappresentative sono mostrati in Figura 2C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il protocollo presentato descrive un modello sperimentale del topo, che consente di monitorare e quantificare l'accumulo di linfociti T umani passivamente trasferiti nel polmone tramite microscopia a fluorescenza di luce-foglio. Figura 1 A fornisce una descrizione schematica dei passaggi del piano sperimentale in vivo. Al fine di garantire risultati affidabili, è di importanza notevole per garantire una buona qualità dell'isolato e fluorescente etichettato CD4 umana+ T cellule, che in seguito saranno trasferite in topi. Come rappresentativo raffigurato in Figura 1B, C, la procedura sopra descritta per cellulare basato su Microperlina arricchimento e successiva fluorescenza-etichettatura solitamente risultati in un flusso cytometrically determinati CD4+ cellula T purezza > 95% e successo fluorescenza-etichettatura di tutti i CD4+ T cellule. La profondità di penetrazione e di qualità di microscopia di fluorescenza di luce-foglio dipende criticamente un appropriato grado di schiarimento del tessuto. Come illustrato nella Figura 1D, il protocollo applicato qui per ECi-basata del tessuto di compensazione era in grado di garantire un elevato livello di trasparenza dell'organo, che indica un esito positivo indice di rifrazione di corrispondenza. Infine, un risultato complessivo rappresentativo del protocollo sperimentale descritto in forma di immagini di microscopia di fluorescenza di luce-foglio completamente elaborato è dimostrato nella Figura 2B, C, D e nel Video supplementari. Il segnale di autofluorescent (visualizzato in grigio) fornisce uno strumento utile per la struttura anatomica del polmone di imaging. Il segnale rosso rappresenta polmone accumulato CD4 umana+ T cellule. Quantificazione di formazione immagine di microscopia di fluorescenza di luce-foglio permette di determinare il totale accumulato numero del polmone umano CD4+ T cellule per area definita del tessuto polmonare infiammato. Una strategia per la quantificazione di infiltrazione delle cellule umane è illustrata nella Figura 2,E. La rilevazione cytometric di flusso (opzionale) di fluorescente etichettati cellule all'interno il BAL dei topi destinatari, come raffigurato in Figura 2F, può essere utilizzata come una tecnica supplementare al fine di confermare la migrazione riuscita dei tessuti di passivamente trasferito CD4+ T cellule. Inoltre, la preferenza delle cellule T umane trasferite per accumulo selettivo nel tessuto polmonare infiammato nel qui descritto impostazione sperimentale era ulteriormente supportata dal fatto che CD4 umana+ T le cellule non possono essere recuperate nella mucosa intestinale del destinatari animali come raffigurato in Figura 2B (pannello di destra).

Figure 1
Figura 1 : Panoramica schematica del flusso di lavoro sperimentale in vivo. Infiammazione polmonare allergica (A) è stata indotta in topi C57BL/6J per inalazione di papaina (50 µ g/topo) per tre giorni consecutivi (d0, d1 e d2). Il giorno successivo (d3), appena isolato e fluorescente etichettati CD4 umana+ T cellule sono state trasferite passivamente in topi tramite iniezione della vena della coda. Dopo altre tre ore, i topi sono stati sacrificati, seguita da aspersione in situ e la fissazione dei polmoni. Infine, i polmoni sono stati espiantati e ulteriormente analizzati ex vivo da microscopia di fluorescenza di luce-foglio. Facoltativamente, BAL possono essere raccolti prima espianto del polmone per eseguire esteso ex vivo analisi delle cellule umane extravasated e migrate con successo. (B) istogramma rappresentante confermando la purezza del CD4 isolato+ frazione di cellule T come determinato tramite flusso cytometry. Le cellule colorate da un controllo anti-umano dell'anticorpo o isotipo di CD4 vengono visualizzate in nero e grigio, rispettivamente. (C) istogramma rappresentante confermando l'efficacia di fluorescenza-etichettatura dei CD4 umana+ cellule prima del trasferimento adottivo. (D) immagini rappresentative di un lobo del polmone murino irrorato prima e dopo schiarimento con ECi. FI, intensità di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Analisi rappresentativa dell'accumulo polmonare di umano CD4 cellule nel contesto dell'infiammazione polmonare in vivo di+ . CD4 umana+ cellule sono state isolate da sangue periferico mediante centrifugazione su gradiente seguita da una fase di purificazione della microperla magnetico densità. CD4 umana+ cellule erano etichettate utilizzando un colorante di proliferazione delle cellule eccitabili a luce rossa ed iniettate per via endovenosa nei topi di C57BL/6J papaina-esposti. Dopo tre ore, i topi sono stati sacrificati per raccogliere e analizzare ulteriormente il tessuto polmonare tramite microscopia a fluorescenza di luce-foglio. (A) quadro rappresentativo di una ricostruzione 3D del tessuto polmonare murina, papaina-esposti (grigio) a tre ore dopo l'iniezione endovenosa di CD4 umana con etichetta+ cellule microscopia (rosso) come registrato tramite foglio di luce di fluorescenza. (B) del tessuto polmonare di un destinatario mouse tre ore dopo il trasferimento di cellule mostrato come panoramica o segmento ad alto ingrandimento (pannello di sinistra). Estratto umano CD4+ cellule potrebbero essere visualizzate come segnali rossi e sono stati entrambi rappresentati in sovrapposizione con il segnale di autofluorescenza del tessuto polmonare o come immagine monocanale. Al fine di confermare la specificità del segnale rilevato, controllo del tessuto polmonare senza trasferimento di cellule endovenosa servito come controllo negativo (pannello centrale). In contrasto con il tessuto polmonare, non etichettati CD4 umana+ cellule (rosso) potrebbero essere rilevate nell'ileo del mouse stesso destinatario (pannello di destra). (C) Post elaborazione delle immagini permette l'analisi di singole fette del tessuto polmonare, così come la generazione di ricostruzioni 3D del segmento intero organo che può essere sia rappresentata come proiezione di massima intensità (MIP) o in modalità di superficie. Sono raffigurate immagini rappresentative. (D) quantificazione strategia è illustrata esemplarmente nel polmone stesso come già raffigurato in Figura 2A. Definiti cubi del segmento polmonare analizzati sono stati selezionati e il numero di CD4 umana+ cellule (rosso) è stato quantificato per ogni cubo. Risultati di una quantificazione successivamente eseguita (eventi/813 µm x 813 µm x 1,000 µm cubo) sono indicati come media ± SEM. (E) come opzione aggiuntiva, rilevamento di cytometric di flusso delle cellule T umane fluorescente contrassegnate nel BAL di animali destinatari può essere eseguita al fine di confermare la migrazione riuscita dei tessuti di CD4 umano accumulato+ T cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Video
Video supplementari: Visualizzando sequenza video rappresentante accumulato CD4 umana+ cellule all'interno del tessuto del polmone murino. Ricostruzione 3D di visualizzazione il polmone murino accumulato CD4 umana+ cellule (rosse) all'interno del contesto del tessuto polmonare (grigio) tre ore dopo l'iniezione endovenosa nella vena della coda. Immagini vengono visualizzate come MIP nell'inizio e nella modalità di superficie alla fine. Immagini sono state acquisite tramite microscopia a fluorescenza di luce-foglio ed elaborati dal software di post-imaging per l'analisi 3D. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L'impostazione sperimentale descritto qui offre la possibilità di monitorare la capacità di homing polmonare delle cellule immuni umane primarie sotto condizioni infiammatorie in vivo e quindi relativo complementi classicamente eseguita la chemiotassi e l'adesione in vitro saggi. Per tener conto delle caratteristiche specifiche dell'organo anatomico del polmone, aspetti importanti della cellula immunitaria homing (compreso distribuzione chemiotassi e cella all'interno dell'organo bersaglio) nonché la rilevanza clinica e la trasferibilità dei dati acquisiti, abbiamo preso vantaggio di tre caratteristiche tecniche principali: (1) l'analisi delle cellule umane primarie all'interno di un organismo murino vivente; (2) l'induzione di papaina-mediata di infiammazione polmonare; e microscopia di fluorescenza di luce-foglio (3) del tessuto polmonare deselezionata.

Anche se gli studi funzionali di trasferiti passivamente umano cellule immunitarie all'interno di un organismo murino vivente potrebbero essere limitate in alcuni aspetti a causa di incompatibilità potenzialmente rilevanti nel recettore-ligando-interazioni fra i topi e gli uomini, il concetto generale di modelli murini umanizzati sono state stabilite con successo come un importante strumento sperimentale nel campo della medicina traslazionale durante le ultime decadi24,32,33,34,35 . Rispetto ai classici modelli animali, studi in topi umanizzati offrono il vantaggio di analizzare direttamente derivata da paziente cellule immuni in uno scenario di in vivo e quindi di identificare alterazioni funzionali improntate dalla particolare malattia32, 36,37. Per quanto riguarda la rilevanza delle differenze di potenziale tra definiti recettori sulla superficie delle cellule immuni umane e loro rispettivi ligandi murini o viceversa, ex studi già indicato quello umano CD4+ T le cellule sono in grado di interagire in modo efficiente con le molecole di adesione murino MAdCAM-1 e VCAM-1, che rappresentano cruciale ligandi per integrina-mediata dei linfociti homing32. Di conseguenza, la migrazione delle cellule immuni umane per via intravascolare trasferite nel tessuto dell'intestino murino con successo potrebbe essere bloccata in vivo dal trattamento con il clinicamente usate α4β7 integrina anticorpo vedolizumab32. Tuttavia, anche nel caso che una recettore-ligando-interazione specifica rilevanza potrebbe mostrare una mancata completa corrispondenza umano/murino, presumibilmente sarà possibile superare questa limitazione con l'ingegneria genetica e, per esempio, da transgenica sovraespressione della rispettivo ligando umano, fattore di crescita, citochine o recettore all'interno l'organismo murino33,35.

Come una notevole influenza di infiammazione cronica sulla locale secrezione di chemochine, l'espressione endoteliale di molecole di adesione e il conseguente accumulo di linfociti è stata descritta in numerose pubblicazioni38,39 ,40, la scelta di un adatto modello sperimentale di infiammazione polmonare ha rappresentato un passo critico mentre stabilire quanto sopra descritto il protocollo e potrebbe essere adattato a seconda del contesto clinico di ogni studio individuale. L'impostazione selezionata qui dell'infiammazione polmonare allergica indotta da Papaina rappresenta un modello sperimentale ben descritto, che si basa sulla capacità della papaina proteasi della cisteina amministrato localmente per irritare l'epitelio delle vie aeree e il grilletto il conseguente rilascio di alarmins27,41,42. È interessante notare che, esposizione accidentale alla papaina è conosciuto per causare lo sviluppo di asma negli esseri umani come ben43. Dipende la dose inalata di papaina, topi esposti Visualizza un accumulo di cellule immuni innate ed adattabili e livelli elevati di citochine di tipo 2 nell' polmone27. Mentre l'incremento della dose è risultato risultato in un ingrandimento di spazi aerei (fenomeno istologico classico della BPCO) e una distruzione delle pareti dei vasi sanguigni con conseguente emorragia, moderato dosaggio pianificazioni è andato con un'eosinofilia polmonare prominente e così ha imitato un'importante caratteristica istologica di asma umana27. Come il nostro scopo era di utilizzare questo modello sperimentale per generare un contesto infiammatorio per l'analisi di cellule immunitarie polmonare homing, abbiamo provato con attenzione evitare danni indotti da papaina di vasi sanguigni, che potrebbero altrimenti derivare in un DAergici stravaso di cellule immunitarie umane a causa di integrità endoteliale disturbato. Di conseguenza, abbiamo selezionato una dose intermedia di 50 µ g di papaina per topo al giorno nel protocollo descritto sopra. Anche se lo sviluppo di papaina indotta infiammazione delle vie aeree si verifica anche in assenza di B e i linfociti T, cellule del sistema immunitario adattative di infiltrazione polmonare sono noti per avere un impatto significativo sul corso della malattia27,42. Per esempio, cellule di T regolarici potrebbero essere identificate come regolatori potenti di papaina-indotta della via aerea eosinofilia27. In prospettiva, il coinvolgimento attivo dei linfociti polmonari nella patogenesi infiammatoria dei topi esposti papaina implica che il protocollo sopra descritto potrebbe inoltre consentono di analizzare la capacità funzionale del passivamente trasferiti e con successo accumulato di polmone umane cellule immuni di modulare la patologia del polmone (ad esempio, tramite acquisizione di cytometric di flusso dei conteggi eosinofili in BAL). Inoltre, un'inoltre effettuata somministrazione intranasale di chemochine umano malattia-pertinenti selezionati appena prima del trasferimento intravascolare delle cellule potrebbe consentire di analizzare l'impatto di questi mediatori umorali sul processo di homing polmonare di umani distinti popolazioni di cellule immuni in un ambiente in vivo. Allo stesso modo, può essere studiato l'effetto degli inibitori sul processo di homing polmonare e, successivamente, su patologia infiammatoria del polmone.

Un particolare vantaggio della procedura sperimentale introdotta qui è il tracciamento preciso e la localizzazione del polmone umane cellule immuni di infiltrazione dalla qualità high-end formazione immagine di microscopia di fluorescenza di luce-foglio. Già gli studi recenti hanno dimostrato che la tecnica di microscopia di fluorescenza di luce-foglio rappresenta un prezioso strumento sperimentale per l'analisi di cellule immunitarie intestinali homing nella ricerca traslazionale IBD ed è in grado di superare i limiti di immunofluorescenza convenzionale microscopia e flusso cytometry24,32. Mentre le analisi basate su microscopia convenzionale sono in genere limitate a una piccolissima e zona potenzialmente non rappresentativa dell'organo e flusso cytometry non prendere in considerazione l'aspetto della organizzazione del tessuto affatto, luce-foglio microscopia di fluorescenza del tessuto chimicamente sgomberato permette una profondità di penetrazione aumentata senza perdita di risoluzione e quindi permette una ricostruzione 3D delle sezioni dell'organo piuttosto grande (fino a 1,5 cm x 1,5 cm)24,28,44. Di sicuro, la qualità e la validità delle ricostruzioni 3D acquisiti dipendono criticamente le prestazioni della clearance del tessuto. Nell'impostazione descritta qui, abbiamo incluso una versione leggermente adottata del protocollo pubblicato di recente per ECi-basata del tessuto44di compensazione. Rispetto ad altre strategie ben consolidate per il tessuto a base di solvente compensazione26,45,46, il protocollo basato su ECi combina i vantaggi di schiarimento eccellente proprietà, bassa tossicità dell'usato reagenti e un tempo moderato requisito44. Come la capacità di microscopia di fluorescenza di luce-foglio standard per risolvere le più belle strutture del tessuto come capillari alveolari è ancora limitata anche in condizioni ottimali condizioni28, di compensazione potrebbe in qualche modo essere difficile differenziare attendibilmente tra le cellule immunitarie intravascolare e già extravasated. L'inclusione di un ulteriore standard basati sulla fluorescenza vaso sanguigno che macchia nel protocollo descritto qui molto probabilmente non sarebbe in grado di completamente superare questa limitazione. Così, gli studi con un focus particolare sul comportamento delle cellule immuni all'interno la microcircolazione polmonare o loro diapedesi potrebbero preferenzialmente prendere in considerazione un protocollo pubblicato di recente e molto elegante per l'imaging polmonare videomicroscopia basato su 2-fotone la microscopia47. In questa impostazione sperimentale, una finestra toracica è stata impiantata in topi anestetizzati e ventilati, attraverso il quale il polmone stabilizzato può essere monitorato da un risonante-esame modulo 2-fotone microscopia, permettendo ad alta risoluzione di imaging in tutto il ciclo respiratorio al momento conservato ventilazione e perfusione47,48. Questa tecnica è stata applicata con successo in vari studi ed è stato in grado di visualizzare ad esempio la biogenesi della piastrina intrapolmonare e l'ingresso di polmone di fare circolare le cellule del tumore49,50. Tuttavia, oltre il requisito di sofisticate apparecchiature strumentali (ad es., sistema di ventilazione del mouse) e la necessità di modifiche estese dilagante in animali vivi (l'impianto della finestra toracica e microscopia intravital), la principale limitazione di questo polmone dal vivo sistema di microscopia è la penetrazione di ristretti dell'asse z. L'imaging di superficie polmonare eseguita consente solo analizzando l'esterno 100 µm di subpleural polmone tessuto47,48. Dipende dal contesto scientifico, potrebbe essere un'opzione importante per attuare il protocollo descritto sopra 2-fotone microscopia dei polmoni espiantati come un'ulteriore procedura. Analizzando il polmone stesso prima di 2-fotone microscopia ed in seguito da microscopia di fluorescenza di luce-foglio potrebbe rappresentare una strategia per ottenere una descrizione quantitativa della distribuzione e localizzazione delle cellule immuni umane all'interno del polmone murino ( microscopia di fluorescenza di luce-foglio) e, allo stesso tempo, alcuni spunti più dettagliate nei processi cellulari o microvascolari (2-fotone microscopia). 2-fotone microscopia di espianti tracheali murini rappresenta infatti, un consolidato strumento di imaging per l'analisi del comportamento delle cellule immuni nel contesto di infiammazione polmonare sperimentalmente indotto51,52. Invece di visualizzare piccoli vasi capillari polmonari, il successo dello stravaso e polmone infiltrazione del tessuto delle cellule T umane trasferite nel nostro modello sperimentale può essere dimostrato anche rilevando le cellule umane fluorescente contrassegnate all'interno il BAL del destinatario animali tramite citometria a flusso come exemplarily raffigurato in Figura 2,E. In generale, analisi del compartimento cellulare BAL rappresentano un metodo ben consolidato per caratterizzare l'afflusso delle cellule immuni polmonare nel contesto di malattie respiratorie infiammatorie31. Infine, un'altra strategia di cytometric di flusso per quantificare lo stravaso delle cellule immuni passivamente trasferiti all'interno del tessuto polmonare è stato descritto da Galkina et al (2005)53 e potrebbe potenzialmente essere combinata con il protocollo descritto qui. Nello studio di Galkina et al., una singola iniezione endovenosa di un anticorpo di fluorescenza-coniugato anti-CD8 poco prima resezione del polmone ha provocato un'esclusiva e completa etichettatura di prima trasferito CD8+ T cellule all'interno del polmone compartimento vascolare, mentre già extravasated CD8+ T cellule all'interno dell'interstizio polmonare è rimasto senza macchia. Analisi successive delle cellule immuni polmonare con etichettate in vivo sono stati eseguiti Flusso cytometrically dopo ex vivo digestione del polmone tessuto53. Naturalmente, il processo di digestione del tessuto significa che la separazione anatomica tra l'intra - e compartimento extravascolare polmonare è abrogata e, quindi, c'è un rischio generale di falsi positivi etichettatura delle cellule immuni interstiziale dovuto perdita di anticorpo tra entrambi i compartimenti. Questo rischio può solo essere minimizzato eseguendo la digestione del tessuto in presenza di quantità di anticorpo adenoide53 di saturazione o, potenzialmente, sostituendo l'analisi cytometric di flusso mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio, che rende possibile per evitare completamente la distruzione della struttura del tessuto.

In sintesi, il qui presentare la combinazione di homing in vivo delle cellule immuni primarie fluorescente contrassegnate e microscopia a fluorescenza di luce-foglio successivo è in grado di attendibilmente identificare, quantificare e localizzare le cellule immunitarie umane polmone accumulato in un modello sperimentale del topo di infiammazione polmonare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.F. Neurath ha servito come consulente per Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda e Boehringer. Gli autori rimanenti non divulgare qualsiasi conflitto.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono con gratitudine finanziamenti dalla DFG Collaborative Research centri SFB 1181 e TRR 241. L'Optical Imaging centro Erlangen (OICE) e in particolare Ralf Palmisano, Philipp Tripal e Tina Fraaß (progetto Z2 del DFG CRC 1181) sono riconosciuti per il supporto tecnico di esperti per l'imaging di fluorescenza di luce-foglio microscopico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose NEEO Ultra Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody BioLegend, San Diego, USA 304060
Ammonium chloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany K2981
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 301300
Cell proliferation dye eflour670 eBioscience Inc., San Diego, USA 65-0840-85
CD4 MicroBeads, human Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 21066001
Ethly cinnamate (ECi) Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany P40-47500
Filter 100 µm  VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany 732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 Bitplane AG, Zurich, Switzerland n.a.
ImspectorPro software Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany n.a.
Ketamin  Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany 3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany n.a.
MACS MultiStand Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-303
Multifly cannula 20 G Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 851638035
30 G needle B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9161502
Neubauer counting chamber neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany C-1003
Pattex Glue Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany PSK1C
LS column Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) anprotec AC-AF-0018
Papain Merck 1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) Biochrom GmbH, Berlin, Germany L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 BioLegend, San Diego, USA 317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl BioLegend, San Diego, USA 400337
PFA (paraformaldehyde) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 0335.1
Potassium hydrogen carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany P7481
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 86.1254.001 
Syringe 1 mL B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9166017V
Syringe 5 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260067
Syringe 20 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260069
Tube 1.5 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,706,400
Tube 2 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72.695.400 
Tube 2 mL, brown Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,695,001
Tube 15 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.554.502 
Tube 50 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.547.254 
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-090-976
Xylazin (Rompun 2%) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany KPOBD32

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14, (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210, (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179, (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254, (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190, (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79, (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112, (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42, (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182, (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70, (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171, (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35, (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69, (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166, (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9, (12), 114604 (2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158, (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57, (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14, (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294, (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23, (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186, (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8, (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153, (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43, (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72, (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65, (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25, (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8, (1), 707 (2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95, (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14, (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23, (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36, (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190, (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32, (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28, (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8, (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544, (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531, (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15, (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10, (3), 0118513 (2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115, (12), 3473-3483 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics